專利名稱：：Pcv-2疫苗的制作方法PCV-2疫苗本發(fā)明涉及一種抗豬圓環(huán)病毒(PCV-2)的疫苗，以及制備這種疫苗的方法，用于保護(hù)仔豬免受PCV感染。PCV-2被認(rèn)為與在幼豬中觀察到的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)有關(guān)。這種疾病于1991年在加拿大首次遇到。臨床征象和病理于1997年公布(Clark等Proc.Am.Assoc.Swine.Pract，1997:499-501,Harding等，Proc.Am.Assoc.Swine.Pract,1997:503.)，而且包括進(jìn)行性衰竭，呼吸困難，呼吸急促和偶爾地黃疽以及機(jī)能性黃疽。Nayar等，Can.Vet.J.Volume38，1997年6月在豬中檢測到臨床癥狀為PMWS的豬圓環(huán)病毒，并作出結(jié)論P(yáng)CV可能與PMWS有關(guān)，然后已知的PCV公認(rèn)為是PK-15細(xì)胞的天然棲居者。后來的Later出版物(Hamel等，J.Virol.，72(6)，5262-5267，1998;Meehan等，J.gen.Virol.,79，2171-2179，1998)證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，而且提i義(Meehan等，上文)新的病原性PCV為PCV-2，而原始的PK-15細(xì)胞培養(yǎng)分離物(Tischer等，Nature295，64—66，1982)，應(yīng)該稱為PCV-1,PCV-1和PCV-2是較小的(17nm)二十面體的無包膜病毒，其含有環(huán)狀單鏈DNA基因組。PCV-2基因組的長度為大約1768bp。來源于世界上不同區(qū)域的PCV-2分離物似乎彼此密切相關(guān)，而且顯示95到99%的核普酸序列同一性(Fenaux等，J.Clin.Micorbiol.，38(7)，2494-2503，2000)。PCV的ORF-2編碼病毒的假定衣殼蛋白。PCV2的ORF2編碼一種233個(gè)氨基酸的蛋白。所有PCV-2分離物的ORF2都共有91-100%的核苷酸序列同一性和90-100%的推斷的氨基酸序列同一性。PCV-1與PCV-2的ORF2基因之間只存在65到67%的核苷酸同一性和63到68%的氨基酸序列同一性(Fenaux等，上文)。PDNS(豬皮炎和腎病綜合征)是豬農(nóng)場主的另一個(gè)主要問題，其似乎與PMWS差不多同時(shí)存在。PDNS的特征是紅/褐色環(huán)狀皮膚損害，伴有出血，通常在耳朵，側(cè)腹，小腿和大腿處。Chae.C(2005)Vet.J.169326-336提供了PCV-2相關(guān)綜合征和疾病的綜述。需要一種能保護(hù)小豬對抗PCV-2相關(guān)疾病如PMWS和PDNS的疫苗。然而，至今為止還沒有市場上可買到的對抗PCV-2相關(guān)疾病的疫苗。傳統(tǒng)地，人們將想到基于滅活的全PCV-2病毒的用于豬的常規(guī)疫苗。但是，在PCV-2的情況下，事情因PCV—2在細(xì)胞培養(yǎng)物中沒有復(fù)制到高滴度的事實(shí)而變得復(fù)雜。作為選擇，疫苗可以基于來源于PCV-2的重組抗原。PCV-2蛋白已經(jīng)在各種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。例如，Liu等(ProteinExpressionandPurification,21，115-120(2001)在大腸桿菌中表達(dá)了與MBPHis標(biāo)簽連接的由PCV-2的0RF-2編碼的完整蛋白的融合蛋白。Kim等(J.Vet.Sci，3(1)，19-23，2002)在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了PCV-2的0RFl和2。Blanchard等(Vaccine,21，4565-4575，2003)也在昆蟲細(xì)胞中在基于桿狀病毒的系統(tǒng)中表達(dá)了ORF1和0RF2。對已經(jīng)產(chǎn)生了PCV-2蛋白的昆蟲細(xì)胞進(jìn)行裂解，并配制成疫苗，用于接種無特異病原體(SPF)的仔豬。