專利名稱：癌性疾病調(diào)節(jié)抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)的分離和制備，以及這些 CDMAB在診斷和治療過程中的應(yīng)用，任選地其與一種或多種化學(xué)治療 劑聯(lián)合使用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及利用本發(fā)明的CDMAB的結(jié)合分析。
背景技術(shù)：
用于癌癥治療的單克隆抗體每個(gè)患有癌癥的個(gè)體都是獨(dú)特的，由 于個(gè)體的差異，其患有的癌癥也不同于其他癌癥。盡管如此，目前的治 療對患有同期同類型腫瘤的所有患者采用相同的方式。至少30%的患者 的一線治療是失敗的，這樣就造成更多輪次的治療，增加了治療失敗、 腫瘤轉(zhuǎn)移及最終死亡的可能性。 一種優(yōu)越的治療方式應(yīng)該是針對特定個(gè) 體的個(gè)體化治療。目前唯一采用個(gè)體化治療的方式是外科手術(shù)?；熀?放療不能針對患者量身定做，而在大多數(shù)情況下，手術(shù)本身并不足以治 愈癌癥。
隨著單克隆抗體的問世，發(fā)展個(gè)體化治療的方法的可能性變得更為 現(xiàn)實(shí)，因?yàn)槊糠N抗體能對應(yīng)單一的抗原決定簇。而且，制備針對多個(gè)抗 原決定簇的集群(constellation)的抗體組合成為可能，該抗原決定簇集群唯 一確定了某一特定個(gè)體的腫瘤。
認(rèn)識到癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的顯著差異在于癌細(xì)胞含有轉(zhuǎn)化細(xì)胞特異 的抗原，科學(xué)界長期認(rèn)為可以通過與這些癌抗原特異結(jié)合設(shè)計(jì)出特異靶 向轉(zhuǎn)化細(xì)胞的單克隆抗體；這樣就產(chǎn)生了這樣一種觀點(diǎn)單克隆抗體能 夠作為"魔術(shù)子彈(Magic Bullets)"消除癌細(xì)胞。然而，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛地認(rèn)識到單一的單克隆抗體不能用于癌癥的所有情形，單克隆抗體可以按 類來開發(fā)，用來治療目標(biāo)癌癥。依照本發(fā)明公開的方法分離出的單克隆 抗體已經(jīng)顯示出能夠以有利于患者的方式調(diào)節(jié)癌性疾病進(jìn)程，如通過降 低腫瘤負(fù)荷，并且在本文中這些單克隆抗體將被稱為癌性疾病調(diào)節(jié)抗體
(CDMAB)或"抗癌"抗體。
目前，癌癥患者通?？蛇x擇的治療方式很少。目前的癌癥治療方法 已經(jīng)改善了總體存活率和發(fā)病率。然而，對特定的個(gè)體來說，這些改善 的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與他們個(gè)人情況的改善并無必然關(guān)系。
因此，如果提出一種方法學(xué)，使醫(yī)生能夠在同組患者中，獨(dú)立于其 他患者治療每例腫瘤，這就使根據(jù)個(gè)人進(jìn)行量身定做的獨(dú)特治療成為可 能。理論上，這樣一種治療過程可以增加治愈率，產(chǎn)生更好的效果，從 而滿足長期的需要。
從歷史上來看，多克隆抗體的應(yīng)用在治療人類癌癥的方面取得的成 功有限。 一直用人類的血漿來治療淋巴瘤和白血病，但很少有長期的好 轉(zhuǎn)或反應(yīng)。而且，這種治療方法重復(fù)性差，與化療相比，沒有更多的益 處。像乳癌、黑色素瘤和腎細(xì)胞癌等實(shí)體腫瘤也用人類血液、黑猩猩的 血清、人類血漿和馬血清來治療過，但相應(yīng)的結(jié)果是不可預(yù)測和無效的。
有很多用單克隆抗體治療實(shí)體腫瘤的臨床試驗(yàn)。在20世紀(jì)80年代， 就有至少四項(xiàng)針對人類乳腺癌的臨床試驗(yàn)，在使用了針對特定抗原或基 于組織特異性的抗體的至少47個(gè)患者中，只產(chǎn)生了一名應(yīng)答者。直到1998 年，才有了成功的臨床試驗(yàn)，該試驗(yàn)聯(lián)合使用人源化的抗Her2/neu抗體 (Herceptin⑧)與順鉑。在這項(xiàng)試驗(yàn)中，對37個(gè)患者的反應(yīng)進(jìn)行了評估，大 約有四分之一的患者有部分反應(yīng)，另外四分之一有輕微的或穩(wěn)定的病情 發(fā)展。在反應(yīng)者中，中位進(jìn)展時(shí)間(median time to progression)是8.4個(gè)月， 其中中位反應(yīng)持續(xù)時(shí)間(median response duration)是5.3個(gè)月。
Herceptin⑧在1998年被批準(zhǔn)作為與Taxof聯(lián)合使用的一線用藥。臨 床試驗(yàn)結(jié)果表明，與單獨(dú)接受Taxof治療的人群的中位疾病進(jìn)展時(shí)間(3.0 月)相比，抗體治療與Taxo產(chǎn)的4關(guān)合應(yīng)用增加了患者的中位疾病進(jìn)展時(shí)間 (6.9月)。Herceptii^與Taxof聯(lián)合治療組的中位存活時(shí)間也輕微增加，與 Taxo^單獨(dú)治療組相比是22個(gè)月18個(gè)月。除此之外，該抗體和Taxol 聯(lián)合應(yīng)用組與單獨(dú)使用Taxol②組相比，在完全應(yīng)答者(8%: 2%)和部分應(yīng) 答者(34%: 15%)的數(shù)量方面都有增加。然而Herceptin⑧和Taxof聯(lián)合治 療相比Taxo^單獨(dú)治療，導(dǎo)致了較高的心血管毒性發(fā)病率(分別是13%和 1%)。 Herceptii^治療也只對那些過表達(dá)人類表皮生長因子受體 2(Her2/neu)(通過免疫組化分析來確定)的患者有效。Her2/neu是一種目前 還不知其功能或生物學(xué)重要配體的受體；大約25%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者
過表達(dá)Her2/neu。因此遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足患乳腺癌的患者的治療需求。即便 那些從Herceptir^治療中受益的患者仍然需要化療，隨后還必須處理這類 治療至少在 一 定程度上帶來的副作用。
研究結(jié)腸直腸癌的臨床試驗(yàn)涉及到同時(shí)針對糖蛋白和糖脂耙標(biāo)的抗 體。對腺癌有某些特異性的諸如17-lA等抗體，已經(jīng)在超過60例的患者 中進(jìn)行了2期臨床實(shí)驗(yàn)，其中僅有1例患者有部分反應(yīng)。在其他試驗(yàn)中， 17-1A的使用在采用額外使用環(huán)磷酰胺實(shí)驗(yàn)方案的52例患者中，只產(chǎn)生 了 l例完全反應(yīng)，2例輕孩史反應(yīng)。到目前為止，17-lA作為III期結(jié)腸癌 輔助治療的III期臨床試驗(yàn)還沒有顯示出改善的療效。最初被批準(zhǔn)用于顯 像的人源化鼠單克隆抗體也沒能使肺瘤消退。
只有到了最近，使用單克隆抗體進(jìn)行的結(jié)腸直腸癌的臨床試驗(yàn)才有 一些陽性結(jié)果。2004年，ERBITLD^^皮批準(zhǔn)作為表達(dá)EGFR的轉(zhuǎn)移結(jié)腸 直腸癌患者的二線治療用藥，這些患者對于基于依立替康(irinotecan)的化 療是耐受的。雙臂II期臨床研究和單臂研究的結(jié)果表明，ERBITUX㊣與 依立替康聯(lián)合應(yīng)用分別有23%和15%的反應(yīng)率，中位疾病進(jìn)展時(shí)間分別 是4.1和6.5月。來自同一項(xiàng)雙臂II期臨床試驗(yàn)和另一項(xiàng)單臂研究的結(jié)果 表明，ERBITLC ^單獨(dú)治療的反應(yīng)率分別是ll。/。和9y()，中位疾病進(jìn)展時(shí) 間分別是1.5和4.2個(gè)月。
因而在瑞士和美國』1^1丁1^@與依立替康的聯(lián)合應(yīng)用，以及在美國， ERBITLD^的單獨(dú)治療都已經(jīng)被批準(zhǔn)作為依立替康一線治療失敗的結(jié)腸 癌患者的二線治療。因此，與Herceptii^—樣，ERBITUX⑧治療在瑞士只 被批準(zhǔn)作為單克隆抗體和化療聯(lián)合應(yīng)用。此外，在瑞士和美國，ERBITUX 治療只被批準(zhǔn)作為患者的二線治療。同樣，在2004年，AVASTIN⑧被批 準(zhǔn)與基于靜脈注射5-氟尿嘧啶的化療聯(lián)合應(yīng)用，作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線治療。III期臨床研究結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用AVASTIN②和5-氟尿嘧 啶，與單獨(dú)使用5-氟尿嘧咬相比，延長了患者的中位存活時(shí)間(分別是20 個(gè)月和16個(gè)月)。然而，還是與Herceptii^和ERBITLD^—樣，AVASTIN 只被批準(zhǔn)作為單克隆抗體與化療聯(lián)合應(yīng)用。
對于肺臟、腦、卵巢、胰腺、前列腺和胃癌的治療，療效仍然4艮差。 在II期臨床試驗(yàn)中，得到了對于非小細(xì)胞肺癌最有希望的近期結(jié)果，其 治療包括與化療試劑1^0丁￡11￡@聯(lián)合應(yīng)用的偶聯(lián)細(xì)胞殺傷藥物阿霉素 的單克隆抗體(SGN-15;dox-BR96,抗-唾液酸化的Lex)。 TAXOTERE⑧是唯 一經(jīng)FDA批準(zhǔn)的用于肺癌二線治療的化療藥物。初始數(shù)據(jù)表明，與單獨(dú) 使用丁^0丁￡虹@相比，總體存活率提高。參與本研究的62個(gè)患者中， 三分之二接受了 SGN-15與TAXOTERE⑧的聯(lián)合治療，剩下的三分之一接 受了 TAXOTERE⑧的單獨(dú)治療。接受SGN-15與丁^0丁￡1^@聯(lián)合治療的 患者中位總體存活時(shí)間是7.3個(gè)月，相比之下，接受TAXOTERE⑧單獨(dú)治 療的患者的中位存活時(shí)間是5.9個(gè)月。與接受TAXOTERE⑧單獨(dú)治療的患 者的1年和18個(gè)月的總體存活率為24%和8%相比，接受SGN-15與 丁^(>^肌@聯(lián)合治療的患者是29%和18%。進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)在計(jì)劃 中。
臨床前試驗(yàn)中，使用單克隆抗體治療黑色素瘤取得了有限的成功。 這些抗體中，極少有達(dá)到臨床試驗(yàn)期的，且至今還沒有一種得到批準(zhǔn)， 或在III期臨床試驗(yàn)中顯示出良好效果。
由于對明確促進(jìn)疾病發(fā)生的30， 000種已知基因產(chǎn)物中的相關(guān)靶點(diǎn) 缺乏鑒定，使治療疾病的新藥的發(fā)現(xiàn)受阻。在腫瘤學(xué)研究中，潛在的藥 物靶點(diǎn)只因?yàn)槠湓谀[瘤細(xì)胞中過表達(dá)這一事實(shí)而經(jīng)常被選擇。隨后，這 樣鑒定的靶點(diǎn)通過與大量化合物的相互作用被篩選。就潛在抗體的治療 而言，這些候選化合物通常由依據(jù)Kohler和Milstein提出的基本原理 (1975， Nature, 256， 495-497, Kohler and Milstein)制備單克隆抗體的傳統(tǒng)方 法所產(chǎn)生。從抗原免疫過的小鼠(舉例來說，全細(xì)胞，細(xì)胞成分，純化的 抗原)收集脾細(xì)胞，并與永生的雜交瘤細(xì)胞伴侶融合。根據(jù)與靶抗原密切 結(jié)合的抗體的分泌來篩選所產(chǎn)生的雜交瘤。已經(jīng)用這些方法制備、并已 基于它們的親和性選擇出許多針對癌細(xì)胞的診斷和治療的抗體，包括200680036732.X
