專利名稱：治療重癥肌無力的方法
治療重癥肌無力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合4傳蛋白C5的藥劑在治療與不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活有關(guān) 的疾病尤其是在治療重癥肌無力中的用途。
在本文中提及的以及在說明書結(jié)尾所列的所有文獻(xiàn)通過參考并入本文。
背景技術(shù)：
補(bǔ)體系統(tǒng)是身體抵抗外來入侵的天然防御機(jī)制的基本組成部分，并且 還參與炎癥過程。在血清中和細(xì)胞表面有超過30種蛋白質(zhì)參與補(bǔ)體系統(tǒng)功 能和調(diào)節(jié)。最近，已經(jīng)清楚，有 35種已知的補(bǔ)體系統(tǒng)成員可以與有益過 程和病理過程相關(guān)聯(lián)，補(bǔ)體系統(tǒng)本身與至少85種具有不同功能的生物學(xué)途 徑相互作用，比如血管發(fā)生、血小板活化、葡萄糖代謝和精子發(fā)生 (Mastellos， D., et al" Clin Immunol, 2005.115(3) p.225畫35 )。
外源抗原的存在激活補(bǔ)體系統(tǒng)。存在三種激活途徑(l)通過IgM和 IgG復(fù)合物或者通過糖類識(shí)別激活的經(jīng)典途徑；(2)通過非自身表面(缺 少特異性調(diào)節(jié)分子)和通過細(xì)菌內(nèi)毒素活化的旁路途徑；和(3 )通過結(jié)合 甘露聚糖的凝集素(manna-bindinglectin, MBL)與病原表面上的甘露糖 瓶基結(jié)合激活的凝集素途徑。這三種途徑包括并行級(jí)聯(lián)事件，其通過在細(xì) 胞表面上形成相似的C3和C5轉(zhuǎn)化酶導(dǎo)致產(chǎn)生補(bǔ)體激活，從而導(dǎo)致急性炎 癥介質(zhì)(C3a和C5a)釋放和膜攻擊復(fù)合物(MAC)的形成。在圖1中顯 示涉及經(jīng)典和旁路途徑的并行級(jí)聯(lián)。
在某些情形下補(bǔ)體可以被不適當(dāng)?shù)丶せ睿瑢?dǎo)致不希望的局部組織破壞。 已顯示出不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活在許多種疾病和病癥中起作用，所述疾病和病 癥包括急性m炎、阿耳茨海默氏病、變應(yīng)性腦脊髓炎、異體移植、哮喘、 成人型呼吸窘迫綜合征、燒傷、克羅恩氏病、腎小球腎炎、溶血性貧血、 血液透析、遺傳性血管性水肺、缺血再灌注損傷、多系統(tǒng)器官衰竭、多發(fā) 性硬化、重癥肌無力、缺血性卒中、心旨塞、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 感染性休克、系統(tǒng)性紅斑狼掩、中風(fēng)、血管滲漏綜合征、移植排斥和心肺 旁路術(shù)中不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。因此，多年以來不適當(dāng)激活的補(bǔ)體系統(tǒng)被作 為治療性介入的耙標(biāo)，耙向補(bǔ)體級(jí)^lll應(yīng)不同部分的多種補(bǔ)體抑制劑正在 開發(fā)用于治療用途。
在缺血性卒中和心肌梗塞中，身體識(shí)別腦或心臟中的死組織作為外源 物并且激活補(bǔ)體，從而引起進(jìn)一步的局部損傷。相似地，在心肺轉(zhuǎn)流術(shù)中， 身體將儀器中的塑料表面識(shí)別為外源物，激活補(bǔ)體，可導(dǎo)致血管損傷。在
自身免疫疾病中，身體可以餘溪地將自身識(shí)別為外源物，激活補(bǔ)體，并引 起局部組織損傷(例如，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)破壞和在重癥肌無力 中的肌無力)。
重癥肌無力是一種慢性自身免疫病，導(dǎo)致進(jìn)行性疲勞(progressive fatigue)、肌肉張力喪失和麻痹增加。這些癥狀是由補(bǔ)體的不適當(dāng)激活所引 起的，其導(dǎo)致針對(duì)煙堿型乙酰膽喊受體(AchR)的免疫應(yīng)答，其進(jìn)而導(dǎo)致 神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)減少。重癥肌無力的發(fā)生可與其它疾病相關(guān)聯(lián)，比如胸腺肺 瘤或曱狀腺毒癥，以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼疳。
目前對(duì)于重癥肌無力還不能治愈。起初通常應(yīng)用幫助改善神經(jīng)肌肉傳 導(dǎo)和增加肌肉力量的抗膽堿酯酶劑比如溴新斯的明(Prostigmin)和溴吡 斯的明(Mestinon)治療該病。然而，應(yīng)用抗膽喊酯酶劑的治療與由乙酰 膽堿累積引起的有害副作用相關(guān)，包括胃腸不適和支氣管和口腔分泌物增 加。此外，盡管抗膽喊酯酶劑通常提供癥狀上的改善，但是它們對(duì)該疾病 的病程沒有作用。對(duì)抗膽堿酯酶劑沒有反應(yīng)的患者還可以應(yīng)用長期免疫抑 制藥物比如皮質(zhì)類固醇潑尼;f^或者其它免疫抑制藥物比如環(huán)孢霉素、硫唑 噪呤和環(huán)磷酰胺進(jìn)行治療。不過，這些免疫抑制藥物與嚴(yán)重的副作用有關(guān)。