仔豬在第一次加強(qiáng)方案中接受一種蛋白，該方案中DM接種后進(jìn)行亞單位疫苗接種，或者在另一組小豬中，仔豬在兩次注射中接受0RF1或者0RF2蛋白。不過，所有的實(shí)驗(yàn)都用SPF豬進(jìn)行，SPF豬是無病原體的，因此沒有任何母系來源的對抗PCV一2抗體?？梢詮?周齡直到大約15周齡觀察到由PCV一2引起的PMWS和PDNS。似乎直到斷奶仔豬是相當(dāng)安全的，免受PCV-2相關(guān)疾病的危害，只有在斷奶以后，仔豬才有獲得臨床癥狀的機(jī)會(huì)。因此，為了保護(hù)疫苗接種的仔豬，仔豬理想的是將必須在先地防止斷奶，因?yàn)镻CV-2相關(guān)疾病什么時(shí)候出現(xiàn)是不可預(yù)見的。為了用兩次加強(qiáng)免疫的疫苗接種方案達(dá)到這個(gè)目的，仔豬需要在第一周齡已經(jīng)獲得它們的初始疫苗接種，這樣它們可以在大約斷奶的時(shí)侯接受加強(qiáng)疫苗接種，并剛好在斷奶以后獲得完全的保護(hù)以對抗PCV-2感染。仔豬可能具有母系來源的對抗PCV一2的抗體(MDA)。(實(shí)施例中提供了仔豬中MDA滴度的分布，仔豬用于本發(fā)明的疫苗的實(shí)驗(yàn)。)但是眾所周知母系來源抗體的存在將干擾疫苗接種。仔豬可能具有不同滴度的MDA。很高的被動(dòng)MDA滴度可以保護(hù)仔豬對抗PCV-2感染(Merial:"PCV-2Diseases:Fromresearchbacktothefieldstrain"，18thIPVS，HamburgGermany,June2004，page99-101)。然而當(dāng)仔豬已經(jīng)到達(dá)相關(guān)的齡期(也即，斷奶后)時(shí)，具有較低的MDA滴度的仔豬不會(huì)防止PCV-2感染。對于那些仔豬，其似乎是在田野中遇到的大多數(shù)，MDA滴度可能太低以致于不能提供保護(hù)以免受PCV-2感染，而該滴度仍然高足以干擾疫苗接種，例如，用常規(guī)滅活的PCV-2疫苗接種。尤其因?yàn)闇缁钜呙缈赡馨^少的抗原，由于該病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中不能繁殖到高滴度(或者復(fù)雜的和耗費(fèi)時(shí)間的濃縮步驟應(yīng)該引入到疫苗生產(chǎn)中)這一事實(shí)。尤其對于這組仔豬，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的疫苗提供了對抗PCV-2感染的充分保護(hù)。利用本發(fā)明，提供了可用于保護(hù)仔豬的方法中的疫苗，甚至是對抗PCV—2，對抗PCV—2感染，并因此對抗PCV—2相關(guān)疾病，最值得注意的是PMWS和PDNS的MDA陽性的仔豬。本發(fā)明提供了一種抗PCV-2的疫苗，其包含至少20微克豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的ORF-2蛋白/劑量。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含每劑量至少20微克(jag)PCV-2的ORF-2蛋白的疫苗能引起對抗PCV-2感染(并因此對抗PCV-2相關(guān)疾病如PMWS和PDNS)的保護(hù)性免疫應(yīng)答，甚至面對MDA時(shí)。疫苗優(yōu)選包含每劑量至少50jag,最優(yōu)選每劑量80jag。甚至可以制備本發(fā)明的抗原質(zhì)量高達(dá)每劑量275yg的疫苗，而且這種疫苗在注射部位仍然不引起局部反應(yīng)。當(dāng)然，可以將甚至更多微克的抗原置于本發(fā)明疫苗的疫苗劑量中，但是如果用該疫苗獲得的保護(hù)沒有隨著較高的劑量而改善，那么抗原載荷的增加只導(dǎo)致疫苗比必需的更昂貴。另外，增加的抗原劑量最終可導(dǎo)致注射部位不可接受的局部反應(yīng)，其應(yīng)該避免。本申請的實(shí)驗(yàn)部分提供了測定抗原質(zhì)量的方法。