專利名稱：用于hla-a2陽性人群的來自磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)的癌癥排斥抗原肽以及含有該 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可有效用作肝細(xì)胞癌、惡性黑色素瘤(黑素瘤)等高表 達(dá)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)的癌癥的疫苗的新型肽，以及含有該 肽的肺瘤治療和預(yù)防的藥物。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞癌是在世界各國發(fā)生頻率很高的惡性疾病之一。隨 著乙型和丙型肝炎的世界性流行，亞洲或歐洲各國的肝細(xì)胞癌發(fā)生率 急劇升高，考慮到由肝炎病毒感染至發(fā)病的較長的潛伏期，可以預(yù)想 今后的五十年內(nèi)該傾向會持續(xù)升高。病狀發(fā)展的肝細(xì)胞癌預(yù)后不良， 迫切需要開發(fā)新的治療方案。
另一方面，隨著近年來分子生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)了 解到細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞可識別經(jīng)HLA分子呈遞 于癌細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞的表面、并在癌細(xì)胞中特異性高表達(dá)的蛋白 質(zhì)分解得到的肽，顯示破壞癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)。并且，對很多刺激攻 擊上述癌癥的免疫反應(yīng)的肺瘤抗原蛋白、以及來自該胂瘤抗原蛋白的 肽都進(jìn)行了鑒定，抗原特異性的腫瘤免疫療法的臨床應(yīng)用得到了進(jìn) 展。
HLA-I類分子在身體的所有有核細(xì)胞的表面表達(dá)，與肽結(jié)合，在 細(xì)胞表面表達(dá)，其中，所述肽是在細(xì)胞質(zhì)或核中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在細(xì)胞 內(nèi)分解得到的。在正常的細(xì)胞表面，來自正常的自身蛋白的肽與HLA-I 類分子結(jié)合，免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞并不對該分子進(jìn)行識別及破壞。另一 方面，在癌細(xì)胞形成癌的過程中大量表達(dá)在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)或 者很少表達(dá)的蛋白質(zhì)。上述在癌細(xì)胞中特異性高表達(dá)的蛋白質(zhì)在體內(nèi) 分解成的肽與HLA-I類分子結(jié)合，在癌細(xì)胞的表面表達(dá)，則殺傷T細(xì) 胞識別該分子，只破壞癌細(xì)胞。將上述癌癥特異性抗原或肽給予個體， 不會對正常細(xì)胞產(chǎn)生危害，即可破壞癌細(xì)胞并抑制癌的增殖。將其稱 為使用癌癥特異性抗原的癌癥免疫療法。另外，HLA-II類分子主要在抗原呈遞細(xì)胞的表面表達(dá)，其與肽結(jié)合，在細(xì)胞表面表達(dá)，其中所述 肽是抗原呈遞細(xì)胞從細(xì)胞外攝入、在細(xì)胞內(nèi)分解的來自癌癥特異性抗
原的肽。識別該分子的輔助性T細(xì)胞被激活，生成各種可激活其它免 疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞因子，由此誘導(dǎo)或增強對腫瘤的免疫反應(yīng)。
因此，如果能夠開發(fā)以在這些癌癥中特異性高表達(dá)的抗原為靶的 免疫療法，則可能獲得不對自身正常器官產(chǎn)生傷害、只有效排除癌癥 的治療方法。還有望進(jìn)行其它的治療，成為對任何晚期癌癥患者都可 使用的治療方法。另外，對于發(fā)生上述癌癥的風(fēng)險高的人群預(yù)先以疫 苗的形式給予癌癥特異性抗原和肽，可以預(yù)防癌癥的發(fā)生。
有報道稱，甲胎蛋白(AFP)是正常組織中只在胚胎期表達(dá)，但在 很多肝細(xì)胞癌中其表達(dá)重新被激活，即，是所謂的癌胚胎性蛋白質(zhì)。 另外，在小鼠和人的T細(xì)胞中存在識別通過MHC-I類分子呈遞的、 來自AFP的肽表位物質(zhì)。雖然胚胎在發(fā)育階段暴露于在血漿中高水平 存在的AFP中，但成熟T細(xì)胞不會獲得對AFP的完全免疫耐受，AFP 特異性T細(xì)胞可在末梢血中檢測出。即，癌胚胎性蛋白可成為免疫治 療的革&。
雖然肝細(xì)胞癌的治療方法有多種，但與其它癌癥相比，其預(yù)后差， 是難治性癌癥的一種。其原因在于在肝細(xì)胞癌的基礎(chǔ)上有肝硬化， 患者的肝功能惡化；以及即使治療了一處癌癥，也會由其它的器官生 成癌的特征，人們要求盡快開發(fā)新型的治療方案。如果可以開發(fā)以在 肝細(xì)胞癌中特異性高表達(dá)的抗原為靶的免疫療法，則可以得到不傷及 自身的正常器官、只有效地排除癌癥的治療方法。有望獲得對于任何 晚期癌癥患者、進(jìn)一步說對于肝功能過于惡化、無法進(jìn)行其它治療的 患者均可使用的治療方法。目前在日本，據(jù)稱肝細(xì)胞癌的后備人 群——丙型肝炎感染者有200萬人以上。對于這些感染者的肝細(xì)胞癌 的預(yù)防，可以采用上述免疫療法。