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Herceptin⑧和RITUXIMAB。這項(xiàng)策略的缺陷是雙重的。首先，由于對組 織特異性的癌癥過程認(rèn)識的貧乏及由此產(chǎn)生的鑒定這些靶標(biāo)的過分筒單 的方法(諸如通過過表達(dá)來篩選)，與用于診斷和治療的抗體結(jié)合的合適靶 標(biāo)的選擇是有限的。其次，與受體有最大親和性的藥物分子啟動(dòng)或抑制 信號通路的可能性最大這一假說并不總是成立。
盡管乳癌和結(jié)腸癌的治療取得了一些進(jìn)展，但是有效的抗體治療的 鑒定與開發(fā)對所有類型癌癥而言都是不夠的，不管是作為單一試劑還是 聯(lián)合治療?，F(xiàn)有專利
美國第5,750,102號專利公開了一種方法，其中用可從患者的組織或 細(xì)胞中克隆的MHC基因轉(zhuǎn)染來自患者腫瘤的細(xì)胞。然后用這些轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞給患者接種。
美國專利4,861,581公開了一種方法，它包括的步驟有獲取單克隆 抗體，該抗體對哺乳動(dòng)物肺瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分是特異的， 對外部成分沒有特異性；標(biāo)記單克隆抗體；將該標(biāo)記的抗體與哺乳動(dòng)物 的組織接觸，該哺乳動(dòng)物已接受殺滅腫瘤細(xì)胞的治療；以及通過測量該 標(biāo)記抗體與退化的肺瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分的結(jié)合來確定治療的效果。在 制備針對人類細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體時(shí)，專利權(quán)所有人認(rèn)識到腫瘤細(xì)胞是這 類抗原的一個(gè)方便來源。
美國專利5,171,665提供了一種新型抗體及其制備方法。具體的，該 專利名又述了一種單克隆抗體的制備，該抗體有與人類腫瘤(例如腸癌和肺 癌)相關(guān)的蛋白抗原牢固結(jié)合的特性，而與正常細(xì)胞的結(jié)合程度弱得多。
美國專利5，484，596提供了一種癌癥治療的方法，該方法包括手術(shù) 去除人類癌癥患者的腫瘤；處理腫瘤組織以獲得肺瘤細(xì)胞；照射腫瘤細(xì) 胞，使其能成活但不致瘤；用這些細(xì)胞來制備抑制原發(fā)性腫瘤復(fù)發(fā)，同 時(shí)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的患者疫苗。該專利講述了能夠與腫瘤細(xì)胞表面抗原反 應(yīng)的單克隆抗體的開發(fā)。如在第4欄，第45行等處提到的，專利權(quán)所有 人在開發(fā)單克隆抗體中應(yīng)用了自體腫瘤細(xì)胞，該單克隆抗體對人類腫瘤 表現(xiàn)出活性特異的免疫治療。美國專利5,693,763講述了人類癌細(xì)胞的糖蛋白抗原特性，其不依賴 于起源的上皮組織。
美國專利5,783,186涉及誘導(dǎo)表達(dá)Her2的細(xì)胞凋亡的抗-Her2抗體、 產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞系、用該抗體和包括所述抗體在內(nèi)的藥物組合 物治療癌癥的方法。
美國專利5,849，876描述了產(chǎn)生單克隆抗體的新的雜交瘤細(xì)胞系，該 抗體針對從肺瘤和非腫瘤組織來源中純化的粘液素抗原。
美國專利5,869,268涉及一種制備產(chǎn)生特異針對目標(biāo)抗原的抗體的 人類淋巴細(xì)胞的方法，制備單克隆抗體的方法及該方法制備的單克隆抗 體。該專利特別涉及用于癌癥診斷和治療的抗-HD人類單克隆抗體的制 備。
美國專利5,869,045涉及與人類癌細(xì)胞反應(yīng)的抗體、抗體片段、抗體 偶聯(lián)物和單鏈免疫毒素。這些抗體的作用機(jī)制是雙重的，其中該分子可 與人類癌細(xì)胞表面的細(xì)胞膜抗原反應(yīng)，而且該抗體能夠進(jìn)一步內(nèi)化入癌 細(xì)胞內(nèi)，隨后結(jié)合，使它們對形成抗體-藥物，抗體-毒素的偶聯(lián)物尤其有 用。未經(jīng)修飾的抗體在特定濃度下，也表現(xiàn)出細(xì)胞毒特性。
美國專利5,780,033公開了用于腫瘤治療和預(yù)防的自身抗體的使用。 不過，這種抗體是來自老年哺乳動(dòng)物的抗核自身抗體。這里，自身抗體 是指一種存在于免疫系統(tǒng)的天然抗體。因?yàn)樽陨砜贵w來自"老年哺乳動(dòng) 物"，所以就不要求自身抗體真正來自受治患者。此外，該專利公開了來 自老年哺乳動(dòng)物的天然單克隆抗核自身抗體及產(chǎn)生單克隆抗核自身抗體 的雜交瘤細(xì)胞系。
發(fā)明概述
本申請利用美國專利6,180，357講述的制備患者特異性的抗癌抗體的 方法，分離編碼調(diào)節(jié)癌性疾病的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系?？梢葬槍?一個(gè)腫瘤專門制備這些抗體，從而使癌癥治療的個(gè)性化成為可能。在本 申請公開的內(nèi)容中，有殺傷細(xì)胞(細(xì)胞毒的)或抑制細(xì)胞生長(細(xì)胞生長抑 制的)特性的抗癌抗體將在下文被稱為細(xì)胞毒性作用。這些抗體可用于輔 助癌癥的分期和診斷，可以用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。這些抗體也可以通過預(yù)防性治療的方式來預(yù)防癌癥。與傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)模式下制備的抗體不同， 用本方法制備的抗體可靶向以前沒有表明對惡性組織生長和/或存活必需 的分子和途徑。而且，這些抗體的結(jié)合親和性滿足啟動(dòng)細(xì)力包毒性作用事 件的要求，該事件可不順從于更強(qiáng)的親和性相互作用。同樣，本發(fā)明的 范圍還包括將傳統(tǒng)的化療調(diào)節(jié)物質(zhì)，比如放射核素，與本發(fā)明中的
CDMAB偶聯(lián)，從而使所述的化療作用集中。該CDMAB也可與毒素、 細(xì)胞毒性部分、酶(例如生物素結(jié)合酶)或造血細(xì)胞偶聯(lián)，從而形成抗體偶 聯(lián)物。
個(gè)體化抗癌治療前景將會帶來患者治療方式的變化。 一個(gè)可能的臨 床情境就是在腫瘤出現(xiàn)時(shí)，就獲取腫瘤樣本并入庫。通過該樣本，從預(yù) 存在的癌性疾病調(diào)節(jié)抗體組中對該腫瘤進(jìn)行分型。對該患者進(jìn)行常規(guī)分 期，而所提供的抗體可用于該患者的進(jìn)一步分期。用現(xiàn)有的抗體可直接 對該患者進(jìn)行治療，且腫瘤特異性的抗體組可通過本文中列出的方法來 制備或通過噬菌體顯示庫與本文公開的篩選方法合用來制備。既然其他 腫瘤可能攜帶一些與被治療肺瘤相同的抗原決定簇，制備的所有抗體將 被加入到抗癌抗體庫中。按照本方法制備的抗體可以用于治療許多患有 與這些抗體結(jié)合的腫瘤的患者的癌性疾病。
除抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦治療作為多模式治療 方案的一部分。通過本方法分離的抗體對于非癌細(xì)胞相對無毒性這一事 實(shí)允許大劑量使用抗體組合，要么單獨(dú)應(yīng)用，要么與傳統(tǒng)的治療聯(lián)合應(yīng) 用。高治療指數(shù)也允許短期內(nèi)的重復(fù)治療，從而降低了治療抗性細(xì)胞出 現(xiàn)的可能性。
如果患者的初期治療產(chǎn)生耐藥性或發(fā)生了轉(zhuǎn)移，可以重復(fù)腫瘤特異 性抗體的產(chǎn)生過程進(jìn)行再次治療。而且，該抗癌抗體可以與從該患者體 內(nèi)獲得的紅細(xì)胞偶聯(lián)，重新輸注到患者體內(nèi)用于治療轉(zhuǎn)移腫瘤。目前幾 乎沒有有效的治療轉(zhuǎn)移癌的方法，而轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著導(dǎo)致死亡的不良結(jié) 果。然而，轉(zhuǎn)移癌通常血管豐富，通過紅細(xì)胞來運(yùn)輸抗癌抗體可以使抗 體富集在腫瘤部位。即便在轉(zhuǎn)移之前，大多數(shù)癌細(xì)胞也要依賴于宿主的 血供來存活，與紅細(xì)胞偶聯(lián)的抗癌抗體對原位腫瘤同樣有效?；蛘?，所 述抗體可以與其他的血細(xì)胞，比如淋巴細(xì)胞、巨p藍(lán)細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等偶聯(lián)。
抗體有五類，每類都有其重鏈所賦予的功能。通常認(rèn)為通過抗體依 賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性作用來介導(dǎo)棵抗體
(naked antibodies)的癌細(xì)胞殺傷功能。例如，鼠IgM和IgG2a抗體能夠 結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)的C-l組分來活化人類補(bǔ)體，vMv而活化導(dǎo)致腫瘤裂解的補(bǔ) 體活化的經(jīng)典途徑。對于人類抗體，最有效的補(bǔ)體激活抗體通常是IgM 和IgGl。鼠lgG2a和IgG3同種型抗體可以有效地召集具有Fc受體的細(xì) 胞毒細(xì)胞，其導(dǎo)致單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞的細(xì)胞 殺傷作用。人的IgGl和IgG3同種型抗體介導(dǎo)ADCC。
抗體介導(dǎo)的癌殺傷功能的另 一可能機(jī)制是通過使用能夠催化細(xì)胞膜 及其相關(guān)糖蛋白或糖脂中各種化學(xué)鍵水解的抗體，即所謂的催化抗體。
抗體介導(dǎo)的癌細(xì)胞殺傷功能還有三種機(jī)制。第一種是抗體作為疫苗 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對癌細(xì)胞推定抗原的免疫反應(yīng)。第二種是用抗體靶向生 長受體，干擾其功能或下調(diào)該受體，以使其功能有效喪失。第三種是這 類受體與細(xì)胞表面部分直接連接(ligation)的作用，其可導(dǎo)致直接的細(xì)胞死 亡，比如與諸如TRAIL Rl或TRAIL R2的死亡受體，或是與諸如aVj3 3 等的整合素分子連接。