本發(fā)明的疫苗可包含重組ORF-2蛋白，其中所述重組蛋白優(yōu)選通過由桿狀病毒表達(dá)栽體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的方式產(chǎn)生，所述桿狀病毒表達(dá)載體包含在適合的啟動(dòng)子調(diào)控下的PCV-20RF-2基因序列。盡管本領(lǐng)域已知的其它適合的表達(dá)系統(tǒng)也可用于制備本發(fā)明的疫苗的方法中，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用巴庫洛表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)致產(chǎn)生高產(chǎn)量的病毒抗原，而且該抗原顯示良好的抗原性。使用巴庫洛表達(dá)系統(tǒng)因此消除了對復(fù)雜而且耗費(fèi)時(shí)間的步驟的需要，當(dāng)抗原不能以高濃度產(chǎn)生時(shí)，例如在病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物中，其可使抗原濃縮到適合的水平。最常用的巴庫洛表達(dá)載體是苜蓿銀紋夜蛾(h^^/a/7力aca/2'尸077/ca)，其常與SF-9，SF-21或者Highfive昆蟲細(xì)胞的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物一起使用。SF-9和SF-21是來自草地貪夜蛾(SpocTo/^era/Vi^/peiY/a)的卵巢細(xì)胞系，Highfive細(xì)胞來自于粉紋夜蛾(7V/c力o/7/i^/a//)的卵細(xì)胞。應(yīng)該將PCV-ORF-2基因置于適合的啟動(dòng)子的調(diào)控下。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中最常用的啟動(dòng)子是多角體蛋白基因的啟動(dòng)子和plO基因的啟動(dòng)子，意味著ORF-2PCV-2基因序列被插入到桿狀病毒基因組的多角體基因座或plO基因座中的插入位點(diǎn)。也可以使用本領(lǐng)域已知的其它適合的啟動(dòng)子，同源的或者異源的。D.R.O'Reilly,L.K.Miller和V.A.Luckow(1992，W.H.Freeman&Co,NewYork)的"巴庫洛表達(dá)栽體"中提供了對桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的所有方面的詳細(xì)描述。此外，桿狀病毒來源的表達(dá)載體和完全的表達(dá)系統(tǒng)可從許多不同的公司購買到。本發(fā)明的疫苗可進(jìn)一步包含適合的佐劑。許多佐劑系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，例如通常使用的水包油型佐劑系統(tǒng)。也可以使用任何適合的油，例如本領(lǐng)域已知的用于佐劑中的礦物油。油相還可包含不同油類，礦物或者非礦物的油類的適當(dāng)混合物。適當(dāng)?shù)淖魟┮部梢园S生素E，任選地與一種或多種油類混合。水包油型含佐劑的疫苗的水相將包含抗原物質(zhì)。適當(dāng)?shù)闹苿┩ǔ蠹s25—60%的油相(40一75%的水相)。適當(dāng)制劑的實(shí)例可包含30%的水相和70%的油相或者各50%。本發(fā)明的疫苗可通過本領(lǐng)域已知的任何適合的途徑給藥，如肌內(nèi)、經(jīng)皮或者皮下，其中肌內(nèi)給藥是優(yōu)選的。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備欲用于保護(hù)幼小仔豬對抗PCV-2感染的疫苗的方法，該仔豬是PCV-2MDA陽性的，其中所述的疫苗含有至少20jag/劑量的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的0RF-2蛋白。本發(fā)明的疫苗(通過某種方法制備的)可用于保護(hù)幼小仔豬對抗PCV-2感染的方法中。