專利名稱：：成纖維細胞激活劑及成纖維細胞活化方法、膠原合成促進劑及膠原合成促進方法、以及皮...的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及與膠原的分解、合成相關(guān)的、活化成纖維細胞的成纖維細胞激活劑及成纖維細胞活化方法、膠原合成促進劑及膠原合成促進方法、以及通過活化成纖維細胞和促進膠原合成而防止皮膚老化的皮膚老化預防劑及預防皮膚老化的方法。
背景技術(shù)：
：通常，皮膚老化是指伴隨年齡增加的生理老化與紫外線照射等光老化相互影響而產(chǎn)生的一種生理現(xiàn)象。20~30歲以后，皮膚的真皮層中構(gòu)成肌膚彈力基本單位的膠原等蛋白質(zhì)減少。此外，產(chǎn)生膠原的成纖維細胞本身的能力也衰減。光老化是指皮膚經(jīng)紫外線照射后分泌出分解膠原的酶，由此膠原受到破壞、真皮的彈力消失的現(xiàn)象。膠原量的降低和成纖維細胞的功能降低是產(chǎn)生皺紋、松弛等老化現(xiàn)象的主要因素。迄今為止，作為抗老化的對策有應用抑制膠原分解酶(膠原酶)活性的抗老化成分的^R案。例如，有應用下列物質(zhì)作為膠原酶抑制劑的提案，某種蘑菇的提取物(特開平9-40552)、艾蒿屬植物的提取物(特開平10-194982)、葡萄種子和蘋果種子、虎耳草科植物全草的提取物(特開平11-71294)、麝香草屬植物的提取物(特開平11-79970)、藍桉(五wca/3^MSg/o&w/ws)、鼠尾、蕺草、牡丹、芍藥等的提取物(特開平11-147833)、藤黃、貫葉連翹的提取物(特開平11-315008)、梅雨花(Oocasmi'"Xcrocoamae/Zora)球才艮的提取物(特開2000-191512)、茜草(及w&aceae)、柿、地榆、薄荷等的提取物(特開2000-159631)。但是，這僅僅是抑制膠原分解酶(膠原酶)的活性，僅僅是預防紫外線造成的膠原分解(光老化)，而不能有效改善紫外線和隨增齡而發(fā)生的肌膚老化。已知有視黃醇酸(視黃酸，維生素A衍生物)這種能有效促進膠原自身合成的抗老化成分(MethodsinEnzymology,1990，vol.190,p352-360)。但是，視黃醇酸刺激性強，在日本限定了醫(yī)師的使用。因此，迫切期望開發(fā)有效性高且安全的老化防止劑。
發(fā)明內(nèi)容為了達成上述目的，本發(fā)明者們進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄樹液具有成纖維細胞活化作用和促進成纖維細胞膠原合成的作用，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及包含以葡萄樹液為有效成分的成纖維細胞激活劑、使用葡萄樹液的成纖維細胞的活化方法、以及將葡萄樹液作為成纖維細胞激活劑使用的方法。本發(fā)明還涉及包含以葡萄樹液為有效成分的膠原合成促進劑及使用葡萄樹液的膠原合成促進方法、以及將葡萄樹液作為膠原合成促進劑使用的方法。此外，本發(fā)明還涉及包含以葡萄樹液為有效成分的皮膚老化預防劑及使用葡萄樹液的皮膚老化預防方法、以及將葡萄樹液作為皮膚老化預防劑使用的方法。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明可促進膠原的合成，有效防止皮膚的老化。此外，本發(fā)明中，如果葡萄樹液與脯氨酸并用可進一步增強葡萄樹液的效果。發(fā)明的最佳實施方式以下，進一步對本發(fā)明進行詳細i兌明。