黑素瘤是被稱為惡性黑色素瘤的皮膚癌的 一種。皮膚癌有多種， 它是惡性度最高的皮膚癌，非常可怕。構(gòu)成皮膚的細(xì)胞中有生成黑素 的細(xì)胞，將其稱為色素細(xì)胞(黑素細(xì)胞)，該細(xì)胞癌化成黑素瘤。
日本黑素瘤發(fā)生人數(shù)是每10萬人口中約有1.5-2人左右，由此推 測每年有1500人-2000人左右發(fā)病。在歐美每10萬人口中有10多人 或以上發(fā)病，在澳大利亞每10萬人口中有20多人或以上的發(fā)病，可以說是世界第一的發(fā)病人數(shù)。僅此，歐美或澳大利亞的人們對黑素瘤 有很大的關(guān)心程度，非常注意黑素瘤的發(fā)生。另外，由于環(huán)境破壞導(dǎo) 致大氣中臭氧層減少，暴露在紫外線中的機會增加，因此，特別是在 白種人中發(fā)生頻率增加。在日本，黑素瘤的發(fā)生每年有增加傾向。最
近的調(diào)查中，日本的黑色素瘤年死亡人數(shù)增加至450人左右。黑素瘤 在任何年齡的人群中均發(fā)生，特別是40歲或以上發(fā)生增多，在60歲 -70歲左右最多。兒童的發(fā)生非常少，但是并不是不發(fā)生，最近在20-30 歲左右年輕人中的發(fā)生有增加傾向。在性別方面，并沒有某一方多的 傾向，在男女人群均有發(fā)生。在日本，容易發(fā)生黑素瘤的部位最多的 是在足底(腳底面)，約占三成左右。在足或手指尖的部分較多，這是 曰本人的特征。除此之外，與歐美人同樣，在身體、手、足、面部、 頭等任何皮膚上都有發(fā)生。
本發(fā)明人首先利用cDNA微陣列分析，對包括23,040種人類基因 的全基因組的基因表達(dá)分析，對20例原發(fā)性肝細(xì)胞癌和包括胚胎期 的各種正常器官中這些基因的表達(dá)概況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇 蛋白聚糖3 (GPC3)在胚胎期的肝臟、腎臟、肺中表達(dá)，在成人的正常 器官中除胎盤以外幾乎不表達(dá)，而在很多肝細(xì)胞癌中高表達(dá)。并且報 道，該GPC3為分泌蛋白，使用ELISA法，可以在40%的肝細(xì)胞癌癥 患者的血清中檢測出GPC3，這可用作肝細(xì)胞癌的新的腫瘤標(biāo)志 (Nakatsura, T.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 306， 16-25 (2003))。還才艮道了， GPC3也在黑素瘤患者的血清中檢測出，可用作 黑素瘤的腫瘤標(biāo)志(Nakatsura， T.等人，Clin. Cancer Res. 10:6612-6621 (2004》。
本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出在以HLA-A24陽性肝細(xì)胞癌或黑素瘤患者 為對象的免疫療法中有用的、與HLA-A24結(jié)合并呈遞在人殺傷T細(xì) 胞上的GPC3肽。并在使用表達(dá)小鼠Kd分子的BALB/c小鼠的動物實 驗中證明使用該肽有效，并已報道(國際申請編號PCT/JP2004/016374; 國際申請日2004年10月28日)，其中所述Kd分子與一種肽結(jié)合，該 肽與同HLA-A24結(jié)合的肽具有同樣的結(jié)構(gòu)。GPC3在正常器官中只在 胎盤和胚胎期的肝臟中表達(dá)，因此，通過小鼠實驗可確認(rèn)進(jìn)行以 GPC3為靶的免疫療法，可抑制肺瘤的增殖但不會發(fā)生自身免疫疾病 等有害狀況。本發(fā)明人還對于目前為止作為肺瘤排斥抗原的磷脂酰肌醇蛋白
聚糖-3 (GPC3)，對于主要通過HLA-A24向殺傷T細(xì)胞呈遞的肽進(jìn)行 了鑒定(國際申請編號PCT/JP03/10459;國際申請日2003年8月19 日)。但是，如果只是通過HLA-A24呈遞在殺傷T細(xì)胞上的肽，日本 人群中只有60%具有HLA-A24,因此無法作為肽疫苗給予對象。并且， 如果可以鑒定出日本人群的40。/。所具有的陽性HLA-A2呈遞于殺傷T 細(xì)胞的肽，將兩者合并則可以以日本人群的約85%作為對象，不僅如 此，HLA-A2在歐美白種人中陽性的頻率高，因此也可應(yīng)用于^f艮多歐 美白種人。因此，通過HLA-A2向殺傷T細(xì)胞呈遞的肽的鑒定成為重 要課題。特別是黑素瘤在歐美白種人中較多，是可有效應(yīng)用免疫療法 進(jìn)行治療的癌癥，并且肝細(xì)胞癌在歐美也急速增加，因此可以推定 使用HLA-A2結(jié)合性GPC3肽的免疫療法可以適應(yīng)很多患者。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的課題在于鑒定通過HLA-A2呈遞于殺傷T細(xì)胞 的肽，由此提供可以進(jìn)行以日本人中高表達(dá)GPC3的各種癌癥患者的 約40%為對象的免疫療法的方法。