本發(fā)明的疫苗甚至可以用于保護(hù)幼小仔豬的方法中，該仔豬是對抗PCV-2，對抗PCV-2感染的母系來源的抗體(MDA)陽性的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的疫苗可以保護(hù)仔豬，甚至當(dāng)仔豬具有比較高的對抗PCV-2的MDA滴度時(shí)。在跨越歐洲的各個(gè)農(nóng)場的田野中遇到的幼小仔豬中MDA滴度的分布列于表1中，而由本發(fā)明的疫苗提供的保護(hù)列于表2中。已經(jīng)表明本發(fā)明的疫苗甚至可以為仔豬提供充分的對抗PCV-2感染的保護(hù)，該仔豬具有落入如實(shí)施例所限定的"第2簇"中的MDA滴度(表2)。落入該簇中的仔豬的MDA滴度為8到121og2，其是較高的MDA滴度。本發(fā)明的疫苗因此甚至可用于保護(hù)幼小仔豬的方法中，該仔豬對抗PCV-2的MDA滴度高達(dá)101og2，或甚至121og2(如用實(shí)施例中所示方法測量的)。從表1可以看出，在整個(gè)歐洲的各個(gè)農(nóng)場收集的大約55%的仔豬屬于此第2簇(當(dāng)然屬于第1簇的仔豬，其具有較低的MDA滴度而且其占群體的32%，也可被本發(fā)明的疫苗保護(hù))。因此可以得出結(jié)論，本發(fā)明的疫苗可為野外遇到的絕大多數(shù)仔豬提供保護(hù)，包括具有高M(jìn)DA滴度的那些仔豬。為了提供充分的保護(hù)，疫苗優(yōu)選以2次加強(qiáng)免疫的疫苗接種方式給藥，其中在第一到第四周齡給仔豬打第一針(初始疫苗接種)，優(yōu)選在斷奶之前，例如在第一周齡?？梢栽诖蠹s3周以后打第二針(加強(qiáng)疫苗接種)。這樣仔豬在剛斷奶以后就已經(jīng)獲得了完全的對抗PCV-2感染的保護(hù)，斷奶是仔豬最易受到PCV-2感染，因而最易患PMWS和PDNS的時(shí)候。實(shí)施例實(shí)施例1:(確定母系來源的)PCV-2特異性抗體滴度對抗PCV-2的抗體滴度可以用下面的方法進(jìn)行確定在96孔組織培養(yǎng)平板中形成單層PK15細(xì)胞，在80%鋪滿時(shí)，細(xì)胞用PCV一2的場分離物進(jìn)行感染，并在C02孵育箱中于37匸進(jìn)一步孵育2天。此階段以后，細(xì)胞在乙醇中固定，并于2-8C儲(chǔ)存直到使用。當(dāng)大約20%的細(xì)胞被感染時(shí)，將平板用于測試。為了確定給定血清的PCV-2特異性抗體的滴度，進(jìn)行系列稀釋，并在乙醇固定的細(xì)胞上孵育。37r孵育1小時(shí)以后，平板用自來水洗滌，通過與FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG—起孵育對結(jié)合的抗體進(jìn)行檢測。將給定血清的滴度表示為最高稀釋度的倒數(shù)，其中仍然可以觀察到PCV-2特異性抗體應(yīng)答.表1提供了預(yù)先斷奶的仔豬中對抗PCV-2的母系來源的抗體滴度的典型分布。從來自整個(gè)歐洲的各個(gè)國家的232頭仔豬中收集血清。表1在一組232頭幼小仔豬中母系來源的抗體滴度的分布<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表l中可以分為3簇第l簇；滴度小于8的仔豬，第2簇;滴度從8到12的仔豬和第3簇；滴度為13和更高的仔豬。在第3簇中，母系來源的抗體滴度較高，預(yù)期這些仔豬在臨界的齡期將被保護(hù)(Merial:"PCV-2Diseases:Fromresearchbacktothefieldstrain",18thIPVS，HamburgGermany,June2004，page99-101)。然而在第l簇中，母系來源的抗體滴度較低，大部分的這些仔豬可以被容易地接種。但是，在笫2簇中，抗體滴度是這樣的大小以致于常規(guī)的疫苗接種方法可能不能使這組的大多數(shù)免疫。因?yàn)槌^半數(shù)的仔豬似乎屬于這個(gè)簇，所以如果想從農(nóng)場消除PMWS，則能保護(hù)這個(gè)簇的仔豬將是極其重要的。本領(lǐng)域公知在面對母系來源的抗體滴度時(shí)疫苗接種可以借助于佐劑和/或高抗原含量。哪種佐劑或抗原含量將能突破針對給定病原體的母系來源的抗體滴度是未知的。