皮質(zhì)類固醇類的副作用包括體重增加、骨質(zhì)疏松、高血壓和青光眼。硫唑 噤呤和環(huán)孢霉素與肝功能障礙和惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。在一些情形中， 推薦胸腺切除術(shù)作為藥物的替代方案，但是其反應(yīng)是不可預(yù)測(cè)的并且在術(shù) 后所述疾病癥狀可持續(xù)數(shù)月或數(shù)年。
通過用純化的AChR或抗AChR抗體免疫可以在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)，這些模型可用于評(píng)價(jià)補(bǔ)體抑制劑對(duì)所述疾病逸艮的作用。補(bǔ)體 抑制劑可溶性補(bǔ)體受體1 (sCRl)已經(jīng)顯示出延遲體重減少和減輕EAMG 的臨床體征，it^明這種分子可用于治療重癥肌無力(Piddlesdenetal.， J. Neuroimmunol.， 1996， 71:173-177)。然而，為達(dá)到這些效果必需每天注射 sCRl,并且盡管sCRl降低了體重減輕，但是不能完全地阻止。因此sCRl 不能完全地阻止重癥肌無力的癥狀。
此夕卜，sCRl通過結(jié)合補(bǔ)體級(jí)^l^應(yīng)的早期產(chǎn)物C3b和C4b發(fā)揮作用
補(bǔ)體系統(tǒng)在防御病原體中發(fā)揮重要的和有價(jià)值的作用，該級(jí)^應(yīng)的許多 早期副產(chǎn)物在病原微生物的識(shí)別和調(diào)理作用中是重要的。因此，認(rèn)為在經(jīng) 典和旁路途徑的較早階段進(jìn)行治療性介入具有增加微生物感染易感性的
風(fēng)險(xiǎn)(Roos， A., et al" Immunobiology， 2002, 205(4-5): p. 595-609 )。 因此，非常需要用于改善目前可用的重癥肌無力治療的藥劑。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防重癥肌無力的方法，其包括向有 此需要的對(duì)象施用治療或預(yù)防有效量的結(jié)合補(bǔ)體C5的藥劑。
本發(fā)明還提供治療或預(yù)防有效量的結(jié)合補(bǔ)體C5的藥劑在制備用于治 療或預(yù)防重癥肌無力的藥物上的用途。
優(yōu)選地，所述藥劑具有阻止C5轉(zhuǎn)化酶將補(bǔ)體C5切割成補(bǔ)體C5a和補(bǔ)體 C5b-9的作用。
補(bǔ)體C5蛋白，在本文也被稱為C5，由C5轉(zhuǎn)化酶所切割，其本身是 從C3a形成的，C3a是所述旁路途徑的一種較早期產(chǎn)物(圖1 )。這種切割 產(chǎn)物包括過敏毒素C5a和裂解復(fù)合物C5b-9，其也被稱為膜攻擊復(fù)合物 (membrane attack complex, MAC), C5a是一種高活性肽，其涉及許多 病理炎癥過程，包括嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞趨化性、嗜中性粒細(xì)胞 活化、毛細(xì)血管通透性增加和嗜中性粒細(xì)胞凋亡抑制(Guo， R.F. and P.A. Ward, Annu Rev Immunol, 2005， 23: p. 821-52 )。
MAC與其它一些重要的病理過程相關(guān)，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (Neumann, E.， et al" Arthritis Rheum， 2002. 46(4): p. 934-45; Williams, A.S.， et al.， Arthritis Rheum， 2004， 50(9): p. 3035-44 )、增生性腎小球腎炎 (Quigg， R. J.， Curr Dir Autoimmun, 2004. 7: p. 165-80 )、特發(fā)性膜性腎病 (idiopathic membranous nephropathy) (Papagianni， A.A., et al" Nephrol Dial Transplant, 2002,17(1): p. 57-63 )、蛋白尿(proteinurea)(He， C， et al.， J Immunol, 2005.174(9): p. 5750-7 )、急性軸突損傷后的脫髓鞘病(Mead， R. J" et al., J Immunol, 2002. 168(1): p. 458-65)并且還引起異種移植后的急 性移植物排斥(Nakashima， S., et al" J Immunol, 2002.169(8): p. 4620-7 )。
C5a已成為補(bǔ)體相關(guān)病癥領(lǐng)域中特別關(guān)注的乾標(biāo)(Mizuno， M. and D.S.