癌癥藥物的臨床應(yīng)用是基于該藥物在可接受的風(fēng)險(xiǎn)范圍下對患者的 益處。在癌癥治療過程中，存活率通常是追求的最主要的益處。但是， 除了延長壽命之外，還有一些其他公認(rèn)的益處。在治療對存活率沒有負(fù) 面影響的情況下，這些其他益處包括癥狀減輕、防止副作用、延長復(fù)發(fā) 或無疾病存活時(shí)間以及延長病情進(jìn)展時(shí)間。這些標(biāo)準(zhǔn)是被普遍接受的， 且像美國食品藥品管理局(F.D.A.)等管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)產(chǎn)生這些益處的藥物 (Hirschfeld & a/. Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143 2002)。除了這些標(biāo)準(zhǔn)之外，人們充分認(rèn)識到還有一些其他的指標(biāo)可以預(yù) 測這些類型的益處。在某種程度上，美國FDA準(zhǔn)許的快速審批程序肯定 了可能預(yù)測患者受益的替代品的存在。到2003年末，有16種藥物在這 種程序下得到批準(zhǔn)，在這些藥物中，有四種進(jìn)入了完全審批，即后續(xù)的 研究已經(jīng)顯示了直接的患者受益，正如替代指標(biāo)預(yù)測的那樣。確定藥物 對實(shí)體腫瘤療效的一個(gè)重要的指標(biāo)是通過測定對治療的反應(yīng)來評價(jià)腫瘤負(fù)荷(Therasse & a/. Journal of the National Cancer Institute 92(3):205國216 2000)。這類評價(jià)的臨床標(biāo)準(zhǔn)(RECIST criteria)已經(jīng)由實(shí)體腫瘤反應(yīng)評價(jià) 才示)偉工4乍纟且(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group), 一個(gè)國際癌癥專家組公布。正如依據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)的客觀反應(yīng)顯示的， 與適當(dāng)?shù)膶φ战M相比，對胂瘤負(fù)荷有確切作用的藥物易于最終對患者產(chǎn) 生直接的益處。在臨床前設(shè)置中，肺瘤負(fù)荷通常能更直接地被評價(jià)和記 錄。因?yàn)榕R床前研究可以轉(zhuǎn)化成臨床設(shè)置，所以在臨床前模型中延長存 活率的藥物有最大的預(yù)期臨床效用。與臨床治療產(chǎn)生的積極作用相似， 在臨床前設(shè)置中減輕腫瘤負(fù)荷的藥物也對疾病有明顯的直接影響。盡管 延長生存時(shí)間是癌癥藥物治療中追求的最主要的臨床結(jié)果，但仍有其他 有臨床作用的益處，顯然，P爭低腫瘤負(fù)荷(其與疾病進(jìn)展的延遲、生存時(shí) 間的延長或兩者都有關(guān)系)也能導(dǎo)致直接的益處，并具有臨床作用 (Eckhardt & a/. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds(發(fā)展的治療學(xué)耙化合物的 臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)的成功與失敗)；ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003， pages 209-219)。
本發(fā)明描述了 AR58A258.8的開發(fā)和應(yīng)用，其通過在細(xì)胞毒性作用分 析和人類癌癥的動(dòng)物模型中的作用得到鑒定。本發(fā)明描述了特異性結(jié)合 存在于靶分子上的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇的試劑，其作為棵抗體，在體 外對惡性腫瘤細(xì)胞也有細(xì)胞毒性作用，對正常細(xì)胞沒有毒性，其也可作 為棵抗體直接介導(dǎo)腫瘤生長的抑制作用。更進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用諸如此 類的抗癌抗體靶向表達(dá)同類抗原標(biāo)志物的腫瘤以實(shí)現(xiàn)腫瘤生長的抑制及 癌癥治療的其他陽性指標(biāo)。
總之，本發(fā)明講述了 AR58A258.8抗原作為治療試劑靶點(diǎn)的應(yīng)用，當(dāng) 給予AR58A258.8時(shí)，可以減輕哺乳動(dòng)物中表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù) 荷。本發(fā)明也講述了 CDMAB (AR58A258.8)及其衍生物、其抗原結(jié)合片 段和其細(xì)胞毒性作用誘導(dǎo)配體，靶向它們的抗原以減輕哺乳動(dòng)物中表達(dá) 該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷的用途。而且，本發(fā)明也講述了在癌細(xì)胞內(nèi)檢 測AR58A258.8抗原的應(yīng)用，其用于攜帶表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動(dòng)物的 診斷、治療的預(yù)測及預(yù)后。因此，本發(fā)明的目的是采用產(chǎn)生癌性疾病調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)方法， 該抗體針對來自特定個(gè)體的癌細(xì)胞，或一個(gè)或多個(gè)特定癌細(xì)胞系，該 CDMAB對癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用，而同時(shí)對非癌細(xì)胞相對無毒，該方 法是為了分離雜交瘤細(xì)胞系和該雜交瘤細(xì)胞系編碼的相應(yīng)的分離的單克 隆抗體及其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及癌性疾病調(diào)節(jié)抗體、配體及其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是制備癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細(xì)胞毒性作用由 抗體依賴的細(xì)胞毒性作用介導(dǎo)。
本發(fā)明另一個(gè)目的是制備癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細(xì)胞毒性作用由補(bǔ) 體依賴的細(xì)胞毒性作用介導(dǎo)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是制備癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其細(xì)胞毒性作用是 其催化細(xì)胞化學(xué)鍵水解的能力的作用。
本發(fā)明進(jìn)一步目的是制備癌性疾病調(diào)節(jié)抗體，其用于癌癥診斷、預(yù) 后和監(jiān)測的結(jié)合分析。
通過本發(fā)明下述的說明、舉例和一些實(shí)施方式的描述，本發(fā)明其他 的目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。
附圖簡^^兌明


圖1比較了雜交瘤上清液對MDA-MB-231、 OVCAR-3、 SW1116、 Lovo和CCD-27sk細(xì)胞系的細(xì)胞毒性作用百分比及結(jié)合水平。
圖2顯示AR58A258.8和抗-EGFR對照與癌細(xì)胞及正常細(xì)胞系的結(jié) 合。數(shù)據(jù)制成表格，以高于同種型對照的倍增來表示平均熒光強(qiáng)度。
圖3包括針對幾種癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞系的AR58A258.8和抗-EGFR 抗體的代表性FACS直方圖。
圖4顯示AR58A258.8在Lovo結(jié)腸癌模型中對腫瘤生長的影響。垂 直線表示給予抗體的階段。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖5顯示AR58A258.8在Lovo結(jié)腸癌才莫型中對體重的影響。數(shù)據(jù)點(diǎn) 代表平均值+A標(biāo)準(zhǔn)誤。發(fā)明的詳細(xì)描述
下面用于概述、描述、實(shí)施例和權(quán)利要求書中的字詞或短語通常都 有其指定的含義。
術(shù)語"抗體"使用其最寬泛的涵義，且特別包括，例如單克隆抗體(包
括激動(dòng)劑、拮抗劑和中和抗體，脫免疫的、鼠的、嵌合的或人源化的抗
體)、攜帶有多表位特異性的抗體組合物、單鏈抗體、抗體的免疫偶聯(lián)物 和抗體片段(見下文)。
本發(fā)明中使用的術(shù)語"單克隆抗體"指從基本同質(zhì)的抗體群中獲得 的一種抗體，即構(gòu)成該群抗體的單個(gè)抗體是相同的，除了可少量存在的 可能自然發(fā)生的變異。單克隆抗體高度特異性的針對單一抗原位點(diǎn)。而 且，與包含針對不同決定基(抗原決定簇)的不同抗體的多克隆抗體制劑相 比，每一種單克隆抗體針對抗原上的單一決定基。除了特異性之外，單 克隆抗體的優(yōu)勢還在于其合成可以不受其他抗體的污染。修飾語"單克 隆的"指從基本同質(zhì)的抗體群中獲得的抗體的特征，而不能解釋為需要 通過任何特定的方法來生產(chǎn)該抗體。例如，本發(fā)明中使用的單克隆抗體
可以通過由Kohler & a/.， Mm/", 256:495 (1975)首次描述的雜交瘤(鼠或 人)方法制備或由重組DNA方法制備(參見，例如，美國專利第4,816,567 號)。還可以使用在例如Clackson " a/.， A^ww, 352:624- 628 (1991)和 Marks e"/,丄Mo/.歷o/， 222:581-597 (1991)中描述過的技術(shù)，從噬菌體抗 體庫中分離"單克隆抗體"。
"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括其抗原結(jié)合區(qū)域或 可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括非全長的抗體、Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv 片段；雙功能抗體(diabodies);線性抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體，單 結(jié)構(gòu)域抗體分子，融合蛋白，重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性抗 體。
"完整"抗體指包括抗原結(jié)合可變區(qū)，以及輕鏈恒定區(qū)(C。和重鏈恒 定區(qū)ChI, Ch2和Ch3的抗體。恒定區(qū)可以是天然序列的恒定區(qū)(例如， 人天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列的變體。優(yōu)選地，該完整抗體有一個(gè) 或多個(gè)效應(yīng)器功能。
依據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，完整抗體可以分為不同的"種類"。有五種完整的抗體IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM，其中幾種可進(jìn)一 步分為"亞類"(同種型)，例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和IgA2。 與不同種類抗體對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別被稱為"S,e,7和M。不同種類的 免疫球蛋白的三維空間構(gòu)型和亞結(jié)構(gòu)是公知的。
抗體"效應(yīng)器功能"指那些由抗體Fc區(qū)引起的(天然序列的Fc區(qū)或 氨基酸序列變異的Fc區(qū))的生物活性。抗體效應(yīng)器功能的例子包括Clq 結(jié)合；補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用；Fc受體結(jié)合；抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的 細(xì)胞毒性作用(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體的下調(diào)(例如B細(xì)胞受 體；BCR)等。