本發(fā)明人首先根據(jù)cDNA微陣列分析鑒定了人肝細(xì)胞癌中特異性 過量表達(dá)的新型癌胚胎性蛋白一一磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)，又 在肝細(xì)胞癌患者血清中檢測出可溶性GPC3蛋白，明確了 GPC3可成 為肝細(xì)胞癌的新的腫瘤標(biāo)志。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)GPC3在小鼠黑素瘤細(xì)胞 林B16中表達(dá)，GPC3在黑素瘤中與肝細(xì)胞癌中同樣高表達(dá)，從而考 慮其是否可以作為有用的腫瘤標(biāo)志，在為了確認(rèn)該推測而進(jìn)行的實驗 中發(fā)現(xiàn)，GPC3在黑素瘤中是目前尚未被確認(rèn)的可早期診斷的腫瘤標(biāo) 志。本發(fā)明人通過在體外將人CD8陽性殺傷T細(xì)胞與通過脈沖導(dǎo)入 了具有HLA-A2結(jié)合基序的人GPC3肽的、來自人.末梢血單核細(xì)胞 的樹狀細(xì)胞共培養(yǎng)，進(jìn)行刺激，誘導(dǎo)GPC3肽特異性殺傷T細(xì)胞。判 斷各GPC3肽是否誘導(dǎo)了特異性的殺傷T細(xì)胞，是使用ELISPOT法， 對殺傷T細(xì)胞所生成的y-干擾素(IFN-力進(jìn)行檢測，該T細(xì)胞可識別通 過HLA-A2呈遞的肽并被激活，由此鑒定出可作為可應(yīng)用于免疫治療 的4美選耙抗原的新型的GPC3肽。
即，本發(fā)明提供以下內(nèi)容。(1) 以下的任意一種肽
(A) SEQ ID NO. 1 -3中任 一 項所示的氨基酸序列組成的肽；
(B) 在SEQ ID NO.1-3中任一項所示的氨基酸序列中有1個 或2個氨基酸置換或附加得到的氨基酸序列組成的、具有殺傷T 細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽。
(2) 癌癥免疫誘導(dǎo)劑，該癌癥免疫誘導(dǎo)劑含有至少一種或以上(l) 的肽。
(3) 胂瘤的治療和/或預(yù)防的藥物，該藥物含有至少一種或以上(l)的肽。
(4) 用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物，該藥物含有(l)的肽，其中該 抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)胂瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的能力高。
(5) 用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物，該藥物含有編碼以下任意一 項肽的基因，其中該抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)胂瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的能力高
(A) SEQ ID NO. 1 -3中任一項所示的氨基酸序列組成的肽；
(B) 在SEQ ID NO.1-3中任一項所示的氨基酸序列中有1個 或2個氨基酸置換或附加得到的氨基酸序列組成的、具有殺傷T 細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽。
(6) 用于誘導(dǎo)肺瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的藥物，該藥物含有(l)的肽。
(7) 抗體，該抗體是抗(l)的肽的抗體。
(8) 輔助性T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞或含有它們的免疫細(xì)胞集團(tuán)，上 述細(xì)胞或免疫細(xì)胞集團(tuán)是使用(l)的肽誘導(dǎo)的。
(9) 抗原呈遞細(xì)胞，該抗原呈遞細(xì)胞呈遞HLA分子和權(quán)利要求1 的肽的復(fù)合物。
(10) (9)的抗原呈遞細(xì)胞，該抗原呈遞細(xì)胞由(4)或(5)的藥物誘導(dǎo)。 實施發(fā)明的最佳方式
(1)本發(fā)明的肽、以及含有該肽的癌癥免疫誘導(dǎo)劑 本發(fā)明的肽可是下述任意一種肽
(A) SEQ ID NO 1 -3中任一 項所示的氨基酸序列組成的肽；
(B) 在SEQ ID NO.1-3中任一項所示的氨基酸序列中有1個或2 個氨基酸置換或附加的、具有殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽。
本說明書中所述的具有殺傷T細(xì)胞的誘導(dǎo)能力的肽是指具有刺激殺傷T細(xì)胞(殺傷T細(xì)胞/CTL)的殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的肽。
本發(fā)明的肽的獲得、制備方法并沒有特別限定，可以是化學(xué)合成 的蛋白質(zhì)，也可以是通過基因重組技術(shù)制備的重組蛋白。
獲得化學(xué)合成肽時，例如可按照Fmoc法(藥甲氧基羰基法)，tBoc 法(叔丁基氧基羰基法)等化學(xué)合成方法合成本發(fā)明的肽。還可利用各 種市售的肽合成儀器合成本發(fā)明的肽。
將本發(fā)明的肽以重組蛋白的形式生產(chǎn)時，可以獲得具有編碼該肽 的堿基序列的DNA或其突變體或同源體，將其導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系中 來制備本發(fā)明的肽。
表達(dá)載體只要是可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，或者可以整合到宿主 細(xì)胞的染色體中即可，還可使用在可使編碼肽的基因表達(dá)的位置上含 有啟動子的載體。具有編碼本發(fā)明的肽的基因的轉(zhuǎn)化體可通過將上述 表達(dá)載體導(dǎo)入宿主中制備。宿主可以是細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞、昆蟲 細(xì)胞中任意一項。表達(dá)載體向宿主的導(dǎo)入可根據(jù)各宿主的不同而通過 z^知的方法進(jìn)4亍。