Cole, Expert Opin Investig Drugs, 2005. 14(7): p. 807-21 )。盡管C5a具有 許多被充分認(rèn)可的病理學(xué)相關(guān)性，但是在人體中去除C5a的影響似乎比較 有限。已經(jīng)開發(fā)出結(jié)合并抑制C5a或C5a受體的單克隆抗體和小分子來治 療多種自身免疫疾病。然而，這些分子不能阻止MAC的釋放。
相對(duì)而言，根據(jù)本發(fā)明第一方面施用結(jié)合C5的藥劑既抑制C5a肽又 抑制MAC。意想不到的是，發(fā)現(xiàn)對(duì)C5a和MAC的抑制完全地減輕了與 重癥肌無力有關(guān)的臨床癥狀。此外，因?yàn)镃5是經(jīng)典和旁路補(bǔ)體途徑的晚 期產(chǎn)物，所以對(duì)C5的抑制更少可能與并發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而這種風(fēng)險(xiǎn) 在把向所述級(jí):iill應(yīng)的較早期產(chǎn)物時(shí)是存在的(Allegretti, M., et al., Curr Med Chem， 2005.12(2): p. 217-36 )。
通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)體外測(cè)定，例如在將^上的蛋白質(zhì)與已標(biāo)記 的C5 —起孵育之后進(jìn)行western印跡，可以確定藥劑結(jié)合C5的能力。優(yōu) 選地，根據(jù)本發(fā)明的藥劑以小于0.2mg/ml、優(yōu)選小于O.l mg/ml、優(yōu)選小 于0.05 mg/ml、優(yōu)選小于0.04 mg/ml、優(yōu)選小于0.03 mg/ml、優(yōu)選0.02 mg/ml、優(yōu)選小于lfig/ml、優(yōu)選小于100 ng/ml、優(yōu)選小于10 ng/ml、更優(yōu) 選小于1 ng/ml的IC5(>結(jié)合C5。
優(yōu)選地，結(jié)合C5的所述藥劑來自食血節(jié)肢動(dòng)物。術(shù)語"食血節(jié)肢動(dòng)物" 包括所有從適合的宿主攝血為食的節(jié)肢動(dòng)物，比如昆蟲、蜱(ticks )、虱 (lice)、跳蚤(fleas)和螨(mites )。優(yōu)選地，所述藥劑來自于蜱、優(yōu)選 源于毛白純緣蜱(Oi7i///r<w/wYW附仰to")。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，結(jié)合C5的所述藥劑是一種包含圖2中 M酸序列第19至168位氨基酸的蛋白質(zhì)，或者是此蛋白質(zhì)的功能等價(jià)物。 結(jié)合C5的所述藥劑可以是由圖2中M酸序列第19至168位M酸組成 的蛋白質(zhì)，或者是此蛋白質(zhì)的功能等價(jià)物。
根據(jù)一個(gè)替代實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明此實(shí)施方案使用的蛋白質(zhì)可以包 含圖2中Jl^酸序列第1至168位JL&酸或者由其組成，或者是其功能等 價(jià)物。在圖2中給出的蛋白質(zhì)序列的前18個(gè)M酸形成對(duì)于C5結(jié)合活性 并非必需的信號(hào)序列，因此，可以任選地將其舍棄，例如為了重組蛋白質(zhì) 生成的效率。
具有圖2中給出的M^列的蛋白質(zhì)，在本文中也被稱為EV576蛋白，分離自毛白鈍緣蜱的唾液腺。EV576是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipocalin)家 族的較遠(yuǎn)成員(outlying member),是第一個(gè)顯示出抑制補(bǔ)體激活的脂質(zhì) 運(yùn)載蛋白家族成員。通過結(jié)合C5并阻止C5轉(zhuǎn)化酶將其切割成補(bǔ)體C5a 和補(bǔ)體C5b-9，從而抑制C5a肽和MAC的作用，EV576蛋白抑制旁路、 經(jīng)典和凝集素補(bǔ)體途徑。本文使用的術(shù)語"EV576蛋白"是指有或沒有信號(hào) 序列的圖2中給出的序列。
在WO2004/106369中公開了 EV576蛋白和這種蛋白質(zhì)抑制補(bǔ)體激活 的能力，其中EV576蛋白被稱為"OmCI蛋白"?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)EV576蛋白在 治療和預(yù)防重癥肌無力中出乎意料的有效。本文給出的數(shù)據(jù)證明，單注射 EV576在至少7天中完全地減輕了 EAMG小鼠的體重降低和肌無力。因 此，EV576比sCRl在治療和預(yù)防EAMG中更加有效，如上所述，sCRl 在每天施用時(shí)只減輕重癥肌無力的臨床癥狀(Piddlesden et al， J. Neuroimmunol.， 1996， 71:173-177 )。 EV576在治療重癥肌無力中出乎意料
此外，本文給出的數(shù)據(jù)證明rEV576在早期輕度重癥肌無力和晚期嚴(yán)重重 癥肌無力危M型中是有效的。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，所述藥劑可以是編碼EV576蛋白或其功 能等價(jià)物的核酸分子。例如，可以應(yīng)用基因療法實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)或者離體由對(duì) 象的相關(guān)細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生EV576蛋白。另一方法是施用"棵DNA"，其中
治療基因被直接注入血流或肌肉組織中。
優(yōu)選地，這種核酸分子包含圖2中核苷,列的第53至507位a， 或者由其組成。該核普酸序列編碼沒有信號(hào)序列的圖2中的EV576蛋白,
列?；蛘?，所述核酸分子可以包含圖2中核酸序列的第1至507位堿基， 或者由其組成，所述核酸分子編碼具有信號(hào)序列的所述蛋白質(zhì)。
已證明EV576蛋白在大鼠、小鼠和人血清中結(jié)合C5并阻止C5轉(zhuǎn)化 酶對(duì)其的切割，其具有約0.02 mg/ml的IC別。優(yōu)選地，EV576蛋白的功能 等價(jià)物保留有結(jié)合C5的能力，其IC知值小于0.2 mg/ml、優(yōu)選小于0.1 mg/ml、優(yōu)選小于0.05 mg/ml、優(yōu)選小于0.02 mg/ml、優(yōu)選小于l照/ml、 優(yōu)選小于100ng/ml、優(yōu)選小于10ng/ml、更優(yōu)選小于lng/ml。