"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用"和"ADCC"指一種細(xì)胞介 導(dǎo)的反應(yīng)，在該反應(yīng)中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性的細(xì)胞毒細(xì)胞(例如 自然殺傷(NK)細(xì)胞，噬中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗 體，并隨后導(dǎo)致靶細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只 表達(dá)Fc7Rin，而單核細(xì)胞表達(dá)Fc7RI，F(xiàn)cRi1和F(ryRIII。Ravetch和Kinet,
i ev. /附mmo/ 9:457-92 (1991 )第464頁的表3總結(jié)了造血細(xì)胞的 FcR表達(dá)。為了測定目標(biāo)分子的ADCC活性，可以進(jìn)行例如在美國專利 5,500,362或5,821,337描述的體外ADCC活性測定。用于這類分析的效 應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。選擇地或附 加地，可在體內(nèi)評^介目標(biāo)分子的ADCC活性，例如在諸如Clynes " a/. /WJS (TJSA) 95:652-656 (1998)中公開的動(dòng)物模型中。
"效應(yīng)器細(xì)胞"指表達(dá)一種或多種FcRs并執(zhí)行效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。 優(yōu)選地，這些細(xì)胞至少表達(dá)Fc^RIII,并執(zhí)行ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo) ADCC的人類白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷 (NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK 細(xì)胞。效應(yīng)器細(xì)胞可以從其天然來源中分離，例如從本文中描述的血液 或PBMC中分離。
術(shù)語"Fc受體"或"FcR"用于描述結(jié)合于抗體Fe區(qū)的受體。優(yōu)選的 FcR是天然序列的人類FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合于IgG抗體(Y 受體)的受體，并包括Fc7RI，F(xiàn)c7RII和Fc7Rin亞類的受體，其包括這些 受體的等位基因變體和選擇性的剪切形式。Fc^RII受體包括Fc7RIIA("激活性受體")和Fc^RIIB ("抑制性受體")，兩者的氨基酸序列相似， 區(qū)別主要在于其胞漿區(qū)。激活性受體FcryRIIA在其胞漿區(qū)含有免疫受體 酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受體Fc7RIIB在其胞漿區(qū)含有免疫受體 酪氨酸抑制基序(ITIM)。(參見Dagron， 及eu /mmw"o/. 15:203-234
(1997)中的綜述M)。
在 Ravetch和 Kinet， i ev. 7mmtmo/
9:457-92(1991); Capel W a/" /m/w頭ome^ods 4:25-34 (1994)和de Haas a/.,丄丄W. C"".126:330-41 (1995)中對FcR進(jìn)行了綜述。其他FcR， 包括將來要被確認(rèn)的FcR,都包括在本發(fā)明中的術(shù)語"FcR"中。該術(shù)語 也包括負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒體內(nèi)的新生受體，F(xiàn)cRn(Guyer"a/., /. 7mwMwo/. 1 17:587 (1976)和Kim C a/">/ 7mmi/wo/. 24:2429 (1994))。
"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性作用"或"CDC"指分子在補(bǔ)體存在下，裂 解靶細(xì)胞的能力。補(bǔ)體激活途徑通過補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)與交聯(lián)了 同類抗原的分子(比如，抗體)的結(jié)合啟動(dòng)。為了評價(jià)補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行 如在Gazzano-Santoro e, a/"丄/畫歸/. Me/Ao& 202:163 (1996)中描述的 CDC分析。
術(shù)語"可變的"指可變區(qū)某些部分的序列在抗體間高度不同，并用 于每一種特定抗體與其特定抗原的結(jié)合及其特異性。然而，變異并不是
均勻分布在抗體的可變區(qū)域內(nèi)。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)的三個(gè)所謂 的高度可變區(qū)的片段內(nèi)?？勺儏^(qū)內(nèi)更加高度保守的部分被稱為骨架區(qū) (FR)。每個(gè)天然的重鏈和輕鏈可變區(qū)包括由三個(gè)高度可變區(qū)連接的主要 采用jS-片層構(gòu)型的四個(gè)FRs，其形成環(huán)狀連接，且在某些情況下形成部 分〉片層結(jié)構(gòu)。每條鏈的高度可變區(qū)通過FRs以密切靠近的方式結(jié)合在一 起，并與另一條鏈的高度可變區(qū)一起，促進(jìn)抗體的抗原結(jié)合部位的形成(參 見Kabat & g/， 5^we"ces o/ 7VotoVw o/7mmw"o/ogicfl/ /"tems f^瘦夢《標(biāo) 蛋^的#/力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda， Md. pp 15-17; 48-53 (1991 ))。恒定區(qū)并不直接參與抗體與抗原 的結(jié)合，而是呈現(xiàn)各種效應(yīng)器功能，例如在抗體依賴性的細(xì)胞毒效應(yīng) (ADCC)中抗體的參與。
本發(fā)明中使用的術(shù)語"高度可變區(qū)"指抗體中負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高度可變區(qū)通常包括"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘 基(例如輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基24-34 (Ll )、 50-56 (L2)和89-97 (L3) 及重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基31-35 (Hl)、 50-65 (H2)和95-102 (H3); Kabat & a/， 5^Mewc&s o/o/7m腦wo/og/ca/ /"tems《義建夢《標(biāo)f ^的,/力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md.pp 15-17; 48-53 (1991))和/或"高變環(huán)"區(qū)的氨基酸殘基(例 如輕鏈可變區(qū)的殘基2632 (Ll)、 50-52 (L2)和91 -96 (L3)及重鏈可變區(qū)的 26-32 (Hl)、 53-55 (H2)和96-101 (H3); Chothia and Lesk Mo/,說o/. 196:901-917 (1987))。"骨架區(qū)"或"FR"殘基指除了本發(fā)明定義的高變 區(qū)殘基之外的那些可變區(qū)的殘基。木瓜蛋白酶水解抗體產(chǎn)生了兩個(gè)相同 的被稱為"Fab"片段的抗原結(jié)合片段和一個(gè)殘余的"Fc"片段，每個(gè)"Fab" 片段都有單一的抗原結(jié)合部位，"Fc"片段的名稱反映了其易結(jié)晶的能力。 胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab')2片段，其有兩個(gè)抗原結(jié)合部位，且仍能夠與抗 原交聯(lián)。
"Fv"是含有完整的抗原識別和抗原結(jié)合部位的最小抗體片段。該區(qū) 域由以緊密、非共價(jià)結(jié)合的一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)的二聚體構(gòu)成。 以這種每個(gè)可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)相互作用的構(gòu)型決定VH-VL 二聚體表面 的抗原結(jié)合部位。六個(gè)高變區(qū)域共同賦予了抗體的抗原結(jié)合特異性。然 而，即便單一的可變區(qū)(或只含有三個(gè)抗原特異性高變區(qū)的Fv的一半)仍 能夠識別和結(jié)合抗原，盡管比完整結(jié)合位點(diǎn)的親和性低。Fab片段也含 有輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。 Fab'片段不同于Fab片段之處 在于其重鏈CH1區(qū)的羧基末端多了幾個(gè)氨基酸殘基，包括來自抗體鉸 鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH在本發(fā)明中指代Fab'，其中恒定區(qū) 的半胱氨酸殘基至少攜帶一個(gè)游離的硫基。最初的F(ab')2抗體片段以 Fab'片段對產(chǎn)生，之間有鉸鏈的半胱氨酸。其他的抗體片段的化學(xué)偶聯(lián)也 是公知的。
來自任一脊推動(dòng)物的抗體的"輕鏈"基于其恒定區(qū)的M酸序列，都 可以歸于兩種截然不同的所謂kappa (k)和lambda (X)鏈中的 一種。
"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的Vh和Vl區(qū)，其中這些 區(qū)域存在于單一的多肽鏈上。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含VH和Vl區(qū)之間的多肽連接子，其使scFv形成適于抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述 參見Pltickthun in 7T e尸Aflrmaco/ogy o/Mo"oc/o"<2/ v4""fto&esf卓義發(fā)我沐 夯理釣,vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)。
術(shù)語"雙功能抗體(Diabodies)"指帶有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體 片段，該片段在同一多肽鏈上(VH-VJ含有與輕鏈可變區(qū)(vo結(jié)合的重鏈 可變區(qū)(Vh)。通過使用因過短而不能使同一條鏈上的兩個(gè)區(qū)域配對的連接 子，使這些區(qū)域被迫與另一條鏈上的互補(bǔ)區(qū)域配對，由此產(chǎn)生了兩個(gè)抗 原結(jié)合位點(diǎn)。例如在EP 404,097; WO 93/11161 ;和Hollinger " a/.,尸rac. A^/v4c^/. t/&4， 90:6444-6448 (1993)中對雙功能抗體作了更詳細(xì)的描 述。
"分離"抗體是指從其天然環(huán)境的組分中鑒別、分離和/或回收的抗 體。其天然環(huán)境下的污染成分是指干擾抗體診斷或治療作用的物質(zhì)，可 包括酶、激素和其它的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶解物。因?yàn)槿狈贵w的天然 環(huán)境中的至少一種組分，分離抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)部的原位抗體。但是， 通常分離抗體會經(jīng)過至少一步的純化步驟來制備。