本發(fā)明涉及包含以葡萄樹液為有效成分的成纖維細胞激活劑，本發(fā)明的成纖維細胞激活劑除了葡萄樹液之外可包含脯氨酸。本發(fā)明涉及使用葡萄樹液的成纖維細胞的活化方法，本發(fā)明的成纖維細胞的活化方法除了葡萄樹液之外可同時使用脯氨酸。本發(fā)明涉及將葡萄樹液作為成纖維細胞激活劑使用的方法，本發(fā)明的使用方法中，成纖維細胞激活劑除了葡萄樹液之外還可包含脯氨酸。膠原是一種纖維狀蛋白質(zhì)，存在于皮膚、血管、肌腱、牙齒等大多數(shù)細胞中，占構(gòu)成人體總蛋白質(zhì)的30%左右。人體由60兆個以上的細胞構(gòu)成，細胞和細胞所構(gòu)成的臟器，是靠細胞外基質(zhì)的連接作用形成的。膠原是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的一種蛋白質(zhì)，作為細胞存在的場所，有助于其增殖和功能的維持，在軟骨和骨中，基質(zhì)蛋白質(zhì)作為其構(gòu)成成分發(fā)揮著重要作用。成纖維細胞是產(chǎn)生膠原的主要細胞之一，由成纖維細胞分泌的膠原分布在細胞之間，形成細胞間基質(zhì)。本發(fā)明者的研究結(jié)果新發(fā)現(xiàn)葡萄樹液具有活化成纖維細胞本身的作用(成纖維細胞活化作用)。葡萄樹液與脯氨酸一起使用時，可進一步增強葡萄樹液具有的成纖維細胞活化作用。脯氨酸優(yōu)選使用L-脯氨酸。本發(fā)明涉及包含以葡萄樹液為有效成分的膠原合成促進劑，本發(fā)明的膠原合成促進劑除了葡萄樹液之外可包含脯氨酸。本發(fā)明涉及使用葡萄樹液的膠原合成促進方法，本發(fā)明的膠原合成促進方法除了葡萄樹液之外可同時使用脯氨酸。本發(fā)明涉及將葡萄樹液作為膠原合成促進劑使用的方法，本發(fā)明的使用方法，其中膠原合成促進劑除了葡萄樹液之外還可包含脯氨酸。如上所述，葡萄樹液具有成纖維細胞活化作用。此外，本發(fā)明者們的研究結(jié)果新發(fā)現(xiàn)，葡萄樹液具有促進成纖維細胞膠原合成的作用。本發(fā)明的膠原合成促進劑，包含以作用于成纖維細胞自身，具有活化細胞自身和促進成纖維細胞膠原合成作用的葡萄樹液作為有效成分，可有效促進膠原合成。葡萄樹液與脯氨酸一起使用時，可進一步增強葡萄樹液具有的膠原合成促進作用。脯氨酸優(yōu)選使用L-脯氨酸。本發(fā)明涉及包含以葡萄樹液為有效成分的皮膚老化預防劑，本發(fā)明的皮膚老化預防劑除了葡萄樹液之外可包含脯氨酸。本發(fā)明涉及使用葡萄樹液的皮膚老化預防方法，本發(fā)明的皮膚老化預防方法除了葡萄樹液之外可同時使用脯氨酸。本發(fā)明涉及將葡萄樹液作為皮膚老化預防劑使用的方法，本發(fā)明的使用方法，其中皮膚老化預防劑除了葡萄樹液之外還可包含脯氨酸。成纖維細胞的性質(zhì)和狀態(tài)的變化、成纖維細胞的作用與張力降低、皺紋等皮膚的老化密切相關(guān)。這是因為除了水分，皮膚的大約80%由膠原構(gòu)成。皮膚從表面開始順次分為表皮、真皮、皮下組織3層。膠原存在于其中的真皮，占據(jù)其中的大部分，具有纖維狀構(gòu)造的性質(zhì)。皮膚要承受外界的各種各樣的力，要求它具有強度和柔軟性，而使它具有這樣性質(zhì)的發(fā)揮主要作用的就是膠原。成纖維細胞控制著膠原的分解和合成，并且成纖維細胞的力量通常保持拉長狀態(tài)。本發(fā)明的皮膚老化預防劑含有葡萄樹液作為有效成分，通過膠原合成促進作用和成纖維細胞活化作用，有效防止張力降低、皺紋等皮膚的老化。葡萄樹液與脯氨酸一起使用時，可進一步增強葡萄樹液具有的預防皮膚老化效果。