已發(fā)現(xiàn)在大鼠中1251標(biāo)記的EV576的血清p半衰期為30-38小時(shí)。優(yōu)
選地，EV576蛋白和其功能等價(jià)物保留大于20小時(shí)、優(yōu)選大于25小時(shí)、 優(yōu)選大于30小時(shí)、優(yōu)選大于40小時(shí)、優(yōu)選大于50小時(shí)、優(yōu)選大于100 小時(shí)的半衰期。
在一個(gè)方面，本文使用術(shù)語"功能等價(jià)物"描述EV576蛋白的同源物和 片段，其保留結(jié)合C5并阻止C5轉(zhuǎn)化酶將補(bǔ)體C5切割成補(bǔ)體C5a和補(bǔ)體 C5b-9的能力。術(shù)語"功能等價(jià)物"也表示在結(jié)構(gòu)上相似于EV576蛋白的或 者含有相似或相同三級(jí)結(jié)構(gòu)(尤其是在結(jié)合C5的EV576蛋白的一個(gè)或多 個(gè)活性位點(diǎn)環(huán)境中)的分子，比如合成的分子。
術(shù)語"同源物"意指包括由圖2明確所示的EV576序列的旁系同源物 (paralogues )和直系同源物(orthologues ),包括例如來自其它蜱物種的 EV576蛋白序列，所述蜱物種包括具尾扇頭蜱(i^i》/c印^/ns
)、嚢狀扇頭蜱(及.6"r糊)、
美洲鈍目艮蜱(j. fl附eWcawM柳)、卡)^鈍目艮蜱(」.cfl>wwe/iw )、希伯來鈍3艮 蜱(爿.Zre6n^w附)、微'J、牛蜱(w,Vtv/;/ws )、具環(huán)牛蜱(及 aw艦/"似s )、 消色牛碑(fifeco/om似s )、 網(wǎng)紋革碑(De環(huán)flce"tor rW/cw/fl似s )、安德遜氏革蜂(D. ""rferao",')、邊緣革蜂(D.附"rg/""似s )、 變異革蜂(".v""Vi緣's )、鐵角血蜂(1Tfl側(cè)fl/7/y;s"/i's /"e簡/s )、 /e"c/w7、 ^ ./|"/1""似、小亞璃8艮蜱(母fl/o挑附fl )、駱雜璃目艮
碑(母.</ wfi^/an7 )、邊緣璃目艮蜂(場(chǎng).附flrgi7ia似附maf^/"a似m )、蓖子硬 蜱(/xorfes )、全溝硬蜱(/ /;^sw/c"似s )、肩突硬蜱(/ )、
六角形硬蜱(/ Aexfl^m"s)、波斯銳緣蜱(爿^"s/^m'c"s)、鴿銳緣蜱(A f^/ ems)、 Oi7i/f/w^ww e/r"f/c"s1、 毛白純緣蜂(O.附o"6a似附做辦她)、 a附.；wfd"ws、和asflv/gwy/。術(shù)語"同源物"意思包括來自蚊物種，所述 蚊物種包括庫蚊屬(C"/狄)、按蚊屬(v4wfl^/^/^)和伊^>^ (j^/w)、尤 其是致乏庫墳(Cw/ex:拜Vt《"e/as"'a似s )、埃及伊墳(爿^/es fleg^P")和岡 比亞按:^(爿/io/7/^/m gtf附W"e);浪^刺flea )物種，比如多苗刻Cte"o"/ /^/iVfes )(貓?zhí)?；馬蠅(horseflies);白蛉(sandflies);墨蚊(blackflies); 舌錄(tsetse flies);虱(lice);螨(mites);蛭(leeches);和扁蟲(flatworms )、 的等價(jià)EV576蛋白序列。天然的EV576蛋白被認(rèn)為以約18 kDa的另外三 種形式存在于毛白鈍緣蜱(a w做&to)中，術(shù)語"同源物"意思還包括 EV576的這些替代形式。
鑒定圖2所示EV576序列的同源物的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而
易見的。例如，可以通it^公共和私人序列數(shù)據(jù)庫的同源搜索鑒定同源物。 便利地是，可以應(yīng)用公共數(shù)據(jù)庫，但是私人或商用數(shù)據(jù)庫同樣是可用的， 尤其是如果它們包含公用數(shù)據(jù)庫所沒有的數(shù)據(jù)時(shí)。 一級(jí)數(shù)據(jù)庫^1保存一級(jí) 核苷酸或tt酸序列數(shù)據(jù)的網(wǎng)站并且可以是公用或商用的。公用的一級(jí)數(shù) 據(jù)庫的實(shí)例包括GenBank數(shù)據(jù)庫(http:〃www,ncbi.nlm.nih.gov/)、 EMBL 數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ebi.acuk/)、 DDBJ數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/)、 SWISS-PROT 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http:〃expasy.hcuge,ch/) 、 PIR (http:y7pir.georgetown.edu/)、 TrEMBL (http:〃www.ebi.ac.uk/)、 TIGR數(shù)據(jù) 庫(見 http:y7www.tigr.org/tdb/index.html) 、 NRL-3D 數(shù)據(jù)庫 (http:Vwww.nbrfa.georgetown.edu) 、 the Protein Data Base (http:Vwww.rcsb.org/pdb)、 NRDB 數(shù)據(jù) 庫
(ftp:Vncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README) 、 OWL 數(shù)據(jù)庫 (http:〃www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/)以及二級(jí)數(shù)據(jù)庫 PROSITE (http:〃expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html) 、 PRINTS (http:y7iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html) 、 Profiles
(http:〃ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN—form.html) 、 Pfam
(http:〃www.sanger.ac.uk/software/pfam) 、 Identify