因此，在描述的實(shí)驗(yàn)中，我們設(shè)法限定保護(hù)第2簇中的仔豬對抗PCV-2感染所需的抗原的最小量。實(shí)施例2構(gòu)建表達(dá)PCV-20RF-2的重組桿狀病毒使用沒有PCV的豬睪丸(ST)細(xì)胞，從待肥育豬的肺組織，其顯示PMWS的臨床和組織病理學(xué)的病征，分離PCV-2病毒。通過在沒有PCV的PK15細(xì)胞上的5次傳代繁殖病毒。從純化自感染的PK15細(xì)胞上清液的PCV-2病毒制品分離DNA。使用包含BamHl限制性位點(diǎn)的引物(正向引物:CGGGATCCGTTTTCAGCTATGACGTAT，反向引物CGGGATCCTTTATCACTTCGTAATGGTT)，基于公開序列，進(jìn)行PCR以擴(kuò)增ORF-2基因。得到的擴(kuò)增子包含完全的ORF-2基因加上側(cè)翼BamHl限制性位點(diǎn)。在凝膠電泳后，切割和純化擴(kuò)增子。純化的PCV-2ORF-2片段然后用BamHl消化，并連接到BamHl消化的pAcAS3上(Vlaket.al.(1990)Virology179312-320)。該質(zhì)粒包含位于插入位點(diǎn)上游的plO啟動(dòng)子，其允許在plO啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)外源基因。TOP10F'細(xì)菌(Invitrogen，Carlsbad,USA)用連接混合物轉(zhuǎn)化，并根據(jù)它們的序列選擇含有正確的構(gòu)建體的克隆。擴(kuò)大陽性克隆，使用測序再次重新測試轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)染之前，苜蓿銀紋夜蛾核多角體病病毒(AcNPV,描述于Martenset.al.(1995)J.Virol.Methods5215-19)用Bsu36I消化。該病毒中的Bsu36I位點(diǎn)是plO基因座中的單一限制性位點(diǎn)。草地貪夜蛾(Sf9)細(xì)胞然后使用CellFectine(LifeTechnologies,Gaithersburg，USA)用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和Bsu361消化的AcNPV桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后第3天收獲轉(zhuǎn)染的上清液，并對Sf9細(xì)胞進(jìn)行噬斑純化。擴(kuò)大噬斑，通過對分離的病毒DNA進(jìn)行測序，來選擇得到病毒的PCV-20RF-2基因，使用抗PCV-2兔和豬血清對Sf9細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光。制備重組桿狀病毒BacPCV-2-0RF-2的種子，稱為"Masterseed"。通過對分離DNA進(jìn)行測序和對Sf9細(xì)胞進(jìn)4亍免疫熒光，來測試Masterseed和Masterseed在Sf9細(xì)胞上的第5次傳代的PCV-20RF-2基因的穩(wěn)定插入。進(jìn)行滴定以測定病毒制品中感染性病毒的量。對Sf9細(xì)胞進(jìn)行滴定，并使用多克隆兔抗PCV-2免疫血清，通過觀察桿狀病毒特異性CPE和/或PCV-20RF-2特異性免疫熒光進(jìn)行讀數(shù)。證實(shí)產(chǎn)生了重組AcNPV桿狀病毒BacPCV-2-0RF-2的噬斑純化的Masterseed。通過測序和Masterseed以及來自Sf9細(xì)胞上的Masterseed的第5次傳代的免疫熒光判斷，該構(gòu)建體在p10啟動(dòng)子的調(diào)控下在Sf9細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá)PCV-0RF-2蛋白。實(shí)施例3PCV-2抗原的生產(chǎn)為了獲得最大量的表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)行中間試驗(yàn)以最佳化用于獲得重組PCV-20RF—2蛋白的條件。