脯氨酸優(yōu)選使用L-脯氨酸。葡萄樹液是葡萄(Vitis科)植林的活體內(nèi)流淌的植物導管水。本發(fā)明中使用的葡萄樹液可利用葡萄、山葡糖等樹液，對其種屬無特殊限定，只要是葡萄屬植物的樹液即可。例如，至于葡萄可使用巨峰、曱州、曱斐路、蜜思嘉(t久力7卜.弋ijA)、玫瑰露(f，々工7)、康拜爾(《々.7-卩-)、PIONE(匕。才-凈)、白浮士德(凈才.7義力少卜)、尼亞加4i(大47*方，，)、康可(-》3誦卜、、)、斯圖本(只f工誦《>)、赤霞珠(力《/k凈乂々4-3^)、黑比"i若(匕°乂乂7/D、MERLOT(爿y^口一)、森美戎(七；、3乂)、雷司令(卩-義卩》夕')、霞多麗(；Y^K才)等品種。此外，對栽培地域、栽培方法等無限定，但其中優(yōu)選春天發(fā)芽期前從修剪下的葡萄枝溢出的樹液。可切開葡萄莖采集流出的樹液獲得葡萄樹液。對樹液的采集方法無特殊限定，例如，將小型容器放置到要流出樹液的修剪部位采集樹液、將之收集到加入了防腐劑的大型保存容器中。優(yōu)選使用一次性可從不同位置采集樹液的裝置，例如特開平10-295207號公報中記載的采集裝置，特開2005-118035公報中記載的應用受液器采集等，這樣作業(yè)效率高，且可防止品質(zhì)惡化。所采集的葡萄樹液，既可作為液狀物質(zhì)(必要時與防腐劑等混合)應用，也可作為冷凍干燥品應用。此外，所采集的葡萄樹液必要時可進行加熱處理、澄清處理。這樣可防止樹液的白濁和褐變。加熱處理時，將葡萄樹液加熱，例如60100。C，優(yōu)選80-90。C，例如10分鐘以上。加熱處理既可對采集后的葡萄樹液直接進行處理，也可在制成制品后進行。此外，澄清處理可應用公知的澄清劑，例如，活性炭、硅膠、硅溶膠、聚乙烯基聚吡咯垸酮(polyvinylpolypyrrolidone,PVPP)等。本發(fā)明的成纖維細胞激活劑、膠原合成促進劑和皮膚老化預防劑，均既可包含葡萄樹液的原液體，也可包含其冷凍千燥品。對其劑型無特殊限定，可提供洗劑、乳劑、膠劑、乳膏劑、軟膏劑、粉末劑、顆粒劑等各種劑型。本發(fā)明的成纖維細胞激活劑、膠原合成促進劑和皮膚老化預防劑，可單獨包含葡萄樹液、或包含葡萄樹液和脯氨酸，必要時適當配合常規(guī)醫(yī)藥品、醫(yī)藥外用品、皮膚化妝品等中配合使用的油性成分、表面活性劑、保濕劑、顏料、紫外線吸收劑、抗氧化劑、香料、色素、抗菌劑、防徵劑、酒精、水等。另外，在不破壞本發(fā)明效果的范圍內(nèi)可與其它的細胞激活劑、膠原合成促進劑、老化預防劑等并用。本發(fā)明的成纖維細胞激活劑、膠原合成促進劑和皮膚老化預防劑，換算成未調(diào)整的樹液，包含1質(zhì)量％以上，更優(yōu)選3質(zhì)量％~100質(zhì)量％,更優(yōu)選10質(zhì)量％~80質(zhì)量％的葡萄樹液。本發(fā)明中，葡萄樹液作為成纖維細胞激活劑、膠原合成促進劑、皮膚老化預防劑應用。本發(fā)明的成纖維細胞激活劑、膠原合成促進劑和皮膚老化預防劑中，除葡萄樹液之外還配合脯氨酸時，其配合量適于在0.1%~3質(zhì)量%、優(yōu)選0.1質(zhì)量％~1.5質(zhì)量％的范圍內(nèi)。脯氨酸的配合量是與葡萄樹液合計為100%時的比率。本發(fā)明的成纖維細胞激活劑、膠原合成促進劑和皮膚老化預防劑作為皮膚外用劑的適用方法，可按照外用劑的類型進行適當選擇。通常情況下，作為以洗劑、乳劑、膠劑、乳膏劑、軟膏劑等劑型制備的外用劑適用的情況是，針對面部等皮膚，優(yōu)選每天涂抹約1~2次。