專利名稱：：抗gdf-8的拮抗劑抗體以及在als和其他gdf-8-相關(guān)病癥治療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
涉及生長(zhǎng)和分化因子-8(GDF-8)拮抗劑，尤其是GDF-8的抗體，例如小鼠、人和人源化的抗體及其片段，尤其是在體外和/或體內(nèi)抑制GDF-8活性的那些。該領(lǐng)域進(jìn)一步涉及治療、改善、預(yù)防、預(yù)后或監(jiān)測(cè)GDF-8-相關(guān)病癥，例如肌肉病癥，神經(jīng)肌肉病癥，骨退化病癥，代謝性或誘發(fā)性骨病癥，脂肪病癥，葡萄糖代謝病癥或胰島素-相關(guān)的病癥，尤其是肌萎縮性側(cè)索硬化癥("ALS")。相關(guān)的
背景技術(shù)：
：生長(zhǎng)和分化因子-8(GDF-8)亦稱抑月幾素(myostatin),為分泌蛋白并且是結(jié)構(gòu)相關(guān)生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-P(TGF-p)超家族的成員。本超家族成員具有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和形態(tài)發(fā)生的性質(zhì)(Kingsley等(1994)Ge薦Z)ev.8:133-46;Hoodless等(1998)C鮮.71—c^Mc油o/.//wm/wo/.228:235-72)。人GDF-8以形成同型二聚體復(fù)合物的375個(gè)氨基酸的前體蛋白合成。在加工期間，稱為"潛伏相關(guān)肽"(LAP)的氨基-末端前肽被裂解并且可以保持非共價(jià)結(jié)合至該同型二聚體，形成命名為，，小潛伏復(fù)合物"的無活性復(fù)合物(Miyazono等(1988)丄C/z縫263:6407-15;Wakefield等(1988J/Szo/.C/zew.263:7646-54;Brown等(1999)OowAFa"ors3:35-43;Thies等(2001)GrowAF""om18:251-59;Gentry等(1990)Aoc/^脂W^29:6851-57;Derynck等(1995)胸廚316:701-05;Massague(19卯)顛.版C"/說o/.12:597-641)。諸如卵泡抑素的蛋白質(zhì)和其相關(guān)蛋白也結(jié)合成熟的GDF-8同型二聚體并且抑制GDF-8的生物學(xué)活性(Gamer等(1999)Dev.脂.208:222-32)。來自不同物種的推斷的GDF-8氨基酸序列的比對(duì)表明GDF-8為高度保守的(McPherron等(1997)7Vfl//.aSJ.94:12457-61)。人、小鼠、大鼠、豬和雞GDF-8的序列在C-末端區(qū)域100%相同，而狒狒、牛和羊的GDF-8在C-末端僅僅3個(gè)氨基酸不同。物種之間高度的GDF-8保守性提示GDF-8具有重要的生理功能。已表明GDF-8通過抑制成肌細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化而在肌肉發(fā)育和體內(nèi)平衡的調(diào)控中起著重要的作用(Lee和McPherron1999)Curr.6>一.Ge威Z^v.9:604-07;McCroskery等(2003)丄Ce〃.162:1135-47)。其在發(fā)育骨骼肌早期表達(dá)，并且繼續(xù)在成年骨骼肌中表達(dá)，優(yōu)先在快肌(fasttwitch)類型中。另外，GDF-8在成年小鼠中過表達(dá)引起明顯的肌肉萎縮(Zimmers等(2002)296:1486-88)。此外，已表明使得GDF-8基因無活性的天然突變導(dǎo)致動(dòng)物和人中的肥大和增生(Lee和McPherron(1997)上文)。例如，GDF-8敲除轉(zhuǎn)基因小鼠以骨骼肌的明顯肥大和增生以及改變的皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)為特征(McPherron等(1997)A^we387:83-90;Hamrick等(2000)5o"e27:343-49)。類似的骨骼月幾質(zhì)量的增加在天然GDF-8突變的牛中也很明顯(Ashmore等(1974)38:501-07;Swatland等(1994)丄38:752-57;McPherron等，Kambadur等(1997)Ge,weAe&7:910-15)。此外，不同的研究表明提高的GDF-8表達(dá)與HIV-誘發(fā)的肌肉損耗有關(guān)(Gonzalez-Cadavid等(1998M^/.爿caJ.Sc/.95:14938-43)。GDF-8還參與肌肉-特異性酶(例如，肌酸激酶)的產(chǎn)生以及成月幾細(xì)月包的增殖(WO00/43781)。除了其生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和形態(tài)發(fā)生的性質(zhì)之外，認(rèn)為GDF-8參與許多其他的生理學(xué)過程，包括2型糖尿病發(fā)展期間葡萄糖的體內(nèi)平衡、葡萄糖耐量減低、代謝性綜合癥(即涉及一組健康狀況(可包括胰島素抵抗、腹部肥胖、脂血異常、高血壓、慢性炎癥、血栓前狀態(tài)等等)同時(shí)發(fā)生的綜合癥，例如X綜合癥，，其使得人處于2型糖尿病和/或心臟病的高風(fēng)險(xiǎn)中)、胰島素抵抗(例如，通過諸如燒傷或氮失衡的外傷誘發(fā)的4氏抗)以及脂肪組織病癥(例如肥胖、脂血異常、非酒精性脂肪肝疾病等等。)(Kim等(2000)祝oc/ze肌Ao;^"."仏Comm.281:902-06)。人和動(dòng)物的許多病癥與功能受損的肌肉組織有關(guān)，例如肌萎縮性側(cè)索硬化癥("ALS，，)、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥("MD";包括Duchenne，s肌營(yíng)養(yǎng)不良)、肌肉萎縮癥、器官萎縮癥、虛弱、充血梗阻性肺病(COPD)、肌肉減少癥、惡病質(zhì)和由其他疾病和病情引起的月幾肉損4毛綜合癥。目前，幾乎沒有可靠的或有效的治療用于治療這些病癥。這些疾病的病理學(xué)表明GDF-8信號(hào)作為靶標(biāo)在這些疾病的治療中的潛在作用。ALS是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化和月幾肉萎縮為特征的晚期發(fā)病和致死的神經(jīng)退行性疾病。ALS通常以步態(tài)異常和不靈巧開始，并且隨后發(fā)展至四肢和隔肌麻痹。雖然ALS的大多數(shù)病例為突發(fā)的并且病原不明，已表明5-10。/o的病例由顯性家族性(FALS)遺傳引起。大約10-20%的FALS病例歸因于Cu/Zn過氧化物歧化酶(SOD1)基因的突變(Brmjn等的綜述(2004)"ev.A^wcwcz.27:723-49)。SOD1為催化過氧化物為過氧化氳和二價(jià)氧反應(yīng)的異源二聚體金屬-蛋白，并且由于SOD1的損失并不引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病(Reaume等(1996)Nat.Genet.13:43-47),其被認(rèn)為通過毒性的功能獲得而誘導(dǎo)疾病(Brmjn等的綜述，上文)。SODl-誘發(fā)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡的特定機(jī)制并不清楚，并且可能涉及軸突運(yùn)輸?shù)母淖?、?duì)錯(cuò)誤折疊蛋白的細(xì)胞應(yīng)答、線粒體機(jī)能障礙和興奮毒性(Bruijn等，上文)。ALS中觀察到的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化可能通過多個(gè)機(jī)制發(fā)生，包括營(yíng)養(yǎng)因子被運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的攝取或運(yùn)輸破壞(Holzbaur的綜述(2004)TrendsCellBiol.14:233-40)。因此，ALS可通過經(jīng)才是供最適的生存環(huán)境而復(fù)原退行神經(jīng)元的療法而治療。神經(jīng)環(huán)境包括非神經(jīng)元細(xì)胞，例如由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)支配的的神經(jīng)膠質(zhì)和肌細(xì)胞。該環(huán)境提供營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子，其由神經(jīng)元內(nèi)化并且經(jīng)逆行性軸突運(yùn)輸而運(yùn)輸至細(xì)胞體(Chao(2003)Neuron39:1-2;Holzbaur,上文)。FALS已在小鼠和大鼠中通過突變體SODl的過表達(dá)而才莫式化(Howland等(2002)/Voc.AAw/.爿c^/."S.A99:1604-09)。過表達(dá)G93A型突變體S0D1的轉(zhuǎn)基因小鼠在90至100天齡時(shí)呈現(xiàn)肌肉虛弱和萎縮，并且通常在130天齡左右死亡(Gurney等(1994XSc,e"ce264:1772-75)。然而，下面的SODG93A-誘發(fā)的病理(包括握力虛弱和神經(jīng)肌肉連接損失)，早在50天齡時(shí)就^艮明顯(Frey等(2000)J.A^wmy"20:2534-42;Fisher等(2004X&cp.A^wo.185:232-40;Ligon等(2005)A^"TOi^/wt16:533-36;Wooley等(2005)7^fmc/eA^n;e32:43-50)。表達(dá)SODG93A突變的轉(zhuǎn)基因大鼠遵循類似的退化時(shí)程(Howland等，上文)。最近的工作提示了病變的發(fā)展并不是細(xì)胞自主的，與ALS中觀察到的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化通過多種機(jī)制發(fā)生的假設(shè)一致，其包括營(yíng)養(yǎng)因子-陂運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元攝取和運(yùn)輸?shù)钠茐?參見如上)。Clement和合作者已4吏神經(jīng)元的生存(Clement等(2003)5We"ce302:113-17)。這些觀察引導(dǎo)了可能通過提供最適的生存微環(huán)境而延緩神經(jīng)元退化的療法的研究。例如，SODG93A小鼠通過直接肌內(nèi)注射由病毒表達(dá)的生長(zhǎng)因子(包括IGF-1、GDNF和VEGF)的治療延長(zhǎng)了動(dòng)物的生存(Kaspar等(2003)S"ewce301:839-42;Azzouz等(2004)A^we429:413-17;Wang等(2002".臉?biāo)_d.22:6920-28)。此外，局部IGF-l-特異的異構(gòu)型(mIGF-l)的肌肉-特異性表達(dá)穩(wěn)定神經(jīng)肌肉連接，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生存并且延緩SODG93A轉(zhuǎn)基因小鼠模型中疾病的發(fā)作和發(fā)展，表明對(duì)肌肉的直接作用可以影響轉(zhuǎn)基因SOD1動(dòng)物中疾病的發(fā)作和發(fā)展(Dob麗olny等(2005)O詣o/.168:193-99)。在ALS小鼠中還報(bào)道了肌肉代謝亢進(jìn)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元易損性之間的聯(lián)系，其支持肌肉中的缺陷可能與疾病病因有關(guān)的，b殳(Dupois等(2004)尸rac.Ato/.爿cadS"101:11159-64)。因此，增強(qiáng)肌肉生長(zhǎng)定當(dāng)提供運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元提高的局部支持，并且因此產(chǎn)生治療益處。抑月幾素表達(dá)的抑制導(dǎo)致月幾肉月巴大和增生(Lee和McPherron,上文；McPherron等，上文)。抑肌素在損傷后負(fù)調(diào)節(jié)肌肉再生，并且GDF-8基因敲除小鼠中抑肌素的缺乏導(dǎo)致加速的肌肉再生(McCroskery等(2005)丄Ce〃.Sc,.118:3531-41)。抑肌素國(guó)中和抗體提高野生型小鼠(Whittemore等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300:965-71)和用于肌營(yíng)養(yǎng)不良模型的mdx小鼠(Bogdanovich等(2002)Nature420:418-21;Wagner等(2002)Ann.Neurol.52:832-36)的體重、骨骼肌質(zhì)量以及骨骼肌的肌肉大小和力量。此外，這些小鼠中的抑生長(zhǎng)因子(例如HGF)對(duì)肌肉的作用可能由于抑肌素表達(dá)的抑制(McCroskery等(2005),上文)而有助于在再生和退化之間以積才及的方向轉(zhuǎn)變"推進(jìn)和牽拉"或平衡。因此，GDF-8抑制以治療ALS、肌營(yíng)養(yǎng)不良(MD)和其他的GDF-8-相關(guān)病癥(例如神經(jīng)月幾肉病癥)的潛在藥理學(xué)靶標(biāo)存在，對(duì)這些病癥需要增強(qiáng)肌肉質(zhì)量質(zhì)量、力量、大小等等。利用ALS動(dòng)物模型(小鼠和大鼠)，有可能在兩種不同的物種中檢測(cè)療法，由此提高人體內(nèi)治療作用的把握。除了人的神經(jīng)肌肉病癥之外，還存在生長(zhǎng)因子-相關(guān)的病情，其與例如骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎的骨損失有關(guān)，其主要影響老年人和/或絕經(jīng)后的婦女。此外，代謝性骨疾病和病癥包括由于長(zhǎng)期糖皮質(zhì)激素療法、早期性腺衰竭、雄激素抑制、維生素D缺乏、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、營(yíng)養(yǎng)缺乏和神經(jīng)性厭食造成的較低骨質(zhì)量。雖然許多用于這些病情的當(dāng)前療法通過抑制骨吸收而起作用，促進(jìn)骨形成的療法將是有效的替代治療。因?yàn)镚DF-8在骨發(fā)育以及肌肉發(fā)育中起作用，GDF-8的調(diào)控對(duì)骨-退行性病癥的治療也是極好的藥理學(xué)靶標(biāo)。因此，存在對(duì)開發(fā)化合物和治療方法的需求，其促進(jìn)尤其在人中，并且尤其在患有ALS和其他肌肉-損庫毛疾病以及骨-退行性病癥的那些人中肌肉質(zhì)量和/或力量和/或骨密度等等的整體加強(qiáng)。生產(chǎn)具有對(duì)GDF-8增強(qiáng)的親和力的中和抗體和其他小分子是治療這些病癥的極好的藥理學(xué)方法。發(fā)明概要本發(fā)明的GDF-8拮抗劑涉及抗體(例如完整的抗體和其抗原結(jié)合片段)，其在此指"抗-GDF-8抗體"或"GDF-8抗體"。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗-GDF-8抗體降低、中和和/或拮抗至少一種GDF-8-相關(guān)的活性(即"GDF-8活性")。本發(fā)明因此提供利用這些抗-GDF-8-抗體治療與GDF-8活性有關(guān)的各種骨、肌肉、葡萄糖和脂肪病癥的方法。本發(fā)明公開了GDF-8拮抗劑，例如GDF-8抗體在用于治療患有ALS的動(dòng)物時(shí)為高度有效的療法，以及所述抗體的給藥降低ALS病變期間肌肉靶標(biāo)(例如隔肌、腓腸肌等等)的損耗。此外，本發(fā)明公開了這些拮抗劑對(duì)于患有ALS的動(dòng)物增強(qiáng)肌肉質(zhì)量和握力是高度有效的。因此，本發(fā)明教導(dǎo)了抗-GDF-8抗體為治療GDF-8-相關(guān)病癥，例如ALS、肌肉損耗病癥或由GDF-8調(diào)節(jié)異常引起的其他病癥的有效成分。在一個(gè)方面，本發(fā)明的特征為治療(例如治愈、抑制)、改善或預(yù)防(例如延緩或預(yù)防發(fā)作、復(fù)發(fā)或反復(fù))患者中GDF-8-相關(guān)病癥的方法。該方法包括給予患者足以治療或預(yù)防GDF-8-相關(guān)病癥量的GDF-8拮抗劑，例如抗-GDF-8抗體。GDF-8拮抗劑，例如抗-GDF-8抗體可以單獨(dú)或與此處所述的其他治療方法結(jié)合給予患者。GDF-8抗體可以治療性地、預(yù)防性地或同時(shí)治療并預(yù)防性地給予。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者為哺乳動(dòng)物，例如患有GDF-8-相關(guān)病癥，包4舌例如骨和力幾肉病癥的人。優(yōu)選地，患者為人。更優(yōu)選，患者為患有此處所述的GDF-8-相關(guān)病癥的人。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、篩查、治療、改善和/或預(yù)防GDF-8-相關(guān)病癥的安全且有效的治療方法，相關(guān)病癥例如肌肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨-退行性病癥、代謝性或誘發(fā)的骨病癥、脂肪病癥、葡萄糖代謝病癥或胰島素-相關(guān)病癥，其包括但不限于，葡萄糖體內(nèi)平衡、2型糖尿病、葡萄糖耐受性減低、代謝綜合癥(即涉及一組健康狀況(其可能包括胰島素抵抗、腹部肥胖、脂血異常、高血壓、慢性炎癥、血栓前狀態(tài)等等)同時(shí)發(fā)生的綜合癥，其使得人處于2型糖尿病和/或心臟病的高風(fēng)險(xiǎn)中)、胰島素抵抗(例如通過創(chuàng)傷(例如燒傷或氮不平衡)誘發(fā)的抵抗)、脂肪組織病癥(例如肥胖、脂血異常、非酒精性脂肪肝疾病等等)、HIV-誘發(fā)的肌肉損耗、肌營(yíng)養(yǎng)不良(包括Duchenne，s肌營(yíng)養(yǎng)不良)、肌萎縮性側(cè)索硬化("ALS")、肌肉萎縮、器官萎縮、虛弱、充血梗阻性肺病、骨骼肌減少癥、惡病質(zhì)、肌肉損耗綜合癥、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、代謝性骨疾病和代謝性骨病癥(包括由于長(zhǎng)期的糖皮質(zhì)激素療法、早期性腺衰竭、雄激素抑制、維生素D缺乏、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、營(yíng)養(yǎng)缺乏和神經(jīng)性厭食造成的低骨質(zhì)量)。在優(yōu)選但非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于在脊推動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物且更尤其是人中診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、篩查、治療、改善和/或預(yù)防GDF-8-相關(guān)病癥(例如^L肉病癥)的安全且有^:的治療方法。本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、篩查、治療、改善和/或預(yù)防的GDF-8-相關(guān)病癥，例如肌肉病癥為ALS。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供體內(nèi)或體外抑制GDF-8功能的方法。這些方法可用于治療GDF-8-相關(guān)病癥，例如肌肉和骨骼退刊-性病癥，尤其是肌肉病癥例如ALS,并且可用于增強(qiáng)肌肉質(zhì)量和/或骨力量和/或密度。該方法也可用于增強(qiáng)正常動(dòng)物，包括但不限于人中的肌肉質(zhì)量和骨密度。本方法可用于活體外(例如無細(xì)胞體系中、培養(yǎng)物中等等)、體外或體內(nèi)。例如，GDF-8受體-表達(dá)細(xì)胞可在培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)并且與此處所述的諸如一種或多種抗-GDF-8抗體接觸?；蛘?，該方法可在患者的細(xì)胞上進(jìn)行，例如作為體內(nèi)(例如治療性的或預(yù)防性的)方案的一部分。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明的特征為GDF-8拮抗劑，例如與GDF-8相互作用(例如結(jié)合)和中和和/或抑制它的分離的抗體。特別地，由GDF-8抗體結(jié)合的GDF-8蛋白為哺乳動(dòng)物例如人、綿羊、非人靈長(zhǎng)類的GDF-8。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供以高親和力，例如以至少l(T7M，優(yōu)選10-8、10-9、10-1G，更優(yōu)選l(T11M或更高的Kd結(jié)合GDF-8的抗體?？?GDF-8抗體的親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)可利用一些熟知的方法牙全測(cè)，例如生物傳感器4支術(shù)(Biacore,Piscataway,NJ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗-GDF-8抗體(例如完整的抗體或抗體片段(例如Fab、F(ab，)2、Fv或單鏈Fv片段))為單克隆抗體?？贵w可以是人的、人源化的、嵌合的或體外-產(chǎn)生的抗體。在優(yōu)選而非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-GDF-8抗體為人源化抗體。這些抗-GDF-8抗體可用于診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、篩查、治療、改善和/或預(yù)防肌肉、骨骼、脂肪和葡萄糖代謝-相關(guān)病癥。抗-GDF-8抗體的非限制性實(shí)例在此稱為"RK35",并且包括小鼠和修飾的抗體，例如嵌合或人源化形式。小鼠RK35重鏈可變區(qū)的核苦酸和氨基酸序列在此分別為SEQIDNO:2和SEQIDNO:3。人源化RK35重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列在此分別為SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。小鼠RK35輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列在此分別為SEQIDNO:4和SEQIDNO:5。人源化RK35輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列在此分別為SEQIDNO:8和SEQIDNO:9。在本發(fā)明優(yōu)選而非限制性的實(shí)施方案中，抗體為GDF-8的小鼠或人源化抗體。本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體由SEQIDNO:3的VH(可變重鏈)結(jié)構(gòu)域和SEQIDNO:5的VL(可變輕鏈)組成。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體由SEQIDNO:7的VH結(jié)構(gòu)域和SEQIDNO:9的VL結(jié)構(gòu)域組成。本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括列于表l的一個(gè)或多個(gè)VH或VL結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括RK35的H3片段，即SEQIDNO:12所述的序列。又一個(gè)實(shí)施方案中，GDF-8拮抗劑包括具有選自SEQIDNO:10-12和20-22序列、來自此處/^開抗體重鏈可變區(qū)的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的拮抗劑包括具有選自SEQIDNO:13-15和23-25序列、來自此處/>開抗體輕鏈可變區(qū)的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CDR。又一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包括具有選自SEQIDNO:10-15和20-25序列的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)CDR。本發(fā)明的抗-GDF-8抗體的重鏈和輕鏈可以是全長(zhǎng)的(例如抗體可包括至少一個(gè)，并且優(yōu)選兩個(gè)全長(zhǎng)重鏈，以及至少一個(gè)，并且優(yōu)選兩個(gè)全長(zhǎng)輕鏈)或可以包括抗原-結(jié)合片革殳(例如Fab、F(ab，)2、Fv或單鏈Fv片段("scFv"))。其他的實(shí)施方案中，抗體重鏈恒定區(qū)選自例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD和IgE,尤其選自例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，更尤其是IgGl(例如人IgGl)。在另一實(shí)施方案中，抗體輕鏈恒定區(qū)選自例如k或X,尤其是k(例如人k)。在一個(gè)實(shí)施方案中，恒定區(qū)改變(例如突變)以改變抗體的性質(zhì)(例如提高或降低一種或多種Fc受體結(jié)合、抗體糖基化、半胱氨酸殘基數(shù)目、效應(yīng)細(xì)胞功能或補(bǔ)體功能)。例如，人IgGl恒定區(qū)可在一個(gè)或多個(gè)殘基處突變，例如SEQIDNO:19的117和120殘基的一個(gè)或多個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗-GDF-8抗體包括在SEQIDNO:19所示的人IgGl恒定區(qū)。在另一實(shí)施方案中，抗-GDF-8抗體包括人k序列，例如SEQIDNO:17所示的序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供GDF-8抗體作為結(jié)合GDF-8并且保留中和或降低GDF-8活性能力的新的抗體片段。在本發(fā)明優(yōu)選而非限制性的實(shí)施方案中，抗體片段選自由dAb片段、雙鏈抗體(diabody)、Fd片段、Fab片段、F(ab，)2片段、scFV片段和Fv片段組成的組。本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體片^:由選自SEQIDNO:2、4、6或8的多核苷酸編碼。本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體片段包括選自SEQIDNO:10-15和20-25所述氨基酸序列的氨基酸序列。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供序列與列于表1中的那些序列不同(例如由于遺傳密碼的冗余)，然而保留結(jié)合GDF-8以及中和或降低GDF-8活性能力的新的抗體片段。