所有的實(shí)驗(yàn)都使用28C懸浮培養(yǎng)的草地貪夜蛾21(Sf21)細(xì)胞進(jìn)行。來自Masterseed的笫4次傳代水平的BacPCV-2-0RF-2病毒被用于感染。為了最佳化生產(chǎn)，感染時(shí)的細(xì)胞密度是1.4x106細(xì)胞/ml，感染復(fù)數(shù)(M0I)是0.01，而且感染之后繼續(xù)培養(yǎng)6天。得到的混合物稱為表達(dá)產(chǎn)物收獲物。在l年的期間內(nèi)，在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中在最佳化條件下進(jìn)行5次表達(dá)。由于抗原位于細(xì)胞中，所以對含有細(xì)胞和上清液的總收獲物進(jìn)行超聲處理，到至少90%的細(xì)胞被破裂的程度。此后分批的超聲波處理的收獲物中活的重組病毒在連續(xù)攪拌下，于pH7.5用33mM二氮丙啶(BEI)在37*0下滅活72小時(shí)。滅活以后，通過添加1.6倍摩爾過量的疏代石克酸鈉中和BEI。中和以后，通過600g低速離心10分鐘來除去細(xì)胞碎片和多角體。得到的上清液稱為滅活的病毒懸浮液。檢驗(yàn)收獲物的不育性以及完全滅活。通過在Sf9細(xì)胞上傳代滅活的病毒懸浮液2周來檢驗(yàn)完全滅活，并目測檢查桿狀病毒特異性CPE的缺乏。證實(shí)獲得了8.5logl。TCID5。/ml的桿狀病毒滴度，其用BEI處理以后完全滅活。實(shí)施例4PCV-2抗原量的測定低速離心之前和之后的滅活懸浮液樣本，和親本傳遞病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液樣本，根據(jù)Laemmli(Lae隱li，U.K.(1970).Nature227680-685)的方法進(jìn)行變性十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用4-12%梯度凝膠，其用考馬斯亮藍(lán)染色。當(dāng)進(jìn)行Western印跡時(shí)，把來自凝膠的蛋白質(zhì)電泳傳遞到尼龍膜上，用溶于PBS的脫脂牛奶封閉，并與抗PCV-2分離物的稀釋的多克隆豬血清反應(yīng)。作為對得到的滅活病毒懸浮液的抗原量測定，把1微升(jlil)這種懸浮液以類似的方式跑膠，而牛血清白蛋白的系列稀釋(Sigma,St.Louis，USA.cat.no.A-2153)在相同的凝膠上平行跑膠，作為參考，使用照相機(jī)捕獲成像和使用GeneTools進(jìn)行的計(jì)算機(jī)分析，通過比較BSA參考的密度與含有PCV_2的樣本的密度，對滅活病毒懸浮液中的ORF一2基因產(chǎn)物進(jìn)行定量(SynGene，Cambridge,UK.v.3.06.02),當(dāng)?shù)退匐x心之前和之后,通過在抗PrecisionPlusmarkers(Bio-Rad，Hercules,USA)的SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳分離，來比較滅活的收獲物時(shí)，該物質(zhì)在離心之前產(chǎn)生了表觀分子量(MW)為30和26.8kDa的2條幾乎相等密度的重要條帶，而離心以后該物質(zhì)只包含下面的條帶。當(dāng)親本轉(zhuǎn)移病毒與重組病毒并排地跑膠時(shí)，親本轉(zhuǎn)移病毒只包含兩條條帶的上面的條帶，這證明下面的條帶是PCV的0RF-2，上面的條帶是離心以后被除去的多角體蛋白。下面的26.8kDa條帶的身份通過Western印跡被進(jìn)一步證實(shí)，表明該條帶，而不是30kDa的條帶，與抗PCV—2病毒的多克隆豬血清反應(yīng)。在5個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中確定PCV-2ORF-2的表達(dá)水平，存每種情況中，表達(dá)量高于測試的檢測極限，具體地為每毫升滅活病毒懸浮液40到550微克(pg/ml)。實(shí)施例5PCV-2ORF-2的量對MDA陽性的幼小仔豬接受疫苗的影響配制不同的PCV-2ORF-2抗原含量的疫苗，用于接種具有各種水平的抗PCV-2的母系來源的抗體(MDA)的幼小仔豬。