本發(fā)明中，培養(yǎng)上述制備的轉(zhuǎn)化體，使本發(fā)明的肽在培養(yǎng)物中生 成并積累，由該培養(yǎng)物采集本發(fā)明的肽，由此可分離重組肽。
轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌等原核生物、酵母菌等真核生物時，培養(yǎng)這些 微生物的培養(yǎng)基只要是含有該微生物可同化的碳源、氮源、無機鹽類 等并可有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可，可以是天然培養(yǎng)基、合 成培養(yǎng)基的任何形式。培養(yǎng)條件也可以在培養(yǎng)該微生物時通常所采用 的條件下進(jìn)行。培養(yǎng)后，為了從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中分離純化本發(fā)明的 肽，可采用通常的肽的分離、純化方法。
含有在SEQ IDN0.1-3中任一項所示的氨基酸序列中有一個或兩 個氨基酸置換或附加得到的氨基酸序列的肽，可根據(jù)編碼SEQ ID NO.1-3中任一項的氨基酸序列的DNA序列的堿基序列信息，由本領(lǐng) 域技術(shù)人員適當(dāng)制備或獲得。即，編碼在SEQIDN0.1-3中任一項所 示的氨基酸序列中有一個或兩個氨基酸置換或附加得到的氨基酸序 列組成的、具有殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽的基因可通過化學(xué)合成、基 因工程學(xué)方法或誘變等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法制備。例如， 作為基因工程方法之一的位點專一誘變法是可向特定的位置上導(dǎo)入 特定突變的方法，其可應(yīng)用于本發(fā)明，可按照Molecular Cloning: Alaboratory Mannual， andEd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989 (以下簡稱為分子克隆第2版)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38， John Wiley & Sons (1987-1997)
(以下簡稱為分子生物學(xué)實驗室指南)等記載的方法進(jìn)行。
后述實施例所述，上述本發(fā)明的肽如可以誘導(dǎo)對癌癥的免疫。因
此，本發(fā)明可提供含有本發(fā)明的肽的癌癥免疫誘導(dǎo)劑。
本發(fā)明的癌癥免疫誘導(dǎo)劑可以體外或體內(nèi)、優(yōu)選體外使用，可誘
導(dǎo)輔助性T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞或含有它們的免疫細(xì)胞集團(tuán)，由此可以
獲得對癌癥的免疫。
(2)本發(fā)明的抗體
本發(fā)明涉及以上述本發(fā)明的肽的部分或全部作為表位(抗原)進(jìn)行 識別的抗體，以及使用該蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行體外刺激來誘導(dǎo)的殺傷T細(xì) 胞。通常，殺傷T細(xì)胞顯示比抗體更強的抗腫瘤活性。
本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，其制備可 按照常規(guī)方法進(jìn)行。
例如，多克隆抗體可以如下獲得以本發(fā)明的肽作為抗原來免疫 致敏哺乳動物或鳥類，從該哺乳動物或鳥類采集血液，由采集的血液 中分離、純化抗體。例如可以免疫小鼠、倉鼠、豚鼠、雞、大鼠、兔、 狗、山羊、綿羊、牛等哺乳動物或鳥類。免疫致敏的方法是本領(lǐng)域技 術(shù)人員所公知的，例如可以將抗原以例如7-30天的間隔給予2-3次。 給予量每次例如可以是約0.05-2 mg抗原左右。給予途徑?jīng)]有特別限 定，可以適當(dāng)選擇皮下給予、皮內(nèi)給予、腹膜腔內(nèi)給予、靜脈內(nèi)給予、 肌肉內(nèi)給予等?？乖扇芙庥谶m當(dāng)?shù)木彌_液、例如含有完全弗氏佐劑 或氫氧化鋁等通常使用的佐劑的適當(dāng)?shù)木彌_液中使用。
將免疫致敏的哺乳動物或鳥類詞養(yǎng)一段時間，如果抗體滴度升 高，則可以用例如100 iag-1000 |ag的抗原進(jìn)行追加免疫。最后給予1-2 個月后，從免疫致4文的哺乳動物或烏類中采集血液，將該血液例如通 過離心、使用硫酸銨或聚乙二醇的沉淀、凝膠過濾色譜、離子交換色 譜、親和層析等色譜等的常規(guī)方法進(jìn)行分離純化，由此可以獲得識別 本發(fā)明的肽的多克隆抗體作為多克隆抗血清。
單克隆抗體可以制備雜交瘤獲得。例如通過抗體生成細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞抹的細(xì)胞融合獲得雜交瘤。生成本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤 可通過以下細(xì)胞融合方法獲得。
抗體生成細(xì)胞使用由被免疫的動物得到的脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、 B淋巴細(xì)胞等?？乖褂帽景l(fā)明的肽。免疫動物可使用小鼠、大鼠等， 可按照常規(guī)方法將抗原給予這些動物。例如將完全弗氏佐劑、不完全 弗氏佐劑等佐劑與作為抗原的本發(fā)明的肽的混懸液或乳液多次給予 動物的靜脈、皮下、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)等，由此免疫動物。由被免疫的動 物獲得作為抗體生成細(xì)胞，例如脾細(xì)胞，可以按照公知的方法