在另一實(shí)施方案中，抗-GDF-8抗體包括至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)具有列于表1(VH的SEQIDNO:3或7，和/或VL的SEQIDNO:5或9)的氨基酸序列或與其基本上相同的序列(例如與SEQIDNO:3、5、7或9至少約85%、90%、95%、99%或以上相同，或與之相差不超過l、2、5、10或15個(gè)氨基酸殘基的序列)的抗原-結(jié)合區(qū)域，例如可變區(qū)。在另一實(shí)施方案中，抗體包括由具有列于表1(VH的SEQIDNO:2或6和/或VL的SEQIDNO:4或8)的核苷酸序列的核酸，或與其基本上相同的序列(例如與SEQIDNO:2、4、6或8至少約85%、90%、95%、99%或以上相同，或與之相差不超過3、6、15、30或45個(gè)核苦酸的序列)編碼的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域。又一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包括來自重鏈可變區(qū)、具有列于表l(SEQIDNO:10-12和20-22)的氨基酸序列或與其基本上同源的序列(例如與之至少約85%、90%、95%、99%或以上相同和/或具有一個(gè)或多個(gè)取代，例如保守取代的序列)的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CDR。又一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包括來自輕鏈可變區(qū)、具有列于表1(SEQIDNO:13-15和23-25)的氨基酸序列或與其基本上同源的序列(例如與之至少約85%、90%、95%、99%或以上相同和/或具有一個(gè)或多個(gè)取代，例如保守取代的序列)的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CDR。又一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包括來自重鏈和輕鏈可變區(qū)的、具有列于表1(VHCDR的SEQIDNO:10-12和SEQ20-22;VLCDR的SEQIDNO:13-15和23-25)的氨基酸序列或與其基本上同源的序列(例如與之至少約85%、90%、95%、99%或以上相同和/或具有一個(gè)或多個(gè)取^Ft,例如〗呆守取卩戈的序列)的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)CDR。在另一實(shí)施方案中，抗-GDF-8抗體包括人IgGl恒定區(qū)，其具有SEQIDNO:19所述的氨基酸序列或與其基本上同源的序列(例如與SEQIDNO:19至少約85%、90%、95%、99%或以上相同，或與之相差不超過l、2、5、10、50或100個(gè)氨基酸殘基的序列)。在另一實(shí)施方案中，抗-GDF-8抗體包括人k恒定鏈，例如具有SEQIDNO:17所述氨基酸序列或與其基本上同源的序列(例如與SEQIDNO:17至少約85%、90%、95%、99%或以上相同，或與之相差不超過1、2、5、10、50或100個(gè)氨基酸殘基的序列)的人k恒定鏈。又一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包括此處所述的人IgGl恒定區(qū)和人K恒定鏈。在優(yōu)選而非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由SEQIDNO:2、4、6或8所述多核苷酸編碼的抗體。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO:2、4、6或8所述多核苷酸雜交的多核苷酸序列編碼的抗體。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由不同于SEQIDNO:2、4、6或8所述的序列，^旦由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼SEQIDNO:3、5、7、9或10-15所述氨基酸序列的多核苷酸編碼的抗體。GDF-8拮抗劑，例如抗-GDF-8抗體，可衍生或連接至另一個(gè)功能性分子，例如另一種肽或蛋白質(zhì)(例如Fab片段)。例如，融合蛋白或抗體或抗原-結(jié)合部分可功能性地連接(例如通過化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、非共價(jià)締合或其他)至一個(gè)或多個(gè)其他分子體，例如其中的抗體(例如雙特異性或多特異性抗體)、毒素、放射性同位素、細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。本發(fā)明又一方面提供作為GDF-8拮抗劑的純化和分離的核酸，其編碼GDF-8拮抗劑，例如本發(fā)明的GDF-8抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由編碼列于表l的VH(SEQIDNO:3或SEQIDNO:7)、VL(SEQIDNO:5或SEQIDNO:9)和/或CDR(SEQIDNO:10-15和20-25)的序列組成的多核苷酸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至編碼列于表1的VH、VL或CDR(SEQIDNO:3、5、7、9、10-15或20-25)的核酸的多核苦酸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括SEQIDNO:2、4、6或8或SEQIDNO:2、4、6或8的片段的核酸。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO:2、4、6或8雜交的多核苷酸。本發(fā)明另一個(gè)方面提供包括本發(fā)明多核苷酸作為GDF-8拮抗劑的宿主細(xì)胞和載體。本發(fā)明的抗體具有許多有用的性質(zhì)。第一，該抗體能夠以高親和力結(jié)合成熟的GDF-8。第二，公開的抗體抑制體外和體內(nèi)的GDF-8活性。第三，公開的抗體抑制與骨骼肌質(zhì)量和骨骼密度負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān)的GDF-8活性。第四，公開的抗體為用于肌肉病癥，尤其是ALS的有效治療。這些抗體具有許多另外的用途，包括診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、篩查、治療、改善和/或預(yù)防GDF-8-相關(guān)病癥，例如肌肉和/或骨骼-相關(guān)病癥。本發(fā)明的其他方面提供由本發(fā)明的GDF-8拮抗劑，例如本發(fā)明的抗-GDF-8抗體組成的組合物，以及所述組合物抑制或中和動(dòng)物，尤其患有肌肉病癥(例如ALS)的人或動(dòng)物中GDF-8中的用途。本發(fā)明的抗體還可以用于GDF-8-相關(guān)病癥，例如用于需要增強(qiáng)肌肉組織或骨骼密度的病癥中。例如，抗-GDF-8抗體可以用于療法和組合物以^修復(fù)受損的肌肉，例如心肌、隔肌等等。通過公開的方法和組合物治療的例證性的GDF-8-相關(guān)病癥和疾病包括肌肉和神經(jīng)肌肉失調(diào)例如肌營(yíng)養(yǎng)不良(包括Duchenne's肌營(yíng)養(yǎng)不良)；肌萎縮性側(cè)索硬化；肌肉萎縮；器官萎縮；虛弱；管綜合癥(tunnelsyndrome);充血梗阻性肺病(COPD);骨骼肌減少癥，惡病質(zhì)和其他肌肉損耗綜合癥；脂肪組織病癥(例如肥胖)；2型糖尿??；葡萄糖耐受性減低；代謝性綜合癥(例如X綜合癥)；胰島素抵抗(包括由諸如燒傷或氮不平衡的創(chuàng)傷誘發(fā)的抵抗)以及骨骼-退行性疾病(例如骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥)。在本發(fā)明優(yōu)選而非限制性的實(shí)施方案中，包含抗-GDF-8抗體的組合物用于治療、降低或改善ALS的方法中。另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供組合物，例如藥物組合物，其包括藥學(xué)可接受載體和至少一種GDF-8拮抗劑，例如此處所述的抗-GDF-8抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物，例如藥物組合物包括兩種或多種上述GDF-8拮抗劑(例如抗-GDF-8抗體或其片段)的組合。GDF-8拮抗劑，例如抗-GDF-8抗體與治療劑，例如生長(zhǎng)因子抑制劑、免疫抑制劑、抗炎劑(例如全身性抗炎劑)、代謝抑制劑、酶抑制劑和/或細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑的組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。又一個(gè)實(shí)施方案中，GDF-8拮抗劑，例如抗-GDF-8抗體或其藥物組合物單獨(dú)或以耳關(guān)合治療，即與其^也試劑例如可用于治療GDF-8-相關(guān)病癥的治療劑結(jié)合而給予。除了治療各種疾病或病癥的用途之外，抗-GDF-8抗體可以用作診斷工具以定量或定性檢測(cè)生物樣品中的GDF-8蛋白或蛋白片段。檢測(cè)的GDF-8蛋白的存在或量可與此處所列的一種或多種醫(yī)學(xué)狀況相關(guān)連。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)和/或篩查GDF-8-相關(guān)病癥的方法。另一方面中，本發(fā)明提供用于體外檢測(cè)樣品(例如生物樣品，如血清、血漿、組織、活組織)中GDF-8存在的方法。本方法可用于診斷GDF-8-相關(guān)病癥，例如骨骼、肌肉、脂肪或葡萄糖代謝-相關(guān)病癥。該方法包括(i)將樣品或?qū)φ諛悠放c此處所述的抗-GDF-8抗體接觸；和(ii)斥全測(cè)抗-GDF-8抗體和樣品或?qū)φ諛悠分g復(fù)合物的形成，其中樣品相對(duì)于對(duì)照樣品的復(fù)合物形成的基本上顯著的變化指示樣品中存在GDF-8。又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)患者體內(nèi)GDF-8存在的方法(例如患者的體內(nèi)成像)。本方法可用于診斷GDF-8-相關(guān)病癥，例如ALS。該方法包括(i)將此處所述的抗-GDF-8抗體在允許抗體結(jié)合GDF-8的條件下給予患者或?qū)φ帐茉囌撸缓?ii)檢測(cè)抗體和GDF-8之間復(fù)合物的形成，其中患者相對(duì)于對(duì)照受試者的復(fù)合物形成基本上顯著的差異提供與GDF-8存在有關(guān)的指示。本發(fā)明其他的實(shí)施方案提供診斷或檢測(cè)患者是否患有GDF-8-相關(guān)病癥(例如肌肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨骼退行性病癥、代謝性或誘發(fā)的骨骼病癥、脂肪病癥、葡萄糖代謝病癥或胰島素-相關(guān)病癥)的方法，包括步驟(a)獲得來自目的患者的樣品；(b)將樣品與此處所述的抗-GDF-8抗體接觸；(c)測(cè)定患者樣品中存在的GDF-8的水平；和(d)比4支患者樣品中GDF-8的水平與對(duì)照樣品中GDF-8的水平，其中患者樣品中GDF-8的水平相比對(duì)照樣品中GDF-8的水平的顯著提高、降低或類似表明患者是否患有GDF-8-相關(guān)病癥。用于i貪斷或^r測(cè)患者是否患有此處所述GDF-8-相關(guān)病癥的再一個(gè)實(shí)施方案包括步驟(a)獲得取自目的患者的第一樣品；(b)將該第一樣品與此處所述的抗-GDF-8抗體接觸；(c)測(cè)定第一樣品中GDF-8的水平；(d)獲得來自未患GDF-8-相關(guān)病癥的個(gè)人的第二樣品；(e)將該第二樣品與此處所述的抗-GDF-8抗體接觸；(f)測(cè)定第二樣品中GDF-8的水平；和(g)比4支第一和第二樣品中GDF-8的水平，其中第一樣品相比第二樣品水平的顯著提高、降低或類似表明患者是否患有由GDF-8過表達(dá)(部分或全部)引起的GDF-8-相關(guān)病癥。例如第一樣品中GDF-8水平相比第二樣品的提高可能表明患者患有GDF-8-相關(guān)病癥。相反，第一樣品中GDF-8水平相比第二樣品的降低或類似可能表明患者并不患有GDF-8-相關(guān)病癥。本發(fā)明的抗體在預(yù)測(cè)患者發(fā)展為GDF-8相關(guān)病癥，例如肌肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨骼退4亍性病癥、代謝性或誘發(fā)的骨餘病癥、脂肪病癥、葡萄^f唐^f戈i射病癥或胰島素-相關(guān)病癥的可能性的方法中也有效。在優(yōu)選但非限制性的實(shí)施方案中，該方法包括步驟(a)獲得來自目的患者的第一樣品；(b)將該第一樣品與此處所述的抗-GDF-8抗體接觸；(c)測(cè)定第一樣品中GDF-8的水平；(d)獲得來自未患GDF-8-相關(guān)病癥的個(gè)體的第二樣品；(e)將該第二樣品與此處所述的抗-GDF-8抗體接觸；(f)測(cè)定第二樣品中GDF-8的水平；和(g)比較第一和第二樣品中GDF-8的水平，其中第一樣品相比第二樣品GDF-8水平的顯著提高、降低或類似指示患者發(fā)展為GDF-8-相關(guān)病癥的可能性。例如，對(duì)于由GDF-8過表達(dá)(部分或全部)引起的GDF-8-相關(guān)病癥，如果第一樣品相比第二樣品具有提高的GDF-8水平則4艮可能該患者將發(fā)展GDF-8-相關(guān)病癥。相反，對(duì)于由GDF-8過表達(dá)(部分或全部)引起的GDF-8-相關(guān)病癥，如果第一樣品相比第二樣品具有類似的或降低的GDF-8水平則該患者不太可能將發(fā)展GDF-8-相關(guān)病癥。本發(fā)明的抗體在監(jiān)測(cè)GDF-8相關(guān)病癥，例如月幾肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨骼退行性病癥、代-浙性或誘發(fā)的骨骼病癥、脂肪病癥、葡萄糖代謝病癥或胰島素-相關(guān)病癥的嚴(yán)重程度的方法中也有效。在優(yōu)選而非限制的實(shí)施方案中，該方法包括步驟(a)在第一時(shí)間點(diǎn)獲得取自目的患者的第一樣品；(b)將該第一樣品與此處所述的抗-GDF-8抗體接觸；(c)測(cè)定第一樣品中GDF-8的水平；(d)在第二時(shí)間點(diǎn)獲得取自該患者的第二樣品；(e)將該第二樣品與此處所述的抗-GDF-8抗體接觸；(f)測(cè)定第二樣品中GDF-8的水平；和(g)比較第一和第二樣品中GDF-8的水平，其中第二樣品中GDF-8水平的顯著提高、降低或類似指示GDF-8-相關(guān)病癥的嚴(yán)重程度是否改變。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的監(jiān)測(cè)方法用于監(jiān)測(cè)ALS,并且第二樣品中GDF-8水平的降低表明ALS嚴(yán)重程度的降低。監(jiān)測(cè)此處所述病癥的另外的方法包括步驟(a)獲得來自目的患者的第一樣品；(b)將該第一樣品與此處所述的抗-GDF-8抗體接觸；(c)測(cè)定第一樣品中GDF-8的水平；(d)獲得來自未患肌肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨骼退行性病癥、代:浙性或i秀發(fā)的骨骼病癥、脂肪病癥、葡萄糖代謝病癥或胰島素-相關(guān)病癥的個(gè)體的第二樣品；(e)將該第二樣品與此處所述的抗-GDF-8抗體接觸；(f)測(cè)定第二樣品中GDF-8的水平；和(g)比較第一和第二樣品中GDF-8的水平，其中第一樣品相比第二樣品GDF-8水平的顯著提高、降低或類似指示GDF-8病癥在該時(shí)間點(diǎn)的嚴(yán)重程度。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的監(jiān)測(cè)方法用于監(jiān)測(cè)ALS，并且第一樣品相比第二樣品GDF-8水平的降4氐或類似表明ALS具有低的嚴(yán)重程度。未結(jié)合抗體的檢測(cè)。合適的;檢測(cè)物質(zhì)包括各^t酶:輔基:熒光材料:、發(fā)光材料和放射性材料。用于將本發(fā)明的拮抗劑，例如抗體遞送或靶向至體內(nèi)的GDF-8-表達(dá)細(xì)胞的方法在此處公開并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。用于治療和診斷用途的包括本發(fā)明的GDF-8拮抗劑，例如抗-GDF-8抗體的試劑盒也在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明另外的目的將在下列描述中闡述。本發(fā)明的不同的目的、方面和優(yōu)點(diǎn)將通過尤其在權(quán)利要求中指出的要素和組合而實(shí)現(xiàn)和獲4曰付?？衫斫獾氖巧鲜龈攀龊拖铝性敿?xì)說明僅僅是例證性的和說明性的，并且不是如所主張的本發(fā)明的限制。附圖簡(jiǎn)述圖1:RK35抗-GDF-8抗體的表征。A.如用生物素化的GDF-8的ELISA測(cè)定法中測(cè)定，RK35抗體直接結(jié)合至GDF-8。RK35抗體(圓圏)對(duì)GDF-8的結(jié)合親和力測(cè)定為4nM。對(duì)照IgG不呈現(xiàn)明顯的結(jié)合(正方形)。B.RK35抗體對(duì)結(jié)合至其高親和力受體的GDF-8的作用。在利用高親和力GDF-8受體的竟?fàn)嶦LISA中，ActRIIB用于測(cè)量RK35的GDF-8抑制活性。在缺乏(菱形)或存在不同濃度的RK35mAb、可溶性ActRIIB或?qū)φ誌gG時(shí)評(píng)估生物素化的GDF-8與融合至人IgG恒定區(qū)(Fc)的固定的人嵌合蛋白ActRIIB的結(jié)合?？扇苄訟ctRIIB-Fc受體(正方形)和無關(guān)的小鼠IgG(三角形)分別用作陽性和陰性對(duì)照。RK35(圓圈)以IC50~2.5nM阻斷生物素化的GDF-8結(jié)合至固定的ActRIIB。C.GDF-8-誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。表達(dá)TGF-P啟動(dòng)子-焚光素酶融合基因的橫紋肌肉瘤細(xì)胞在缺乏(正方形)或存在(圓圏)不同濃度的RK35抗體時(shí)用10ng/ml的GDF-8處理。RK35按劑量-應(yīng)答方式，以IC50為0.2nM降低焚光素酶活性的GDF-8誘導(dǎo)。在不添加GDF-8時(shí)測(cè)量本底(菱形)信號(hào)。圖2:抑肌素的抑制導(dǎo)致SODG93A小鼠和大鼠中體重和肌肉質(zhì)量的增加。A.RK35-處理(正方形)(n=ll)和PBS-處理(菱形)(n=ll)的轉(zhuǎn)基因SODG93A小鼠以及PBS-處理的同窩對(duì)照(野生型)小鼠(三角形)(n=9)的體重。B.雄性(圓圈)和雌性(三角形)RK35-處理以及雄性(正方形)和雌性(菱形)PBS-處理的轉(zhuǎn)基因SODG93A大鼠(每組n=10)的體重。C.疾病早期-階段RK35-和PBS-處理的SODG93A和PBS-處理的同窩對(duì)照小鼠(n=9-12)的月幾肉質(zhì)量。測(cè)定來自用PBS處理的88天的野生型小鼠(黑條)、用PBS處理的SODG93A小鼠(白條)和用RK35處理的SODG93A小鼠(灰條)的腓腸肌(腓腸肌)、盧貞脛骨肌(脛骨肌)、四頭肌(四)和隔肌(隔肌)肌肉的鮮重。D.來自疾病早期-階l殳(~95天)用PBS(白條)或RK35(灰條)處理的SODG93A大鼠的肌肉質(zhì)量(每組i^7)。E.在疾病末期-階段(~134天)用PBS處理的野生型小鼠(黑條)、用PBS處理的SODG93A小鼠(白條)和用RK35處理的SODG93A小鼠(灰條)的肌肉質(zhì)量。F.來自疾病結(jié)束-階段(~128天)用PBS(白條)或RK35(灰條)處理的SODG93A大鼠的肌肉質(zhì)量。星號(hào)(*)表示所示組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)(p<0.05)差異。圖3:抑肌素抑制增強(qiáng)SODG93A小鼠和大鼠的肌肉力量。A.PBS-處理的野生型小鼠(三角形)和PBS(菱形)或RK35(正方形)處理的SODG93A小鼠中與年齡有關(guān)的下肢握力。下肢握力可以表示為千克壓力(kg)。B.PBS-處理的野生型小鼠(三角形)和PBS(菱形)或RK35(正方形)處理的SODG93A小鼠中與年齡有關(guān)的前月支握力。C.PBS-處理的野生型大鼠(WT+PBS)或PBS(SOD+PBS)或RK35(SOD+RK35)處理的SODG93A大鼠的前肢握力。對(duì)于大鼠，在95-110天，相當(dāng)于疾病早期的4-周時(shí)間間隔期間進(jìn)行測(cè)量。前肢握力可以表示為千克張力(kg)。星號(hào)(*)表示所示組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(p<0.0001)差異。圖4:在SODG93A嚙齒類中抑肌素抑制對(duì)肌肉結(jié)構(gòu)和功能的作用。來自88天小鼠的中央腓腸肌的蘇木素伊紅染色表明(B)PBS-處理的SODG93A小鼠相比(A)野生型或(C)RK35-處理的SODG93A小鼠顯著的萎縮。末期(E)PBS-處理和(F)RK35-處理的SODG93A小鼠中央腓腸肌的蘇木素伊紅染色表明相比(D)野生型小鼠腓腸肌顯著的肌肉萎縮和細(xì)胞核集中(箭頭)。分別來自(G)PBS-處理的野生型小鼠和(H)PBS-或(I)RK35-處理的SODG93A小鼠末期的隔肌的蘇木素伊紅染色。萎縮的肌纖維的實(shí)例標(biāo)記為("a")。平板H中的星號(hào)表示纖維劈裂。示出條表示平板A-F中50^m和平板G-I中25pm的比例尺。平板J:示出記錄自PBS處理的野生型大鼠(WT+PBS)或PBS(SOD+PBS)或RK35(SOD+RK35)處理的SODG93A大鼠隔月幾月幾肉的吸入脈沖的EMG干涉圖。平板K:來自野生型大鼠(n=4)和來自載體(PBS,n=9)或RK35(n=8)處理的SODG93A大鼠隔月幾月幾肉的EMG脈沖峰速率(Hz)。星號(hào)(*)表示所示組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(p<0.05)差異。圖5:SODG93A小鼠中RK35處理在早期-階—?dú)W疾病中減i爰用卄腸肌肌肉月幾纖維直徑的減小以及在末期疾病中減》爰隔月幾月幾纖維直徑的減小。在88天通過對(duì)來自PBS-處理(A)和RK35-處理(B)的SODG93A小鼠以及PBS-處理的野生型小鼠(C)的腓腸肌形態(tài)測(cè)量而測(cè)量纖維直徑。ANOVA表明平均值顯著不同(p<0.0001);通過Tukey，s多重比較后-檢-瞼的兩兩比較也顯著不同(p<0.001)。在末期，PBS-處理和RK35-處理的SODG93A小鼠腓腸肌中觀察到纖維分布無顯著差異(數(shù)據(jù)沒有示出)。D.與年齡-相當(dāng)?shù)囊吧蛯?duì)照小鼠相比，來自末期PBS-處理和RK35-處理的SODG93A小鼠隔肌月幾肉的纖維直徑的分4斤。來自RK35-處理的SODG93A小鼠隔肌月幾肉呈現(xiàn)在末期PBS-處理的SODG93A小鼠和野生型對(duì)照小鼠之間的纖維直徑分布中間值。ANOVA表明平均值顯著不同(p<0.0001);通過Tukey，s多重比較后-檢驗(yàn)的兩兩比4支也顯著不同(p<0.01)。每組分析三個(gè)月幾肉；利用ZeissAxiovision軟件進(jìn)行至少兩百個(gè)纖維短軸最大直徑的長(zhǎng)度測(cè)量。纖維直徑以20pm間隔i殳置，對(duì)每個(gè)肌肉組產(chǎn)生頻率直方圖。圖6:抗-抑肌素處理對(duì)脊髓腹角中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損失的作用。顯示與年齡一相當(dāng)?shù)囊吧托∈?WT+PBS)相比，來自疾病早期-階段(A)和末期-階l殳(C)PBS(SOD+PBS)或RK35(SOD+RK35)處理的SODG93A小鼠腹角L3-5區(qū)域大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(面積大于300|im2)的體4見學(xué)分一斤。RK35處理顯示在疾病早期-階段(A)4氏消運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損失(p=0.08)的趨向。與年齡-相當(dāng)?shù)囊吧托∈笙啾?，?duì)來自(B)疾病早期-階,殳和(D)末期-階l殳PBS或RK35處理的SODG93A小鼠的NISSL-染色切片L3-5進(jìn)行可見細(xì)胞核的大的健康運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的單獨(dú)計(jì)數(shù)。對(duì)于每個(gè)切片，計(jì)數(shù)兩種腹角(每個(gè)動(dòng)物總計(jì)20個(gè)腹角)并且數(shù)據(jù)表示為每個(gè)腹角的大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的平均數(shù)。星號(hào)(*)表示所示組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(p<0.001)差異。示出在疾病早期(88天)(E-G)和末期(134天；H-J)分析的用PBS處理的野生型小鼠(E和H)、用PBS處理的SODG93A小鼠(F和I)以及用RK35處理的SODG93A小鼠(G和J)的來自NISSL-染色腹角切片(20x放大倍數(shù))的代表性的圖像。條表示200|im的比例尺。圖7:對(duì)RK35抗體的GDF-8表位作圖。利用人GDF-8的重疊13個(gè)氨基酸的肽鑒定GDF-8上RK35的結(jié)合位點(diǎn)。RK35與GDF-8的接觸位點(diǎn)為粗體。圖8:RK35的輕鏈和重鏈可變區(qū)(分別為VL和VH)分別與人系框架DPK9和DP-47的比對(duì)。在人源化的RK35(HuRK35)區(qū)域改變的鼠科RK35(MRK35)可變鏈的氨基酸用星號(hào)(*)表示并且為粗體；RK35的互補(bǔ)決定區(qū)圈入框中并下劃線。發(fā)明詳述I.定義如此處所用的"抗體"指免疫球蛋白或其部分，并且包含任何包括不管其來源，物種來源，產(chǎn)生方法和特性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽。除非另有說明，本發(fā)明的目的還包括抗體片段如Fab、F(ab，)2、Fv、scFv、Fd、dAb、雙鏈抗體和保留抗原-結(jié)合功能的其他抗體片段?？贵w可例如通過常j^見的雜交瘤技術(shù)、重組DNA方法或利用抗體文庫的噬菌體展示技術(shù)制備。對(duì)于各種其他的抗體產(chǎn)生技術(shù)，參見Antibodies:ALaboratoryManual,eds.Harlow等,ColdSpringHarborLaboratory,1988。術(shù)語"抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域"指包括特異性結(jié)合或互補(bǔ)部分或所有抗原的區(qū)域的抗體分子部分。當(dāng)抗原很大時(shí)，抗體僅可結(jié)合至抗原的特定部分。"表位"或"抗原決定簇，，為負(fù)責(zé)與抗體的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的抗原分子部分。抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可通過一個(gè)或多個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域(例如由VH結(jié)構(gòu)域組成的所謂的Fd抗體片段)提供?？乖?結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包括抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。術(shù)語"GDF-8"指特定的生長(zhǎng)和分化因子-8，而不是結(jié)構(gòu)或功能與GDF-8有關(guān)的其他因子，例如BMP-ll和屬于TGF-卩超家族的其他因子。該術(shù)語指GDF-8的全長(zhǎng)未加工的前體形式以及由翻譯后裂解產(chǎn)生的成熟和前肽形式。該術(shù)語還指包括序列已修飾的GDF-8的任何片段和變體，其維持如此處論述的至少某些與成熟GDF-8有關(guān)的生物學(xué)活性。成熟的人GDF-8氨基酸序列在SEQIDNO:1提供。本發(fā)明涉及來自所有脊推動(dòng)物物種的GDF-8，包括但不限于人、牛、雞、小鼠、大鼠、豬、羊、火雞、狒狒和魚(對(duì)于序列信息，參見例如McPherron等，上文)。術(shù)語"GDF-8活性"指與有活性的GDF-8蛋白有關(guān)的一種或多種生理生長(zhǎng)-調(diào)控或形態(tài)發(fā)生的活性。例如，有活性的GDF-8為骨骼肌質(zhì)量的負(fù)調(diào)節(jié)劑。有活性的GDF-8還可以調(diào)節(jié)肌肉-特異性酶的產(chǎn)生(例如肌酸激酶)、刺激成肌細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)前成脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。用于測(cè)量體內(nèi)和體外GDF-8活性的例證性的方法在實(shí)施例中闡述。術(shù)語"GDF-8拮抗劑"或"GDF-8抑制劑"包括能夠抑制GDF-8活性、表達(dá)、加工或分泌的任何試劑。所述抑制劑包括大分子和小分子，例如蛋白質(zhì)、抗體、肽、肽才莫擬物、siRNA、核酶、反義寡核苷酸、雙鏈RNA和抑制GDF-8的其他小分子。除了此處提供的抗體之外，GDF-8拮抗劑包括有效抑制GDF-8的任何抗體，包括以高特異性結(jié)合GDF-8的抗體(例如對(duì)TGF-卩超家族的其他成員(例如BMP-ll)具有低親和力的抗體)。這些抗體的變體，包括人源化的變體也考慮在本發(fā)明的診斷、預(yù)測(cè)、監(jiān)測(cè)、治療、改善和預(yù)防方法中。所述抑制劑"抑制"、"減小"或"降低"GDF-8的生物學(xué)活性。術(shù)語"中和"、"中和"和其同義詞指GDF-8活性相對(duì)于無相同的抑制劑時(shí)GDF-8活性的顯著降低或消除。例如，75-100%活性的降低可認(rèn)為是"中和"GDF-8活性。術(shù)語"治療"在此可與術(shù)語"治療方法"互換使用并且指治療性的治療和預(yù)防性的/預(yù)防措施。需要治療的人包括已患有特定的醫(yī)學(xué)病癥的個(gè)體以及可能最終患上該病癥的人(即需要預(yù)防措施的人)。術(shù)語"分離的"指基本上從其自然環(huán)境分離的那些分子。例如，分離蛋白為基本上從其來源的細(xì)胞或組織源分離的蛋白。術(shù)語"純化的"指基本上沒有在其自然環(huán)境中與該分子締合的其他物質(zhì)的分子。例如，純化的蛋白質(zhì)基本上沒有來自其來源的細(xì)胞或組織的細(xì)胞物質(zhì)或其他蛋白質(zhì)。該術(shù)語指其中分離蛋白足夠純以作為治療組合物給予，或至少70%至80%(w/w)純的，更優(yōu)選至少80%-90%(w/w)純的，甚至更優(yōu)選90-95%純的和最優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(w/w)純的制備物。術(shù)語"有效劑量"、"治療有效劑量"、"有效量，，等等指引起患者中癥狀改善或所需生物學(xué)結(jié)果(例如提高骨骼肌質(zhì)量和/或骨骼密度)的化合物的量。所述量應(yīng)該足以降低與骨骼肌質(zhì)量和骨骼密度的負(fù)調(diào)節(jié)或與葡萄糖體內(nèi)平衡和脂肪代謝有關(guān)的GDF-8活性。有效量可如此處所述而確定。"與GDF-8活性有關(guān)的病癥"、"與GDF-8有關(guān)的病癥"、"GDF-8-相關(guān)病癥，，等等指可能完全或部分由GDF-8(和/或GDF-8活性)的調(diào)節(jié)異常(例如異常提高或降低)引起的病癥，和/或可以通過調(diào)節(jié)和/或監(jiān)測(cè)GDF-8(和/或GDF-8活性)治療、改善、預(yù)防、診斷、預(yù)測(cè)或監(jiān)測(cè)的病癥。GDF-8-相關(guān)病癥包括肌肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨骼退行性病癥、代謝性或誘發(fā)的骨骼病癥、脂肪病癥、葡萄糖代謝病癥或胰島素-相關(guān)病癥。本發(fā)明優(yōu)選的GDF-8-相關(guān)病癥為肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。術(shù)語"小分子"指非大分子的化合物(參見，例如Karp(2000)Bz'oz力/orw""cs(9z^o/ogy16:269-85;Verkman(2004)yl/尸-Ce〃P/zyw'o/.286:465-74)。因此，小分子常常為小于一千道爾頓的化合物(例如，VoetandVoet,Bz'oc/zewz'W^y,2""e<i.,ed.N.Rose,WileyandSons,NewYork,14(1995))。例如，Davis等((2005)Proc.Natl.Acad.Sd.USA102:5981-86)使用短語小分子表示葉酸，甲氨喋呤和神經(jīng)肽，而Halpin和Harbury((2004)PLosBiology2:1022-30)使用該短語表示小分子基因產(chǎn)物，例如DNAs、RNAs和肽。天然小分子的實(shí)例包4舌，但不限于膽固醇、神經(jīng)遞質(zhì)和siRNA;合成的小分子包括，但不限于登記在許多市場(chǎng)上可買到的小分子數(shù)據(jù)庫的各種化學(xué)品，例如FCD(FineChemicalsDatabase)、SMID(SmallMoleculeInteractionDatabase)、ChEBI(ChemicalEntitiesofBiologicalInterest)和CSD(CambridgeStructuralDatabase)(參見例如，Alfarano等(2005)Nuc.AcidsRes.DatabaseIssue33:D416-24)。II.GDF-8的抗體和抗體片段A.小鼠和人源化抗體RK35本說明書提供有效結(jié)合GDF-8的新型抗體(例如完整的抗體和抗體片段)。所述抗體的非限制性的例證性實(shí)施方案稱為RK35。該例證性的實(shí)施方案以小鼠和人源化抗體和其抗體片段的形式提供。本發(fā)明的例證性抗體在此指具有獨(dú)特和有益特性的"RK35"。第一，該抗體和抗體片段能夠以高親和力結(jié)合成熟的GDF-8。第二，本發(fā)明的該抗體和抗體片段例如通過ActRIIB結(jié)合抑制和報(bào)告基因測(cè)定法表明體外和體內(nèi)抑制GDF-8活性。第三，該^公開的抗體和抗體片段例如通過提高所治療突變SOD小鼠中的肌肉質(zhì)量而表明可用于治療與GDF-8-相關(guān)病癥有關(guān)的癥狀，例如月幾肉病癥尤其是ALS。例證性的實(shí)施方案中，GDF-8拮抗劑為有^丈結(jié)合至GDF-8并且抑制一種或多種GDF-8相關(guān)活性的抗體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的抗體可用于檢測(cè)、測(cè)量和抑制源自不同物種(例如本說明書中所述的那些)的GDF蛋白。通過標(biāo)準(zhǔn)的比對(duì)算法確定同一性百分比，例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10中所述的BasicLocalAlignmentTooKBLAST)、Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48:444-53的算法或Meyers等(1988)Comput.Appl.B腦i.4:11-17的算法。通常，本發(fā)明的抗體和抗體片段可與任何蛋白質(zhì)一起使用，所述蛋白保留基本的GDF-8生物學(xué)活性并且包括與SEQIDNO:1所述的GDF-8成熟形式至少100、80、60、40、20或15個(gè)連續(xù)氨基酸的〗壬何序列至少約70%、80%、90%、95%或更高同一性的氨基酸序列。B.抗體可變結(jié)構(gòu)域完整的抗體，亦稱免疫球蛋白，通常為四聚體的糖基化蛋白，其由每條大約25kD的兩條輕(L)鏈和每條大約50kD的兩條重(H)鏈組成?？贵w中存在兩種類型的輕鏈，稱為X和K。取決于重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，免疫球蛋白分為五種主要類別A、D、E、G和M,并且其部分可進(jìn)一步分成亞類(同型)，例如IgG!、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2。每條輕鏈由N-末端可變(V)結(jié)構(gòu)域(VL)和恒定(C)結(jié)構(gòu)域(CL)組成。每條重鏈由N-末端V結(jié)構(gòu)域(VH),三個(gè)或四個(gè)C結(jié)構(gòu)域(CH)和4交鏈區(qū)組成。最接近VH的CH結(jié)構(gòu)域稱為CH1。VH和VL結(jié)構(gòu)域由名為才匡架區(qū)(FR1、FR2、FR3和FR4)的四個(gè)序列相對(duì)保守區(qū)組成，其形成對(duì)三個(gè)序列高變區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)的支架。CDR包含負(fù)責(zé)抗體與抗原相互作用的大部分殘基。CDR稱為CDR1、CDR2和CDR3。因此，重鏈上的CDR組分稱為Hl、H2和H3，而輕鏈上的CDR組分稱為L(zhǎng)l、L2和L3。CDR3為抗體-結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)分子多樣性的最大來源。例如H3可短至兩個(gè)氨基酸殘基或大于26個(gè)氨基酸。不同免疫球蛋白類別的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型為本領(lǐng)域所熟知?？贵w結(jié)構(gòu)的綜述，參見Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,eds.Harlow等，1988。本領(lǐng)域:技術(shù)人員將i人識(shí)到每種亞基結(jié)構(gòu)，例如CH、VH、CL、VL、CDR和/或FR結(jié)構(gòu)包括有活性的片I史。例如，有活性的片段可由結(jié)合抗原，即抗原-結(jié)合片段的VH、VL或CDR亞基的部分或結(jié)合和/或活化Fc受體和/或補(bǔ)體的CH亞基的部分組成。此處所用術(shù)語"抗體片段"包含的結(jié)合片段的非限制性實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHI結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab')2片段，包括通過二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段；和(vi)分離的CDR。此外，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨(dú)的基因編碼，其可通過合成接頭重組連接，產(chǎn)生其中VL和VH區(qū)域配對(duì)形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)的單個(gè)蛋白質(zhì)鏈。最常用的接頭為15個(gè)殘基(Gly4Ser)3肽，但其他接頭也是本領(lǐng)域已知的。單鏈抗體也意圖包含在術(shù)語"抗體"或抗體的"抗原-結(jié)合片段"中。這些抗體利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得，并且以與完整的抗體相同的方法篩查片段的功用。抗體多樣性由編碼可變區(qū)的多個(gè)種系基因和多種體細(xì)胞事件產(chǎn)生。體細(xì)胞事件包括可變基因片段與差異(D)和連接(J)基因片段重組以形成全長(zhǎng)VH區(qū)域，以及可變和連接基因片段重組以形成全長(zhǎng)VL區(qū)域。重組過程本身不精確，導(dǎo)致V(D)J連接處的氨基酸丟失或添加。這些多樣性機(jī)制在抗原暴露之前正發(fā)育的B細(xì)胞中出現(xiàn)?？乖碳ず?，B細(xì)胞中表達(dá)的抗體基因經(jīng)歷體細(xì)胞突變。以評(píng)估的種系基因片段、這些片段的隨機(jī)重組和隨機(jī)的VH-VL配對(duì)的數(shù)量為基礎(chǔ)，可產(chǎn)生上至1.6x1Q7的不同抗體(FundamentalImmunology,第三版(1993),Paul,RavenPress,NewYork,NY)。當(dāng)考慮促進(jìn)抗體多樣性的其他方法時(shí)(如體細(xì)月包突變)，i人為可產(chǎn)生超過1x1010的不同抗體(ImmunoglobulinGenes,第二版(1995)，Jonio等,AcademicPress,SanDiego,CA)。由于參與產(chǎn)生抗體多樣性的許多方法，具有相同抗原特異性的獨(dú)立來源的單克隆抗體可能不具有相同的氨基酸序列。因此，本發(fā)明提供結(jié)合GDF-8的新抗體。本發(fā)明的抗體片段，例如包含CDR的結(jié)構(gòu)通常為抗體重或輕鏈序列，或其活性片段，其中CDR位于相當(dāng)于天然存在的VH和VL的CDR部位。免疫^求蛋白可變結(jié)構(gòu)域(例如CDR的結(jié)構(gòu)和部位)，可利用熟知的編號(hào)方案定義，例如Kabat編號(hào)方案，Chothia編號(hào)方案，Kabat和Chothia組合(AbM)等等(參見例如,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices(1991),Kabat等；Al-Lazikani等(1997)J.Mol.Biol.273:927-48)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供新的CDR。攜帶本發(fā)明CDR的結(jié)構(gòu)通常為多肽，例如抗體重或輕鏈序列或其相當(dāng)大的部分，其中CDR位于相當(dāng)于天然存在的VH和VL區(qū)域的CDR位點(diǎn)。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和部位可如上文Kabat等和上文Al-Lazikani等中所述的而確定。本發(fā)明的抗體分子(包括抗體片l殳)，即拮抗GDF-8的抗體分子，包括但不限于鼠科單克隆抗體RK35和其變體，特別是人源化的變體。本發(fā)明的GDF-8拮抗劑除了RK35之外包括有效結(jié)合GDF-8的其他抗體，包括以高特異性結(jié)合GDF-8的抗體(例如，對(duì)TGF-(3超家族的其他成員(例如BMP-11)具有4支4氐親和力的抗體)。這些抗體的變體，包括人源化的變體也考慮在本發(fā)明的診斷、預(yù)測(cè)、監(jiān)測(cè)、治療、改善和預(yù)防方法中。這些抗體分子可用于預(yù)防或治療GDF-8-相關(guān)病癥，例如骨骼、肌肉、脂肪和葡萄糖代謝相關(guān)的病變。鼠科和人源化RK35的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為SEQIDNO:5和SEQIDNO:9。鼠科和人源化RK35的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為SEQIDNO:3和SEQIDNO:7。鼠^F和人源4tRK35可變輕鏈中的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的氨基酸序列如SEQIDNO:13、14、15、23、24和25所示。鼠科和人源化RK35可變重鏈中的三個(gè)CDR的氨基酸序列如SEQIDNO:10、11、12、20、21和22所示。如上所述，CDR包含負(fù)責(zé)與抗原相互作用的大部分殘基，并且分別包含在VH和VL結(jié)構(gòu)域，即重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)內(nèi)。因此，如果抗體包括至少一個(gè)CDR或其活性抗體片段，該CDR其包含選自SEQIDNO:10-15和20-25所示氨基酸序列的氨基酸序列，則其為本發(fā)明的抗體，即結(jié)合GDF-8并且干涉GDF-8信號(hào)的抗體。因此本發(fā)明的實(shí)施方案包括諸如抗體的多肽，其包含一個(gè)或多個(gè)CDR或其活性片段，該CDR包括選自SEQIDNO:10-15和20-25所示氨基酸序列的氨基酸序列。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的抗體包括其中VL鏈的CDR為SEQIDNO:13-15和23-25所示或VH鏈的CDR為SEQIDNO:10-12和20-22所示的抗體。抗原-結(jié)合片段可以是Fv片段，其由VH和VL結(jié)構(gòu)域組成。因此，RK35的Fv片段可組成本發(fā)明的抗體，條件是其結(jié)合GDF-8并且干涉GDF-8信號(hào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到包含諸如RK35的Fv片段的任何抗體片段也可以是本發(fā)明的抗體。另外，包含具有選自SEQIDNO:10-15和20-25所示氨基酸序列的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)CDR的任何Fv片段、scFv片段、Fab片段或F(ab，)2片段，也可以是本發(fā)明的抗體。所述抗體分子可通過本領(lǐng)域」技術(shù)人員熟知的方法產(chǎn)生。例如，單克隆抗體可通過按照已知方法生產(chǎn)雜交瘤而產(chǎn)生。以此方式形成的雜交瘤隨后利用標(biāo)準(zhǔn)方法(如酶耳關(guān)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和Biacore分析)篩查，以鑒定產(chǎn)生結(jié)合GDF-8、干涉GDF-8信號(hào)以及中和或抑制一種或多種GDF-8-相關(guān)活性的抗體的雜交瘤。重組GDF-8、天然存在的GDF-8、其任何變體以及GDF-8的抗原性肽片,殳可以用作免疫原。GDF-8抗原性肽片段包含七個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基并且包含一個(gè)表位使得該肽的抗體與GDF-8形成免疫復(fù)合物。優(yōu)選地，抗原性肽包含至少10個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少15個(gè)氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少30個(gè)氨基酸殘基。另外，優(yōu)選GDF-8的抗原性肽片段包含GDF-8受體-結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的多克隆血清和抗體可通過用GDF-8、其變體和/或其部分來免疫合適的受試者而產(chǎn)生。免疫受試者中的抗體效價(jià)可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如ELISA),或通過利用固定的GDF-8或其他標(biāo)記蛋白(例如FLAG)而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。如果需要，本發(fā)明的抗體分子可分離自受試者或培養(yǎng)基并且通過熟知的技術(shù)(如蛋白A色譜法)進(jìn)一步純化而獲得IgG組分。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括RK35Fv片段的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的抗體片段，例如Fab、F(ab')2、Fd和dAb片段可按照本領(lǐng)域熟知的方法通過裂解抗體而產(chǎn)生。例如，免疫活性的Fab和F(ab，)2片段可通過用酶(如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)處理抗體而產(chǎn)生。另外的實(shí)施方案包括如SEQIDNO:10-15和20-25所示的、任何這些VH和VL結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)CDR。一個(gè)實(shí)施方案包括如SEQIDNO:12所示的、RK35VH結(jié)構(gòu)域的H3片段。本文公開的抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域以及CDR的DNA和氨基酸(AA)序列列于表1中。為方便起見，VH和VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)的每個(gè)CDR的近似位點(diǎn)列于表2中。表l:RK35中VH、VL、CH、CL和CDR的DNA和氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表2:根據(jù)Kabat(非斜體)或AbM(斜體)定義的小鼠和人源化抗體RK35可變區(qū)內(nèi)的近似CDR位點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>抗-GDF-8抗體可進(jìn)一步包括抗體恒定區(qū)或其部分。例如，本發(fā)明的VL結(jié)構(gòu)域可以其C-末端附著于抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，例如人CK或CX鏈，優(yōu)選CX鏈。同樣，基于VH結(jié)構(gòu)域的抗原-結(jié)合片革爻可以其C-末端附著于源自任何同型抗體(例如IgG、IgA、IgE和IgM)以及任何同型亞類(尤其IgG!和IgGj的免疫球蛋白重鏈的所有或部分。例證性的實(shí)施方案中，抗體包括人IgGR的重鏈和輕鏈的C-末端片段。優(yōu)選的輕X鏈C-末端恒定片段的DNA和氨基酸序列分別如SEQIDNO:16和SEQIDNO:17所示。優(yōu)選的IgGl重鏈C-末端恒定片段的DNA和氨基酸序列分別如SEQIDNO:18和SEQIDNO:19所示。應(yīng)理解的是，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，列于表1的DNA序列僅僅為編碼目的氨基酸序列、肽和抗體的代表，而并不認(rèn)為是限制性的。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括RK35Fv片段的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域。另外的實(shí)施方案包括任何這些VH和VL結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。一個(gè)實(shí)施方案包括RK35VH結(jié)構(gòu)域的H3片段。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的VH和VL結(jié)構(gòu)域?yàn)榉N系的，即這些結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)(FR)利用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)改變以匹配人種系基因產(chǎn)物的共有氨基酸序列。此亦稱人源化的或種系抗體。其他的實(shí)施方案中，框架序列偏離種系。人源化的抗體可利用轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生，其不能表達(dá)內(nèi)源的免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但能夠表達(dá)人重鏈和輕鏈基因。C.修飾的抗體和其片段本發(fā)明另一方面提供用于獲得針對(duì)抗GDF-8的抗體抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法。技術(shù)人員將理解本發(fā)明的抗體不限于表1中列舉的VH和VL的特定序列而且包括保留這些序列的抗原-結(jié)合能力的變體。所述變體可利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)由所提供的序列獲得?？稍贔R或CDR中進(jìn)行氨基酸取代、缺失或添加。雖然框架區(qū)中的改變通常設(shè)計(jì)成提高抗體的穩(wěn)定性以及降低其免疫原性，CDR中的改變通常設(shè)計(jì)成增強(qiáng)抗體對(duì)于其粑標(biāo)的親和力。所述親和力-增強(qiáng)的改變通常通過改變CDR并且4全測(cè)抗體而憑經(jīng)-驗(yàn)確定。所述改變可纟艮據(jù)例如AntibodyEngineering,第二版，Borrebaeck,ed.,OxfordUniversityPress,1995中所述的方法完成。因此，本發(fā)明的抗體也包括結(jié)合GDF-8、干涉GDF-8信號(hào)并且在重鏈和輕鏈恒定區(qū)具有突變的那些。有時(shí)需要突變和滅活某些恒定區(qū)的片段。例如，有時(shí)需要重恒定區(qū)的突變以產(chǎn)生減少結(jié)合Fc受體(FcR)和/或補(bǔ)體的抗體；所述突變?yōu)楸绢I(lǐng)i或所熟知。本領(lǐng)域:技術(shù)人員還會(huì)認(rèn)識(shí)到確定CL和CH亞基的哪個(gè)活性片段是必須的將取決于本發(fā)明抗體的應(yīng)用。例如，以其共價(jià)鍵相互連接的CL和CH亞基的活性片段在完整抗體的產(chǎn)生中將是重要的。制備此處所述的VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變體的VH結(jié)構(gòu)域的方法包括在目前公開的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，選擇性地組合VH結(jié)構(gòu)域從而具有一個(gè)或多個(gè)以及(優(yōu)選)檢測(cè)所述抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)一種或多種GDF-8-相關(guān)活性的能力。VL結(jié)構(gòu)域可能具有基本如此處所述的氨基酸序列?？