(http:〃dna.stanford.edu/identify/)和Blocks (http:〃www.blocks.fhcrc.org) 數(shù)據(jù)庫。商用數(shù)據(jù)庫或私人數(shù)據(jù)庫的實(shí)例包括PathoGenome (Genome Therapeutics Inc.)和PathoSeq (Incyte Pharmaceuticals Inc.)。
典型地，兩個(gè)多肽之間(優(yōu)選特定區(qū)域比如活性位點(diǎn))大于30%的一 致性被認(rèn)為標(biāo)志著功能上等價(jià)，因此標(biāo)志著兩個(gè)蛋白質(zhì)是同源物。優(yōu)選地， 同源蛋白質(zhì)具有與圖2中確定的EV576蛋白大于60%的序列一致性。更 優(yōu)選的同源物分別具有與圖2中給出的EV576蛋白大于70%、80%、90%、 95%、 98%或99%的一致性。本文所指的一致性百分率是使用2.1.3版 BLAST并采用NCBI(仇e National Center for股otechnology Information; http:〃www,ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默認(rèn)參數(shù)Blosum 62矩陣；缺口罰 分(gap open penalty) =11和缺口延伸罰分(gap extension penalty) =1
所確定的。
圖2中給出的EV576蛋白序列的同源物包括含有對(duì)野生型序列的M 酸替換、插入或缺失例如l個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、IO個(gè)或更 多個(gè)氨基酸的突變體，前M這樣的突變體保留結(jié)合C5的能力。因此突 變體包括含有不以有害形式影響所述蛋白質(zhì)功能或活性的保守氨基酸替
換的蛋白質(zhì)。該術(shù)語意思還包括天然生物學(xué)變體(例如，EV576蛋白來源 物種中的等位基因變體或地理變異)。還可以通過在所述蛋白質(zhì)序列中對(duì) 特定殘基進(jìn)行系統(tǒng)性或定向突變來設(shè)計(jì)具有改善的結(jié)合C5能力的突變體。
只要EV576蛋白和EV576蛋白同源物的片段保留結(jié)合C5的能力，這 樣的片段也包含在術(shù)語"功能等價(jià)物，，的范圍內(nèi)。片段可以包括例如源于 EV576蛋白序列的多肽，其小于150個(gè)氨基酸、小于125個(gè)氨基酸、小于 IOO個(gè)氨基酸、小于75個(gè)氨基酸、小于50個(gè)氨基酸、或甚至等于或小于 25個(gè)M酸，只要這些片段保留結(jié)合補(bǔ)體C5的能力。所包括的這些片段 不但可以是本文圖2中明確給出的毛白鈍緣蜱(a WM/^i似)EV576蛋白 的片段，還可以是如上所述的此蛋白質(zhì)同源物的片段。這樣的同源物的片 段通常與圖2的EV576蛋白序列片段具有大于60%的一致性，更優(yōu)選的 同源物的片段分別與圖2的EV576蛋白序列片段具有大于70%、 80%、 卯％、 95%、 98%或99%的一致性。當(dāng)然，可以通過對(duì)野生型序列的系統(tǒng) 性突變或者片段化接著通過適當(dāng)?shù)幕钚詼y(cè)定來合理設(shè)計(jì)有改善的片段。片 段對(duì)C5可以展示出與EV576相似的或更大的親和性，并且對(duì)C5可以具 有相等的或更大的ICSo。
根據(jù)本發(fā)明使用的功能等價(jià)物可以是融合蛋白質(zhì)，其可通過例如將編 碼EV576蛋白的多核普酸框內(nèi)(inframe)克隆至編碼異源蛋白質(zhì)序列的 序列中獲得。本文使用的術(shù)語"異源"意指不同于EV576蛋白或其功能等價(jià) 物的任何多肽?？砂诳扇苄匀诤系鞍踪|(zhì)N-或C-端的異源序列的實(shí)例 如下膜結(jié)合蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc區(qū))、多聚 化結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞外蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、信號(hào)序列、輸出序列、或允許通過親和 色譜純化的序列。許多這些異源序列可在表達(dá)質(zhì)粒中商品化供應(yīng)，因?yàn)檫@ 些序列通常包含在融合蛋白質(zhì)中以提供其它特性而又不明顯損害它們?nèi)?合的蛋白質(zhì)的特定生物活性(Terpe K， Appl Microbiol Biotechnol， 60:523-33， 2003 )。這些其它特性的實(shí)例有在體液中持續(xù)更長的半衰期、細(xì) 胞外定位、或者允許依靠標(biāo)簽(tag)(比如組氨酸或HA標(biāo)簽)進(jìn)行較容 易的純化步驟。
可以通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)，以重組形式制備EV576蛋白和其功能等 價(jià)物。這樣的表達(dá)方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的，并且 Sambrook et al (2000)和Fernandez & Hoeffler (1998)進(jìn)行了詳細(xì)的描 述。EV576蛋白和其功能等價(jià)物的重組形式優(yōu)選是iMt基化的。
還可以使用蛋白質(zhì)化學(xué)的常規(guī)技術(shù)制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)和片段。例如， 可以通過化學(xué)合成制M白質(zhì)片段。生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域中是
標(biāo)準(zhǔn)的，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在Sambrook et al. (2000) 或Ausubel et al. (1991)中可以找到大多數(shù)常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)重 組DNA纟支術(shù)和免疫纟支術(shù)。
按本發(fā)明的方法或用逸拖用結(jié)合C5的藥劑的對(duì)象優(yōu)選是哺乳動(dòng)物， 優(yōu)逸人。施用結(jié)合C5的藥劑的對(duì)象還可以患有與重癥肌無力相關(guān)的其它 疾病比如胸腺肺瘤、甲狀腺毒癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼疾。