"結(jié)合，，目的抗原的抗體是指對該抗原有充分親和力的抗體，以致 該抗體在耙定表達(dá)該抗原的細(xì)月包時(shí)，可以作為治療或i貪斷試劑。如果抗 體能結(jié)合抗原性部分，它通常會優(yōu)先結(jié)合其抗原性部分，而不是其它受 體，這不包括諸如非特異性的Fc接觸的偶然結(jié)合或與其他抗原共有的翻 譯后修飾成分結(jié)合，該抗體不會與其他蛋白有明顯的相互作用。檢測與 目的抗原結(jié)合的抗體的方法在本領(lǐng)域中是公知的，可包括但并不局限于 例如FACS、細(xì)胞ELISA和Western印跡等分析。
正如本發(fā)明中使用的，"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"、"細(xì)胞培養(yǎng)物"的表述可 以交替使用，所有這些用法都包括其子代。也可以理解為由于人為的或 非人為的突變，所有的子代在DNA組成上不可能完全相同。在原始轉(zhuǎn)化 細(xì)胞內(nèi)篩選的有相同功能或生物學(xué)活性的突變子代包括在內(nèi)。根據(jù)有意 使用的不同指代的上下文，指代是清楚的。
"治療，，既指治療性處理，也指預(yù)防性或防止性的措施，其目的就 是預(yù)防或減緩(減輕)目標(biāo)病理狀態(tài)或病癥。需要治療的個(gè)體包括那些已經(jīng)存在所述病癥的個(gè)體，還包括那些將發(fā)展為該病癥的或名欠對其病癥進(jìn)行 預(yù)防的個(gè)體。因此，本文中欲被治療的哺乳動(dòng)物可已經(jīng)被診斷為患有該 病癥或可傾向于或易感于該病癥。
術(shù)語"癌癥"和"癌性(的)"是指或描述哺乳動(dòng)物的生理狀態(tài)，其典 型特征是細(xì)胞生長或死亡不受調(diào)控。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴 瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性腫瘤。這些癌癥更多具體的例 子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如鱗狀上皮細(xì)胞癌)，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺 癌、肺腺癌和肺鱗癌在內(nèi)的肺癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，包括胃腸道癌在 內(nèi)的胃癌，胰腺癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝臟癌癥，膀胱 癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子 宮癌，唾液腺肺瘤，腎癌，前列腺癌，外陰胂瘤，曱狀腺癌，肝癌，肛 癌，陰莖癌，還有頭頸部癌。
"化療劑"是用于癌癥治療的化合物?；焺┑睦影ㄖT如噻 替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化劑；諸如白消安(busulfan)、英丙舒 凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯類；如苯佐替派 (benzodopa)、卡波醌、美妥替旅(meturedopa)、烏瑞替派(uredopa)的氮丙 啶類；包括六曱蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺、 三亞乙基硫代磷酰胺和三甲基奧羅蜜胺(trimethylolomelamine)在內(nèi)的乙 烯亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamine); 如瘤可寧 (chlorambucil),萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺、 氮芥(mechlorethamine)、鹽酸曱氧氮芥、美法侖(melphalan)、新氮芥 (novembichin)、苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫 司汀(uracilmustard)等氮芥類藥物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛 莫司汀、尼莫司丁、雷莫司汀等硝脲類(nitrosureas);如阿克拉霉素類、 放線菌素、安曲霉素、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、加里剎霉 素、洋紅霉素、碳霉素(carnomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、 柔紅霉素、地托咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、 依索比星、依達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄 欖霉素、灰霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈 黑霉素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星類抗生素；曱氨碟呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)類抗代謝類藥；如二曱葉酸、氨曱喋呤、 蝶羅呤、三曱曲沙等葉酸擬似物；如氟達(dá)拉濱、6-巰嘌呤、硫米嘌呤、 硫鳥嘌呤類噤呤類似物；如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、 阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU等嘧啶 類似物；如卡魯睪酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯酮 等男性激素類藥物；如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦等抗腎上腺類藥物； 如亞葉酸等葉酸補(bǔ)充物；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安 吖咬；bestrabucil;比生群；依達(dá)曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依 氟鳥氨酸；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá) 明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖啶；噴司他??；蛋氨氮芥； 吡柔比星；足葉草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃；鍺 螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2'，2"-三氯三乙胺；烏拉坦；長春 地辛；達(dá)卡巴溱；甘露莫司?。欢甯事洞?；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷； gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");環(huán)磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(TAXOL⑧: Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.)和多西他賽(TAXOTERE⑧， Aventis， Rhone國Poulenc Rorer, Antony, France)等紫杉烷類；苯丁酸氮芥； 吉西他濱；6-碌u鳥噪呤；巰嘌呤；曱氨蝶呤；如順鉑和卡鉑等鉑類似物； 長春堿；鉑；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌； 長春新堿；長春瑞濱；去曱長春堿；諾消靈(novantrone);替尼泊苷；柔 紅霉素；氨蝶呤鈉；希羅達(dá)；伊班膦酸鈉；CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑 RFS2000; 二氟甲基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；esperamicins;卡培他濱； 以及上述任一種藥物在藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。調(diào)節(jié)或抑制激 素對腫瘤作用的抗激素類藥物也包括在本定義內(nèi)，像抗雌激素藥物，包 括例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制劑4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔 芬、曲沃昔芬、雷諾昔芬(keoxifene)、 LY1 17018、奧那司酮和托瑞米芬(法 樂通)；以及抗雄激素物質(zhì)，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞 林和戈舍瑞林；以及上述任一種藥物在藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。 用于治療目的的"哺乳動(dòng)物"指任何一種可歸于哺乳類的動(dòng)物，包 括人類、小鼠、免疫缺陷鼠(SCID)或棵鼠或品系小鼠、家畜和農(nóng)場動(dòng)物 及動(dòng)物園內(nèi)的動(dòng)物、體育動(dòng)物或?qū)櫸?，比如綿羊、狗、馬、貓、母牛等。優(yōu)選地，本發(fā)明中的哺乳動(dòng)物指人類。
"寡核苷酸，，指短長度、單鏈或雙鏈多聚脫氧核苷酸，其通過已知
的方法(例如磷酸三酯、亞磷酸鹽、亞磷酰胺化學(xué))，利用例如發(fā)表于1988 年5月4日的EP 266,032中描述的固相技術(shù)，或利用Froehler " a/， M/c/. 爿c/A14:5399-5407， 1986描述的脫氧核苷H-磷酸鹽中間物化學(xué)合 成。然后將其用聚丙烯酰胺凝膠純化。
"嵌合"抗體指免疫球蛋白，其部分重鏈和/或輕鏈與來源于特定種 屬或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體的對應(yīng)序列相同或同源，同時(shí)鏈上 的其余序列與來源于另一種屬或?qū)儆诹硪环N類或亞類的抗體的對應(yīng)序列 相同或同源，此外還指這些抗體的片段，只要它們能夠表現(xiàn)出所需的生 物活性(美國專利4,816,567和Morrison & fl/,A^/. A^w/. Scz' L^4， 81 :6851 -6855 (1984》。
非人類(例如鼠科)抗體的"人源化，，形式指特殊的嵌合免疫球蛋白、 免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv， Fab, Fab'， F(ab)2或抗體的其他抗原結(jié)合 序列)，其包含來自非人類免疫球蛋白的最少序列。在絕大多數(shù)情況下， 人源化抗體是人的免疫球蛋白(受者抗體)，其中，來自受者抗體的互補(bǔ)決 定區(qū)(CDRs)的殘基^C諸如具有所需的特異性、親和力、能力的小鼠、大 鼠或兔等非人類抗體(供者抗體)的CDRs的殘基所替代。在一些情況下， 人類免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人類FR殘基所替代。 此外，人源化抗體可包含既不在受者抗體也不在供者抗體的CDR或FR 序列的殘基。產(chǎn)生的這些修飾可進(jìn)一步改善和優(yōu)化抗體的性能。通常， 人源化抗體包含至少一個(gè)，通常是兩個(gè)可變區(qū)的幾乎所有的部分，其中 所有或幾乎所有的CDR區(qū)對應(yīng)非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)，且所有或 幾乎所有的FR殘基是人類免疫球蛋白共有序列的FR殘基。最優(yōu)地，人 源化抗體也包含免疫球蛋白恒定區(qū)序列的至少一部分，通常是人類免疫 球蛋白的序列。