蓱?yīng)用類似的方法，其中此處公開VL結(jié)構(gòu)域的一種或多種序列變體與一種或多種VH結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。本發(fā)明另一方面提供制備與GDF-8相互作用的抗原-結(jié)合片l殳的方法。該方法包4舌(a)提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的起始組分(repertoire),所述VH結(jié)構(gòu)域或包括所要取代的CDR(例如CDR3)或缺乏CDR(例如CDR3)編碼區(qū)域的VH結(jié)構(gòu)域；(b)將該組分與編碼供體CDR的供體核酸組合，其包括SEQIDNO:2或6的活性片l殳，例如編碼SEQIDNO:3或7所示氨基酸序列的供體核酸，使得供體核酸插入組分中例如CDR3區(qū)域的CDR中以提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的產(chǎn)物組分；(c)表達(dá)產(chǎn)物組分的核酸；(d)選擇與GDF-8相互作用的抗原-結(jié)合片段；和(e)回收選擇的抗原-結(jié)合片段或編碼其的核酸。此外，可應(yīng)用類似的方法，其中本發(fā)明的VLCDR(例如L3)與或包括所要取代的CDR或缺乏CDR編碼區(qū)域的編碼VL結(jié)構(gòu)域的核酸組分結(jié)合。本發(fā)明的CDR編碼序列(例如CDR3)可利用重組DNA技術(shù)導(dǎo)入缺乏CDR(例如CDR3)的可變結(jié)構(gòu)域組分中。例如，Marks等(1992)Bio/Technology10:779-83描述了產(chǎn)生抗體可變結(jié)構(gòu)域組分的方法，其中定向或接近于可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域5，端的共有引物用于連接人VH基因第三框架區(qū)的共有引物以提供缺乏CDR3的VH可變結(jié)構(gòu)域的組分。該組分可與特定抗體的CDR3相結(jié)合。利用類似的技術(shù)，本發(fā)明源自CDR3的序列可用缺乏CDR3的VH或VL結(jié)構(gòu)域組分改組(shuffle),改組的全長(zhǎng)VH或VL結(jié)構(gòu)域與同源的VL或VH結(jié)構(gòu)域結(jié)合以提供本發(fā)明的抗原結(jié)合片段。該組分可隨后在合適的宿主系統(tǒng)中展示，如WO92/01047的噬菌體展示系統(tǒng)，以便能夠選擇合適的抗原結(jié)合片段。類似的改組或組合技術(shù)也由Stemmer(1994)Nature370:389-91公開，其描述了與P-乳糖酶基因有關(guān)的技術(shù)但觀察到該方法可用于產(chǎn)生抗體。另外的替代方案為利用一個(gè)或多個(gè)所選VH和/或VL基因的隨機(jī)誘變以產(chǎn)生整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變而產(chǎn)生攜帶本發(fā)明的源自CDR序列的新VH或VL區(qū)域。所述技術(shù)在Gram等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:3576-80中通過利用易錯(cuò)PCR描述?？捎糜诋a(chǎn)生新抗體或其片段的另一種方法為直接誘變VH或VL基因的CDR。所述技術(shù)在Barbas等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:3809-13和Schier等(1996)J.Mol.Biol.263:551-67中公開。同樣，一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)CDR可移才直入VH或VL結(jié)構(gòu)域的組分中，其隨后篩查GDF-8的結(jié)合伴侶或結(jié)合片段。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的大部分將包括至少CDR和選擇性地來自此處所述抗體片l殳的其插入框架區(qū)。該部分也包括FR1和FR4紙已或全部的至少約50%,50%為50%的FR1C-末端和50%的FR4N-末端。可變結(jié)構(gòu)域大部分的N-末端或C-末端其他的殘基可以是通常與天然存在的可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域無關(guān)的那些。例如，通過重組DNA才支術(shù)產(chǎn)生的本發(fā)明抗體片段的構(gòu)建可以使得導(dǎo)入由引入的接頭所編碼的N-或C-末端殘基以便于克隆或其他操作步驟。其他操作步驟包括接頭導(dǎo)入以連接本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域至另外的蛋白質(zhì)序列，包括以下更詳細(xì)地論述的免疫球蛋白重鏈、其他的可變結(jié)構(gòu)域(例如雙鏈抗體的產(chǎn)生)或蛋白標(biāo)記物。雖然實(shí)施例中舉例說明的實(shí)施方案包括VH和VL結(jié)構(gòu)域的"配，，對(duì)，本發(fā)明還包含含有單個(gè)可變域的、源自VH或VL結(jié)構(gòu)域序列(尤其是VH結(jié)構(gòu)域)的結(jié)合片段，例如dAb片段。任何一個(gè)單鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域的情況下，這些結(jié)構(gòu)域可用于篩選能夠形成能結(jié)合GDF-8的兩個(gè)-結(jié)構(gòu)域抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域。此可通過利用如WO92/01047中公開的所謂分級(jí)雙組合方法的噬菌體展示篩選法實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)中，包含或H或L鏈克隆的單一克隆用于感染編碼另一種鏈(L或H)的克隆全長(zhǎng)文庫并且根據(jù)如參考文獻(xiàn)中所述的噬菌體展示技術(shù)選擇得到的兩條-鏈抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該技術(shù)也在Marks等，上文中公開?？贵w可通過化學(xué)方法與放射性核素、藥物、大分子或其他試劑偶聯(lián)，并且可制備成包括本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)CDR的融合蛋白?？贵w融合蛋白包含VH-VL對(duì)，其中這些鏈(通常VH)之一和另一種蛋白質(zhì)作為單個(gè)多肽鏈合成。這類產(chǎn)物不同于抗體，其通常具有另外的功能元件-小分子的活性部分或偶聯(lián)或融合的大分子的主要分子結(jié)構(gòu)特征。除了如上所述對(duì)氨基酸序列的改變之外，抗體可以糖基化、聚乙二醇化或連接至白蛋白或非蛋白質(zhì)聚合物。例如，抗-GDF-8抗體可連接至多種非蛋白質(zhì)聚合物的一種，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯?？贵w可以是化學(xué)修飾的，例如通過共價(jià)偶聯(lián)至聚合物而提高其循環(huán)半衰期。例證性的聚合物和將其附著至肽的方法為本領(lǐng)域所知。其他的實(shí)施方案中，抗體可以修飾以具有改變的糖基化類型(即相對(duì)于原始的或天然的糖基化類型)。如此處所用，"改變的"指具有一個(gè)或多個(gè)糖類部分缺失，和/或具有一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)添加至原始的抗體。糖基化位點(diǎn)添加至抗-GDF-8抗體通過改變氨基酸序列以包含糖基化位點(diǎn)共有序列的熟知方法實(shí)現(xiàn)。提高抗體上糖類部分?jǐn)?shù)目的另一種方法為通過糖苷化學(xué)或酶促偶聯(lián)至抗體的氨基酸殘基?？贵w上任何糖類部分的除去可如本領(lǐng)域已知的那樣化學(xué)或酶促實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的抗體還可用可沖全測(cè)的或功能性的標(biāo)記物如1311或99Tc標(biāo)記，該標(biāo)記物可利用本領(lǐng)域已知的常規(guī)化學(xué)過程附著于本發(fā)明的抗體。標(biāo)記物還包括如辣根過氧化酶或堿性磷酸酶的酶標(biāo)記物。標(biāo)記物進(jìn)一步包括化學(xué)部分如生物素，其可通過結(jié)合特定的同源可檢測(cè)部分，例如標(biāo)記的抗生物素蛋白而4企測(cè)。其中CDR序列僅非實(shí)質(zhì)性地不同于列于表1的那些的抗體包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。非實(shí)質(zhì)差異包括微小的氨基酸改變，例如CDR序列中任何五個(gè)氨基酸中一個(gè)或兩個(gè)的取代。通常，氨基酸被具有類似電荷、疏水性或立體化學(xué)特性的相關(guān)氨基酸取代。所述取代在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的理解范圍之內(nèi)。結(jié)構(gòu)框架區(qū)(FR)可比CDR更實(shí)質(zhì)性地改變而不負(fù)面影響抗體結(jié)合性質(zhì)。FR的改變包括，但不限于人源化非人類來源的框架或遺傳改造對(duì)抗原接觸或?qū)Ψ€(wěn)定結(jié)合位點(diǎn)重要的某些框架殘基，例如改變恒定區(qū)的類或亞類、改變可能改變效應(yīng)物功能(如Fc受體結(jié)合)的特定的氨基酸殘基(例如Lund等(1991)J.Immunol.147:2657-62;Morgan等(1995)Immunology86:319-24)，或改變恒定區(qū)所來源的物種?？贵w可具有重鏈CH2區(qū)域的突變，其降低或改變效應(yīng)物功能，例如Fc受體結(jié)合和補(bǔ)體激活。例如抗體可具有如美國(guó)專利No.5,624,821和5,648,260中所述的那些突變。例如IgGl或IgG2重鏈中，所述突變可在SEQIDNO:19的氨基酸殘基117和120處，其代表IgGl的Fc部分(這些殘基相當(dāng)于IgGl或IgG2全長(zhǎng)序列的氨基酸234和237)?？贵w還可以具有穩(wěn)定免疫球蛋白的兩條重鏈之間二硫鍵的突變，如在例如Angal等(1993)Mol.Immunol.30:105-08中所公開的IgG4鉸鏈區(qū)的突變。本發(fā)明的多肽和抗體還包含結(jié)構(gòu)上不同于所公開多肽和抗體的蛋白質(zhì)，例如其與所公開的多肽和抗體具有改變的序列但基本相同的生物化學(xué)性質(zhì)，例如僅在功能上非必要氨基酸中具有改變。所述分子頁包括天然存在的等位變體和有意遺傳改造(包含改變、取代、替換、插入或缺失)的變體。用于所述改變、取代、替代、插入或缺失的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明的抗體可另外利用轉(zhuǎn)基因的非人類動(dòng)物產(chǎn)生，其經(jīng)修如，PCT出版物WO94/02602。非人宿主中編碼重和輕免疫球蛋白鏈的內(nèi)源性基因已喪失能力，并且編碼人重鏈和輕鏈免疫球蛋白的活性基因座插入該宿主基因組中。人基因例如利用包含必要的人DNA片段的酵母人工染色體摻入。提供所有所需修飾的動(dòng)物隨后通過雜交包含比全部修飾補(bǔ)體更少的中間轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而作為子代獲得。所述非人動(dòng)物的一個(gè)實(shí)施方案為小鼠，并且如PCT出版物WO96/33735和WO96/34096所公開一皮稱為XENOMOUSETM。該動(dòng)物產(chǎn)生完全分泌人免疫球蛋白的B細(xì)胞?？贵w可在用目的免疫原，例如作為多克隆抗體的制劑免疫后直接獲自該動(dòng)物，或者直接獲自源自該動(dòng)物的永生化的B細(xì)胞，如產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。另外，可回收編碼具有人可變區(qū)的免疫球蛋白的基因并且表達(dá)以直接獲得抗體，或可進(jìn)一步修飾以獲得抗體類似物，例如單鏈Fv分子。因此，如此處所用的術(shù)語抗體包括完整的抗體、抗體片段，例如Fab、F(ab，)2Fd、dAb和scFv片段，以及已經(jīng)在其恒定和/或可變區(qū)中突變(例如突變以產(chǎn)生嵌合的、部分人源化的或完全人源化的抗體，以及產(chǎn)生具有所需特性的抗體，例如增強(qiáng)的GDF-8結(jié)合和/或降低的FcR結(jié)合)的完整抗體和片段。所述這些抗體包括在本發(fā)明的范圍中，條件是該抗體特異地結(jié)合GDF-8,干涉GDF-8信號(hào)和/或中和或抑制一種或多種GDF-8-相關(guān)活性。也可采用其他的蛋白結(jié)合分子調(diào)節(jié)GDF-8的活性。所述蛋白結(jié)合分子包括小的模塊化免疫藥物(SMI)藥品(TrubionPharmaceuticals,Seattle,WA)。SMIP為由用于同源結(jié)構(gòu)(如4元原、拮抗受體等等)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域、具有一個(gè)或沒有半胱氨酸殘基的鉸鏈-區(qū)多肽以及免疫球蛋白CH2和CH3結(jié)構(gòu)域組成的單鏈多肽(也參見www.tmbion.com)。SMIP和其用途及應(yīng)用在例如美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)朜o.2003/0118592、2003/0133939、2004/0058445、2005/0136049、2005/0175614、2005/0180970、2005/0186216、2005/0202012、2005/0202023、2005/0202028、2005/0202534和2005/0238646以及其相關(guān)的專利族成員中公開，其所有在此通過引用整體引入。本發(fā)明抗體的結(jié)合能力可通過以下方法測(cè)定Biacore分沖斤、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、X射線結(jié)晶學(xué)、序列分析和以下實(shí)施例所述掃描i秀變，以及本領(lǐng)域熟知的其他方法。本發(fā)明抗體中和和/或抑制一種或多種GDF-8-相關(guān)活性的能力可通過下列非限制性方法測(cè)定測(cè)量GDF-8-依賴的細(xì)胞系增殖的測(cè)定法；測(cè)量GDF-8-介導(dǎo)的多肽表達(dá)的測(cè)定法；測(cè)量下游信號(hào)分子活性的測(cè)定法；檢測(cè)本發(fā)明抗體預(yù)防相關(guān)的動(dòng)物才莫型中肌肉病癥的效率的測(cè)定法；以下實(shí)施例中所述的測(cè)定法；以及本領(lǐng)^或熟知的其4也測(cè)定法。本發(fā)明另一方面提供選4奪能夠結(jié)合GDF-8并且中和和/或抑制一種或多種GDF-8-相關(guān)活性的抗體的方法。該方法包^fe:a)將大量抗體與GDF-8締合；b)選擇結(jié)合GDF-8的抗體；c)檢測(cè)所選擇的抗體阻止GDF-8結(jié)合GDF-8受體的能力；和d)選擇能夠阻止GDF-8結(jié)合其受體的抗體。本發(fā)明的抗-GDF-8抗體也可用于分離、純化和/或檢測(cè)上清液、細(xì)胞裂解物或細(xì)胞表面上的GDF-8。本發(fā)明中公開的抗體可作為臨床檢驗(yàn)方法的一部分診斷性地用于監(jiān)測(cè)GDF-8蛋白水平。另外，本發(fā)明的抗體可用于需要中和和/或抑制一種或多種GDF-8-相關(guān)活性的治療中，例如ALS和其^也月幾肉-相關(guān)病理學(xué)的治療。本發(fā)明也提供與針對(duì)抗人GDF-8新抗體有關(guān)的新分離和純化的多核苷酸和多肽。本發(fā)明的基因、多核苷酸、蛋白質(zhì)和多肽包括但不限于，GDF-8的鼠科和人源化的抗體(例如RK35)和其變體。D.核酸、克隆和表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼本發(fā)明抗體的分離和純化的核酸。根據(jù)本發(fā)明的核酸可包括DNA或RNA并且可以是全部或部分合成的。除非上下文另有需要，在此所述的核苷酸序列的參照包含具有指定序列或基因組同等物的DNA分子，以及具有其中U取代T的指定序列的RNA分子。例如，本發(fā)明提供編碼鼠科GDF-8抗體可變區(qū)的純化和分離的多核苷酸，其調(diào)節(jié)一種或多種GDF-8-相關(guān)活性(例如中和GDF-8生物活性)(RK35)以及人源化的RK35型。本發(fā)明優(yōu)選的DNA序列包括基因組、cDNA和化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的核苷酸序列包括編碼SEQIDNCh4所示小鼠RK35輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，包括編碼輕鏈可變區(qū)序列前的前導(dǎo)序列的核苷酸序列，例如SEQIDNO:30所示的核苷酸序列(核普酸l-60對(duì)應(yīng)前導(dǎo)序列，并且核苷酸61-381對(duì)應(yīng)SEQIDNO:4)。本發(fā)明的核苷酸序列包括編碼SEQIDNO:2所示小鼠RK35重鏈可變區(qū)的核香酸序列，包括編碼重鏈可變區(qū)序列前的前導(dǎo)序列的核苷酸序列，例如SEQIDNO:28所示的核苦酸序列(核苷酸l-57對(duì)應(yīng)前導(dǎo)序列，而核苦酸58-405對(duì)應(yīng)SEQIDNO:2)。本發(fā)明的核苷酸序列還包括分別如SEQIDNO:6和8所示的重《連和輕鏈可變區(qū)的人源化序列。本發(fā)明的多核普酸還包4舌在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO:2、4、6和8中所示核酸序列及其互補(bǔ)物雜交，和/或編碼保留可變區(qū)基本生物學(xué)活性多肽(即活性片段)的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸還包括SEQIDNO:2、4、6和8所示序列的連續(xù)部分，包括至少15個(gè)連續(xù)的核苦酸。小鼠RK35可變輕鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。小鼠RK35可變輕鏈結(jié)構(gòu)域前的前導(dǎo)序列的氨基酸序列的實(shí)例如SEQIDNO:31所示。RK35可變重鏈的氨基酸序列以SEQIDNO:3所示。小鼠RK35可變重鏈結(jié)構(gòu)域前的前導(dǎo)序列的氨基酸序列的實(shí)例如SEQIDNO:29所示。人源化的可變重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別以SEQIDNO:7和9所示。小鼠RK35重鏈內(nèi)包含的CDR的氨基酸序列以SEQIDNO:10-12和20-22所示。小鼠RK35輕鏈內(nèi)包含的CDR的氨基酸序列以SEQIDNO:13-15和23-25所示。本發(fā)明的多肽還包括基本上如SEQIDNO:3、5、7、9、10-15和20-25所示序列的任何連續(xù)部分，包括至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸。本發(fā)明優(yōu)選的多肽保留本發(fā)明抗體的基本生物學(xué)活性的、包括SEQIDNO:3、5、7、9、10-15所示序列的任何連續(xù)部分。除如上所述的多核苷酸之外，本發(fā)明還包括編碼基本如SEQIDNO:3、5、7、9和10-15所示氨基酸序列或其連續(xù)的部分，以及^5l由于熟知的遺傳密碼簡(jiǎn)并性而不同于上述多核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明分離的多核苦酸可用作雜交探針和引物以鑒定和分離具有與編碼所公開多核苷酸的序列相同或類似的核酸。用這種方式分離的多核苷酸可例如用于產(chǎn)生GDF-8或其他TGF-卩家族成員的抗體或筌定表達(dá)所述抗體的細(xì)胞。鑒定和分離核酸的雜交方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、Southern雜交、原位雜交和Northern雜交，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。雜交反應(yīng)在不同嚴(yán)謹(jǐn)度的條件下進(jìn)行。雜交反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)度包括任何兩種核酸分子相互雜交的難度。優(yōu)選地，每個(gè)雜交多核苷酸在降低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，更優(yōu)選嚴(yán)謹(jǐn)條件下，并且最優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至其相應(yīng)的多核苷酸。嚴(yán)謹(jǐn)度條件的實(shí)例在以下表3中顯示高嚴(yán)謹(jǐn)條件為至少如條件A-F的嚴(yán)謹(jǐn)；嚴(yán)謹(jǐn)條件為至少如條件G-L的嚴(yán)謹(jǐn)；而降低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件為至少如條件M-R的嚴(yán)謹(jǐn)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>1雜交物長(zhǎng)度為預(yù)期雜交多核苷酸雜交區(qū)域的長(zhǎng)度。當(dāng)多核苷酸雜交至未知序列的耙標(biāo)多核苷酸時(shí)，雜交物長(zhǎng)度假定為雜交多核苷酸的長(zhǎng)度。當(dāng)已知序列的多核苷酸雜交時(shí)，雜交物長(zhǎng)度可通過比對(duì)多核苷酸序列并且鑒定該區(qū)域或最優(yōu)序列互補(bǔ)性區(qū)域而確定。2雜交和洗滌緩沖液中SSPE(lxSSPE為0.15MNaCl,10mMNaH2P04和1.25mMEDTA,pH7.4)可替代SSC(lxSSC為0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)；洗滌在雜交完成后進(jìn)4于15分鐘。Tb*_tr*:預(yù)期小于50個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的雜交物的雜交溫度應(yīng)當(dāng)?shù)陀陔s交物的解鏈溫度(Tm)5-10°C,其中Tm根據(jù)下列等式確定。對(duì)于小于18個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的雜交物，Tm(°C)=2(A+T堿基)+4(G+C堿基)。對(duì)于18和49個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度之間的雜交物，Tm(°C)=81.5+16.6(log10Na+)+0.41(%G+C)-(600/N),其中N為雜交物中堿基數(shù)，并且Na+為雜交緩沖液中鈉離子濃度(lXSSC的Na^0.165M)。其他多核苷酸雜交嚴(yán)謹(jǐn)度條件的其他實(shí)例提供于Sambrook等，Mo/ecw/arC7om'wg.'J丄aZora/o^yMaw皿/,Chs.9&11,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1989),和Ausubel等,eds.,/Votoco/sz力A/o/ecwAarSz'o/ogy,Sects.2.10&6.3-6.4,JohnWiley&Sons，Inc.(1995),此處通過引用引入。本發(fā)明的分離多核苷酸可用作雜交探針和引物以筌定和分離具有編碼所公開多核苷酸等位變體序列的DNA。等位變體為所公開多核苷酸天然存在的替代形式，其編碼與所公開的多核苷酸編碼的多肽相同或與其具有顯著相似性的多肽。優(yōu)選地，等位變體具有與所公開的多核苷酸至少90%序列同一性(更優(yōu)選至少95%同一性；最優(yōu)選至少99%同一性)。本發(fā)明的分離多核苷酸還可用作雜交探針和引物以鑒定和分離具有編碼與所公開多核苷酸相同的多肽序列的DNA。這些同系物為分離自與所公開多肽和多核苷酸不同的物種或在相同的物種內(nèi)，但具有與所公開多核苷酸和多肽顯著序列相似性的多核苷酸和多肽。優(yōu)選地，多核苷酸同系物具有與所公開多核苷酸至少50%序列同一性(更優(yōu)選至少75%同一性；最優(yōu)選至少90%同一性)，而多肽同系物具有與所公開抗體/多肽至少30%序列同一性(更優(yōu)選至少45%同一性；最優(yōu)選至少60%同一性)。優(yōu)選地，所公開多核苷酸和多肽的同系物分離自哺乳動(dòng)物物種。本發(fā)明的分離多核苷酸還可用作雜交探針和引物以鑒定表達(dá)本發(fā)明抗體的細(xì)月包和組織以及表達(dá)其的條件。另外，本發(fā)明的分離多核苷酸可用于改變(即增強(qiáng)、降低或改變)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明多核苷酸的基因在細(xì)胞或生物體中的表達(dá)。這些"對(duì)應(yīng)基因"為本發(fā)明的基因組DNA序列，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生本發(fā)明的多核苷酸來源的mRNA。本發(fā)明還提供質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的構(gòu)建體，其包括如上的至少一種本發(fā)明的核酸。本發(fā)明的分離多核苷酸可有效地(operably)連接至表達(dá)調(diào)控序列用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。另外本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的多核苦酸可有效地連接至編碼不同抗體同型恒定區(qū)的熟知的核苷酸序列。例如，編碼本發(fā)明輕鏈可變區(qū)(例如SEQIDNO:4或8所示序列)的本發(fā)明的多核苷酸可有效地連接至編碼k輕鏈或X輕鏈恒定區(qū)(或其衍生物)的核苷酸序列，使得連接的核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生具有特異性結(jié)合和中和GDF-8的可變區(qū)的完全的k或X輕鏈。同樣，編碼本發(fā)明重鏈可變區(qū)(例如SEQIDNO:2或6中所示序列)的本發(fā)明的多核苷酸可有效地連接至編碼重鏈同型恒定區(qū)(或其書f生物)，例如IgM、IgD、IgE、IgG和IgA的核苦酸序列。表達(dá)重組蛋白質(zhì)的常規(guī)方法為本領(lǐng)域所熟知。所述重組蛋白質(zhì)可以可溶形式表達(dá)，用于治療與GDF-8活性有關(guān)的病癥，例如月幾肉和骨骼退4亍性病癥。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可攜帶其他的序列，如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))、標(biāo)簽序列(如組氨酸)和篩選標(biāo)記基因。