以治療或預(yù)防有效量施用所述藥劑。術(shù)語"治療有效量"意指治療或改 善目標(biāo)疾病所需的藥劑的量。本文4吏用的術(shù)語"預(yù)防有效量"意指預(yù)防目標(biāo) 疾病所需的藥劑的量。
優(yōu)選地，所述藥劑的劑量足以結(jié)合對(duì)象中盡可能多的可利用C5、更優(yōu) 選所有可利用的C5。優(yōu)選地，所提供藥劑的劑量是結(jié)合對(duì)象中所有可利用 C5所需摩爾劑量的至少兩倍。所提供藥劑的劑量可以是結(jié)合對(duì)象中所有可 利用€5所需摩爾劑量的2.5倍、3倍或4倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述劑 量是從1 mg/kg至15 mg/kg。優(yōu)選地，所述劑量;i從1 mg/kg (藥物質(zhì)量 比患者質(zhì)量)至10 mg/kg、優(yōu)選2 mg/kg至8 mg/kg。
需要施用藥劑的頻率將取決于所涉及藥劑的半衰期。當(dāng)所述藥劑是 EV576蛋白或其功能等價(jià)物時(shí)，施用劑量可以基于每天一次、每天兩次、 或每兩天、三天、四天、五天、六天、七天、10天、15天或20天或更多 天一次。
確切的劑量和施用頻率還可取決于患者在施用時(shí)的狀態(tài)。確定劑量時(shí) 可以考慮的因素包括患者疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度、患者的#^健康情況、年 齡、體重、性別、飲食、施用時(shí)間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性和患者 對(duì)治療的耐受性或反應(yīng)。通過常規(guī)試驗(yàn)可以確定準(zhǔn)確的量，但是最終可取 決于臨床醫(yī)生的判斷。
通常所述藥劑作為藥學(xué)可接受載體的一部分來施用。本文使用的術(shù)語 "藥學(xué)可接受載體"包括基因、多肽、抗體、脂質(zhì)體、多糖、聚乳酸、聚乙 醇酸和無活性病毒顆粒，或者實(shí)際上任何其它藥劑，只要所述載體本身不 誘導(dǎo)毒性作用或致使產(chǎn)生對(duì)接受所述藥物組合物的個(gè)體有害的抗體即可。
藥學(xué)可接受載體可另外含有液體比如水、鹽水、甘油、乙醇或輔助物質(zhì)比
如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物等。因此，所用的藥物載體將取決于施用 途徑而有所不同。載體能夠使所述藥物組合物配制成片劑、丸劑、糖錠劑、 膠嚢、液體、凝膠劑、糖漿劑、骨劑(slurries )、混懸劑，以幫助患者的 攝取。在Remington Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.， N.J. 1991) 中可以找到對(duì)藥學(xué)可接受載體的詳細(xì)論述。
可以通過任何已知的施用途徑遞送所述藥劑?？梢酝ㄟ^胃腸外途徑(例 如，通過皮下、皿內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射，或者遞送至組織間隙)遞 送所述藥劑。還可以將所述組合物施用至損傷中。其它施用模式包括口服 和肺部施用、栓劑、和透皮或經(jīng)皮施用、針和無針注射(hypospray)。
結(jié)合C5的藥劑可以單獨(dú)施用，或者作為治療方案一部分施用，所述 治療方案還包括施用目前用于治療重癥肌無力患者的其它藥物。例如，可 以^合抗膽堿酯酶劑(比如新斯的明和吡斯的明)或免疫抑制藥物(比如 潑尼松、環(huán)孢霉素和硫唑噤呤)施用所述藥劑。聯(lián)合藥物治療對(duì)治療所述 疾病可具有加和或協(xié)同作用。
因此，本發(fā)明提供(i)結(jié)合C5的藥劑，優(yōu)選EV576蛋白或其功能等 價(jià)物，和(ii)抗膽喊酯酶劑和/或免疫抑制藥物，用于治療用途。
本發(fā)明還提供(i)結(jié)合C5的藥劑，優(yōu)選EV576蛋白或其功能等價(jià)物， 和(ii)抗膽堿酯酶劑和/或免疫抑制藥物在制備治療重癥肌無力藥物中的 用途。
可以與其它藥物同時(shí)、依次或者分別地施用結(jié)合C5的藥劑。例如， 可以在施用其它藥物之前或之后施用結(jié)合C5的藥劑。
因此本發(fā)明提供了結(jié)合C5的藥劑，優(yōu)選EV576蛋白或其功能等價(jià)物， 在制備用于治療對(duì)象中重癥肌無力的藥物中的用途，其中所^t象之前已 用抗膽喊酯酶劑和/或免疫抑制藥物預(yù)先治療過。4^發(fā)明還提供了抗膽喊酯 酶劑和/或免疫抑制藥物在制備用于治療對(duì)象中重癥肌無力的藥物中的用 途，其中所述對(duì)象已用結(jié)合C5的藥劑，優(yōu)選EV576蛋白或其功能等價(jià)物 預(yù)先治療過。
結(jié)合C5的藥劑還可以作為治療方案的一部分施用，所述治療方案還 包括施用目前用于治療與重癥肌無力相關(guān)的其它疾病的其它藥物，所述其
它疾病比如胸腺胂瘤、甲狀腺毒癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡?？梢耘c
所述其它藥物同時(shí)、依次或分別地施用結(jié)合C5的藥劑。例如，可以在施 用所述其它藥物之前或之后施用結(jié)合C5的藥劑。
現(xiàn)將更詳細(xì)地舉例說明本發(fā)明的多個(gè)方面和實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì) 本發(fā)明細(xì)節(jié)的修改并不脫離本發(fā)明的范圍。


圖1:補(bǔ)體激活的經(jīng)典和旁路途徑的示意圖。暗灰色表示酶組分。過 敏毒素被星狀圖所圍繞。
圖2: Ey57，、的一級(jí)序列。下劃線表示信號(hào)序列。粗體表示半胱氨酸
圖3:從蜱唾液腺提取物(SGE)純化EV576。 A)陰離子交換色鐠。 B)級(jí)分的常規(guī)溶血測(cè)定。C)還原SDS-PAGE。 D) RP-HPLC。
圖4: EV576的作用機(jī)制。A)對(duì)C3a生成沒有作用。B)阻止C5a 生成。C )直接結(jié)合C5。
圖5:重組EV576。 A)重組EV576 (rEV576)與天然EV576同樣有 效地抑制補(bǔ)體。B)EV576的結(jié)構(gòu)。
圖6: rEV576在實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力模型中的作用。A)與對(duì)照動(dòng)物相 比，rEV576阻止體重減輕。B)與對(duì)照動(dòng)物相比，用rEV576治療的動(dòng)物 的臨床評(píng)分。C)臨床評(píng)分的原始數(shù)據(jù)。