(G.Kohler等人.，Nature, 256 495 (1975))將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，制備 雜交瘤。
細(xì)胞融合所使用的骨髓瘤細(xì)胞林例如有小鼠的P3X63Ag8、 P3U1 林、Sp2/0林等。進(jìn)行細(xì)胞融合時，可使用聚乙二醇、仙臺病毒等融 合促進(jìn)劑，細(xì)胞融合后進(jìn)行雜交瘤選擇時，可按照常規(guī)方法使用次黃 嘌呤 氨基蝶呤 胸腺嘧啶核苷(HAT)培養(yǎng)基。由細(xì)胞融合得到的雜 交瘤通過極限稀釋法進(jìn)行克隆。還可根據(jù)需要通過使用本發(fā)明的肽的 酶聯(lián)免疫測定法進(jìn)行篩選，由此可以獲得生產(chǎn)特異性識別本發(fā)明肽的 單克隆抗體的細(xì)胞林。
從上述得到的雜交瘤中制備目標(biāo)單克隆抗體時，可通過通常的細(xì) 胞培養(yǎng)法或腹水形成法培養(yǎng)該雜交瘤，由培養(yǎng)上清或腹水純化該單克 隆抗體。由培養(yǎng)上清或腹水純化單克隆抗體可按照常規(guī)方法進(jìn)行。例 如可將硫酸銨分組、凝膠過濾、離子交換色譜、親和層析等適當(dāng)組合 使用。
上述抗體的片段也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？贵w的片段有F(ab')2 片段、Fab，片段等。
(3)輔助性T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞或包含它們的免疫細(xì)胞集團(tuán)
性T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞或包含它們的免疫細(xì)胞集團(tuán)。、例如，使用本發(fā) 明的肽體外刺激末梢血淋巴細(xì)胞或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，則可誘導(dǎo)腫瘤 反應(yīng)性激活T細(xì)胞，該激活T細(xì)胞可有效用于過繼免疫細(xì)胞療法。通 過使本發(fā)明的肽在強力的抗原呈遞細(xì)胞——樹狀細(xì)胞中體內(nèi)或體外 表達(dá)，然后給予該抗原表達(dá)樹狀細(xì)胞，則可以進(jìn)行免疫誘導(dǎo)。優(yōu)選使用本發(fā)明的肽和免疫激活劑，通過體外刺激，誘導(dǎo)輔助性
T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞或包含它們的免疫細(xì)胞集團(tuán)。這里所使用的免疫 激活劑有細(xì)胞生長因子或細(xì)胞因子等。
通過將上述得到的輔助性T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞或含有它們的免疫 細(xì)胞集團(tuán)轉(zhuǎn)移到體內(nèi)，可以抑制腫瘤，預(yù)防和/或治療癌癥。
通過使用本發(fā)明的肽，如上所述，可以制備可抑制上述腫瘤的輔 助性T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞或包含它們的免疫細(xì)胞集團(tuán)。因此，本發(fā)明 可以提供含有本發(fā)明的肽的細(xì)胞培養(yǎng)液。通過使用該細(xì)胞培養(yǎng)液，可 以制備可抑制腫瘤的輔助性T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞、或包含它們的免疫 細(xì)胞集團(tuán)。并且根據(jù)本發(fā)明，還可以提供包含上述細(xì)胞培養(yǎng)液或細(xì)胞 培養(yǎng)容器的、用于制備輔助性T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞或包含它們的免疫 細(xì)胞集團(tuán)的細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒。
(4)本發(fā)明的腫瘤治療和/或預(yù)防用的藥物(癌癥疫苗)
本發(fā)明的肽可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞特異性殺傷T細(xì)胞，因此有望用作癌 癥的治療、預(yù)防劑。例如，通過將編碼本發(fā)明的肽的基因摻入適當(dāng)?shù)?載體中、用該重組DNA轉(zhuǎn)化的BCG菌的細(xì)菌，或者將編碼本發(fā)明的 肽的DNA摻入到基因組中得到的痘苗病毒可有效用作人癌癥的治療、 預(yù)防用的活疫苗。癌癥疫苗的給予量和給予方法與通常的接種或BCG 疫苗相同。
即，編碼本發(fā)明的肽的DNA(可以直接或者以摻入到表達(dá)載體中 的質(zhì)粒DNA的形式)、含有該DNA的重組病毒或重組細(xì)菌直接或以 分散于佐劑中的狀態(tài)作為癌癥疫苗給予包括人在內(nèi)的哺乳動物。本發(fā) 明的肽也同樣可以以分散于佐劑中的狀態(tài)、以癌癥疫苗的形式給予。