篩選標(biāo)記基因便于選擇已導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞。例如，通常篩選標(biāo)記基因(如G418、潮霉素或氨曱喋呤)賦予抗藥性給已導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞，。優(yōu)選的篩選標(biāo)記基因包括二氳葉酸還原酶(DHFR)基因(用于具有氨甲喋呤選擇/擴(kuò)增的dhfr-宿主細(xì)胞中)和neo基因(用于G418選擇)?？蛇x擇或構(gòu)建合適的載體，其包含合適的調(diào)控序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和視情況而定的其他序列。載體可以是質(zhì)?；虿《?，例如一見情況而定為噬菌體或喧粒。為了解詳情參見，例如MolecularCloning:aLaboratoryManual:第二版,Sambrook等,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989。例如核酸構(gòu)建體的制備、突變、測(cè)序、DNA導(dǎo)入細(xì)胞和基因表達(dá)以及蛋白質(zhì)分析中用于核酸操作的許多已知技術(shù)和方案在CurrentProtocolsinMolecularBiology,第二版,Ausubel等,JohnWiley&Sons,1992中詳細(xì)描寫。本發(fā)明還提供包括如上的一種或多種構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。編碼任何此處提供的CDR(H1、H2、H3、Ll、L2或L3)、VH或VL結(jié)構(gòu)域或抗原-結(jié)合片段的核酸形成本發(fā)明的一個(gè)方面。本發(fā)明還包括通過在宿主細(xì)l包中表達(dá)來自編碼核酸的蛋白質(zhì)而產(chǎn)生肽的方法。表達(dá)可通過在合適的條件下培養(yǎng)包含該核酸的重組宿主細(xì)i包而實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的特異性抗體片段，VH和/或VL結(jié)構(gòu)域以及編碼核酸分子和載體可以分離和純化的形式提供，例如從其自然環(huán)境，以基本上純的或均一的形式，或?qū)τ诤怂?，沒有或基本上沒有非編碼具有所需功能多肽的序列來源的核酸或基因。許多細(xì)胞系為用于本發(fā)明的多肽和抗體重組表達(dá)的合適的宿主細(xì)胞。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括，例如COS纟田月包、CHO細(xì)胞、293T細(xì)月包、A431纟田月包、3T3纟田月包、CV-1纟田月包、HeLa細(xì)月包、L細(xì)月包、BHK21細(xì)胞、HL-60細(xì)胞、U937細(xì)胞、HaK細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞，以及源自原代組織和原代外植體體外培養(yǎng)的細(xì)胞林。所述宿主細(xì)胞還允許剪接由基因組DNA組成的本發(fā)明的多核苷酸?；蛘?，可以在較低等的真核生物如酵母或在原核生物中重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽和抗體?？赡芎线m的酵母菌林包括釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、克盧費(fèi)氏酵母屬菌林和假絲酵母屬菌抹?？赡芎线m的菌林包括大腸桿菌、枯草桿菌和鼠傷寒沙門氏菌。如果本發(fā)明的多肽在酵母或細(xì)菌中制備，其可能有必要例如通過合適位點(diǎn)的磷酸化或糖基化修飾以獲得功能性的蛋白質(zhì)。所述共價(jià)吸附可利用熟知的化學(xué)或酶促方法完成。本發(fā)明的多肽和抗體還可通過將本發(fā)明的分離多核苷酸有效地連接至一種或多種昆蟲表達(dá)載體(如桿狀病毒載體)中的合適的調(diào)控序列并且利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)而重組產(chǎn)生。用于桿狀病毒/Sf9表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法為市場(chǎng)上可買到的試劑盒形式(例如MAXBAC⑧試劑盒,Invitrogen,Carlsbad,CA)。在合適的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)后，可利用已知的純化方法，和抗體。純化還可包括用已知結(jié)合本發(fā)明多肽和抗體的試劑的親和層析。這些純化方法還可用于從天然來源純化本發(fā)明的多肽和抗體?；蛘撸景l(fā)明的多肽和抗體可以〗更于純化的形式重組表達(dá)。例如，多肽可以表達(dá)為與蛋白(例如麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或硫氧還蛋白(TRX))的融合體。表達(dá)和純化所述融合蛋白的試劑盒為分別從NewEnglandBioLabs(Beverly,MA)、Pharmacia(Piscataway,NJ)和Invitrogen市售購(gòu)買。本發(fā)明的多肽和抗體還可用小表位標(biāo)記且隨后利用該表位的特異性抗體鑒定或純化。優(yōu)選的表位為FLAG表位，其為可從EastmanKodak(NewHaven,CT)買到的。本發(fā)明的多肽和抗體還可通過已知的常規(guī)化學(xué)合成產(chǎn)生。用于化學(xué)合成本發(fā)明多肽和抗體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。所述化學(xué)合成的多肽和抗體可具有與天然純化的多肽和抗體同樣的生物學(xué)特性，并且因此可作為天然的多肽和抗體的生物學(xué)活性或免疫代替物而應(yīng)用。本發(fā)明另一方面提供包括此處公開的核酸、多肽、載體或抗體和其片段的宿主細(xì)胞。更進(jìn)一步的方面提供包括將本發(fā)明的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。導(dǎo)入可應(yīng)用任何有效的纟支術(shù)。對(duì)于真核細(xì)力包，合適的技術(shù)可包括磷酸釣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或另一種病毒例如牛痘或用于昆蟲細(xì)胞的桿狀病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和利用噬菌體的感染。核酸導(dǎo)入后可引起或允許^^人該核酸產(chǎn)生蛋白質(zhì)，例如通過在適于基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。所述條件為本領(lǐng)域所熟知。III.治療、改善、預(yù)防和抑制骨、脂肪、葡萄糖代謝、胰島素和肌肉病癥發(fā)展的方法ALS中涉及GDF-8以及本發(fā)明新抗體的發(fā)現(xiàn)使得能夠進(jìn)行治療、減輕和改善GDF-8-相關(guān)病癥的方法，例如肌肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨骼退行性病癥、代謝性或誘導(dǎo)的骨病癥、葡萄糖代謝病癥、脂肪病癥和力夷島素-相關(guān)病癥。此外，抗體允許通過測(cè)量生物樣品中GDF-8的水平而診斷、預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)骨、肌肉、脂肪或胰島素病癥的發(fā)展。尤其，本發(fā)明的抗體可用于治療患有ALS或其他肌肉病癥的個(gè)體，或可用于辨別患者是否患有ALS或另一種月幾肉病癥的方法中。本發(fā)明的抗體和其他的分子可用于預(yù)防、診斷或治療人或動(dòng)物中的各種醫(yī)療病癥。該抗體可用于抑制或降^氐一種或多種與GDF-8有關(guān)的活性。最優(yōu)選，該抗體抑制或降低相對(duì)于未結(jié)合的GDF-8活性的一種或多種GDF-8活性。某些實(shí)施方案中，GDF-8的活性當(dāng)由一種或多種抗-GDF-8抗體結(jié)合時(shí)相對(duì)于未通過一種或多種抗-GDF-8抗體結(jié)合的成熟GDF-8蛋白被抑制至少50%,優(yōu)選至少60、62、64、66、68、70、72、72、76、78、80、82、84、86或88%,更優(yōu)選至少90、91、92、93或94%,并且甚至更優(yōu)選至少95%至100%。GDF-8活性的抑制或中和可在例如Thies等，上文中所述的pGL3(CAGA)12才艮告基因測(cè)定法(RGA)和實(shí)施例中舉例說明的ActRIIB受體測(cè)定法中測(cè)定。通過GDF-8抗體診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、治療、改善或預(yù)防的醫(yī)療病癥為GDF-8相關(guān)病癥，例如，月幾肉或神經(jīng)月幾肉病癥，包4舌例如，肌營(yíng)養(yǎng)不良(MD;包括Duchenne，s肌營(yíng)養(yǎng)不良)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、肌肉萎縮、器官萎縮、虛弱、管綜合癥、充血的梗阻性肺病、骨骼月幾減少癥、惡病質(zhì)和其他的月幾肉損4毛綜合癥(例如由其4也疾病和病情引起)。此外，可通過GDF-8抗體診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、治療、改善或預(yù)防的其他醫(yī)療病癥為脂肪組織病癥，例如肥胖、2型糖尿病、葡萄糖耐受性減低、代謝性綜合癥(例如X綜合癥)、由創(chuàng)傷(如燒傷或氮不平衡)誘導(dǎo)的胰島素抵抗或骨骼退行性疾病(例如骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等等)。優(yōu)選實(shí)施方案中，通過GDF-8抗體診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、治療、改善或預(yù)防的醫(yī)療病癥為肌肉或神經(jīng)月幾肉病癥。更優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過GDF-8抗體診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、治療、改善或預(yù)防的醫(yī)療病癥為MD或ALS。本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的GDF-8拮抗劑(例如抑制GDF-8活性的抗體)診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、治療、改善或預(yù)防的肌肉或神經(jīng)肌肉病癥為ALS?？赏ㄟ^GDF-8拮抗劑i貪斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、治療、改善或預(yù)防的其他醫(yī)療病癥為與骨損失有關(guān)的病癥，其包括骨質(zhì)疏+》癥，尤其在老年人和/或經(jīng)絕后的婦女中、糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥-相關(guān)的骨折。其他靶代謝性骨疾病和病癥包括由于慢性糖皮質(zhì)激素治療引起的低骨質(zhì)量、早期的性腺衰竭、雄激素抑制、維生素D缺乏、繼發(fā)性曱狀旁腺功能亢進(jìn)、營(yíng)養(yǎng)缺陷和神經(jīng)性厭食?？贵w優(yōu)選用于診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、治療、改善或預(yù)防哺乳動(dòng)物，尤其人的所述病癥。本發(fā)明的抗體以治療有效量給予。通常，治療有效量可隨受試者年齡、病情和性別，以及受試者中醫(yī)療病情的嚴(yán)重程度而變化。劑量可由醫(yī)師確定并且根據(jù)需要調(diào)整，以適合觀察到的治療效果。所述化合物的毒性和治療效力可通過細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法確定，例如用于確定LD5Q(群體50%的致死劑量)和ED50(群體50%的治療有效劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比例，即LD5()/ED50為治療指數(shù)，并且優(yōu)選表現(xiàn)出大的治療指數(shù)的抗體。獲自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可用于配制用于人中的劑量范圍。所述化合物的劑量?jī)?yōu)選處于包括帶有少量毒性或不具毒性的ED50劑量的血液循環(huán)濃度范圍之內(nèi)。此劑量可以在此范圍內(nèi)變動(dòng)，取決于劑型和給藥途徑。對(duì)于在本發(fā)明方法中使用的任何抗體，可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法初步估算出治療有效劑量。根據(jù)動(dòng)物模型可配制此劑量，使之達(dá)到包括如在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的IC5o(即達(dá)到對(duì)癥狀半數(shù)最大抑制或生物學(xué)活性半數(shù)最大抑制的檢測(cè)抗體的濃度)在內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍。例如利用高效液相層析可測(cè)定血漿中的水平?？赏ㄟ^合適的生物測(cè)定法監(jiān)測(cè)任何特定劑量的效果，包括但不限于，DNA復(fù)制測(cè)定法、基于轉(zhuǎn)錄的測(cè)定法、GDF-8蛋白/受體結(jié)合測(cè)定法、肌酸激酶測(cè)定法、基于前成脂肪細(xì)胞分化的測(cè)定法、基于脂肪細(xì)胞中葡萄糖攝取的測(cè)定法和免疫學(xué)測(cè)定法。通常，組合物以使得抗體或其結(jié)合片段在以l昭/kg至150mg/kg、l|tig/kg至100mg/kg、lpg/kg至50mg/kg、l|tig/kg至20mg/kg、ljig/kg至10mg/kg、lpg/kg至lmg/kg、10|ig/kg至lmg/kg、10^g/kg至100pg/kg、IOO昭至lmg/kg和500^g/kg至lmg/kg的劑量給予而給藥。優(yōu)選，抗體作為丸劑劑量給予，以在該劑量給予后最長(zhǎng)時(shí)間最大化抗體的循環(huán)水平。連續(xù)的輸液也可在丸劑劑量之前、之后或代替使用。IV.筌定治療劑的方法本發(fā)明的又一個(gè)方面提供鑒定用于肌肉治療例如葡萄糖代謝、脂肪和骨病癥中的治療劑的方法。合適的篩選測(cè)定法(例如基于ELISA的測(cè)定法)為本領(lǐng)域已知。所述篩選測(cè)定法中，通過將本發(fā)明的抗體和其配體GDF-8組合形成第一結(jié)合混合物，并且測(cè)量第一結(jié)合混合物(Mo)中配體與抗體間的結(jié)合量。還通過將抗體、配體和待篩的化合物或試劑組合形成第二結(jié)合混合物，并且測(cè)量第二結(jié)合混合物(MJ中配體與抗體間的結(jié)合量。隨后例如通過計(jì)算NVM。的比例來比較第一和第二結(jié)合混合物中的結(jié)合量。如果觀察到相比第一結(jié)合混合物第二結(jié)合混合物中結(jié)合的降低(即Mi/M(^1),則該化合物或試劑認(rèn)為能夠抑制GDF-8活性。結(jié)合混合物的配制和優(yōu)化在本領(lǐng)域技術(shù)人員水平內(nèi)；所述結(jié)合混合物還可包含增強(qiáng)或優(yōu)化結(jié)合所必需的緩沖液和鹽，并且本發(fā)明的篩選測(cè)定法中可以包括另外的對(duì)照測(cè)定法。可由此鑒定發(fā)現(xiàn)降^f氐抗體-配體結(jié)合至少約10%(即N^/MoO.9),優(yōu)選大于約30%的化合物，并且隨后如果需要，在其他測(cè)定法(如ActRIIB結(jié)合測(cè)定法)或?qū)嵤├兴龌虮绢I(lǐng)域熟知的其他基于細(xì)胞和體內(nèi)測(cè)定法中對(duì)抑制GDF-8活性的能力進(jìn)4亍第二次篩選。V.小分子抑制患有(或處于患病風(fēng)險(xiǎn)中)GDF-8-相關(guān)病癥的生物體(或受試者)中或來自涉及所述病癥的生物體細(xì)胞中的GDF-8活性也可通過使用拮抗，即抑制GDF-8活性的拮抗劑小分子(通常有機(jī)小分子)而實(shí)明的治療方法中。反之，提高患有(或處于患病風(fēng)險(xiǎn)中)與降低的GDF-8表達(dá)和/或活性有關(guān)的病癥或與降低的GDF-8水平有關(guān)的病癥生物體(或受試者)中GDF-8活性也可通過使用促進(jìn)，即增強(qiáng)GDF-8活性的小分子(通常有機(jī)小分子)而實(shí)現(xiàn)。新的激發(fā)型小分子可通過上述篩選法鑒定并且可用于此處所述的本發(fā)明的治療方法中。VI.診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)骨、脂肪、葡萄糖代謝、胰島素和肌肉病癥發(fā)展的方法除治療例如肌肉、骨、葡萄糖代謝和脂肪病癥之外，本發(fā)明提供通過一企測(cè)生物樣品，例如血清、血漿、支氣管肺泡灌洗液、唾液、活組織(例如肌肉的)等等中GDF-8降低或提高而診斷上述病癥的方法。"診斷的"或"診斷"指確定病理病情的有或無。診斷方法包括通過例如測(cè)定來自受試者(人或非人哺乳動(dòng)物)的生物樣品中GDF-8多肽的檢測(cè)量而檢測(cè)GDF-8的存在，以及將該檢測(cè)量與GDF-8多肽的正常量或范圍(例如來自已知未患有上述病癥的個(gè)體的量或范圍)比較。雖然特定的診斷方法也許不提供ALS或其他GDF-8-相關(guān)病癥的確診，其在該方法提供有助于診斷的陽性指標(biāo)時(shí)確診。本發(fā)明還提供通過4企測(cè)GDF-8的上調(diào)而用于預(yù)后ALS或其他肌肉病癥或例如骨、葡萄糖代謝和脂肪病癥的方法。"預(yù)后的"或"預(yù)后"指預(yù)測(cè)病理病情的大概的發(fā)展和/或嚴(yán)重程度。預(yù)后的方法包括測(cè)定來自受試者的生物樣品中GDF-8的沖企測(cè)量，以及將該才企測(cè)量與GDF-8的預(yù)后量或范圍(例如來自患有不同ALS嚴(yán)重程度的個(gè)體的量或范圍)比較。才企測(cè)樣品中GDF-8的不同量與對(duì)ALS或其他GDF-8-相關(guān)病癥的某些預(yù)后一致。檢測(cè)特定預(yù)后水平的GDF-8的量提供對(duì)于受試者的預(yù)后。本發(fā)明還提供通過4企測(cè)GDF-8的上調(diào)或下調(diào)用于監(jiān)測(cè)ALS或其他GDF-8-相關(guān)病癥進(jìn)程的方法。監(jiān)測(cè)方法包括測(cè)定在第一和第二時(shí)間取自受試者的生物樣品中GDF-8的片僉測(cè)量，以及比4交該量。第一和第二時(shí)間之間GDF-8量的改變表明在例如ALS或其他GDF-8-相關(guān)病癥期間嚴(yán)重程度的變化。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在類似ALS的GDF-8-相關(guān)病癥中(例如希望增加肌肉質(zhì)量的病癥)，第一和第二時(shí)間之間GDF-8的量和/或GDF-8活性的降低表明病癥的緩解，而量的提高表明病癥的發(fā)展。上述監(jiān)測(cè)測(cè)定法還可用于評(píng)估治療ALS或其他GDF-8-相關(guān)病癥的患者中特定治療干預(yù)(例如疾病減弱和/或抵消)的效力。本發(fā)明的抗體可通過沖全測(cè)體內(nèi)或體外GDF-8的存在而用于診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)。上述4全測(cè)方法為本領(lǐng)域所熟知并且包括ELISA、i文射免疫測(cè)定、免疫印跡、蛋白質(zhì)印跡、免疫熒光、免疫沉淀和其他可比較的技術(shù)?？贵w可另外在診斷試劑盒中提供，其結(jié)合一種或多種檢測(cè)GDF-8的技術(shù)。上述試劑盒可包含其他的組分、包裝、說明書或其他的材料以幫助檢測(cè)該蛋白質(zhì)和使用該試劑盒。當(dāng)抗體設(shè)計(jì)為診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)的目的時(shí)，例如用配體基團(tuán)(如生物素)或可檢測(cè)的標(biāo)記基團(tuán)(如熒光基團(tuán)、放射性同位素或酶)修飾他們可能是需要的。如果需要，抗體(不管多克隆的或單克隆的)可利用常規(guī)方法標(biāo)記。合適的標(biāo)記物包括熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性原子、密電子試劑、酶和具有特定結(jié)合伴侶的配體。酶通常通過其活性檢測(cè)。例如，辣根過氧化酶可通過其轉(zhuǎn)變四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為藍(lán)色顏料的能力而纟企測(cè)，用分光光度計(jì)計(jì)量。其他合適的標(biāo)記物可包4舌生物素和抗生物素蛋白或鏈親和素、IgG和蛋白A,以及本領(lǐng)域已知的許多受體-配體偶聯(lián)物。其他排列和可能性對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的，并且認(rèn)為是在本發(fā)明范圍內(nèi)的同等物。VII.藥物組合物和纟會(huì)藥方法本發(fā)明提供包括本發(fā)明GDF-8拮抗劑，即多肽、多核苷酸、載體、抗體、抗體片段和小分子的組合物。上述組合物可適合于藥學(xué)用途并且給予患者。該組合物通常包括本發(fā)明的一種或多種分子，優(yōu)選抗體，以及藥學(xué)可接受的賦形劑。本發(fā)明的抗-GDF-8抗體可用于體外、活體外或與藥學(xué)可接受載體結(jié)合時(shí)摻入藥物組合物中。如此處所用，短語"藥學(xué)可接受的賦形劑"包括任何以及所有的溶劑、溶液、緩沖液、分散體介質(zhì)、包衣、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等等，其適合藥學(xué)給予。除本發(fā)明的抗體和載體之外，所述組合物可包含各種稀釋劑、填料、鹽、緩沖液、穩(wěn)定劑、增溶劑和本領(lǐng)域熟知的其他材料。術(shù)語"藥學(xué)可接受的"指不干擾活性組分生物學(xué)活性有效性的無毒材料。載體的特征取決于給藥途徑。用于藥學(xué)活性物質(zhì)的所述介質(zhì)和試劑的用途為本領(lǐng)域所熟知。組合物還可包含提供輔助的、額外的或增強(qiáng)的治療功能的其他活性化合物。該藥物組合物還可與給藥說明書一起包括在容器、包裝或配量器中。本發(fā)明的藥物組合物可以是脂質(zhì)體形式，其中除其他的藥學(xué)可接受載體之外，本發(fā)明的抗體與兩性試劑(如脂類)組合，所述試劑以水溶液中的膠粒、不溶性單層、液態(tài)結(jié)晶或片狀層的聚集形式存在。適于脂質(zhì)體配制的脂類包括，但不限于單酸甘油酯、甘油二酯、腦硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂角苷、膽汁酸等等。所述脂質(zhì)體制劑的制備在本領(lǐng)域4支術(shù)水平內(nèi)。如此處所用的，術(shù)語"治療有效量"指藥物組合物或方法的每種活性組分的總量，其足以表現(xiàn)出有意義的患者益處，例如癥狀的改善、所述病情的痊愈或痊愈速率的提高。當(dāng)施加單一的活性成分時(shí)，單獨(dú)給予，該術(shù)語指組分單獨(dú)的。當(dāng)施加組合時(shí)，術(shù)語指產(chǎn)生治療效果的活性成分的組合量，而不管其以組合、連續(xù)或同時(shí)給予。在實(shí)踐本發(fā)明的治療方法或使用中，例如治療有效量的結(jié)合GDF-8并且千涉GDF-8信號(hào)的抗體給予受試者，例如哺乳動(dòng)物(例如人)。合給予。、當(dāng)與二種或多種試劑共同給予:「;發(fā)明的抗體可與第二種試劑或同時(shí)或按順序給予。如果按順序給予，主治醫(yī)師將決定給予本發(fā)明的抗體聯(lián)合其他試劑的合適順序。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體，例如其藥物組合物以聯(lián)合治療癥會(huì)予，即結(jié)合可用于治療病理病情或病癥，如月幾肉病癥、神經(jīng)月幾肉病癥、骨駱退行性病癥、代i謝性或誘導(dǎo)的骨病癥、脂肪病癥、葡萄糖代謝病癥或胰島素-相關(guān)病癥，以及過敏性和炎癥病癥的其他試劑，例如治療劑。術(shù)語"以組合"在這里指試劑基本上同時(shí)給予，或同時(shí)或按順序。如果按順序給予，在第二種化合物給藥的起始時(shí)，兩種化合物的第一種優(yōu)選在治療部位或在受試者中仍然可檢測(cè)其有效濃度。本發(fā)明的藥物組合物;故配制成與其計(jì)劃的給藥途徑相適應(yīng)。完成給藥的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。還可能獲得局部或口服給予，或其能夠透過粘膜傳遞的組合物。實(shí)踐本發(fā)明方法的用于藥物組合物中本發(fā)明抗體的給藥可以各種常規(guī)方式，如進(jìn)行口腔攝入、吸入、皮膚、皮下或靜脈注射。用于皮內(nèi)或皮下給藥的溶液或懸液通常包括一種或多種下列組分無菌稀釋劑如注射用水、生理鹽溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它的合成溶劑；抗菌劑如苯曱醇或?qū)αu基苯曱酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或硫酸氬鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及滲透壓調(diào)節(jié)劑如氯化鈉或右旋糖。pH可用酸或堿，如鹽酸或氳氧化鈉調(diào)節(jié)。所述制劑可被封裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器、或多劑量藥瓶?jī)?nèi)。適合于注射的藥物組合物包括無菌的水溶液或分散體，以及用于臨時(shí)配制成無菌注射液或分散體的無菌粉末。用于靜脈內(nèi)給藥的適合載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorTMEL(BASF,Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下此組合物都必須是無菌的，并且應(yīng)該是易于以可注射狀態(tài)存在的流質(zhì)。在生產(chǎn)和貯存條件下它必須是穩(wěn)定的，并且必須防止^f敖生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。此載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多羥基化合物(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)，以及其適合的混合物。