圖7: rEV576在慢性實(shí)驗(yàn)重癥肌無力模型中的作用。A)與對(duì)照動(dòng)物 相比，在具有嚴(yán)重EAMG的動(dòng)物中，rEV576阻止體重減輕和死亡。B) 與對(duì)照動(dòng)物相比，在具有嚴(yán)重EAMG的動(dòng)物中，rEV576治療對(duì)臨床評(píng)分 和握力(grip strength)有明顯的改善。C)與對(duì)照動(dòng)物相比，在具有輕度 EAMG的動(dòng)物中，rEV576阻止體重減輕。
圖8: rEV576在慢性實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力模型中的作用。A)在經(jīng)過治 療的、未經(jīng)治療的、輕度的EAMG或嚴(yán)重的EAMG組之間，AchR抗體 未顯示出差異。B)來自表現(xiàn)出嚴(yán)重和輕度EAMG大鼠的大鼠血清中總補(bǔ) 體溶血活性。
圖9: rEV576在慢性實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力模型中的作用。A)來自表現(xiàn) 出嚴(yán)重EAMG大鼠的大鼠血清的細(xì)胞毒性。B)來自表現(xiàn)出輕度EAMG 大鼠的大鼠血清的細(xì)胞毒性。
實(shí)施例
1. 作用機(jī)制和抑制濃度
如WO2004/106369所公開的，通過對(duì)經(jīng)常規(guī)溶血測(cè)^Jt現(xiàn)含有補(bǔ)體抑 制活性的唾液腺提取物級(jí)分進(jìn)行SDS-PAGE和RP-HPLC (圖3 )，從軟蜱 (soft tick)毛白鈍緣蜱(OW/i,Viorfrmw附做6"to)的唾液腺提取物中純化 EV576。
EV576抑制人和豚鼠的經(jīng)典和旁路途徑。它對(duì)C3a生成的速率沒有影 響(圖4A )，但是阻止將C5切割成C5a (圖4B )。
EV576抑制經(jīng)典的和旁路補(bǔ)體途徑的能力是由于該分子與補(bǔ)體C5結(jié) 合所致，其中C5是C5a和C5b-9的前體。EV576直接結(jié)合C5 (圖4C )， IQ。約為0.02 mg/ml。確切的結(jié)合機(jī)制和血清因子所起的輔助作用(如果 有的話)正在研究之中。
去除糖基化位點(diǎn)(否則在酵母表達(dá)系統(tǒng)中發(fā)生糖基化)的重組EV576 (rEV576)與天然非糖基化蛋白質(zhì)一樣有活性(圖5A)。
EV576的結(jié)構(gòu)確認(rèn)它;O旨質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的一種較遠(yuǎn)的成員(圖5B)， 與moubatin具有46%的一致性，后者是來自毛白鈍緣蜱(a附卵6Wfl) 的一種血小板凝集抑制因子。脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白是一大組的軟蜱蛋白質(zhì)，除了 很少的幾種之外它們的功能是未知的。
2. 半衰期
發(fā)現(xiàn)在大鼠中1251標(biāo)記的rEV576的血清p半衰期約為30-38小時(shí)。
3. EV576對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力的作用 試發(fā)J
按照Piddlesden et al.(如上)的方法，在雌性Lewis大鼠中謙導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)。
在第0天給Lewis大鼠MJ^內(nèi)注射1 mg/kg的抗-AchR mAb35,并連 同注射i) 3.25 mg rEV576 (經(jīng)計(jì)算為結(jié)合所有可用C5所需要的摩爾劑 量的2,5倍)；或者ii)PBS。在7天中評(píng)價(jià)大鼠的體重和臨床評(píng)分的變化。 (圖6)
與對(duì)照相比，注射3.25 mg的rEV576完全地減輕了 mAb35誘導(dǎo)的體 重減輕和肌無力。
在誘導(dǎo)后72小時(shí)所有對(duì)照動(dòng)物都變得瀕臨死亡并且不得不實(shí)施安樂 死，而所有經(jīng)rEV576治療的動(dòng)物都存活下來，體重增加并且在實(shí)驗(yàn)期間 (183小時(shí))沒有表現(xiàn)出肌無力(圖6 )。
因此單次注射rEV576在至少7天中完全地減輕了 EAMG的癥狀。
試發(fā)2
在慢性EAMG模型中進(jìn)一步對(duì)rEV576進(jìn)行分析。在該模型中，動(dòng)物 接受完全弗氏佐劑(CFA)中的乙跣膽堿受體蛋白并且在約30天的過程中 產(chǎn)生它們自己的抗體。該模型模擬人的情形，其中癥狀的發(fā)生和J Ubf目對(duì) 緩慢。
通過皮下注射純化的乙酰膽喊受體蛋白(2x100 jil PBS中20照乙酰 膽堿受體蛋白，所述蛋白溶液在等體積的完全弗氏佐劑+滅活的結(jié)核分枝 桿菌(Mycobacterium tuberculosis) -0.5 mg中乳化)免疫18只Lewis大 鼠。對(duì)照大鼠只注射PBS。
疾病發(fā)作(EAMG臨床評(píng)分1或2并且體重減輕<15% )之后，給9 只大鼠J^M內(nèi)(i.p.)注射3.25 mg的rEV576，治療持續(xù)10天，每12小 時(shí)注射1 mg。在這9只大鼠中，三只大鼠被評(píng)價(jià)為具有嚴(yán)重的肌無力 (S-EAMG)和六只大鼠具有輕度的肌無力(M-EAMG)。
余下的9只大鼠未經(jīng)處理。這9只大鼠中，四只大鼠,皮評(píng)估為具有嚴(yán) 重的肌無力(S-EAMG),五只大鼠具有輕度的肌無力(M-EAMG)。
在10天中，評(píng)價(jià)這兩組大鼠的體重、握力和臨床評(píng)分的變化。
在嚴(yán)重EAMG組中的大鼠，它們的體重減輕12%并且在用rEV576 治療開始時(shí)起的24小時(shí)內(nèi)死亡。未經(jīng)治療的大鼠在24時(shí)內(nèi)全部死亡。經(jīng)
rEV576治療的大鼠顯示出在體重減輕方面明顯的減少。在第33天開始用 rEV576治療時(shí)，平均臨床評(píng)分是2.0。 10天的rEV576注射減輕了臨床癥 狀的嚴(yán)重性并且還阻止了體重的減輕(圖7A)。這些大鼠還顯示出在握力 方面的明顯改善(圖7B)。