本發(fā)明的成纖維細胞激活劑、膠原合成促進劑和皮膚老化預防劑也可作為化妝品使用，可用于洗劑、乳液、美容液、乳膏劑、液體粉底霜、粉狀粉底霜、口紅等。本發(fā)明的成纖維細胞激活劑、膠原合成促進劑和皮膚老化預防劑作為粉末劑、顆粒劑等經(jīng)口服用的藥物應用時的施用量，可根據(jù)施用者的年齡、肌膚狀況等條件進行適當選擇。施用量，例如成人每人在100~1000mg(有效成分量)的范圍內(nèi)。但是，上述施用量可按照上述條件進行適當?shù)脑鰷p。實施例以下，進一步對本發(fā)明的實施例進行詳細說明。但是，本發(fā)明并不限定于這些實施例。以下實施例中使用的葡萄樹液，是2005年4月上旬，在山梨縣東山梨群勝沼町的葡萄園中，從修剪中的葡萄(品種，甲州)枝流出的樹液，是應用特開平10-295207號公報中記載的裝置采集的，lg葡萄樹液的冷凍干燥品相當于280g未調(diào)整的樹液。實施例1(成纖維細胞激活作用實驗)3-(4，5-二曱基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)，能被線粒體中細胞內(nèi)能量代謝過程中產(chǎn)生的NADPH或NADH還原，生成曱臘。曱臘的生成量作為細胞活化作用的指標。將正常人成纖維細胞以3.0x104細胞/孔的細胞密度接種到96孔培養(yǎng)板。在含有1%胎牛血清(FBS)的Dulbecco，s改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)24小時后，換成含有表1中所示濃度葡萄樹液冷凍干燥品且含有1%FBS的DMEM。應用含5%FBS的DMEM作為陽性對照(PC)。再培養(yǎng)48小時后，換成含0.4mg/mLMTT(大力，4)的、含1%FBS的DMEM，培養(yǎng)2小時。洗滌細胞后，用2-丙醇溶解細胞內(nèi)生成的曱臘，用酶標儀測定550nm和650nm的吸光度，以二者的差作為細胞內(nèi)生成的甲臘量進行評價。細胞激活作用是以未添加樣品培養(yǎng)的細胞(對照)的吸光度(ABS.)作為IOO的活性指標(ActivationIndex)(%)。結(jié)果如表l所示。所有的結(jié)果均以均值士標準差表示。用Student-t;險驗進行顯著性差異的檢測。當p值p0.05時為有顯著性差異。如表1中所示，可確認通過用添加了葡萄樹液的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，激活了成纖維細胞。對成纖維細胞的激活作用(n=5)濃度(|ig/ml)活性指標(％)平均值士SDP(t國試驗)對照一100.0±1.7l細PC一116.0±2.9O細葡萄樹液冷凍干燥品500.0114.6±6.7o扁1000.0120.3±6.90.001下劃線有細胞激活作用實施例2(成纖維細胞的膠原合成促進作用實驗)通過應用ELISA對培養(yǎng)上清中分泌的I型膠原進行定量來評價成纖維細胞的膠原合成。將正常人成纖維細胞以3.0x104細胞/孔的細胞密度接種到96孔培養(yǎng)板。在含有0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，換成含有表2中所示濃度的葡萄樹液冷凍干燥品且含有0.5%FBS的DMEM。應用抗壞血酸磷酸鎂酯(VCPMg)作為PC。再培養(yǎng)48小時后，回收上清用于I型膠原的ELISA。將培養(yǎng)上清及作為標準應用的I型膠原加入到96孔培養(yǎng)板中，4。C包被一晚。用1%牛血清白蛋白(BSA)溶液37。C封閉1小時，然后與一抗(抗人i型膠原(兔))37。