例如借助于如下方法可保持其適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性使用包衣如卵磷脂、在分散體的情況下保持所需的顆粒大小，以及使用表面活性劑。用各種抗菌劑和抗真菌劑可實(shí)現(xiàn)防止微生物作用，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在很多情況下，最好是在組合物內(nèi)包含等滲劑例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨醇、氯化鈉。通過在組合物內(nèi)包含延緩吸收劑(如單硬脂酸鋁和明膠)可引起注射的組合物吸收的延遲。當(dāng)本發(fā)明抗體的治療有效量通過例如靜月永內(nèi)的、皮膚或皮下注射給予時(shí)，結(jié)合劑將是無熱原的、腸胃外可接受的水溶液的形式。適當(dāng)注意pH、等滲性、穩(wěn)定性等等，所述腸胃外可接受的蛋白質(zhì)溶液的制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。用于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射的優(yōu)選藥物組合物應(yīng)當(dāng)包含結(jié)合劑之外的等滲載體如氯化鈉注射液、Ringer，s注射液、葡萄糖注射液、右旋糖和氯化鈉注射液、乳酸鹽Ringer，s注射液或本領(lǐng)域已知的其他載體。本發(fā)明的藥物組合物還可包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖液、抗氧化劑或其他添加劑。本發(fā)明藥物組合物中的本發(fā)明抗體(或本發(fā)明其他的拮抗劑)的量將取決于所治療的病情的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，以及患者之前所經(jīng)歷的治療的性質(zhì)。最終，主治醫(yī)師將決定治療每個(gè)單獨(dú)患者的抗體量。最初，主治醫(yī)師給予低劑量的抗體并且觀察患者的應(yīng)答。大劑量抗體可給至患者獲得最優(yōu)的治療效果，并且在那點(diǎn)時(shí)劑量通常不進(jìn)一步增加。預(yù)期用于實(shí)踐本發(fā)明方法的各種藥物組合物應(yīng)當(dāng)包含約每公斤體重O.ljig至50mg抗體。利用本發(fā)明藥物組合物的治療持續(xù)時(shí)間取決于所治療的疾病嚴(yán)重程度和病情以及每個(gè)單獨(dú)的患者潛在的特異性應(yīng)答而不同。預(yù)期抗體每次施用的持續(xù)時(shí)間將例如通過皮下途徑在每周一次的范圍內(nèi)。最終主治醫(yī)師將決定利用本發(fā)明的藥物組合物合適的治療持續(xù)時(shí)間?？诜M合物通常包括惰性稀釋劑或可食用的載體?？梢詫⑺鼈兎庋b在明膠膠嚢內(nèi)或壓制成片劑。為了口服治療給藥的目的，可使GDF-8拮抗劑(例如抗體、小分子等等)同賦形劑混合，以片劑或膠嚢劑的形式使用。作為組合物的一部分還可包含藥劑學(xué)相容的結(jié)合劑和/或佐劑材料。片劑、丸劑、膠嚢劑等可以包含任何如下成分或類似特性的化合物結(jié)合劑如微晶纖維素、西黃蓍樹脂或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes;助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或者芳香劑如薄荷、曱基水揚(yáng)酸酯或柑橘芳香劑。當(dāng)口月良給予治療有效量的本發(fā)明藥物組合物，例如結(jié)合GDF-8并且干涉GDF-8信號(hào)的抗體時(shí)，結(jié)合劑將為片劑、膠嚢、粉劑、溶液或酏劑的形式。當(dāng)以片劑形式給予時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物可另外包含固體載體如明膠或佐劑。片劑、膠嚢和粉劑包含約5至95%的結(jié)合劑，并且優(yōu)選約25至90%的結(jié)合劑。當(dāng)以液態(tài)癥合予時(shí)，可以添加液體載體如7jc、石油、動(dòng)物或才直物來源的油例如花生油、礦物油、豆油或芝麻油或合成油(考慮個(gè)體患者和/或個(gè)體的大群體對(duì)所述液體載體的過敏反應(yīng)后)。藥物組合物的液體形式可進(jìn)一步包含生理鹽溶液、右旋糖或其他的糖類溶液或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。當(dāng)以液體形式給予時(shí)，藥物組合物包含約0.5至90%重量計(jì)的結(jié)合劑，并且優(yōu)選約1至50%的結(jié)合劑。對(duì)于吸入給藥，GDF-8拮抗劑以氣霧劑噴霧的形式用裝有適當(dāng)推進(jìn)劑(如二氧化碳?xì)怏w)的壓縮容器或分送器，或者噴霧器遞送。因此，此處所述的化合物可通過吸入肺組織而給予。除非另外指明，如此處所用的術(shù)語"肺組織"指呼吸道的任何組織并且包括上下呼吸道。一種或多種GDF-8抗體可與用于治療肺疾的一種或多種現(xiàn)有才莫式結(jié)合給予。在一個(gè)實(shí)例中，配制化合物用于噴霧器。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物可以凍干形式貯存(例如在室溫下)并且在吸入之前在溶液中重構(gòu)。還可以配制該化合物用于以利用醫(yī)療裝置，例如吸入器(參見例如，美國(guó)專利No.6，102,035(并分末吸入器)和6,012，454(干粉吸入器))吸入。吸入器可包括用于活性化合物(以適于貯存的pH存在)的分離室和用于中和緩沖液的另一個(gè)室，以及將該化合物在霧化之前立即與中和緩沖液組合的才幾構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，吸入器為定量吸入器。雖然不是必需的，遞送增強(qiáng)劑(如表面活性劑)可用于進(jìn)一步提高肺遞送。如此處所用的"表面活性劑"指具有親水性和親脂性部分的化合物，其通過與兩種不互溶相之間接觸面的相互作用而促進(jìn)藥物吸收。具有干燥顆粒的表面活性劑由于若干原因(例如顆粒結(jié)塊減少，巨噬細(xì)胞吞噬作用降低等等)是有用的，。當(dāng)與肺表面活性劑偶聯(lián)時(shí)，可因?yàn)楸砻婊钚詣?如DPPC)將大大促進(jìn)化合物擴(kuò)散而實(shí)現(xiàn)化合物更有效的吸收。表面活性劑為本領(lǐng)域所熟知并且包括但不限于，磷酸甘油酯，例如卵磷脂、L-a卵磷脂二棕櫚?；?DPPC)和心磷脂(DPPG);十六醇；脂肪酸；聚乙二醇(PEG);聚氧化乙烯-9-;氧金根醚(aurylether);棕櫚酸；油酸；去水山梨糖醇三油酸酯(Span85);甘膽酸鹽；表面活性素；poloxomer;山梨糖醇酐脂肪酸酯；去水山梨糖醇三油酸酯；泰洛沙、泊禾口石壽月旨。還可以通過透粘膜或透皮方式進(jìn)4亍全身性給藥。例如，在包括Fc部分的抗體的情況下，組合物能夠通過FcRn受體-介導(dǎo)的途徑(例如美國(guó)專利No.6,030,613)而透粘膜傳遞(例如腸、口腔或肺)。通常，可例如通過使用糖錠、鼻噴霧劑、吸入器或栓劑實(shí)現(xiàn)透粘膜給藥。對(duì)于透皮給藥，活性化合物配制成本領(lǐng)域通常已知的軟膏、油膏劑、凝膠劑、膜片或乳膏劑。對(duì)于透粘膜或透皮給藥，該制劑中使用了適于透過屏障的滲透劑。所述滲透劑是本領(lǐng)域通常所知的，包括例如洗滌劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。藥物組合物還可由適于基因治療的組合物組成，即由此處公開的多核苷酸組成的組合物。在基因治療的情況下，藥學(xué)可接受載體可包括，例如脂類、膠原球、陽離子乳劑系統(tǒng)、水、鹽水緩沖液、病毒載體、乳糜粒剩余物、聚合納米顆粒(例如明膠-DNA或殼聚糖-DNA)、金顆粒、聚合復(fù)合物、脂聚物(lipoplexes)、多聚物(polyplexes)等等(參見例如，Gardlik等(2005)Med.Sd.Monit.11(4):RA110-21)。穩(wěn)定性和保留在一個(gè)實(shí)施方案中，例如在血液、血清、淋巴、支氣管肺或支氣管肺泡灌洗或其他組織中，GDF-8抗體與提高其循環(huán)中穩(wěn)定性和/或滯留至少1.5、2、5、10或5CH咅的部分物理連接。本發(fā)明的拮抗劑可用保護(hù)免受身體快速消除的載體制備，如控-釋制劑，包括植入和微嚢密封的遞送系統(tǒng)?？衫蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、易見的。包含GDF-8拮抗劑，例如一種或多種抗-GDF-8抗體的脂質(zhì)體懸液還可以用作藥學(xué)可接受載體。這些可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。例如，GDF-8抗體可與聚合物締合，例如基本上非抗原性的聚合物，如聚烯基氧化物或聚環(huán)氧乙烷。合適的聚合物重量基本上不同。可使用具有數(shù)均分子量約200至約35,OOO(或約l,000至約15,000,或約2,000至約12,500)的聚合物。例如，GDF-8抗體可偶聯(lián)至水溶性聚合物，例如親水性的聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。所述聚合物的非限制性列表包括聚烯基氧化物同聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，條件是保持該嵌段共聚物的水溶性。其他有用的聚合物包括聚氧化烯如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物(Pluronics);聚曱基丙烯酸酯；卡波姆；分枝或不分枝的多糖，其包括糖類單體D-甘露糖、D-和L-半乳糖、巖藻糖、果糖、D畫木糖、L畫阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D畫半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如多聚甘露糖醛酸或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神經(jīng)氨酸，包括同聚多糖和雜多糖如乳糖、支鏈淀粉、淀粉、羥乙基淀粉、直鏈淀粉、葡聚糖硫酸鹽、葡聚糖、糊精、糖原或酸性粘多糖的多糖亞基例如透明質(zhì)酸；糖醇聚合物如聚山梨醇和聚甘露醇；肝素等等。其他化合物也可附著于相同的聚合物，例如細(xì)胞毒素、標(biāo)記物或另一種靶試劑，例如另一種GDF-8抗體或無關(guān)的配體。單-活化的、烷氧基-封端的聚烯基氧化物(PAO),例如單甲氧基-封端的聚乙二醇(mPEG)、CM烷基-封端聚合物和雙-活化的聚環(huán)氧乙烷(乙二醇)可用于交聯(lián)(參見例如，美國(guó)專利No.5,951,974)。在一個(gè)實(shí)施方案中，交聯(lián)至配體之前的聚合物不必，j旦優(yōu)選為水溶性的。通常，交聯(lián)后的產(chǎn)物為水溶性的，例如表現(xiàn)出水溶性至少約0.01mg/ml,并且更優(yōu)選至少約O.lmg/ml,且更優(yōu)選至少約lmg/ml。此外，聚合物在偶聯(lián)形式中不應(yīng)該是高免疫原性的，如果偶聯(lián)物想要通過靜脈內(nèi)輸液、氣溶力交化或注射液給予，則也不應(yīng)該具有不適于該途徑的粘度。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物僅包含反應(yīng)性的單個(gè)基團(tuán)。此有助于避免配體分子相互交聯(lián)。然而，最佳化反應(yīng)條件以降低配體分子之間交聯(lián)或通過凝膠過濾或離子交換層析純化反應(yīng)產(chǎn)物以回收基本上同質(zhì)的衍生物也在此處所述范圍內(nèi)。其他的實(shí)施方案中，聚合物包含用于將多個(gè)配體連接至聚合物骨架的兩個(gè)或更多反應(yīng)基團(tuán)。此外，凝膠過濾或離子交換層析可用于回收基本上均一形式的所需的衍生物。聚合物的分子量可上至約500,000D,并且優(yōu)選為至少約20,000D或至少約30,000D,或至少約40,000D。分子量的選擇取決于獲得的偶聯(lián)物的有效大小、聚合物的性質(zhì)(例如結(jié)構(gòu)，如線性的或分枝的)以及衍生化程度。共價(jià)4建可用于將GDF-8抗體附著于聚合物，例如交聯(lián)至配體的N-末端氨基和配體賴氨酸殘基上的s氨基，以及其他的氨基、亞氨基、羧基、巰基、羥基或其他親水性基團(tuán)。聚合物可不用多功能的(通常雙功能的)交聯(lián)劑而直接共價(jià)鍵合至GDF-8抗體。利用基于三聚氯氰、羧基二咪唑、醛-活性基團(tuán)(PEG醇鹽加溴代乙醛的二乙基乙?；?；PEG加DMSO和乙酸酐，或PEG氯化物加4-羥基苯曱醛的苯酚鹽，活化的琥珀酰亞胺酯，活化的PEG二硫代碳酸鹽，2,4,5-氯甲酸三氯苯酯(2,4,5-trichlor叩henylcloroformate)或P-氯甲酸硝基苯酯活化的PEG)的已知化學(xué)物實(shí)現(xiàn)共價(jià)鍵合至氨基基團(tuán)。羧基可通過利用碳二亞胺偶聯(lián)PEG-胺而衍生。巰基可通過偶聯(lián)至馬來酰亞氨基-取代的PEG(例如烷氧基-PEG胺加磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺曱基)環(huán)己烷-l-羧酸鹽)(參見WO97/10847)或PEG-馬來酰亞胺)而衍生。或者，配體上的游離氨基(例如賴氨酸殘基上的s氨基)可用2-亞氨基-四氫噻吩(Traut，s試劑)硫化且隨后偶聯(lián)至PEG的含馬來酰亞胺的衍生物，例如Pedley等(1994)Br.J.Cancer70:1126-30中所述的?？筛街贕DF-8抗體的功能化的PEG聚合物例如從ShearwaterPolymers,Inc.(Huntsville,AL)4尋到。這些市售的PEG書T生物包括例如氨基-PEG、PEG氨基酸酯、PEG-酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、羧甲基化的PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、PEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯、羧曱基化PEG的琥珀酰亞胺基酯、PEG的琥珀酰亞胺基碳酸酯、氨基酸PEG的琥珀酰亞胺基酯、PEG-氧羰基咪唑(oxycarbonylimidazole)、PEG-碳酸硝基苯酯、PEG-三氟乙基磺酸酯、PEG-縮水甘油基醚、PEG-醛、PEG-乙烯砜、PEG-馬來酰亞胺、PEG-二硫化鄰吡啶(orthopyridyl-disulfide)、雜官能的PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG珪烷、和PEGphospholide。取決于GDF-8抗體、所需的PEG化程度和所采用的PEG衍生物，對(duì)這些PEG衍生物進(jìn)行偶聯(lián)的反應(yīng)條件可有所不同。在選擇PEG衍生物中涉及的一些因素包括所需的連接位點(diǎn)(如賴氨酸或半胱氨酸的R-基團(tuán))，衍生物的水解穩(wěn)定性和反應(yīng)性，連接的穩(wěn)定性、毒性和免疫原性，分析的適合性等。使用任一特定衍生物的具體說明可從制造商處獲得。GDF-8抗體和聚合物的偶耳關(guān)物可例如通過凝:月交過濾或離子交換層析或其他的層析形式(例如HPLC)分離自未反應(yīng)的起始材料。用相同方式將不同種類的偶聯(lián)物相互純化開。也可由于未反應(yīng)的氨基酸離子性質(zhì)的差異(參見例如WO96/34015)而分辨不同的種類(例如包含一個(gè)或兩個(gè)PEG殘基)。本發(fā)明的多核苷酸和蛋白質(zhì)預(yù)計(jì)表現(xiàn)出此處鑒定的一種或多種用途或生物學(xué)活性(包括與以下引用的測(cè)定法有關(guān)的那些)。本發(fā)明蛋白質(zhì)所述的用途或活性可通過所述蛋白質(zhì)的給予或使用，或通過編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸(如在基因治療或適于DNA導(dǎo)入的載體中)的給予或使用而提供。以便于劑量給予和均勻性的劑量單位形式配制口服或腸胃外組合物將是有利的。如此處所用劑量單位形式指適合作為用于待治療受試者的單一劑量的物理分散單位，每一單位包含與所需的藥學(xué)載體結(jié)合、預(yù)測(cè)產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格由如下因素規(guī)定并直接取決于這些因素活性化合物的獨(dú)特特征和將要達(dá)到的特定治療作用，以及配制用于個(gè)體治療的該活性化合物在技術(shù)上的內(nèi)在局限性。本發(fā)明的另一方面因此涉及用于例如與或不與其他的治療化合物一起給予本發(fā)明的GDF-8抗體或用于利用抗-GDF-8抗體作為研究或治療工具以確定生物樣品中GDF-8的存在和/或水平的試劑盒，如ELISA試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括配制在藥學(xué)載體中的一種或多種抗-GDF-8抗體以及酌情配制在一種或多種分離藥物制劑中的至少一種試劑，例如治療劑。以下實(shí)施例用于理解本發(fā)明但并不試圖，以及不應(yīng)該解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。該實(shí)施例不包括常規(guī)方法的詳細(xì)說明，如雜交瘤形成、ELISA、增殖測(cè)定法、流式細(xì)胞分析和重組DNA技術(shù)。所述方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。貫穿本申請(qǐng)引用的所有參考文獻(xiàn)、專利、公開的專利申請(qǐng)和其他的專利文件的全部?jī)?nèi)容在此通過引用引入。實(shí)施例實(shí)施例1抗-GDF-8抗體RK35的產(chǎn)生和鑒定人GDF-8蛋白(成熟的GDF-8和GDF-8前肽)以及BMP-ll蛋白如美國(guó)公開專利申請(qǐng)No.2004/0142382中所述分離和鑒定。六只雌性肌肉抑制素基因敲除的BALB/c小鼠(8周齡；McPherron等，上文)通過用Freund，s完全佐劑中20mg的重組GDF-8二聚體皮下注射免疫。以2-周的時(shí)間間隔給予數(shù)次Freund's不完全佐劑中相同量抗原的激發(fā)注射并且融合之前給予PBS中2jig的最終靜脈注射(尾部靜脈)。表現(xiàn)最高抗體效價(jià)的小鼠中兩只的脾細(xì)胞利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)No.P3X63.Ag8.653)融合(Oi和Herzenberger(1980)In:Mishell,B.B.，Shiigi,S.M.,Henry,C.,Mishell，R.I.(Eds.),jSe/e"et/A/eAo6fe&Ce〃w/ar/mmw"o/ogyW.H.Freemen,SanFrancisco,pp.351-72)。10-14天后，收集上清并且通過固相和液相ELISA(Whittemore等，上文)篩選抗-GDF-8抗體的產(chǎn)生。標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)和pGL3-(CAGA)12報(bào)道分子測(cè)定法(Theis等(2001)GrowthFactors18:251-59)利用通過融合人ActRIIB-Fc受體胞外域與人IgGlFc區(qū)域而產(chǎn)生的嵌合ActRIIB-Fc用于測(cè)定抑制抑肌素結(jié)合至其受體ActRIIB的IC50。被選擇用于進(jìn)一步研究的雜交瘤通過重復(fù)限制稀釋以確保單克隆化而實(shí)現(xiàn)單克隆。選擇單克隆抗體RK35用于進(jìn)一步研究。實(shí)施例2對(duì)GDF-8具有高親和力并且呈現(xiàn)中和活性的RK35單克隆抗體實(shí)施例2.1:實(shí)驗(yàn)流程對(duì)于ELISA,生物素化的GDF-8以l貼/ml涂布于96孔鏈親和素微量滴定板(Pierce,Rockford,IL)上4。C過夜。涂布后，從孔除去溶液，并且該平板在室溫下在SuperBlock溶液(Pierce)中封阻1小時(shí)。平板用PBS漂洗，并且lOO)ilRK35抗體以不同的濃度添加至孔。平板在室溫下溫育1小時(shí)且隨后用PBS洗滌。100pl抗-huIgG-HRP偶聯(lián)物(SouthernBiotech,Birmingham,AL)的1:5000稀釋物添加至每個(gè)孔并且平板在室溫下溫育1小時(shí)。每個(gè)平^反用PBS洗滌三次。TMB底物(100^1)添加至每個(gè)孔并且溫育至顯色。通過添加lOOjil0.18M的H2S04終止反應(yīng)。產(chǎn)生的信號(hào)通過利用微量滴定板讀數(shù)器讀取450nm的吸光度而測(cè)量。利用人同型對(duì)照抗體證實(shí)對(duì)GDF-8的結(jié)合。重組ActRIIB-Fc嵌合體(R&DSystems,Minneapolis,MN,CatNo.339-RB/CF)以0.2M石友酸鈉緩沖液中l(wèi)嗎/ml涂布于96國(guó)孔平底測(cè)定平皿(Costar,NY,Cat.No.3590)在4。C過夜。平皿隨后用lmg/ml牛血清白蛋白封阻并且遵循標(biāo)準(zhǔn)ELISA方案洗滌。等分(lOO)il)生物素化的GDF-8或BMP-11以不同的濃度添加至封阻的ELISA平皿，溫育lhr,洗滌并且通過鏈親和素辣纟艮過氧化酶(SA-HRP,BDPharMingen，SanDiego,CA,Cat.No.13047E)隨后添加TMB(KPL,Gaithersburg,MD,Cat.No.50-76-04)而檢測(cè)結(jié)合的GDF-8或BMP-11量。在MolecularDevices微量板讀數(shù)器中于450nm處進(jìn)行比色測(cè)量。為了分析抑制活性，通過與20ng/mlGDF-8或20ng/mlBMP-11預(yù)溫育而在不同濃度片全測(cè)RK35。在室溫下溫育lhr后，lOO^ilRK35和GDF-8或BMP-11混合物添加至該平亞。結(jié)合因子的檢測(cè)和定量在Whittemore等(2003)5zoc力e肌5zo/^".Owzww".300:965-71中描述。為了i正實(shí)GDF-8的活性，利用在TGF-P誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下表達(dá)熒光素酶的報(bào)告載體pGL3(CAGA)12產(chǎn)生報(bào)告基因測(cè)定法(RGA)。CAGA為TGF-卩-誘導(dǎo)基因PAI-1啟動(dòng)子內(nèi)的TGF-卩-應(yīng)答序列(Denner等(1998)EMBOJ.17:3091-3100)。利用基礎(chǔ)的焚光素酶報(bào)道分子質(zhì)粒pGL3(Promega,Madison,WI)制備包含12個(gè)CAGA框的報(bào)告載體。來自腺病毒主要晚期啟動(dòng)子的TATA框和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(-35/+10)插入BglII和HindIII位點(diǎn)之間。退火包含12個(gè)重復(fù)CAGA框，即AGCCAGACA的寡核普酸且克隆入Xhol位點(diǎn)。人橫紋肌肉瘤細(xì)胞系A(chǔ)204(ATCCHTB-82)用pGL3(CAGA)12利用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(BoehringerManheim，Germany)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞在補(bǔ)充2mM谷氨酰胺、100U/ml鏈霉素、lOOpg/ml青霉素和10%胎牛血清的McCoy's5A培養(yǎng)基中在96-孔平亞上培養(yǎng)16小時(shí)。細(xì)胞隨后用有或無10ng/mlGDF-8的具有谷氨酰胺、鏈霉素、青霉素和lmg/ml牛血清白蛋白的McCoy's5A培養(yǎng)基37。C處理6小時(shí)。利用熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega)定量所處理細(xì)胞中的熒光素酶。為了才企測(cè)RK35的抑制活性，GDF-8與抗體在室溫下預(yù)溫育1小時(shí)。該混合物隨后添加至轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并且細(xì)胞在37。C溫育6小時(shí)。利用熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega)定量熒光素酶。實(shí)施例2.2:結(jié)果通過用純化的重組人GDF-8,其氨基酸序列與成熟的鼠抑肌素氨基酸序列相同(McPherron等，1997)免疫GDF-8敲除小鼠而產(chǎn)生抑肌素的高親和力小鼠單克隆抗體。以高親和力結(jié)合GDF-8的RK35抗體通過直接的ELISA沖全測(cè)(4nM;圖1A)。竟?fàn)幮訣LISA用于評(píng)估RK35抑制GDF-8結(jié)合其高親和力受體ActRIIB的能力。RK35以IC50~2.5nM封阻生物素化的GDF-8結(jié)合至固定的ActRIIB-Fc(圖1B)?？扇苄訟ctRIIb也封阻GDF-8結(jié)合至固定的ActRIIb-Fc而對(duì)照抗體不封阻結(jié)合。也利用基于報(bào)道分子測(cè)定法的pGL3-(CAGA)u細(xì)胞測(cè)量RK35的中和活性。該測(cè)定法中熒光素酶基因在GDF-8/TGF-P應(yīng)答啟動(dòng)子控制下克隆并且人A204坤黃紋肌肉瘤細(xì)胞用該報(bào)道分子質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。GDF-8誘導(dǎo)的A204細(xì)胞中熒光素酶活性的提高以劑量依賴性的方式一皮RK35封阻(圖1C)。RK35以0.2nM的IC5o降低GDF-8的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。因此，RK35為針對(duì)抗GDF-8的新型的高效鼠單克隆中和抗體。實(shí)施例3實(shí)施例3.1:實(shí)^^流程實(shí)施例3.1.1:動(dòng)物和藥物治療所有涉及動(dòng)物的過程由UniversityofPennsylvania或Wyeth的IACUC批準(zhǔn)。在B6SJL雜交背景(JacksonLaboratories)上表達(dá)人SODG93A的轉(zhuǎn)基因小鼠室內(nèi)交配B6SJLF1雌性種鼠(JacksonLaboratories)。通過PCR篩選子代；轉(zhuǎn)基因陰性小鼠用作年齡-匹配的同窩野生型對(duì)照。小鼠分成四組29只SODG93A小鼠用抗-抑肌素抗體RK35處理，28只SODG93A小鼠用磷酸緩沖鹽溶液處理(PBS)(介載體)，23只野生型小鼠用RK35處理，并且23只野生型小鼠用PBS處理。出生后28天開始，小鼠每周經(jīng)腹膜內(nèi)注射抗-GDF-8單克隆抗體RK35或等體積PBS。第一次劑量為40mg/kg;隨后的劑量為20mg/kg/周，按照描述用于抗-抑肌素抗體JA16的方案(Whittemore,等，上文)。