"去免疫化"抗體是對特定的物種沒有免疫原性或免疫原性較差的 免疫球蛋白。通過改造抗體的結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)去免疫化。可以使用任何本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的去免疫化技術(shù)。例如，在發(fā)表于2000年6月15日 的WO 00/34317中，描述了 一項(xiàng)使抗體去免疫原性的適當(dāng)?shù)募夹g(shù)。誘導(dǎo)"細(xì)胞凋亡，，的抗體是通過任一方式誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的抗
體，這些方式例如但不限于結(jié)合Annexin V(膜聯(lián)蛋白V)、 caspase (半 胱天冬酶)活性、DNA斷裂、細(xì)胞皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞破碎和/或膜 嚢泡(所謂的凋亡小體)的形成。
在本說明書中，雜交瘤細(xì)胞系及其產(chǎn)生的分離的單克隆抗體可選擇 用內(nèi)部分類號AR58A258.8或保藏號IDAC 290605-01來表示。
本發(fā)明中使用的"抗體-配體"包括至少對靶抗原的一個(gè)抗原決定簇 有結(jié)合特異性的部分，其可以是完整的抗體分子、抗體片段和至少有一
分子、Fab分子、Fab'.sub.2分子、雙特異性抗體、融合蛋白或任一基因 工程分子，其特異性識別和結(jié)合抗原的至少一個(gè)抗原決定簇，該抗原可
被IDAC 290605-01雜交瘤細(xì)胞系(IDAC290605-01抗原)產(chǎn)生的分離的單 克隆抗體結(jié)合。
本發(fā)明中使用的"癌性疾病調(diào)節(jié)抗體"(CDMAB)指能夠以有益于患 者的方式，例如通過減輕肺瘤負(fù)荷或延長腫瘤患者的生存期的方式，調(diào) 節(jié)癌性疾病過程的單克隆抗體和其抗體-配體。
本發(fā)明中使用的"抗原結(jié)合區(qū)"指識別靶抗原的分子部分。 本發(fā)明中使用的"竟?fàn)幮砸种?是指通過常規(guī)的抗體相互竟?fàn)幏治?(Belanger L.，Sylvestre C.和Dufour D. (1973)， Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竟?fàn)幒蛫A心法 的曱胎蛋白的酶聯(lián)免疫測定).Clinica Chimica Acta 48， 15),能夠識別和結(jié) 合由IDAC 290605-01雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體(IDAC 290605-01 抗體)針對的抗原決定表位。
本發(fā)明中使用的"靶抗原"指IDAC 290605-01抗原或其部分。 本發(fā)明中使用的"免疫偶聯(lián)劑，，指以化學(xué)或生物學(xué)方式連接到細(xì)胞 毒素、放射物質(zhì)、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療劑的諸如抗體的任一分子 或CDMAB。只要能夠與其靶標(biāo)結(jié)合，該抗體或CDMAB可以在其分子 的任一部位與細(xì)胞毒素、》文射物質(zhì)、抗腫瘤藥或治療劑連接。免疫偶聯(lián) 劑的例子包括抗體毒素化學(xué)偶聯(lián)劑和抗體-毒素融合蛋白。
本發(fā)明中使用的"融合蛋白"指任一嵌合蛋白，其抗原結(jié)合區(qū)與例如毒素、酶或蛋白藥物的生物活性分子連接。
為了更充分理解本文中描述的發(fā)明，進(jìn)行下述說明。
本發(fā)明提供CDMABs (即IDAC 290605-OICDMAB)，其特異性識別 和結(jié)合IDAC 290605-01抗原。
以保藏號290605-01保藏于ID AC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體 的CDMAB可以是任一形式，只要其具有竟?fàn)幮砸种艻DAC 290605-01雜 交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體與靶抗原的免疫特異性結(jié)合的抗原結(jié)合 區(qū)。這樣，具有與IDAC 290605-01抗體相同的結(jié)合特異性的任何重組蛋 白(例如融合蛋白，其中抗體與諸如淋巴因子或腫瘤生長抑制因子的另一 種蛋白結(jié)合)都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述CDMAB是IDAC 290605-01抗體。
在其他實(shí)施方式中，所述CDMAB是一個(gè)抗原結(jié)合片段，其可以是 具有IDAC 290605-01抗體的抗原結(jié)合區(qū)的Fv分子(例如單鏈Fv分子)、 Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、融合蛋白、雙特異性抗體、異種抗體 或任一重組分子。本發(fā)明中的CDMAB針對的抗原決定蔟是IDAC 290605-01單克隆抗體針對的抗原決定簇。
本發(fā)明中的CDMAB可以被修飾，即通過分子內(nèi)的氨基酸修飾，產(chǎn) 生出衍生分子。也可能是化學(xué)修飾。
衍生分子要保留多肽的功能特性，也就是說，具有這類細(xì)胞毒性作 用取代的分子仍能夠使該多肽與IDAC 290605-01抗原或其部分結(jié)合。
氨基酸取代包括但不限于在本領(lǐng)域中公知的"保守"M酸取代。
舉例來說，被稱為"保守氨基酸取代"的某些氨基酸取代能夠在蛋 白中頻繁出現(xiàn)，但并不改變該蛋白的構(gòu)象或功能，這是蛋白質(zhì)化學(xué)中已 建立的法則。
這些改變包括用異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和亮氨酸(L)的任一種取代任 何其他的疏水氨基酸；天門冬氨酸(D)取代谷氨酸(E),反之亦然；谷 氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N),反之亦然；以及絲氨酸(S)取代蘇氨酸 (T)，反之亦然。依據(jù)特定tt酸的環(huán)境和其在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的作用， 其他的取代也可被認(rèn)為是保守的。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可經(jīng) ?；Q，丙氨酸和纈氨酸(V)也是。相對疏水的蛋氨酸(M)可經(jīng)常與亮氨酸和異亮氨酸互換，有時(shí)與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)經(jīng)常互 換，其發(fā)生部位氨基酸的重要特征是其帶電特性，而這兩種氨基酸的不 同的pK并不重要。在特定環(huán)境中，仍有其他的一些變化可以被認(rèn)為是"保 守的"。
給定一種抗體，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以生產(chǎn)出竟?fàn)幮砸种频?CDMAB，例如竟?fàn)幮钥贵w，其可識別相同的抗原決定簇(Belanger L " a/. C""/cfl C7n'm/cflv4cto 48:15- 18 (1973))。 一種方法是用表達(dá)該抗體識別抗 原的免疫原產(chǎn)生免疫。該樣本可以包括但不限于組織、分離的蛋白或細(xì) 胞系。用諸如ELISA、 FACS或Western印跡等竟?fàn)幏治鰜砗Y選產(chǎn)生的雜 交瘤，該竟?fàn)幏治瞿荑b別抑制所檢測抗體結(jié)合的抗體。另一種方法是利 用噬菌體展示抗體庫，淘選識別所述抗原至少 一個(gè)抗原決定簇的抗體 (Rubinstein /丄& a/.爿憩/314:294-300 (2003))。在任一情況下，抗 體的篩選都是基于它們與靶抗原至少一個(gè)決定簇的結(jié)合能力竟?fàn)幊鲈?標(biāo)記抗體。因此，這些抗體與原始抗體一樣具有識別所述抗原的至少一 個(gè)抗原決定簇的特征。
實(shí)施例1
雜交瘤制備一雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R58A258.8
依據(jù)布達(dá)佩斯條約，雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R58A258.8于2005年6月29 日保藏于加拿大國際微生物保藏單位(IDAC)，位于加拿大馬尼托巴省 R3E 3R2溫尼伯市阿林頓街道1015的加拿大衛(wèi)生部微生物局，保藏號為 290605-01。依據(jù)37 CFR 1.808的規(guī)定，保藏者保證在專利授權(quán)時(shí)將不可 撤銷地取消對公眾獲取該保藏材料的所有限制。如果保藏中保藏樣本不 存活，應(yīng)替換保藏物。
為了制備產(chǎn)生AR58A258.8抗癌抗體的雜交瘤，在PBS中制備冷凍 的人前列腺腫瘤組織(Genomics Collaborative, Cambridge, MA)的單細(xì)胞 懸浮液。將IMMUNEASYTM (Qiagen, Venlo, Netherlands)佐劑輕輕混合后 備用。通過皮下注射含2百萬個(gè)細(xì)胞的50微升抗原-佐劑來免疫5到7 周齡的BALB/c小鼠。初次免疫后2到5周，用新鮮制備的含2百萬個(gè) 細(xì)胞的50微升抗原-佐劑腹腔注射加強(qiáng)免疫鼠。末次免疫后第3天，取出脾臟用于融合。將分離的脾細(xì)胞與NSO-l骨髓瘤細(xì)胞伴侶融合，制備雜 交瘤。檢測雜交瘤亞克隆融合的上清。
為了檢測雜交瘤分泌的抗體是IgG,還是IgM同種型，進(jìn)行ELISA 分析。將4。C包被緩沖液(0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH9.2-9.6)中的 濃度為2.4 /ig/ml的山羊抗小鼠的IgG + IgM (H+L)，按100pl/孔加入ELISA 板過夜。該ELISA板用洗滌緩沖液(PBS + 0.05% Tween)洗三次。按 孔加入封閉緩沖液(5%奶洗滌緩沖液)，室溫1小時(shí)，隨后用洗滌緩沖液 洗三次。按100pil/孔加入雜交瘤上清，將該板室溫孵育1小時(shí)。該板用洗 滌緩沖液洗三次，按100jnl/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣根過氧化 物酶偶聯(lián)物的1/100,000稀釋液(用含5%奶的PBS稀釋)。室溫孵育1小 時(shí)后，該板用洗滌緩沖液洗三次。按100 jtil/孔加入TMB溶液，室溫孵育 1-3分鐘。按50jLtl/孔加入2M H2S04，終止顏色反應(yīng)，用Perkin-Elmer HTS7000酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀板。如圖1所示，AR58A258.8雜交 瘤主要分泌IgG同種型抗體。