間隔3周提供兩次疫苗接種。第一次疫苗接種以后5-6周，檢測到抗該抗原的血清反應(yīng)。從這些數(shù)據(jù)，計(jì)算面對MDA時(shí)，抗原含量對疫苗接受的影響。制備各種抗原稀釋物，并與水包油的佐劑以1:1(v/v)混合，如本領(lǐng)域常見的。然后，在1到4周齡時(shí)，同窩仔被分成組，并用含有不同含量的PCV-2-ORF-2蛋白的疫苗進(jìn)行肌內(nèi)注射處理，或不進(jìn)行接種。3周以后重復(fù)疫苗接種。產(chǎn)生以下組114頭仔豬用1-14jagPCV-2ORF-2蛋白/劑量進(jìn)行接種(組1)，85頭仔豬用20和80pg/劑量進(jìn)行接種(組2)。在第一次疫苗接種取血，并于其后5一6周時(shí)取血。制備血清，并通過免疫熒光法檢測PCV-2抗體。為此，96孔組織培養(yǎng)板中的單層PK15細(xì)胞用PCV-2的區(qū)域分離物進(jìn)行感染。培養(yǎng)2天以后，當(dāng)大約20-30%的細(xì)胞被感染時(shí)，單層細(xì)胞固定于乙醇中，并2-8"C儲(chǔ)存直到使用。為了確定滴度，測試血清的系列稀釋物與細(xì)胞37"C孵育1小時(shí)，洗滌平板以后，通過用FITC-標(biāo)記的兔抗豬IgG(Nordic,Tilburg，TheNetherlands)37X:孵育1小時(shí)來檢測結(jié)合的抗體，滴度確定為最高稀釋的倒數(shù)，其中仍然可以觀察到PCV-2特異性熒光。對于所有的動(dòng)物，測定第一次與第二次出血之間抗體滴度的下降。如果這個(gè)階段抗體滴度沒有下降或增強(qiáng)了，認(rèn)為涉及的動(dòng)物已經(jīng)吸收了疫苗。而當(dāng)PCV-2特異性抗體滴度降低時(shí)，認(rèn)為疫苗接種沒有成功，而且疫苗沒有吸收。通過在疫苗接種時(shí)，使各種疫苗劑量的吸收與母系來源的抗體滴度相關(guān)，可以確定接種足夠量的仔豬所需的最低抗原質(zhì)量。該分析的結(jié)果列于表2中。表2.在各種MDA滴度和抗原濃縮物時(shí)疫苗吸收的百分比疫苗接種時(shí)組1:1-14)ag/劑量組2:20-80ng/劑量具有PCV-2特每類的仔豬每簇的疫苗每類的仔豬每簇的疫苗異性母系來數(shù)/疫苗吸收吸收百分?jǐn)?shù)數(shù)/疫苗吸收吸收百分?jǐn)?shù)源的抗體滴的仔豬數(shù)的仔豬數(shù)度(1og2)的仔豬的類別<43/390%1/1100%0/03/3615/135/572/23/3812/817%4/476%912/511/10106/013/101121/015/101226/07/41315/00%6/14%142/011/0150/04/0160/01/0>170/01/0總計(jì)114/3127%85/5160%保護(hù)的總數(shù)'114/4842%85/7386%*通過其中滴度小于13的已經(jīng)吸收疫苗的仔豬數(shù)加上已經(jīng)具有13或更高的滴度的仔豬數(shù)來提供保護(hù)的仔豬總數(shù)。在這個(gè)表格中，"疫苗吸收"指仔豬的疫苗接種導(dǎo)致加強(qiáng)疫苗接種1周后PCV—2特異性抗體滴度，等于或高于第一次疫苗接種時(shí)的PCV-2特異性滴度。在所有的這些情況中，證實(shí)疫苗引發(fā)了抗PCV-2的活性血清應(yīng)答，而且在這樣的情況下，可以認(rèn)為仔豬被保護(hù)以免受PCV-2感染。然而，在加強(qiáng)接種l周后滴度小于笫一次疫苗接種時(shí)的滴度的仔豬中，疫苗不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并觀察到母系來源的抗體的自然減少，其將及時(shí)使這些動(dòng)物易受PCV-2感染。從該表格證實(shí)，當(dāng)使用等于或小于14微克的疫苗劑量時(shí)，在第1簇中(MDA滴度<7)，90%的動(dòng)物由于疫苗接種而血清轉(zhuǎn)化，并因此可以認(rèn)為被保護(hù)。但是，在第2簇(MDA滴度>7和<13)中，只有接種劑量小于或等于14微克的17%的動(dòng)物血清轉(zhuǎn)化并被保護(hù)。