每組的9-12只小鼠在84-90天(12周)齡(平均88天)處死以評(píng)估濕的肌肉質(zhì)量和組織結(jié)構(gòu)，并且剩下的小鼠監(jiān)測(cè)至到達(dá)疾病末期(-134天)，定義為左右外側(cè)躺臥時(shí)30秒內(nèi)無法向右(failuretoright)。同時(shí)，雄性和雌性等量混合的表達(dá)人SODG93A的轉(zhuǎn)基因大鼠(Howland等，上文)(58只)給予PBS(介載體)或RK35。每組中十只大鼠在95天齡安樂死以測(cè)定RK35對(duì)濕的肌肉質(zhì)量的作用。每組剩下的19只持續(xù)至疾病末期。利用雌性轉(zhuǎn)基因的和野生型同窩對(duì)照大鼠的第二項(xiàng)研究用于比較跨越處理組和基因型的體重提高以及握力變化。每項(xiàng)研究中，大鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射40mg/kg的RK35(6周齡時(shí)(~42天))并隨后注射20mg/kg/周或介載體，直至在95天安樂死以分析肌肉質(zhì)量或由右側(cè)反射失敗(rightreflexfailure)測(cè)量的末期。實(shí)施例3.1.2:體重和月幾肉質(zhì)量測(cè)量最初的體重均勻分配至群組當(dāng)中的動(dòng)物以確保研究開始時(shí)相等的體重平均值。重量損失的發(fā)作以年齡記分，該年齡是觀察到三次連續(xù)的重量損失的第一次。在與疾病早期(小鼠為88天，大鼠為95天)和末期(小鼠~134天并且大鼠-128天)一致的時(shí)間點(diǎn)對(duì)腓腸肌、顱脛骨肌、四頭肌和隔肌測(cè)定濕的肌肉質(zhì)量。動(dòng)物安樂死并且每條腿的肌肉定量解剖并且稱重；平均左右腿的值。實(shí)施例3.1.3:肌肉組織病理學(xué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)固定腓腸肌和隔肌并且切片用于H&E染色(Howland等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:1604-29)。由不知樣品身份的兩個(gè)獨(dú)立的病理學(xué)家進(jìn)行萎縮和增生的計(jì)分。通過在88天和末期對(duì)腓腸肌肌肉(PBS-和RK35-處理的SODG93A小鼠和PBS-處理的野生型小鼠)，以及末期對(duì)隔肌月幾肉(PBS-和RK35-處理的SODG93A和PBS-處理的野生型)的形態(tài)測(cè)量(Axiovision4.3，Zeiss,Thornwood，NY)測(cè)定纖維直徑。每組的三個(gè)肌肉速凍于干水-冷卻的異戊烷中，以8pm厚冷凍切割并且利用抗-層粘連蛋白抗體免疫染色(Sigma,St.Louis,MO;目錄編號(hào)L9393)。利用ZeissAxiovision軟件進(jìn)行至少兩百個(gè)纖維短軸最大直徑的長(zhǎng)度測(cè)量。纖維直徑以20pm間隔設(shè)置，并對(duì)每個(gè)肌肉組產(chǎn)生頻率直方圖。對(duì)每組(野生型、PBS-治療的SODG93A和RK35-治療的SODG93A)3只小鼠在疾病早期階段和末期進(jìn)行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)(總計(jì)分析18只小鼠)。從去頭小鼠除去的脊柱后-固定于4%多聚曱醛中，隨后解剖脊索并且在4%多聚甲醛中后-固定另外的24小時(shí)。利用MultiBrainTM牙支術(shù)(NeuroscienceAssociates,Knoxville,TN),18條腰段脊髓一起包埋于單個(gè)塊(block),并且順著腰推擴(kuò)大部分的整個(gè)區(qū)段(~6mm)50um以冠狀平面橫切。每笫六個(gè)切片(300pm)用勞氏紫NISSL染色以顯示細(xì)胞體(Bjugn(1993)BrainRes.627:25-33;Kieran等(2004)Nat.Med.10:402-05)。利用兩種獨(dú)立的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。第一種，由不知樣品身份的觀察者利用ZeissAxoplan2以20x和40x分析每18只小鼠中包含L3-5的十個(gè)脊髓切片。計(jì)數(shù)每個(gè)切片的腹角，通過之前所述的可見的細(xì)胞核確定大的健康運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(Kieran等，上文)。得到的數(shù)據(jù)表示為每一腹角大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的平均數(shù)。第二種，來自L3-L5區(qū)域的切片利用配備了機(jī)械化載物臺(tái)、電子指針測(cè)微計(jì)和體視學(xué)軟件的ZeissAxioskop2(StereoInvestigator(MBFBioscience,Williston,VT)體一見學(xué)分析，如(West等(1991)Anat.Rec.231:482-97;Schmitz和Hof(2000)J.Chem.Neuroanat.20:93-114;Schmitz和Hof(2005)Neuroscience130:813-31)所述；a-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元作為具有大于300pm2最大投影面積的神經(jīng)元而計(jì)分。實(shí)施例3.1.4:表型分析按所述的(LaMonte等(2002)Neuron34:715-24)在出生后28天開始每?jī)芍軐?duì)治療和對(duì)照小鼠(n=8-24)的前肢和后肢進(jìn)行握力測(cè)量(ColumbusInstruments,Columbus,OH)。轉(zhuǎn)基因和野生型大鼠利用Dunnett大鼠握力計(jì)量4義(MJSTechnology,Stevenage,Hertfordshire,England)在早期疾病期(出生后95和110天之間；n=10)每周兩次岸企測(cè)前肢握力。大鼠還通過旋轉(zhuǎn)(rotorod)(UgoBasile,Comeno,Italy)分析以及監(jiān)測(cè)步態(tài)異常和四肢可動(dòng)性程度(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例3.1.5:電生理學(xué)對(duì)基因型和處理組雙盲進(jìn)4亍月幾電圖學(xué)(EMG)記錄和數(shù)據(jù)(9013R0011,Medtronic,MN,USA)插入由手術(shù)暴露的隔肌肌肉而進(jìn)4亍針EMG直至每次吸氣出現(xiàn)EMG干涉類型脈沖。用由MP150DataacquisitionUnit、UIM100CUniversalInterfaceModule、EMG100CElectromyopraphy組件禾口Acknowledge軟件(BIOPACSystemsInc,Goleta,CA)組成的BIOPAC裝備獲得20KHz的電信號(hào)。首先分析信號(hào)以除去60Hz々i象并且在500和1000Hz之間帶通過濾以除去由于呼吸造成的運(yùn)動(dòng)假象并且加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)-單位流量。EMG脈沖通過才交正信號(hào)，在10Hz低通過濾并且隨后檢測(cè)得到的包封大于其平均值的時(shí)間而鑒定。持續(xù)小于100ms的脈沖并不計(jì)數(shù)，并且持續(xù)小于100ms的非脈沖周期算作是周圍脈沖的部分。最后，非整流信號(hào)中的峰值利用等于三倍于非脈沖周期期間信號(hào)振幅標(biāo)準(zhǔn)差的峰值檢測(cè)閾設(shè)置檢測(cè)。脈沖峰爆發(fā)分析(spikeburstanalysis)用K.C.McGill(StanfordUniversity,CA)編寫的定制軟件(customsoftware)進(jìn)行，并且每只動(dòng)物的脈沖峰速率(Hz)計(jì)算為每一脈沖的峰值除以平均脈沖持續(xù)時(shí)間的平均數(shù)。實(shí)施例3.1.6:數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)雙-因子-重復(fù)測(cè)量ANOVA模型利用SAS混合方法應(yīng)用于體重?cái)?shù)據(jù)以及所有握力數(shù)據(jù)。二-因子ANOVA線性模型利用SASGLM方法應(yīng)用于肌肉質(zhì)量數(shù)據(jù)。電生理數(shù)據(jù)通過雙樣品t-檢驗(yàn)分析。對(duì)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，利用呈現(xiàn)泊松分布的歸納的線性模型(GLM)。通過ANOVA,隨后是Tukey，s多次對(duì)比檢驗(yàn)分析肌纖維數(shù)據(jù)。p值小于0.05時(shí)的^"比^人為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的；0.05<p<0.15的對(duì)比指趨向。實(shí)施例3.2:結(jié)果實(shí)施例3.2.1:RK35治療提高SODG93A嚙齒類的體重^f旦不延長(zhǎng)生存在出生后28天開始，SODGWA小鼠用抗-抑肌素抗體RK35治療并且持續(xù)至疾病末期(出生后大約134天)。相比PBS-治療的SODG93A小鼠，RK35治療導(dǎo)致出生后40至120天體重的顯著增加。雖然PBS-治療的SODG93A小鼠在70天達(dá)到27.78土0.46g的最大體重，但RK35-治療的小鼠達(dá)到32.13土0.48g的最大體重，相對(duì)提高16%(圖2A)。雖然野生型小鼠在整個(gè)研究過程中繼續(xù)增加體重，PBS-和RK35-治療的小鼠開始顯示由于出生后大約98天疾病發(fā)展造成的顯著失重跡象。轉(zhuǎn)基因SODG93A大鼠還在出生后42天開始用RK35抗體治療并且持續(xù)至疾病末期(~128天大小)。相比PBS-治療的大鼠，SODG93A大鼠中抗-抑肌素RK35的治療導(dǎo)致體重增加(圖2B)。接受RK35的轉(zhuǎn)基因大鼠早在出生后60天稱重顯著超過PBS-治療的轉(zhuǎn)基因大鼠(p<0.05),相當(dāng)于劑量給藥起始后3周。RK35-治療的雄性大鼠在96天達(dá)到最大的458.8±6.5g，超過PBS-治療的雄性大鼠419.1土10.7g10%的增加。RK35-治療的雌性達(dá)到最大的289.7士9.3g,超過PBS-治療的雌性252.8土6.0g15%的增加。用PBS或RK35治療的SODG93A大鼠在~112天后由于疾病發(fā)展而開始顯示顯著的失重；RK35治療沒有延緩失重的起始。雖然RK35治療導(dǎo)致體重的顯著提高，發(fā)明人觀察到RK35治療對(duì)生存無作用。由確定的30秒內(nèi)不能向右的端點(diǎn)所測(cè)量的末期時(shí)間對(duì)于RK35-治療的SODG93A小鼠(n=16)為132±8天，而PBS-治療的小鼠通過134±7天(n=17)達(dá)到末期。相比PBS畫治療的SODG93A大鼠的128±6天，用RK35治療的SODG93A大鼠通過125±8天達(dá)到末期。這些差異不是統(tǒng)計(jì)顯著的，表明在ALS的小鼠或大鼠模型中抑肌素的抑制不延緩到達(dá)疾病末期的時(shí)間。實(shí)施例3.2.2:抑月幾素抑制對(duì)月幾肉質(zhì)量和力量的作用為了測(cè)定抑肌素抑制是否減緩肌肉損耗，每組的SODG93A轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠在出生后88天處死，此時(shí)間接近通過RK35治療誘導(dǎo)的最大體重增加。在該時(shí)間點(diǎn)，相對(duì)于與疾病早期一致的野生型對(duì)照小鼠，PBS-治療SODG93A小鼠顯示腓腸肌、盧貞脛骨月幾和四頭肌肌肉質(zhì)量的顯著降低(圖2C)。相反，與在88-天的時(shí)間點(diǎn)的年齡-匹配的PBS-治療SODG93A小鼠相比，RK35-治療的SODG93A小鼠呈現(xiàn)所有4全查的肌肉中肌肉質(zhì)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的提高，從~19%至32%(腓腸肌肌肉，+26%;盧貞脛骨肌，+19%;四頭肌，+32%)。雖然疾病早期階段PBS-治療的SODG93A小鼠隔肌中沒有觀察到顯著的肌肉質(zhì)量損失；RK35治療同樣誘導(dǎo)該肌肉中質(zhì)量的顯著增加(+21%)。監(jiān)測(cè)每組中剩下的小鼠直至由右側(cè)反射檢驗(yàn)限定的末期。在末期，在RK35-治療和PBS-治療的SODG93A小鼠中觀察到腿肌肉損耗(圖2E)。與對(duì)88-天小鼠組織的觀察相反，末期時(shí)PBS-治療的SODG93A小鼠顯示相對(duì)于野生型動(dòng)物的隔肌肌肉質(zhì)量的明顯減少(圖2E)。然而，治療的SODG93A小鼠中觀察到的RK35-誘導(dǎo)的隔肌質(zhì)量增加在末期仍然顯著，表明抑肌素抑制減緩SODG93A小鼠中隔肌的萎縮。還調(diào)查了SODG93A大鼠中抗-抑肌素抗體對(duì)肌肉質(zhì)量的作用。類似于小鼠中的觀察，用RK35治療的~95-天大小的SODG93A大鼠比PBS-治療的SODG93A大鼠顯示明顯增加的質(zhì)量，朋夂腸肌(+17%),顱脛骨肌(+30%)，四頭肌(+30%)和隔肌(+17%)肌肉(圖2D)。疾病末期，腿肌肉萎縮在PBS-和RK35-治療的SODG93A大鼠都是明顯的(圖2F)。SODG93A大鼠中作為RK35治療結(jié)果的增加腿肌肉質(zhì)量的傾向持續(xù)至末期，但這些作用沒有達(dá)到顯著性。然而，RK35-治療的SODG93A大鼠比PBS-治療的對(duì)照隔肌質(zhì)量實(shí)在的和顯著的35%的增加(-35%)在疾病末期仍然明顯，與SODG93A小鼠觀察到的一致(圖2E)。為了檢驗(yàn)抑肌素抑制對(duì)肌肉功能的作用，對(duì)RK35和PBS-治療小鼠進(jìn)行定量握力測(cè)定。RK35-治療和PBS-治療的SODG93A小鼠在出生后28和56天之間顯示下肢握力的提高。出生后56天，PBS-治療的SODG93A小鼠變得明顯弱于年齡-匹配的對(duì)照小鼠(圖3A)(p<0.0001)。雖然出生后63天RK35-治療的SODG93A小鼠中握力下降還是明顯的，RK35-治療的小鼠仍然比出生后49至88天的PBS-治療的SODG93A小鼠明顯更強(qiáng)壯(或傾向于更強(qiáng)壯)(p<0.05)。前肢握力的分析顯示類似的才莫式(圖3B)。分別觀察出生后~49和56天PBS-和RK35-治療的SODG93A小鼠中前肢力量的峰值。出生后56天PBS-治療的SODG93A小鼠變得明顯弱于野生型動(dòng)物(p<0.05)并且此后持續(xù)下降。從56至88天，RK35-治療的SODG93A小鼠比PBS-治療的SODG93A小鼠更強(qiáng)壯(56d;p=0.08;63d:p=0.06;70-88d;p<0扁)。這些數(shù)據(jù)表明抑肌素抑制在SODG93A小鼠中整個(gè)疾病早期階段減緩肌肉功能的喪失。然而，100天后，治療和未治療的SODG93A小鼠中握力的下降類似。為了確定RK35治療是否誘導(dǎo)SODG93A大鼠類似的變^i,疾病早期階l殳還分一斤了RK35和PBS-治療的SODG93A大鼠和年齡匹配的野生型同窩中的前肢握力(圖3C)。PBS-治療的SODG93A大鼠明顯弱于野生型對(duì)照，證實(shí)SODG93A大鼠還在明顯的運(yùn)動(dòng)缺乏和失重之前以類似小鼠的方式呈現(xiàn)早期的疾病期。RK35-治療的SODG93A大鼠的握力測(cè)量通常低于PBS-治療的野生型大鼠，雖然組并無明顯不同。當(dāng)在該年齡間隔與PBS-治療的SODG93A大鼠相比時(shí)，SODG93A大鼠中的抑肌素抑制明顯提高握力。實(shí)施例3.2.3:抑肌素抑制減緩SODG93A小鼠和大鼠中四肢肌肉和隔肌的退化。還4企查了RK35治療對(duì)月幾肉形態(tài)的作用。4全查來自88天(疾病早期階,炎)和~134天(疾病末期)SODG93A小鼠的隔肌和中間朋卄腸月幾ll幾肉，與來自年齡-匹配的野生型對(duì)照的組織同時(shí)，將RK35治療與PBS的作用相比。每個(gè)組織中萎縮和增生的程度如表4中所示以盲分析計(jì)分(O,無；1，少量的；2,輕微的；3,中等的；4,明顯的；5,嚴(yán)重的)。PBS-治療的SODG93A小鼠在疾病早期階段顯示腓腸肌的顯著萎縮(2.0的平均分；以及圖4B)。觀察到的肌纖維的收縮，集中的細(xì)胞核和染色質(zhì)-致密的細(xì)胞核與經(jīng)受活性去神經(jīng)支配的肌肉一致；也有相比野生型小鼠的炎癥證據(jù)(圖4A和B)。相反，用RK35治療的早期階段SODG93A小鼠的腓腸肌顯示幾乎沒有至沒有萎縮(表4;0.3的平均分)。這些結(jié)果支持肌肉質(zhì)量數(shù)據(jù)，表明疾病早期(出生后88天)SODG93A小鼠中骨胳腿肌肉萎縮通過抑肌素抑制明顯降低。來自末期SODG93A小鼠的腓腸肌的檢查證實(shí)野生型肌肉(圖4D)中沒有退行性跡象的PBS(表4;3.0的平均分)和RK35治療的(表4;3.3的平均分)(圖4E和F)組中的中等肌肉萎縮。這些結(jié)果與肌肉質(zhì)量數(shù)據(jù)一致，表明SODG93A小鼠中疾病早期抑肌素抑制的保護(hù)作用沒有持續(xù)至疾病末期。相比88天的野生型小鼠，PBS-治療或RK35-治療的SODG93A小鼠的隔肌顯示幾乎沒有至沒有萎縮(表4;0.6的平均分)。然而在末期，PBS-治療的SODG93A小鼠隔肌中觀察到輕微至中度的萎縮(圖4H;表4;2.3的平均分)。相反，類似于年齡-匹配的野生型小鼠的隔肌(圖4G),疾病末期時(shí)分析的RK35-治療的SODG93A小鼠的隔肌相比PBS-治療的SODG93A動(dòng)物沒有呈現(xiàn)顯著的萎縮跡象(表4;比較圖4H和41)。合起來，肌肉質(zhì)量和組織評(píng)估表明抑肌素通過RK35的抑制保持隔肌而不是骨胳腿肌肉在整個(gè)疾病時(shí)期的完整性。表4:與年齡-匹配的野生型對(duì)照小鼠相比，用PBS或RK35治療的SODG93A小鼠中觀察到的肌肉病變的概要?；蛐蚏K35:年齡#小鼠G93A88d3G93A+88dWT88d3G93A134d3G93A+134d3WT134d3排腸肌增生0萎縮200.30003.003.:o0計(jì)分0,無；1,微小的；2,輕微的；3,中度的；4,明顯的；5,嚴(yán)重的腓腸肌和隔肌肌肉中肌纖維大小的分析呈現(xiàn)類似的模式。來自88-天腓腸肌的纖維直徑測(cè)量的頻率分布顯示與野生型對(duì)照小鼠相比(圖5C),SODG93A小鼠(圖5A)中呈現(xiàn)向細(xì)纖維的轉(zhuǎn)變。RK35-治療的SODG93A小鼠的纖維直徑分布(圖5B)處于疾病早期階段未治療的SODG93A小鼠和野生型小鼠之間。然而在末期，RK35-治療的SODG93A小鼠朋夂腸肌中纖維平均直徑與PBS-治療的SODG93A小鼠沒有4艮大的差別(數(shù)據(jù)未示出)。RK35-治療和PBS-治療的SODG93A小鼠腓腸肌中纖維平均直徑明顯不同于末期的野生型，與通過組織學(xué)觀察到的明顯的肌肉萎縮一致。野生型和PBS-治療的SODG93A小鼠之間末期時(shí)纖維大小的顯著差異在隔肌肌肉中也^艮明顯。RK35-治療的SODG93A小鼠的隔肌肌纖維大小呈現(xiàn)平均纖維直徑的顯著轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生野生型和PBS-治療的SODG93A小鼠之間的居間大小分布(圖5D)。緊接著利用大鼠模型在相當(dāng)于臨床發(fā)作(~112天；Howland66oo71:o3o2-oo666oo-肌生縮隔增萎等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:1604-09)的時(shí)間才企查SODG93A表達(dá)對(duì)隔肌肌肉電活性的作用(圖4J和4K)。PBS-治療的SODG93A大鼠組所示的EMG呈現(xiàn)稀少的峰值活性以及某些異常自發(fā)活性的存在(圖4J)。用RK35治療的SODG93A大鼠的峰值活性類似于野生型大鼠觀察到的，沒有異常自發(fā)活性的跡象。如圖4K所示，來自轉(zhuǎn)基因SODG93A大鼠的隔肌肌肉呈現(xiàn)受損功能指示的EMG脈沖峰值速率統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降低。相反，用RK35治療的SODG93A大鼠呈現(xiàn)比PBS-治療的SODG93A大鼠明顯高的脈沖峰值速率，并且其并不明顯不同于年齡-匹配的野生型對(duì)照。因此，通過RK35的抑肌素抑制在保持隔肌結(jié)構(gòu)和隔肌功能中都是有效的。實(shí)施例3.2.4:抑^L素抑制減i爰腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損失為了確定RK35是否減緩脊髓中大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損失，對(duì)來自RK35或PBS治療的SODG93A小鼠和用PBS治療的野生型小鼠的腰推L3-5小鼠脊髓大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)。在12周(84-90天齡；平均88天)，即RK35治療導(dǎo)致SODG93A小鼠中增加的肌肉質(zhì)量、增加的體重、增加的握力和減弱的肌肉組織病理的時(shí)間對(duì)脊髓進(jìn)行計(jì)數(shù)。在這時(shí)候，SODG93A小鼠中大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存在顯著的損失(25-40%)(Guo等(2003)H跳Mol.Genet.12:2519-32;Sharp(2005)Neuroscience130:897-910;Schutz等(2005)J.Neurosci.25:7805-12)。PBS-治療的SODG93A小鼠中(圖6F)大腰推運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的計(jì)數(shù)(圖6A-D)相比同窩野生型對(duì)照(圖6E)明顯降低。RK35治療減少疾病早期階段運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損失(圖6G)至PBS-治療的SODG93A小鼠和野生型小鼠之間的居間水平。疾病末期，腰推腹角中大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的顯著損失以及神經(jīng)膠質(zhì)增生的增加在SODG93A小鼠中很明顯，而不管在野生型小鼠中指出的無相應(yīng)變化的治療(圖6I和J)。大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元總數(shù)目的體纟見學(xué)計(jì)數(shù)(大于300jim2的面積)顯示與野生型對(duì)照相比PBS-治療的SODG93A小鼠中25%運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損失的趨勢(shì)。在RK35治療的小鼠中觀察到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損失減緩的趨勢(shì)(p=0.08)(圖6A)。如果計(jì)數(shù)只限于具有可見細(xì)胞核的大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以避免計(jì)數(shù)呈現(xiàn)退化跡象(即不規(guī)則的膜和空泡的出現(xiàn))的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，則與野生型對(duì)照小鼠(圖6B)相比，PBS-治療的SODG93A小鼠中每一切片大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的平均數(shù)存在40%的減少，以及RK35-治療的和PBS-治療的SODG93A小鼠之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(圖6B)。然而合起來，圖6A和B中呈現(xiàn)的組合數(shù)據(jù)表明大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損失和RK35治療對(duì)該損失的作用在12-周(88天)齡期間都是比較微妙的。在末期，通過兩種分析方法，RK35-治療的和PBS-治療的SODG93A小鼠中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的計(jì)數(shù)明顯不同于野生型對(duì)照小鼠(圖6C和D)。這些數(shù)據(jù)與以上呈現(xiàn)的骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能的數(shù)據(jù)一致，疾病早期階段觀察到的RK35-介導(dǎo)的改善并不維持至末期。實(shí)施例4討論ALS為致死和進(jìn)行性疾病，其中脊髓和腦干的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元隨著后續(xù)的肌肉萎縮而退化。^艮多關(guān)注集中于參與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的機(jī)制。一些最近的研究提示多種細(xì)胞類型可能通過控制神經(jīng)肌肉接點(diǎn)胞外樣i環(huán)境中關(guān)鍵因子的產(chǎn)生而參與疾病的病因(Brmjn等(2004)Annu.Rev.Neurosci.27:723-49)。利用嵌合小鼠的研究表明野生型非神經(jīng)元Science302:113-17)。這些觀察已引導(dǎo)可能通過提供最適的生存微環(huán)境而延緩神經(jīng)元退化的療法的研究。例如，給予病毒性表達(dá)的生長(zhǎng)因子(包括IGF-1、GDNF和VEGF)于肌肉已顯示延長(zhǎng)SODG93A小鼠模型的生存(Kaspar等(2003)Science301:839-42;Azzouz等(2004)Nature429:413-17;Wang等(2002)J.Neurosci.22:6920-28)。此外，IGF-1的肌肉-特異性表達(dá)已顯示穩(wěn)定神經(jīng)肌肉接點(diǎn)，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生存并且延緩SODG93A轉(zhuǎn)基因小鼠模型中疾病的發(fā)作和發(fā)展，表明對(duì)肌肉的直接效應(yīng)可以影響疾病的發(fā)作和發(fā)展(Dobrowolny等(2005)J.Cell.Biol.168:193-99)。肌肉代i射和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元易損性的變化也在ALS小鼠中凈艮道,進(jìn)一步支持月幾肉可能是疾病病理有效驅(qū)動(dòng)的假設(shè)(Dupois等(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:11159-64)。抑肌素或GDF-8為肌肉生長(zhǎng)的內(nèi)源性抑制劑，至少部分通過Activmlib受體(ActRIIb)的活性而發(fā)揮其生物學(xué)功能，導(dǎo)致成肌細(xì)月包增殖和分化的抑制(Langley等(2002)J.Biol.Chem.277:49831-40;Thomas等(2000)J.Biol.Chem.275:40235-43)。