可在本發(fā)明中使用的佐劑有弗氏不完全佐劑、BCG、海藻糖二 霉菌酸酯(TDM)、脂多糖(LPS)、明礬佐劑、二氧化硅佐劑等，從抗體 的誘導(dǎo)能力等的關(guān)系考慮，優(yōu)選使用弗氏不完全佐劑(IFA)。
本說明書中所述的癌癥的種類沒有特別限定，具體例子有食道 癌、乳癌、曱狀腺癌、直腸癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤(黑素瘤)、惡 性淋巴瘤、骨肉瘤、成嗜鉻細(xì)胞瘤、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、腦瘤、 慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、腎癌、前列腺癌、肺癌、胃 癌、肝癌、膽嚢癌、睪丸癌、曱狀腺癌、膀胱癌或肉瘤等。本發(fā)明的肽作為T細(xì)胞的表位，可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞特異性殺傷T細(xì) 胞，因此可用作人癌癥的預(yù)防、治療藥。本發(fā)明的抗體只要是可以抑 制癌癥抗原GPC3的活性的即可用作人癌癥的預(yù)防、治療藥。實際的 使用方法可以是將本發(fā)明的肽或抗體直接或者與藥物可接受的載體 和/或稀釋劑一起，根據(jù)需要加入下述助劑，以注射劑的形式給予，還 可以通過噴霧等方法由粘膜經(jīng)過透皮吸收等給予。這里所述的載體例 如是人血清白蛋白，稀釋劑有PBS、蒸餾水等。
給予量是成人每人例如以每次O.Ol mg-100 mg的范圍給予本發(fā)明 的肽或抗體，但并不限于該范圍。制劑的形態(tài)沒有特別限定，可以是 凍干制劑，也可以加入糖等f武形劑制成顆粒。
添加到本發(fā)明的藥物中的用于提高腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的 助劑有胞壁酰二肽(MDP)，除此之外還有BCG菌等菌體成分、Nature, 344巻，873頁(1990)記載ISCOM、 J. Immunol. 148巻，1438頁(1992) 記載的皂苷系的QS-21、脂質(zhì)體、氫氧化鋁等。還可以使用蘑菇多糖、 裂裥菌素、溶血性鏈球菌制劑(匕°〉,一-一^)等免疫激活劑作為 助劑。還可以使用增強IL-2、 IL-4、 IL-12、 IL-1、 IL-6、 TNF等T細(xì) 胞的增殖、分化的細(xì)胞因子等，以及激活NKT細(xì)胞的a半乳糖神經(jīng) 酰胺或與Toll樣受體結(jié)合并激活自然免疫系統(tǒng)的CpG、脂多糖(LPS) 等作為助劑。
在試管內(nèi)加入該抗原肽，在由患者采集的細(xì)胞或共有一部分HLA 等位基因的其他人的(異體細(xì)胞)細(xì)胞中呈遞抗原，然后給予患者血管 內(nèi)，在患者體內(nèi)有效誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞。另外，向患者末梢血淋巴細(xì)胞 中加入該肽，在試管內(nèi)培養(yǎng)，在試管內(nèi)誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞后再返回到患 者血管內(nèi)。這樣細(xì)胞移植治療已經(jīng)作為癌癥治療方法得到實施，是本 領(lǐng)域所熟知的方法。
通過向體內(nèi)注入本發(fā)明的肽，誘導(dǎo)激活殺傷T細(xì)胞，結(jié)果有望獲 得抗腫瘤效果。另外在體外用本發(fā)明的肽刺激淋巴細(xì)胞，則可誘導(dǎo)激 活T細(xì)胞，將該激活的T細(xì)胞注入患部，可有效用于免疫細(xì)胞療法。
通過以下的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實施 例的限定。
實施例[實施例1]
(l)與HLA-A2顯示結(jié)合性的GPC3肽的選擇
通過BIMAS系統(tǒng)檢索人GPC3的氨基酸序列，選擇4種與HLA-A2 的推定結(jié)合力為20或以上的序列。
_肽的位置_多肽的M酸序列.. 結(jié)合親和性評分
GPC3 44- 52 RLQPGLKWV 879 GPC3 144-152 FVGEFFTDV 828 GPC3 155-163 YILGSDINV 162 _GPC3 169-177_ELFDSLFPV_1055
通過HLA-A2結(jié)合性GPC3肽誘導(dǎo)人殺傷T細(xì)胞
(1) 采血
由在熊本大學(xué)醫(yī)學(xué)部消化器外科和國立癌癥中心東病院進(jìn)行治 療的HLA-A2陽性肝細(xì)胞癌患者獲得知情同意書后，取得30ml血液 樣品，按照之前報道的方法(Nakatsura, T.等人,Eur. J. Immunol. 32, 826-836 (2002)),利用Ficoll-Conray密度梯度離心法分離末梢血單核 細(xì)胞。
(2) 由末梢血單核細(xì)胞分離CD8陽性細(xì)胞和CD14陽性細(xì)胞，以及誘 導(dǎo)殺傷T細(xì)胞。
采用之前報道的方法(Monji, M.等人，Clin. Cancer Res. 10:6047-6057 (2004))，由分離出的末梢血單核細(xì)胞誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞。 首先使用MACS,分離末梢血單核細(xì)胞中CD8陽性細(xì)胞和CD14陽性 細(xì)胞，在GM-CSF (100 ng/ml)和IL-4 (20 ng/ml)存在下將CD14陽性細(xì) 胞培養(yǎng)5天，分化誘導(dǎo)樹狀細(xì)胞，然后添加20 ng/ml TNF-a,使其成 熟，第7天再分別添加10 pMGPC3肽，與CD8陽性細(xì)胞共同培養(yǎng)。 通過該來自自身CD14陽性細(xì)胞的樹狀細(xì)胞每周反復(fù)進(jìn)行3-4次抗原 刺激，誘導(dǎo)肽特異性殺傷T細(xì)胞。誘導(dǎo)過程的培養(yǎng)基是每兩天更換一 半，以10 U/ml的濃度添加IL-2。