為了確定雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的亞類，使用小鼠單克隆抗體同種型 分析試劑盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit) (GE Healthcare, Baie d'Urf6, QC)進(jìn)行同種型分型(isotyping)實(shí)驗(yàn)。將含抗體的雜交瘤上清 (在按1:10用TBS-T稀釋的稀釋液中)加到帶有同種型條(isotyping strip) 的試管中，該同種型條攜帶特異性識別不同類型肽鏈的山羊抗體。攪動(dòng) 試管15分鐘。然后在攪動(dòng)下用TBS-T將該同種型條洗兩次，每次5分鐘。 將過氧化物酶標(biāo)記的、種屬特異性的抗小鼠抗體(在按1: 500用TBS-T 稀釋的稀釋液中)加入到試管中15分鐘，以4企測結(jié)合于該條上的山羊抗體 的單克隆抗體。在攪動(dòng)下用TBS-T將該條再洗滌兩次，每次5分鐘。然 后用過氧化物酶底物系統(tǒng)檢測結(jié)合于該條的過氧化物酶標(biāo)記的抗體。將 一片30mg的4-氯-l-萘酚溶于10ml的冷乙醇中，并將一滴過氧化氫溶液 (30%的體積比)稀釋于50ml的TBS中。該兩種液體在使用前直接混合， 取3ml加入到同種型條，攪動(dòng)15分鐘。然后棄除該底物溶液，在攪動(dòng)下 用5ml蒸餾水洗滌該條3次。從試管中取出該分型條，分析結(jié)果?？拱?抗體AR58A258.8為IgG2a， k同種型。
經(jīng)過一輪限制稀釋，在細(xì)胞ELISA測定系統(tǒng)中，檢測雜交瘤上清中與靶細(xì)胞結(jié)合的抗體。檢測了一種人乳腺癌細(xì)胞系、 一種人卵巢癌細(xì)胞
系、 一種人結(jié)腸癌細(xì)胞系和一種人正常皮膚細(xì)胞系分別是MDA-MB-231， OVCAR-3， Lovo和CCD-27sk。所有細(xì)胞系來自美國典型培養(yǎng)物保存中心 (ATCC; Manassas, VA)。板內(nèi)的細(xì)胞在使用前先固定。室溫下，該板用含 MgCl2和CaCl2的PBS洗三次。每孔加PBS稀釋的2%的多聚曱醛100 /xl， 室溫10分鐘，然后棄掉多聚曱醛。再用含MgCl2和CaCl2的PBS在室溫 下洗滌該板三次。每孔加100 pl 5。/。奶洗滌液(PBS + 0.05% Tween)進(jìn)行封 閉，室溫1小時(shí)。該板用洗滌液洗三次，按75/il/孔加入雜交瘤上清，室 溫孵育1小時(shí)。用洗滌緩沖液將該板洗三次，按100 ]Ld/孔加入辣根過氧 化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠的IgG或IgM的1/25,000稀釋液(用含5%奶的 PBS稀釋)。室溫孵育1小時(shí)后，該;〖反用洗滌緩沖液洗三次，每孔加入100 jd TMB底物，室溫孵育1-3分鐘。每孔加入50 jLd 2M碌u酸終止反應(yīng)， 用Perkin-ElmerHTS7000酶標(biāo)儀在450nm波長處讀板。如圖l列表所示， 結(jié)果表示為與內(nèi)部(in-house)的IgG同種型對照相比，高出背景的倍數(shù)， 事先已經(jīng)證明該對照不與所檢測的細(xì)胞系結(jié)合。AR58A258.8雜交瘤分泌 的抗體對乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和結(jié)腸癌細(xì)胞系Lovo表現(xiàn)出最強(qiáng) 的結(jié)合。對正常的皮膚細(xì)胞系CCD-27sk和卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3， AR58A258.8表現(xiàn)出低水平的結(jié)合。沒有檢測其與SW1116細(xì)胞系的結(jié)合 (ND)。
進(jìn)行抗體結(jié)合試驗(yàn)的同時(shí)，在MDA-MB-231 、 OVCAR-3 、 SW1116 、 Lovo和CCD-27sk這些細(xì)胞系上，檢測了雜交瘤上清的細(xì)胞毒性作用。 鈣黃綠素(calcein)AM(Eugene, OR)購自Molecular Probes (Eugene, ORV〉 司，并如下所述進(jìn)行分析。在分析前，將細(xì)胞根據(jù)預(yù)先確定的適當(dāng)密度 進(jìn)行鋪板。兩天后，將75pl來自雜交瘤微孔板的上清轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板 中，在5% C02孵箱中孵育5天。將陽性對照孔吸凈，加入100 /il疊氮 鈉(NaN3， .01%， Sigma, Oakville， ON)、放線菌酮(CHX, 0.5 /xM， Sigma， Oakville, ON)或抗匿EGFR抗體(c225, IgGl, k, 5 jttg/mL， Cedarlane, Homby， ON)。經(jīng)過5天的處理后，倒空反應(yīng)板的液體并吸干。通過多通道塑料擠 瓶，將含MgCl2和CaCl2的室溫DPBS(Dulbecco's磷酸鹽緩沖液)分到每 孔中，叩打三次，倒出液體并吸干。每孔加入50/xl用含MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的熒光染料釣黃綠素，在37°C含5% C02的孵箱內(nèi)孵育 30分鐘。該板置于Perkin-Elmer HTS7000熒光讀板儀內(nèi)讀數(shù)，數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel進(jìn)行分析。結(jié)果在圖1的表格中列出。AR58A258.8雜 交瘤上清對Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞系產(chǎn)生了 15%的特異性細(xì)胞毒性作用，其是 陽性對照放線菌酮的細(xì)胞毒性作用的26%，是陽性對照疊氮鈉的細(xì)胞毒 性作用的兩倍。AR58A258.8對SW1116細(xì)胞也產(chǎn)生了 8%的特異性細(xì)胞 毒性作用，其是陽性對照放線菌酮的細(xì)胞毒性作用的兩倍，是觀測到的 針對表皮生長因子受體的c225抗體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用的38%。圖1的 結(jié)果表明AR58A258.8的細(xì)胞毒效應(yīng)并不與其對這些癌細(xì)胞型的結(jié)合水 平直接相關(guān)。盡管AR58A258.8對Lovo和MDA-MB-231細(xì)胞有相似的 結(jié)合，但其細(xì)胞毒性作用只存在于Lovo細(xì)胞。如圖1所示，AR58A258.8 對CCD-27sk正常細(xì)胞系沒有產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。已知的非特異性的細(xì)胞 毒物質(zhì)放線菌酮和疊氮鈉產(chǎn)生了預(yù)期的細(xì)胞毒性作用?？笶GFR抗體c225 對SW1116細(xì)胞產(chǎn)生了預(yù)期的細(xì)胞毒性作用。
實(shí)施例2 體外結(jié)合
通過在CL-1000瓶(BD Biosciences, Oakville, ON)中培養(yǎng)所述雜交瘤 來制備AR58A258.8單克隆抗體，每星期進(jìn)行兩次收集和再接種。然后用 蛋白G瓊脂4唐4快流(Protein G Sepharose 4 Fast Flow) (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe， QC)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的抗體純化操作。利用人源化的、 去免疫原性的、嵌合的或鼠源化的單克隆抗體均屬于本發(fā)明的范圍。
用流式細(xì)胞儀(FACS)評價(jià)了 AR58A258.8與來自乳腺 (MDA國MB國231 )、結(jié)腸(DLD-l， Lovo和SW1U6)、卵巢(OVCAR-3)和前 列腺(PC-3)的癌細(xì)胞系，以及來自皮膚(CCD-27sk)和肺臟(Hs888丄u)的非 癌細(xì)胞系的結(jié)合。所有細(xì)胞系來自美國典型培養(yǎng)物保存中心(ATCC; Manassas, VA)。首先用DPBS(不含鈣離子和鎂離子)洗滌單層細(xì)胞，以制 備用于流式細(xì)胞術(shù)(FACS)的細(xì)胞。然后在37。C條件下，用細(xì)胞解離緩沖 液將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)板上分離出來。離心收集細(xì)胞，在4。C下，將細(xì)胞 重懸在含MgCl2、 CaCh和2%胎牛血清的DPBS (標(biāo)記培養(yǎng)液)中，記數(shù)，調(diào)整到合適的細(xì)胞密度，離心沉淀細(xì)胞，將其重懸在4。C的標(biāo)記液中， 加入20 pg/mL的測試抗體(AR58A258.8)或?qū)φ湛贵w(同種型對照，抗 -EGFR)，冰上放置30分鐘。在加AlexaFluor546偶聯(lián)的二抗前，細(xì)胞用 標(biāo)記液洗一次。然后加入溶于標(biāo)記培養(yǎng)液中的Alexa Fluor 546偶聯(lián)的二 抗，4°C置30分鐘。最后洗滌一次細(xì)胞，并將其重懸在固定液(含1.5% 多聚曱醛的標(biāo)記培養(yǎng)液)中。通過在FACSarrayTM上運(yùn)行樣本來評估流式 細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞獲取結(jié)果，F(xiàn)ACSarray 使用FACSarrayTM系統(tǒng)軟件 (BD Biosciences, Oakville, ON)。通過調(diào)整前向角散射(FSC)和側(cè)向角散 射(SSC)探測器上的電壓和振幅，設(shè)置細(xì)胞的FSC和SSC。運(yùn)行未標(biāo)記 的細(xì)胞來調(diào)整熒光(Alexa-546)通道的探測器，使這些細(xì)胞有一個(gè)統(tǒng)一的 約為l-5單位的中等熒光強(qiáng)度的波峰。對于每一個(gè)樣本，約需要獲取10， 000個(gè)門事件(標(biāo)記的固定細(xì)胞)，用于分析，結(jié)果見圖2。
圖2以高出同種型對照的倍增表示平均熒光強(qiáng)度。圖3匯集了 AR58A258.8抗體代表性的直方圖。AR58A258.8對結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD-1 (25.7倍)，Lovo (11.6倍)和SW116 (6.2倍)顯示出強(qiáng)結(jié)合。也4企測到了 AR58A258.8與乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(21.4倍)，前列腺癌細(xì)胞系 PC-3(15.8倍)和卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3(20.4倍)的結(jié)合。雖然 AR58A258.8能與正常的肺和皮膚細(xì)胞系結(jié)合，但結(jié)合程度低于觀測到的 與大多數(shù)癌細(xì)胞系的結(jié)合(Hs888丄u(9.6倍)和CCD-27sk (3.9倍))。這些 數(shù)據(jù)表明AR58A258.8可與不同的人類癌細(xì)胞系結(jié)合，且與癌細(xì)胞系的結(jié) 合遠(yuǎn)強(qiáng)于正常細(xì)胞系。
實(shí)施例3
在體Lovo細(xì)胞的腫瘤實(shí)驗(yàn)