利用抗-GDF國(guó)8中和抗體抑制GDF-8的功能已顯示增強(qiáng)健康成年小鼠中的肌肉質(zhì)量和力量以及提供肌營(yíng)養(yǎng)不良的mdx小鼠模型中功能性的改善(Whittemore等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300:965-71;Bogda辦ich等(2002)Nature420:418-21)。為了更好地了解運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病發(fā)展中肌肉的作用，利用GDF-8、RK35的新型中和抗體，其以比之前所述的試劑更高的親和力結(jié)合(RK35的IC5o3nM對(duì)JA16的>100nM;Whittemore等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300:965-71;Bogdanovich等(2002)Nature420:418-21),引起RK35治療的野生型小鼠中肌肉質(zhì)量的更大提高(數(shù)據(jù)未示出)。家族性ALS的SODG93A小鼠和大鼠才莫型中，用RK35治療導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病早期期間體重的增加和月幾肉質(zhì)量和力量的提高。此疾病的早期定義為SODG93A小鼠呈現(xiàn)顯著的肌肉力量喪失的年齡(出生后56-88天),如通過握力評(píng)估(Ligon等(2005)Neuroreport16:533-36)和步態(tài)異常(Wooley等(2005)MuscleNerve32:43-50)所測(cè)量，并且其與神經(jīng)肌肉接點(diǎn)的去神經(jīng)化一致(Frey等(2000)J.Neurosci.20:2534-42;Fischer等(2004)ExperimentalNeurology185:232-40)。由RK35抑制GDF-8引起的肌肉質(zhì)量提高在四頭肌中最明顯，但也呈現(xiàn)在兩種所檢測(cè)嚙齒類模型的腓腸肌、顱脛骨肌和隔肌中。這些提高完全與增強(qiáng)的力量相關(guān)，如相比對(duì)照，RK35-治療的小鼠中后肢和前肢力量的下降更緩。用RK35抗-GDF-8抗體治療所誘導(dǎo)的肌肉質(zhì)量的提高程度與GDF-8基因中斷(disruption)的小鼠雜合體中觀察到的肌肉質(zhì)量25%的增加在量值上類似；純合缺失GDF-8的小鼠的肌肉質(zhì)量為野生型小鼠的約兩倍(McPherron(1997)Nature387:83-90)。SODG93A小鼠中出生后大約84-88天，以及SODG93A大鼠中大約110天，疾病的外表跡象包括體重降低、步態(tài)異常和癱瘓變得4艮明顯。RK35治療沒有延長(zhǎng)SODG93A小鼠或大鼠的生存。疾病早期抗-GDF-8治療誘導(dǎo)的肌肉質(zhì)量和力量的提高沒有延緩SODG93A'J、鼠和大鼠中步態(tài)異常和四肢癱瘓的出現(xiàn)(數(shù)據(jù)未示出)，也沒有維持腿的肌肉質(zhì)量。然而疾病早期和末期，見察到RK35-治療的SODG93A小鼠和大鼠相比介載體-治療的SODG93A對(duì)照隔肌質(zhì)量的顯著提高。末期RK35-治療的SODG93A小鼠的隔肌月幾肉在質(zhì)量和組織評(píng)估中均可與年齡-匹配的野生型對(duì)照相比。末期RK35-治療的SODG93A大鼠也維持隔肌肌肉質(zhì)量的增加。與這些形態(tài)變化一致，未治療的SODG93A大鼠隔肌的電生理分析表明突變SOD1的表達(dá)引起肌肉功能的顯著抑制，而且RK35的治療有效地保留了隔肌的肌肉功能。該研究中利用確定的終點(diǎn)(右側(cè)反射失敗檢驗(yàn)，表明顯著的四肢癱瘓)作為"末期"和安樂死的標(biāo)準(zhǔn)。因此并不清楚通過RK35治療誘導(dǎo)的增強(qiáng)的隔肌肌肉質(zhì)量、降低的萎縮和提高的電生理功能是否導(dǎo)致具有補(bǔ)給營(yíng)養(yǎng)的嚙齒類壽命的延長(zhǎng)。然而，這些發(fā)現(xiàn)由于給出了呼吸機(jī)能障礙為患有ALS的患者死亡主要原因的事實(shí)而很可能是重要的(Lechtzin等(2002)Amyotroph.LateralScler.OtherMotorNeuronDisord.3:5-13)。如設(shè)計(jì)成增強(qiáng)隔肌功能RK35的治療可能具有延緩ALS患者中機(jī)械輔助呼吸的必要性的潛力。雖然在疾病末期似乎失去了許多治療益處，RK35抑制GDF-8可能影響疾病早期腰段脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損失。這些數(shù)據(jù)表明直接對(duì)肌肉起作用的治療能通過調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)微環(huán)境而具有對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)支配肌肉的好處，雖然該方法似乎不足以延緩疾病。這些7見察因此與Dobrowolny等的結(jié)果一致((2005)J.Cell.Biol,168:193-99),其中IGF的肌肉-特異性異構(gòu)型的表達(dá)導(dǎo)致SODG93A小鼠模型中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損失的減緩，以及與Kaspar等的結(jié)果一致((2003)Science301:839-42),低。類似于Kaspar等的觀察((2003),上文)，對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存治療的有益作用并不維持至疾病末期。來自肌肉的提高的營(yíng)養(yǎng)因子支持因此可能不足以預(yù)防SODG93A模型中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損失?？傊?，家族性ALS的小鼠和大鼠模型中，抑肌素的抑制導(dǎo)致增強(qiáng)的肌肉質(zhì)量和力量，其在疾病早期維持而在末期失去。疾病早期階段抑肌素抑制減緩骨骼肌的退行性病變，但正如右側(cè)反射失敗所定義的，沒有延緩癱瘓的發(fā)作也不延長(zhǎng)生存，抑肌素抑制也不明顯減緩運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損失。然而相比未治療的對(duì)照，在用抗-抑力幾素抗體治療的動(dòng)物隔肌肌肉中觀察到疾病晚期階段形態(tài)學(xué)和功能差異。總的來說，此處提供的數(shù)據(jù)支持RK35治療對(duì)肌肉構(gòu)建有益作用的潛力，其可以促進(jìn)病程早期"患者生命質(zhì)量"的提高?？紤]到抗-GDF-8抗體目前用于臨床開發(fā)中，所述臨床試劑在ALS中維持四肢和隔肌肌肉質(zhì)量的用途保證了作為ALS治療多途徑組分的進(jìn)一步研究?？笹DF-8治療與現(xiàn)有藥物如谷氨酸-拮抗劑利魯唑(riluzole)或進(jìn)入臨床開發(fā)的更新試劑的組合通過幫助維持肌肉質(zhì)量而不僅提高效力的水平而且對(duì)患者整體的生活質(zhì)量具有顯著的影響。實(shí)施例5RK35表位的作圖為了作圖精確的GDF-8抗體表位，代表SEQIDNO:1所示成熟GDF-8序列的48個(gè)重疊的13-殘基肽利用點(diǎn)合成技術(shù)直接合成于纖維素紙上(例如Molina等(1996)PeptideRes.9:151-55;Frank等(1992)Tetrahedron48:9217-32)。肽重疊為ll個(gè)氨基酸。該陣列中，半胱氨酸殘基用絲氨酸取代以降低由半胱氨酸引起的化學(xué)復(fù)雜性。聚乙二醇修飾的纖維素膜和Fmoc-保護(hù)的氨基酸購(gòu)自Abimed(Lagenfeld，Germany)。該陣列通過偶聯(lián)P-丙氨酸間隔物而限定在膜上，并且利用之前所述的標(biāo)準(zhǔn)DIC(二異丙基碳化二亞胺)/HOBt(羥基苯并三唑)偶聯(lián)化學(xué)過程合成肽(Molina等，上文；Frank等，上文)。利用AbimedASP222機(jī)器點(diǎn)樣活化的氨基酸。人工進(jìn)行洗滌和脫保護(hù)步驟，并且該肽在最終的合成循環(huán)后N-末端乙?；?。肽合成后，膜在曱醇中洗滌10分鐘并且在封阻劑(TBST(具有0.1%(v/v)TweenTM20的Tris-緩沖鹽)和1%(w/v)酪蛋白)中洗滌10分鐘。膜隨后與2.5|iig/ml抗-GDF-8抗體在封阻劑中溫和4展蕩溫育。在封阻劑中洗滌3次10分鐘后，膜與HRP-標(biāo)記的二抗溫育30分鐘(封阻劑中0.25嗎/ml)。膜隨后每次用封阻劑洗滌三次10分鐘并且每次用TBST洗滌2次10分鐘。利用SuperSignalTMWestreagent(Pierce)和數(shù)碼照相機(jī)(AlphananotechFluoromager)顯象結(jié)合的抗體。如圖7所示，RK35表位作圖至氨基酸30-40和84-97之間的GDF-8區(qū)域，如通過GDF-8受體序列與具有已筌定結(jié)構(gòu)域的同源TGF-卩家族受體比較所預(yù)測(cè)的，其推定地與GDF-8II型受體相互作用。實(shí)施例6表征RK35抗體編碼RK35的可變重(VH)和可變輕(VL)基因克隆自產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞，并且測(cè)定氨基酸序列。RK35抗體的序列數(shù)據(jù)用于鑒定重鏈和輕鏈的最接近的種系序列。RK35輕和重可變區(qū)與最緊密的人種系序列的對(duì)比在圖8中顯示?？衫糜煤线m的誘變引物的標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)誘變技術(shù)產(chǎn)生合適的突變?？贵w突變隨后通過序列分析證實(shí)。人源化RK35的例證性的氨基酸序列在SEQIDNO:7(VH)和9(VL)中顯示，其中兩者都可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定的核酸序列編碼，例如SEQIDNO:6(VH)和8(VL)中所示的核酸序列。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到人源化抗體框架中任何和/或所有氨基酸可突變回到原始的鼠氨基酸，例如以維持該抗原結(jié)合片^a的構(gòu)象。具有某些回復(fù)-突變的SEQIDNO:7(VH)和SEQIDNO:9(VL)的非限制性實(shí)例分別如SEQIDNO:26和SEQIDNO:27所示，該回復(fù)突變有助于維持抗體對(duì)GDF-8的親和力。為了建立嵌合抗體，VH序列亞克隆入pED6hulgGImut表達(dá)載體，其編碼包含兩點(diǎn)突變(L234A和G237A)以降低結(jié)合人Fc受體和補(bǔ)體組分的人IgGl(Morgan等(1995)Immunology86:319-24;Shields等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-604)。RK35的VL序列可亞克隆入pED6K表達(dá)載體。包含RK35VH和VL序列的表達(dá)載體隨后共轉(zhuǎn)染入COS-1細(xì)胞并且從條件培養(yǎng)基純化嵌合的RK35抗體。實(shí)施例7月幾肉病癥的治療GDF-8的抑制劑，即GDF-8拮抗劑，如抑制抗體，可用于與GDF-8有關(guān)的代謝失調(diào)的治療，如2型糖尿病、葡萄糖耐受減低、代謝性綜合癥(例如X綜合癥)、胰島素抵抗(例如通過創(chuàng)傷(如燒傷或氮不平衡)誘導(dǎo)的)以及脂肪組織病癥(例如肥胖)。GDF-8抑制劑也可用于與GDF-8有關(guān)的骨和肌肉病癥的治療，如ALS、月幾營(yíng)養(yǎng)不良和骨關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的抗GDF-8抗體和抗體片段可用于治療受試者，例如人受試者，優(yōu)選患有ALS的處于疾病發(fā)作的受試者或具有確定的代謝性或骨^幾肉疾病的受試者。GDF-8的抑制抗體還可用于預(yù)防和/或降J氐疾病的嚴(yán)重程度和/或癥狀?？梢灶A(yù)料抗GDF-8抗體和抗體片l殳例如經(jīng)皮下，頻繁如每天一次和偶爾如每月一次而給予。治療持續(xù)時(shí)間約一個(gè)月(或更少)至幾年。為了檢測(cè)抗GDF-8在人中的臨床效力，鑒定患有或處于ALS風(fēng)險(xiǎn)中的受試者且隨機(jī)至治療組。治療組包括安慰劑組和接受抗體的一至三個(gè)或更多組(當(dāng)存在兩個(gè)或更多組時(shí)以不同劑量接受)。個(gè)體預(yù)期進(jìn)行例如一個(gè)月至三年以評(píng)估體重、肌肉質(zhì)量和握力的變化。可以預(yù)料接受治療的個(gè)體將呈現(xiàn)改善。GDF-8拮抗劑，優(yōu)選抗體形式，作為唯一的活性化合物或與另一種化合物或組合物組合而給予。當(dāng)作為唯一的活性化合物或與另一種化合物或組合物組合給予時(shí)，劑量?jī)?yōu)選大約ljig/kg至100mg/kg，取決于疾病癥狀和/或發(fā)展的嚴(yán)重程度。治療臨床醫(yī)師可選擇的合適有效劑量來自下列非限制性的范圍1]ng/kg至100mg/kg、lfag/kg至50mg/kg、ljag/kg至20mg/kg、1ixg/kg至10mg/kg、lfig/kg至lmg/kg、10ng/kg至lmg/kg、10jug/kg至100pg/kg、lOOpg至lmg/kg和500pg/kg至lmg/kg。例證性的非限制性治療方式和可能的結(jié)果概括在表5中。表5:可能的臨床病例的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>說明書需要根據(jù)說明書內(nèi)引用的參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)最充分地理解，其所有在此通過引用整體引入。說明書內(nèi)的實(shí)施方案提供本發(fā)明的例證而不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明的范圍。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多其他的實(shí)施方案由權(quán)利要求所包含，并且說明書和實(shí)施例應(yīng)該僅:〖人為是例證性的。權(quán)利要求1.能結(jié)合GDF-8的分離多肽，其中所述多肽包括包含選自由SEQIDNO:10的氨基酸序列、SEQIDNO:11的氨基酸序列、SEQIDNO:12的氨基酸序列、SEQIDNO:13的氨基酸序列、SEQIDNO:14的氨基酸序列、SEQIDNO:15的氨基酸序列、SEQIDNO:20的氨基酸序列、SEQIDNO:21的氨基酸序列、SEQIDNO:22的氨基酸序列、SEQIDNO:23的氨基酸序列、SEQIDNO:24的氨基酸序列、SEQIDNO:25的氨基酸序列和其活性片段的氨基酸序列組成組的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)。2.權(quán)利要求1所述的分離多肽，其中所述多肽為分離的抗體。3.權(quán)利要求2所述的分離多肽，其中所述抗體包括重鏈，并且其中所述重鏈包括第一、第二和第三互補(bǔ)決定區(qū)，其中第一互補(bǔ)決定區(qū)包括選自由SEQIDNO:10的氨基酸序列、SEQIDNO:10活性片段的氨基酸序列、SEQIDNO:20的氨基酸序列和SEQIDNO:20活性片l殳的氨基酸序列所組成的組的氨基酸序列，其中第二互補(bǔ)決定區(qū)包括選自由SEQIDNO:11的氨基酸序列、SEQIDNO:11活性片段的氨基酸序列、SEQIDNO:21的氨基酸序列和SEQIDNO:21活性片段的氨基酸序列所組成的組的氨基酸序列，以及其中第三互補(bǔ)決定區(qū)包4舌選自由SEQIDNO:12的氨基酸序列、SEQIDNO:12活性片段的氨基酸序列、SEQIDNO:22的氨基酸序列和SEQIDNO:22活性片段的氨基酸序列所組成的組的氨基酸序列。4.4又利要求3所述的分離多肽，其中所述重鏈包括選自SEQIDNO:3的氨基酸序列、SEQIDNO:3活性片段的氨基酸序列、SEQIDNO:7的氨基酸序列和SEQIDNO:7活性片段的氨基酸序列所組成的組的氨基酸序列。5.權(quán)利要求2所述的分離多肽，其中所述抗體包括輕鏈，并且其中所述輕鏈包括第一、第二和第三互補(bǔ)決定區(qū)，其中第一互補(bǔ)決定區(qū)包括選自由SEQIDNO:13的氨基酸序列、SEQIDNO:13活性片段的氨基酸序列、SEQIDNO:23的氨基酸序列和SEQIDNO:23活性片段的氨基酸序列所組成的組的氨基酸序列，其中第二互補(bǔ)決定區(qū)包括選自由SEQIDNO:14的氨基酸序列、SEQIDNO:14活性片段的氨基酸序列、SEQIDNO:24的氨基酸序列和SEQIDNO:24活性片段的氨基酸序列所組成的組的氨基酸序列，以及其中第三互補(bǔ)決定區(qū)包4舌選自SEQIDNO:15的氨基酸序列、SEQIDNO:15活性片4殳的氨基酸序列、SEQIDNO:25的氨基酸序列和SEQIDNO:25活性片段的氨基酸序列所組成的組的氨基酸序列。6.權(quán)利要求5所述的分離多肽，其中所述輕鏈包括選自SEQIDNO:5的氨基酸序列、SEQIDNO:5活性片段的氨基酸序列、SEQIDNO:9的氨基酸序列和SEQIDNO:9活性片段的氨基酸序列所組成的組的氨基酸序列。7.權(quán)利要求2所述的分離多肽，其中所述抗體包括包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的輕鏈，并且其中所述抗體進(jìn)一步包括包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈。8.權(quán)利要求2所述的分離多肽，其中所述抗體包括包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的輕鏈，并且其中所述抗體進(jìn)一步包括包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的重鏈。9.權(quán)利要求2-8任何一項(xiàng)中所述的分離多肽，其中所述抗體選自由完整的抗體、雙鏈抗體、Fd片段、Fab片段、F(ab')2片段、scFV片段和Fv片段組成的組。10.權(quán)利要求2-4任何一項(xiàng)所述的分離多肽，其中所述抗體為dAb片段。11.編碼權(quán)利要求1所述的多肽的分離多核苷酸。12.包含權(quán)利要求11所述的多核苷酸的宿主細(xì)胞，其中所述多核苦酸與調(diào)控序列有效連接。13.包含權(quán)利要求11所述的多核苷酸的載體。14.用于產(chǎn)生抗體的方法，包含培養(yǎng)包含權(quán)利要求11的所述多核苷酸的宿主細(xì)胞以及回收由所述宿主細(xì)胞表達(dá)的抗體。15.由權(quán)利要求14所述的方法產(chǎn)生的分離和純化的抗體。16.用于治療、改善和/或預(yù)防GDF-8-相關(guān)病癥的藥物組合物，包括藥學(xué)可接受載體和至少一種選自由權(quán)利要求l所述的多肽和編碼權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸組成的組的GDF-8拮抗劑。17.4又利要求16所述的藥物組合物，其中所述GDF-8相關(guān)病癥選自哺乳動(dòng)物患者中由肌肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨駱退行性病癥、代謝性或誘發(fā)的骨骼病癥、脂肪病癥、葡萄糖代謝病癥和胰島素-相關(guān)病癥組成的組。18.權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述GDF-8相關(guān)病癥選自由肌營(yíng)養(yǎng)不良、ALS、肌肉萎縮、器官萎縮、虛弱、充血梗阻性肺病、骨骼肌減少癥、惡病質(zhì)、肌肉損耗綜合癥、肥胖、2-型糖尿病、葡萄糖耐受減低、代謝性綜合癥、胰島素抵抗、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、早期的性腺衰竭、雄激素抑制、繼發(fā)性曱狀旁腺功能亢進(jìn)、骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎、低骨質(zhì)量、維生素D缺乏和神經(jīng)性厭食組成的組。19.^又利要求18所述的藥物組合物，其中所述GDF-8-相關(guān)病癥為ALS。20.治療、改善和/或預(yù)防GDF-8-相關(guān)病癥的方法，包括:給予需要所述療法的哺乳動(dòng)物患者治療有效量的GDF-8拮抗劑。21.4又利要求20所述的方法，其中所述GDF-8拮抗劑的治療有效量幾乎沒有或者沒有毒性。22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述GDF-8拮抗劑選自由權(quán)利要求1所述的多肽和編碼4又利要求1所述多肽的多核苦酸組成的組。23.4又利要求22所述的方法，其中所述GDF-8-相關(guān)病癥選自哺乳動(dòng)物患者中由肌肉病癥、神經(jīng)肌肉病癥、骨骼退行性病癥、代謝性或誘發(fā)的骨骼病癥、脂肪病癥、葡萄糖代謝病癥和胰島素-相關(guān)病癥組成的組。24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述GDF-8-相關(guān)病癥選自由肌營(yíng)養(yǎng)不良、ALS、肌肉萎縮、器官萎縮、虛弱、充血梗阻性肺病、骨骼肌減少癥、惡病質(zhì)、肌肉損耗綜合癥、肥胖、2-型糖尿病、葡萄糖耐受減低、代謝性綜合癥、胰島素抵抗、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、早期的性腺衰竭、雄激素抑制、繼發(fā)性曱狀旁腺功能亢進(jìn)、骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎、低骨質(zhì)量、維生素D缺乏和神經(jīng)性厭食組成的組。25.4又利要求24所述的方法，其中所述GDF-8-相關(guān)病癥為ALS。26.診斷或檢測(cè)患者是否罹患GDF-8-相關(guān)病癥的方法，包括步驟(a)獲得來自目的患者的第一樣品；(b)將該笫一樣品與權(quán)利要求2所述的抗體接觸；(c)測(cè)定第一樣品中GDF-8的水平；(d)從未患有GDF-8-相關(guān)病癥的個(gè)體獲得第二樣品；(e)將該第二樣品與抗體接觸；(f)測(cè)定第二樣品中GDF-8的水平；(g)比較第一和第二樣品中GDF-8的水平，其中第一樣品中GDF-8水平相比第二樣品的提高、降低或類似指示患者是否患有GDF-8-相關(guān)病癥。27.監(jiān)測(cè)GDF-8-相關(guān)病癥嚴(yán)重程度的方法，包括步驟(a)在第一時(shí)間點(diǎn)獲得取自患有GDF-8-相關(guān)病癥的患者的第一樣口口，(b)將該第一樣品與權(quán)利要求2所述的抗體接觸；(c)測(cè)定第一樣品中GDF-8的水平；(d)在第二時(shí)間點(diǎn)獲得取自該患者的第二樣品；(e)將該第二樣品與抗體接觸；(f)測(cè)定第二樣品中GDF-8的水平；和(g)比較第一和第二樣品中GDF-8的水平，其中第二樣品中GDF-8水平相比第一樣品的提高、降低或類似指示GDF-8-相關(guān)病癥的嚴(yán)重程度是否改變。28.4又利要求27所迷的監(jiān)測(cè)方法，其中所述GDF-8-相關(guān)病癥為ALS，并且其中第二樣品GDF-8水平的降低表明ALS嚴(yán)重程度降低。29.監(jiān)測(cè)GDF-8-相關(guān)病癥嚴(yán)重程度的方法，包括步驟(a)獲得患有GDF-8-相關(guān)病癥患者的第一樣品；(b)將該第一樣品與權(quán)利要求2所述的抗體接觸；(c)測(cè)定第一樣品中GDF-8的水平；(d)從未患有GDF-8-相關(guān)病癥的個(gè)體獲得第二樣品；(e)將該第二樣品與抗體接觸；(f)測(cè)定第二樣品中GDF-8的水平；和(g)比較第一和第二樣品中GDF-8的水平，其中第一樣品中GDF-8水平相比第二樣品的提高、降低或類似指示GDF-8-相關(guān)病癥的嚴(yán)重程度是否改變。30.權(quán)利要求29的監(jiān)測(cè)方法，其中所述GDF-8-相關(guān)病癥為ALS,并且其第一樣品GDF-8水平相比第二樣品的降低或類似表明ALS嚴(yán)重程度降低。31.預(yù)測(cè)患者發(fā)展為GDF-8-相關(guān)病癥可能性的方法，包括步驟(a)在第一時(shí)間點(diǎn)獲得取自目的患者的第一樣品；(b)將該第一樣品與權(quán)利要求2所述的抗體接觸；(c)測(cè)定第一樣品中GDF-8的水平；(d)在第二時(shí)間點(diǎn)獲得取自該患者的第二樣品；(e)將該第二樣品與抗體接觸；(f)測(cè)定第二樣品中GDF-8的水平；和(g)比較第一和第二樣品中GDF-8的水平，其中第二樣品中GDF-8水平的提高、降低或類似指示患者發(fā)展為GDF-8-相關(guān)病癥的可能性。32.權(quán)利要求31所述的預(yù)測(cè)方法，其中所述GDF-8-相關(guān)病癥為ALS，并且其中第二樣品GDF-8水平的提高表明患者發(fā)展ALS的可能性提南。33.預(yù)測(cè)患者發(fā)展GDF-8-相關(guān)病癥可能性的方法，包括步驟(a)獲得來自目的患者的第一樣品；(b)將該第一樣品與權(quán)利要求2所述的抗體接觸；(c)測(cè)定第一樣品中GDF-8的水平；(d)從未患有GDF-8-相關(guān)病癥的個(gè)體獲得第二樣品；(e)將該第二樣品與抗體接觸；(f)測(cè)定第二樣品中GDF-8的水平；和(g)比較第一和第二樣品中GDF-8的水平，其中第一樣品中GDF-8水平相比第二樣品的提高、降低或類似表明患者發(fā)展GDF-8-相關(guān)病癥的可能性。34.;K利要求33的預(yù)測(cè)方法，其中所述GDF-8-相關(guān)病癥為ALS,并且其第一樣品GDF-8水平相比第二樣品的降低或類似表明患者發(fā)展ALS的可能性降低。全文摘要本申請(qǐng)?zhí)峁┝伺c生長(zhǎng)和分化因子-8(GDF-8)有關(guān)的新分子，尤其是小鼠和人源化的抗體以及抗體片段，包括在體外和/或體內(nèi)抑制GDF-8活性和信號(hào)的那些。本申請(qǐng)還提供了用于診斷、治療、改善、預(yù)防、預(yù)測(cè)或監(jiān)測(cè)肌肉、骨和胰島素代謝等等，尤其是肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)退化等級(jí)的方法。此外，本申請(qǐng)?zhí)峁├帽景l(fā)明的抗體、多肽、多核苷酸和載體用于所述病癥治療的藥物組合物。文檔編號(hào)A61K39/395GK101379086SQ200680039173公開日2009年3月4日申請(qǐng)日期2006年8月14日優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日發(fā)明者D·S·霍蘭,E·L·f·霍茲鮑爾-霍蘭,F·S·沃爾什,K·華萊士,L·奇斯蒂亞科瓦,M·M·扎爾斯卡,M·N·潘加洛斯,N·韋伯,P·凱利,R·卡林,X·譚,郭成豐申請(qǐng)人:惠氏公司;賓夕法尼亞州大學(xué)信托人