在該組中，17只動(dòng)物的滴度為13或更大，并因此已經(jīng)被它們天然獲得的PCV-2特異性母系來源的抗體保護(hù)。因此，可以推斷，在該總共114頭仔豬的組中，只有48頭(42%)被保護(hù)；在第1和第2簇中，17頭已經(jīng)具有高母系來源的抗體滴度的仔豬加上31頭血清轉(zhuǎn)化的仔豬被保護(hù)。在用每劑量20微克或更多接種的組中，顯著更多的動(dòng)物被保護(hù)；在第l簇中所有的動(dòng)物和第2簇中76%的動(dòng)物因?yàn)镻CV—2血清轉(zhuǎn)化，并因此被保護(hù)，添加這個(gè)到MDA滴度為13或更多的仔豬中，發(fā)現(xiàn)該組中88%的仔豬被保護(hù)。因?yàn)楫?dāng)大約80%或更多的動(dòng)物被保護(hù)時(shí)，獲得了畜群保護(hù)，可以推斷針對PCV-2的疫苗的抗原質(zhì)量必須包含至少20pg抗原或更多抗原，以能有效地保護(hù)畜群抗PCV-2感染的后果。權(quán)利要求1.一種對抗PCV-2的疫苗，其包含至少20微克/劑量的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的ORF-2蛋白。2.權(quán)利要求1的疫苗，其包含至少50微克/劑量的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的0RF-2蛋白。3.權(quán)利要求1或2的疫苗，其中0RF-2蛋白是重組蛋白。4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其中0RF-2蛋白通過從桿狀病毒表達(dá)栽體表達(dá)的方式在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生，所述桿狀病毒表達(dá)載體包含在適合的啟動(dòng)子調(diào)控下的PCV-20RF-2基因序列。5.權(quán)利要求4的疫苗，其中啟動(dòng)子是plO啟動(dòng)子。6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，所述疫苗進(jìn)一步包含適合的佐劑。7.權(quán)利要求6的疫苗，其中佐劑是水包油乳液。8.權(quán)利要求6或7的疫苗，其中佐劑包括維生素E。9.制備用于保護(hù)仔豬對抗PCV-2感染的疫苗的方法，該仔豬是PCV-2MDA陽性的，，其中所述疫苗含有至少20微克/劑量的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的ORF-2蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及一種對抗豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的疫苗以及制備這種疫苗的方法，用于保護(hù)仔豬免受PCV-2感染。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含至少20微克/劑量的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的ORF-2蛋白的疫苗能引起抗PCV-2(并因此對抗PMWS)的保護(hù)性免疫應(yīng)答，甚至當(dāng)它們具有相對較高的對抗PCV-2的MDA滴度時(shí)。本發(fā)明的疫苗可包含重組ORF-2蛋白，其中所述重組蛋白優(yōu)選通過由桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的方式產(chǎn)生，所述桿狀病毒表達(dá)載體包含在適合的啟動(dòng)子調(diào)控下的PCV-2ORF-2基因序列。文檔編號A61P31/20GK101277717SQ200680036868公開日2008年10月1日申請日期2006年9月8日優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日發(fā)明者F·羅林克,P·范翁塞爾申請人:英特威國際有限公司