實(shí)施例1和2表明AR58A258.8對Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞系有抗癌特性， 且可結(jié)合于這種細(xì)胞系。參見圖4和5，頸背皮下注射的100/xl生理鹽水 中的1百萬個(gè)人結(jié)腸癌細(xì)胞(Lovo)植入到4-6周的雌性SCID小鼠。這 些小鼠^皮隨機(jī)分成兩個(gè)治療組，每組5只。移植癌細(xì)胞后第一天，每組 小鼠腹腔給予的AR58A258.8測試抗體(20 mg/kg)或緩沖液對照， 所述液體由含2.7 mM KC1， 1 mM KH2P04， 137 mM NaCl和20 mMNa2HP04的稀釋液將儲存液稀后得到。隨后抗體組和對照組以相同的方 式每周給藥一次， 一共7周。大約每7天用測徑器測量腫瘤生長， 一直 測到第8周或個(gè)體動(dòng)物達(dá)到了加拿大動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(CCAC)規(guī)定的指標(biāo)。 在研究過程中， 一周記錄一次動(dòng)物的體重。研究結(jié)束時(shí)，依據(jù)CCAC的 指導(dǎo)方針，所有的動(dòng)物都采取安樂死。
在人結(jié)腸癌預(yù)防性在體模型中，AR58A258.8抑制腫瘤生長，并明顯 減輕腫瘤負(fù)荷。在種植后的第56天，也是最后一次給藥后第6天， AR58A258.8治療組腫瘤的平均體積比緩沖液對照治療組腫瘤體積小 44%(圖4)。最后一次測的平均腫瘤體積受到治療期結(jié)束前由于潰瘍損害 所致的小鼠缺失的影響。在第42天，當(dāng)所有小鼠仍然存活時(shí)，相比緩沖 液治療的對照小鼠，AR58A258.8使腫瘤體積降低60% (p=0.083)。
在整個(gè)研究中，沒有出現(xiàn)臨床毒性癥狀。如圖5所示的體重作為動(dòng) 物健康和發(fā)育停止的指標(biāo)。在組內(nèi)，整個(gè)研究期間對照組體重有不顯著 的9%的降低，而AR58A258.8治療組的體重顯示出10%的降低，從平均 21g到19g。在治療期結(jié)束時(shí)，各組間沒有顯著的體重差異( =0.671， t-檢 驗(yàn))?？傊珹R58A258.8在人類結(jié)腸癌異種移植模型中耐受性良好，并 降低了腫瘤的負(fù)荷。
此優(yōu)勢證據(jù)表明AR58A258.8通過癌細(xì)胞系上的抗原決定簇的連接 (ligation)介導(dǎo)了抗癌作用。進(jìn)一步表明，利用例如(但并不局限于)FACS、 細(xì)胞ELISA或IHC等技術(shù)，AR58A258.8抗體可以用于檢測表達(dá)與之特 異性結(jié)合的抗原決定簇的細(xì)胞和/或組織。
技術(shù)人員的水平。所有專利和公開出版物通過引用的方式并入本文，其 可1用程度如同每個(gè)出版物被特別單獨(dú)地指明以引用的方式并入本文。
應(yīng)該明白，盡管本發(fā)明以某種形式被說明，但這不是要將本發(fā)明限 定在本文所描述和顯示的特定形式或布局。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易 見的是，在不偏離本發(fā)明的范圍的前提下還可做出各種變化，且不應(yīng)當(dāng) 認(rèn)為本發(fā)明限于本說明書中顯示和描述的內(nèi)容。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容 易看出使本發(fā)明較好地適合實(shí)現(xiàn)所描述的目的并獲得最終結(jié)果和益處， 以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相關(guān)化合物、方法、流程和技術(shù)都是優(yōu)選實(shí)施方案中有代表性的，其目的 在于示例，并不是限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠想到包括 在本發(fā)明精神的范疇內(nèi)的變化和其它用途，并由所附權(quán)利要求書的范圍 所限定。盡管借助特定的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解所要 求保護(hù)的本發(fā)明并不僅僅局限于這些特定的實(shí)施方案。事實(shí)上，所描述 的實(shí)施本發(fā)明的方式的各種變化，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見 的，均在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.由雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體，該雜交瘤保藏于IDAC，保藏號為290605-01。
2. 由權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體產(chǎn)生的人源化抗體。
3. 由權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體產(chǎn)生的嵌合抗體。
4. 分離的雜交瘤細(xì)月包系，以保藏號290605-01保藏在IDAC。
5. 引發(fā)抗體誘導(dǎo)的選自人類腫瘤的組織樣本中癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作 用的方法，其包括提供所述人類腫瘤的組織樣本；提供由保藏于IDAC、保藏號為290605-01的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單 克隆抗體或其CDMAB，該CDMAB的特征在于具有竟?fàn)幮砸种扑龇?離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力；以及將所述的分離的單克隆抗體或其CDMAB與所述組織樣本接觸； 其中所述的分離的單克隆抗體或其CDMAB與所述組織樣本的結(jié)合 誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
6. 權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體的CDMAB。
7. 權(quán)利要求2所述的人源化抗體的CDMAB。
8. 權(quán)利要求3所述的嵌合抗體的CDMAB。
9. 權(quán)利要求1、 2、 3、 6、 7或8中的任一項(xiàng)所述的分離抗體或其 CDMAB,其與選自細(xì)胞毒部分、酶、放射活性化合物和造血細(xì)胞的成員 偶聯(lián)。
10. 確定選自人類腫瘤的組織樣本中癌細(xì)胞存在的結(jié)合分析，所述癌 細(xì)胞被AR58A258.8雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的分離的單克隆抗體特異性結(jié)合， 該雜交瘤細(xì)胞系在IDAC的保藏號為290605-01，所述分析包括提供所述人類胂瘤的組織樣本；提供至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB，其識別的一種或多 種抗原決定簇與AR58A258.8雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的分離的單克隆抗體識 別的一種或多種抗原決定簇相同，該雜交瘤細(xì)胞系在IDAC的保藏號為 290605-01;將所述的至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB與所述組織樣本 接觸；以及確定所述的至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB與所述組織樣 本的結(jié)合；由此指示出在所述組織樣本中所述癌細(xì)胞的存在。
11. 治療哺乳動(dòng)物中人類腫瘤的方法，其中所述人類腫瘤表達(dá)至少一 種能特異性與分離的單克隆抗體或其CDMAB相結(jié)合的抗原決定簇，該 分離的單克隆抗體由保藏在IDAC、保藏號為290605-01的克隆所編碼， 該CDMAB的特征是具有竟?fàn)幮砸种扑龇蛛x的單克隆抗體與其靶抗原 結(jié)合的能力，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物降低所述哺乳動(dòng)物的腫瘤 負(fù)荷的有效量的所述單克隆抗體或其CDMAB。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體與細(xì) 胞毒性部分偶聯(lián)。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同 位素。
14. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體或其 CDMAB活化補(bǔ)體。
15. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體或其 CDMAB介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
16. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體是人 源化的。
17. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體是嵌 合的。
18. 治療哺乳動(dòng)物中對抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用敏感的人類 腫瘤的方法，其中所述的人類肺瘤表達(dá)至少一種與分離的單克隆抗體或 其CDMAB特異結(jié)合的抗原決定簇，該抗體由保藏在IDAC、保藏號為 290605-01的克隆所編碼，該CDMAB的特征是具有竟?fàn)幮砸种扑龇蛛x 的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物 降低所述哺乳動(dòng)物的腫瘤負(fù)荷的有效量的所述單克隆抗體或其CDMAB。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體與細(xì) 胞毒性部分偶聯(lián)。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同 位素。
21. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體或其 CDMAB活化補(bǔ)體。
22. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體或其 CDMAB介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性作用。
23. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體是人源化的。
24.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的分離的單克隆抗體是嵌 合的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用新型篩選模式制備患者癌性疾病調(diào)節(jié)抗體的方法。該方法利用癌細(xì)胞細(xì)胞毒性作用作為指標(biāo)來分離抗癌抗體，使制備用于診斷和治療的抗癌抗體成為可能。該抗體可用于輔助腫瘤分期和診斷，還可用于治療原發(fā)性腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移。該抗癌抗體能夠與毒素、酶、放射性化合物和造血細(xì)胞偶聯(lián)。
文檔編號A61P35/00GK101292042SQ200680036732
公開日2008年10月22日 申請日期2006年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月2日
發(fā)明者利薩·M·切凱托, 大衛(wèi)·S·F·楊, 蘇姍·E·哈恩 申請人:阿里烏斯研究公司