C反應1.5小時。再與二抗(HistofinePO(兔))37。C反應1.5小時后，加入含有0.3mg/ml2,2,連氮畫雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨(ABTS)的磷酸-檸檬酸緩沖液(O.IM，pH4.0)，20分鐘后，用酶標儀測定405nm的吸光度。根據(jù)同一塊板中測定出的標準曲線算出培養(yǎng)上清中的膠原量。同時用BCAProteinAssayReagent(PIERCE)對細胞的蛋白質(zhì)進行定量。用培養(yǎng)上清中的膠原量除以蛋白質(zhì)量，算出單位蛋白質(zhì)量中的膠原量，作為細胞的膠原合成量。結(jié)果如表2所示。所有的結(jié)果均以均值土標準差表示。用Student-t檢驗進行顯著性差異的檢測。當p值p0.05時為有顯著性差異。如表2中所示，通過用添加了葡萄樹液的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，促進了成纖維細胞的膠原合成，大約是未添加(對照)時的1.2~3.6倍。尤其是，在應用含500jig/ml以上的葡萄樹液冷凍干燥品的培養(yǎng)基時，其作用顯著。此外，在應用含250iig/ml以上的葡萄樹液冷凍干燥品的培養(yǎng)基時，可以確認其蛋白質(zhì)量有顯著性增加。蛋白質(zhì)的增加表示活化了成纖維細胞使之增殖。表2中所示的膠原量是與蛋白質(zhì)量的比值，可以看出各個細胞的膠原合成量有顯著性增力口。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>下劃線顯著性促進膠原的合成下劃線顯著性促進膠原的合成實施例3(聯(lián)合使用脯氨酸的實驗)試驗樣品的制備為了驗證葡萄樹液與脯氨酸并用的效果，按表3中的配方制備用于下述官能評價實驗和皺紋評價實驗的軟膏。表3中所示組成物的配合量都以質(zhì)量％表示。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>官能評價實驗選訴說肌膚干燥和柔軟性、彈力性的60名30~50歲的女性作為受試者。受試者分為4組，15名每組，組間沒有年齡偏差。將按照表3中所示比較例1和例1~3的4種配方例的乳膏分別施用給受試者，早晚1日2次，連續(xù)使用30天，將使用感分為濕潤感(濕潤性)、彈力感(彈力性)和柔軟感(柔軟性)進行功能評價實驗。評價標準如表4所示，官能評價實驗的結(jié)果如表5所示。[表4][評價標準]使用感評價點評價濕潤感(濕潤性)非常濕潤4濕潤3普通2不濕潤1根本不濕潤彈力感(彈力性)非常有彈力4有彈力3普通2沒有彈力1根本沒有彈力柔軟感(柔軟性)非常柔軟4柔軟3普通2不柔軟1根本不柔軟[表5]比較例1例1例2例3濕潤感(濕潤性)2.94.14.24.6彈力感(彈力性)2.83.23.94.5柔軟感(柔軟性)2.73.13.54.2平均值2.83.53,94.4*各組15名的平均評價分值、及3項評價指標的總平均值鈹紋評價實驗選肌膚出現(xiàn)皺紋(尤其是眼睛周圍的細小皺紋)的40名40~60歲的女性作為受試者。受試者分為4組，IO名每組，組間沒有年齡偏差。將按照表3中所示比較例1和例1~3的4種配方例的乳膏分別施用給受試者，早晚1日2次，以容易出現(xiàn)皺紋的眼睛四周為中心，連續(xù)使用30天，應用紫外線照片通過視覺判定法比較使用前后眼睛周圍的皺紋條數(shù)。其結(jié)果示于表6中。