(3) 通過ELISPOT法研究GPC3特異性殺傷T細(xì)胞活性
通過ELISPOT法檢測在這些誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞中是否確實與GPC3特異性反應(yīng)生成IFN-y。 IFN-y的檢測是使用ELISPOT人IFN-y ELISPOT組(BD公司制備)進(jìn)行。殺傷T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)與刺激細(xì)胞 (靶)反應(yīng)并生成IFN-y，則可分別檢測出紅色的斑點。使用在HLA-A2 陽性中不表達(dá)GPC3的親林SK-Hep-l細(xì)胞和導(dǎo)入了表達(dá)GPC3的基因 的SK-Hep-l/GPC3細(xì)胞作為耙細(xì)胞。首先，將抗人IFN-y抗體鋪于 ELISPOT板(BD Bioscience制備)18小時。然后用10% FCS/RPMI封 閉2小時。將效應(yīng)細(xì)胞(100 nl/孔)和靶細(xì)胞(100 pl/孔)混合，在37。C下 培養(yǎng)22小時。以效應(yīng)/耙的比(E/T比)5:1進(jìn)行實驗。然后用滅菌水洗 滌板，與生物素化抗人IFN-y抗體反應(yīng)2小時，再與鏈霉抗生物素-HRP 反應(yīng)1小時，用底物溶液檢測IFN-y p日性斑點。斑點的計數(shù)是使用 MINERVA TECH公司的自動分析軟件進(jìn)行。結(jié)果，用GPC3 44-52、 144-152、 155-163肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞中可見GPC3特異性殺傷T細(xì) 胞活性差異，由GPC3 169-177肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞中則未見GPC3 特異性殺傷T細(xì)胞活性(

圖1和圖2)。對代表性的用GPC3 155-163肽 誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞的分析結(jié)果如圖1所示。 (4)通過細(xì)胞毒性實驗研究殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒性
所誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒性是以在HLA-A2陽性下不表達(dá) GPC3的親林的SK-Hep-l細(xì)胞和導(dǎo)入表達(dá)GPC3的基因的 SK-Hep-l/GPC3細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，通過細(xì)胞毒性實驗進(jìn)行研究。殺 傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒性通過Terra Scan VP的細(xì)胞毒性實-驗進(jìn)行評價。 首先，將靶細(xì)胞在37。C下用鈣黃綠素AM(Calcein AM)染色液進(jìn)行30 分鐘的焚光標(biāo)記。將這些細(xì)胞在Coster Half Area96孔板上與殺傷T 細(xì)胞共同培養(yǎng)，通過在不同時間檢測熒光顯色細(xì)胞來測定細(xì)胞毒的程 度。分析是采用MINERVA TECH公司的熒光法，通過細(xì)胞毒實驗計 算處理軟件CalCt-961進(jìn)行。E/T的比以20:1進(jìn)行實驗。結(jié)果，在用 GPC3 44-52、 144-152、 155-163肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞中可見GPC3特 異性細(xì)胞毒活性，由GPC3 169-177肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞中則未見 GPC3特異性細(xì)胞毒活性(圖2)。
產(chǎn)業(yè)實用性
以通過HLA-A24呈遞的GPC3肽作為靶的癌癥免疫療法在小鼠 的動物實驗中可以確認(rèn)其有效性，但是如果只是通過HLA-A24呈遞于殺傷T細(xì)胞的肽，則只能以日本人的60%作為疫苗給予對象。本發(fā) 明鑒定了通過HLA-A2呈遞在殺傷T細(xì)胞上的肽，將兩者相結(jié)合，則 可以以日本人的85%作為疫苗給予對象。如果在使用通過HLA-A2呈 遞在殺傷T細(xì)胞上的肽進(jìn)行的實驗醫(yī)療中顯示有效性，則對于歐美白 種人的臨床應(yīng)用的可能性也提高。鑒定通過歐美白種人中陽性頻率高 的HLA-A2呈遞在殺傷T細(xì)胞上的肽，由此不僅可應(yīng)用于日本人肝細(xì) 胞癌和黑素瘤患者的40%，還可應(yīng)用于很多的歐美白種人。
附圖簡述