在顯示出輕度早期EAMG的大鼠中，在第33天剛開始出現(xiàn)臨床征象 并且體重剛開始降低。rEV576治療阻止大鼠體重的減輕并且大鼠體重平 均增加3.43%。具有同樣臨床評(píng)分的未經(jīng)治療的動(dòng)物體重減輕約4.59%(圖 7C)。與表現(xiàn)出輕度早期EAMG的未經(jīng)治療的大鼠相比，在經(jīng)過治療的大 鼠中握力沒有改善(數(shù)據(jù)未顯示)。
從所述大鼠中收集血，用于檢測(cè)AchR抗體和評(píng)價(jià)補(bǔ)體溶血活性。在 各實(shí)驗(yàn)組之間，通過直接ELISA檢測(cè)的AchR抗體沒有差異(圖8A)。來 自經(jīng)rEV576治療的顯示嚴(yán)重和輕度EAMG大鼠的大鼠血清完全抑制補(bǔ)體 的活性(圖8B)。
此外，在橫紋肌肉瘤細(xì)胞系(ATCC， CCL-136)上應(yīng)用ToxiLight Bioassay Kit測(cè)定來自顯示嚴(yán)重和輕度EAMG大鼠的大鼠血清的細(xì)胞毒 性。如在圖9A和9B中所能看到的，在具有嚴(yán)重EAMG的未經(jīng)治療的大 鼠中檢測(cè)到最高的細(xì)胞毒性。用rEV576治療的動(dòng)物顯示出細(xì)胞毒活性明 顯降低。
該數(shù)據(jù)表明rEV576可以有效用于治療早期輕度重癥肌無力和嚴(yán)重晚 期疾病(例如肌無力危象)。
權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防重癥肌無力的方法，其包括向有此需要的對(duì)象施用治療或預(yù)防有效量的結(jié)合補(bǔ)體C5的藥劑。
2. 治療或預(yù)防有效量的結(jié)合補(bǔ)體C5的藥劑在制備治療或預(yù)防重癥 肌無力的藥物中的用途。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法或根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述藥 劑用于阻止C5轉(zhuǎn)化酶將補(bǔ)體C5切割成補(bǔ)體C5a和補(bǔ)體C5b-9。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述藥劑以 小于0.2 mg/ml的IC5。結(jié)合C5。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述藥劑來 源于食血節(jié)肢動(dòng)物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述結(jié)合C5 的藥劑是蛋白質(zhì)，其包含圖2中氨基酸序列的第19至168位氨基酸或 者由其組成，或者是該蛋白質(zhì)的功能等價(jià)物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述結(jié)合C5 的藥劑是蛋白質(zhì)，其包含圖2中氨基酸序列的第1至168位氨基酸或者 由其組成，或者是該蛋白質(zhì)的功能等價(jià)物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述藥劑是 編碼如權(quán)利要求6或7所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法或用途，其中所述核酸分子包含圖2中 核普酸序列的第53至507位堿基或者由其組成。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法或用途，其中所述核酸分子包含圖2中 核苷酸序列的第1至507位堿基或者由其組成。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述對(duì)象 是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法或用途，其中以足以結(jié) 合對(duì)象中盡可能多的可利用C5、更優(yōu)選所有可利用C5的劑量施用所述藥劑。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法或用途，其中以足以減 少體重減輕和/或肌無力的劑量施用所述藥劑。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法或用途，其中以1 mg/kg 至15 mg/kg的劑量施用所述藥劑。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的方法或用途，其中以13 mg/kg 的單劑量腹膜內(nèi)施用所述藥劑。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法或用途，其中以13 mg/kg 的劑量腹膜內(nèi)施用所述藥劑，接著每12小時(shí)以4 mg/kg的劑量施用。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法或用途，其中作為治療 方案的一部分施用所述結(jié)合C5的藥劑，所述治療方案還包括施用治療 重癥肌無力的其它藥物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法或用途，其中所述的其它藥物是抗膽 堿酯酶劑，比如新斯的明和吡斯的明，或者是免疫抑制藥物，比如潑尼 松、環(huán)孢霉素、和硫唑嘌呤。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法或用途，其中與所述其它藥物同 時(shí)、依次或分別地施用所述結(jié)合C5的藥劑。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述重癥 肌無力是輕度重癥肌無力或重度重癥肌無力。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合補(bǔ)體蛋白C5的藥劑在治療與不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活有關(guān)的疾病尤其是在治療重癥肌無力中的用途。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101340926SQ200680037667
公開日2009年1月7日 申請(qǐng)日期2006年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日
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