比專交例1例1例2例3涂抹前(第0天)的皺紋數(shù)24222729涂抹后(第30天)的皺紋數(shù)22171918皺紋條數(shù)改善(減少)率8%23%30%38%*各組IO名的平均皺紋條數(shù)、及涂抹前后的改善(減少率)試驗結(jié)果無論是顯示功能評價實驗結(jié)果的表5中，還是顯示皺紋評價實驗結(jié)果的表6中，與比較例1的含有脯氨酸的乳膏相比，例1的含有葡萄樹液的乳膏對千燥、彈力、皺紋等的改善效果高。此外，與葡萄樹液和脯氨酸單獨作用時相比，例2和例3的葡萄樹液與脯氨酸組合的乳膏對干燥、彈力、皺紋等的改善效果更高。也就是說，葡萄樹液對干燥、彈力、皺紋等的改善效果很好，再向葡萄樹液中組合使用構(gòu)成膠原的氨基酸尤其是脯氨酸，肌膚的保濕效果高，顯著減少皺紋的效果更南。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明通過葡萄樹液的成纖維細胞激活作用和成纖維細胞的膠原合成促進作用可有效防止皮膚的老化。本發(fā)明的膠原合成促進劑及成纖維細胞激活劑，除防止老化之外，還可期待用于粉刺痕、妊娠紋的治愈、燒傷等的創(chuàng)傷治療、人工皮膚的培養(yǎng)促進等領域。權(quán)利要求1.一種成纖維細胞激活劑，其包含葡萄樹液作為有效成分。2.權(quán)利要求1中的成纖維細胞激活劑，其還包含脯氨酸。3.—種使用葡萄樹液的成纖維細胞活化方法。4.權(quán)利要求3的成纖維細胞活化的方法，其還聯(lián)合應用脯氨酸。5.將葡萄樹液作為成纖維細胞激活劑使用的方法。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述成纖維細胞激活劑還包含脯氨酸。7.—種膠原合成促進劑，其包含葡萄樹液作為有效成分。8.權(quán)利要求7中的膠原合成促進劑，其還包含脯氨酸。9.一種使用葡萄樹液促進膠原合成的方法。10.權(quán)利要求9的促進膠原合成的方法，其還聯(lián)合應用脯氨酸。11.將葡萄樹液作為膠原合成促進劑使用的方法。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述膠原合成促進劑還包含脯氨酸。13.—種皮膚老化預防劑，其包含葡萄樹液作為有效成分。14.權(quán)利要求13中的皮膚老化預防劑，其還包含脯氨酸。15.—種使用葡萄樹液預防皮膚老化的方法。16.權(quán)利要求15的預防皮膚老化的方法，其還聯(lián)合應用脯氨酸。17.將葡萄樹液作為皮膚老化預防劑使用的方法。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述皮膚老化預防劑還包含脯氨全文摘要本發(fā)明涉及包含以葡萄樹液為有效成分的成纖維細胞激活劑、使用葡萄樹液的成纖維細胞的活化方法、以及將葡萄樹液作為成纖維細胞激活劑使用的方法。此外，本發(fā)明涉及包含以葡萄樹液為有效成分的膠原合成促進劑及使用葡萄樹液的膠原合成促進方法、以及將葡萄樹液作為膠原合成促進劑使用的方法。此外，本發(fā)明涉及包含以葡萄樹液為有效成分的皮膚老化預防劑及使用葡萄樹液的皮膚老化預防方法、以及將葡萄樹液作為皮膚老化預防劑使用的方法。本發(fā)明提供安全性高且有效預防老化的手段。文檔編號A61P43/00GK101299991SQ200680039019公開日2008年11月5日申請日期2006年10月17日優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日發(fā)明者今村一幸,渡邊東申請人:美露香株式會社