圖1表示通過ELISPOT分析來檢測被激活的、特異性識別GPC3 肽的殺傷T細(xì)胞所生成的IFN-y的代表性結(jié)果。用負(fù)載有GPC3 155-163肽的來自CD14陽性單核細(xì)胞的樹狀細(xì)胞刺激肝細(xì)胞癌患者 末梢血中的CD8陽性細(xì)胞，誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞，以導(dǎo)入表達(dá)GPC3的基 因的SK-Hep-1 /GPC3細(xì)胞作為刺激細(xì)胞時(圖右)，與以在HLA-A2陽 性中不表達(dá)GPC3的親抹SK-Hep-l細(xì)胞作為刺激細(xì)胞時(圖左)相比， 上述殺傷T細(xì)胞的斑點數(shù)、斑點面積總和顯著增大。由此判定GPC3 155-163肽是可誘導(dǎo)GPC3特異性殺傷T細(xì)胞的表位肽。
圖2表示ELISPOT分析和細(xì)胞毒性試驗的結(jié)果。從來自HLA-A2 陽性肝細(xì)胞癌患者的末梢血中篩選CD8陽性T細(xì)胞，用負(fù)載有各 GPC3肽的來自單核細(xì)胞的樹狀細(xì)胞刺激，得到殺傷T細(xì)胞，通過 ELISPOT測定，對于該殺傷T細(xì)胞是否與GPC3表達(dá)細(xì)胞特異性反應(yīng) 生成IFN-y進(jìn)行研究，通過細(xì)胞毒性試驗研究是否特異性傷害GPC3 表達(dá)細(xì)胞。使用在HLA-A2陽性中不表達(dá)GPC3的親抹SK-Hep-l細(xì) 胞和導(dǎo)入表達(dá)GPC3的基因的SK-Hep-l/GPC3細(xì)胞作為靶細(xì)胞。結(jié)果， 用GPC3 44-52、 144-152、 155-163肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞GPC3特異性 識別SK-Hep-l/GPC3細(xì)胞，生成IFN-y，且顯示高的細(xì)胞毒性，而GPC3 169-177肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞中不顯示GPC3特異性殺傷T細(xì)胞活性。 以上表明，GPC3 44-52、 144-152、 155-163肽是可誘導(dǎo)GPC3特異性 殺傷T細(xì)胞的表位肽。
權(quán)利要求
1. 以下的任意一種肽(A) SEQ ID NO. 1 -3中任一 項所示的氨基酸序列組成的肽；(B) 在SEQ ID NO.1-3中任一項所示的氨基酸序列中有1個或2 個氨基酸置換或附加得到的氨基酸序列組成的、具有細(xì)胞毒性(殺傷)T 細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽。
2. 癌癥免疫誘導(dǎo)劑，該癌癥免疫誘導(dǎo)劑含有至少一種或以上權(quán) 利要求1的肽。
3. 肺瘤的治療和/或預(yù)防的藥物，該藥物含有至少一種或以上4又 利要求1的肽。
4. 用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物，該藥物含有權(quán)利要求1的肽， 其中該抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的能力高。
5. 用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物，該藥物含有編碼以下任意一 項肽的基因，其中抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的能力高(A) SEQ ID NO. 1 -3中任一項所示的氨基酸序列組成的肽；(B) 在SEQ ID NO.1-3中任一項所示的氨基酸序列中有1個或2 個氨基酸置換或附加得到的氨基酸序列組成的、具有殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo) 能力的肽。
6. 用于誘導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的藥物，該藥物含有權(quán)利要求1 的肽。
7. 抗體，該抗體是抗4又利要求1的肽的抗體。
8. 輔助性T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞或含有它們的免疫細(xì)胞集團(tuán)，上 述細(xì)胞或免疫細(xì)胞集團(tuán)是使用權(quán)利要求1的肽誘導(dǎo)的。
9. 抗原呈遞細(xì)胞，該抗原呈遞細(xì)胞呈遞HLA分子和權(quán)利要求1 的肽的復(fù)合物。
10. 權(quán)利要求9的抗原呈遞細(xì)胞，該抗原呈遞細(xì)胞由權(quán)利要求4 或5的藥物i秀導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明要解決的課題在于鑒定通過HLA-A2呈遞于殺傷T細(xì)胞的肽，由此提供可以進(jìn)行以日本人中高表達(dá)GPC3的各種癌癥患者的約40％為對象的免疫療法的方法。即，本發(fā)明提供以下內(nèi)容。(1)以下的任意一種肽(A)SEQ ID NO.1-3中任一項所示的氨基酸序列組成的肽；(B)在SEQ ID NO.1-3中任一項所示的氨基酸序列中有1個或2個氨基酸置換或附加得到的氨基酸序列組成的、具有殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽。
文檔編號A61P37/04GK101313063SQ200680037419
公開日2008年11月26日 申請日期2006年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月9日
發(fā)明者中面哲也, 小森宏之, 西村泰治 申請人:國立大學(xué)法人熊本大學(xué)