專利名稱：多肽膜及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米工程多肽膜和微膠囊的制備過(guò)程及制作這類
膜和微膠囊的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及將功能性生物大分子封裝 到納米工程多肽微膠囊內(nèi)。
背景技術(shù)：
聚電解質(zhì)多層膜是由帶相反電荷的聚電解質(zhì)層交替構(gòu)成的薄 膜(如幾納米到幾毫米厚)。在合適的基底上通過(guò)層疊組裝，可以形成這 種膜。靜電層疊自組裝工藝("ELBL")中，靜電是聚電解質(zhì)結(jié)合的物理 基礎(chǔ)。由于膜表面電荷密度符號(hào)在層連續(xù)沉積時(shí)發(fā)生反轉(zhuǎn)，所以有可能 形成積層膜。帶相反電荷的聚離子的ELBL沉積的一般原理如圖l所示。 鑒于ELBL膜工藝的普遍性和相對(duì)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，可以將許多不同類型的聚 電解質(zhì)沉積到許多不同類型的表面上。多肽多層膜屬于聚電解質(zhì)多層膜， 包含至少一個(gè)含帶電多肽的層。多肽多層膜的主要優(yōu)點(diǎn)是環(huán)保。ELBL膜 還可以用于封裝工藝。多肽膜和微膠囊例如應(yīng)用在納米反應(yīng)器、生物感 應(yīng)器、人工細(xì)胞和藥物釋放載體等方面。美國(guó)專利(公開(kāi)號(hào)20050069950)中最先闡述了將多肽加到 多層膜內(nèi)的設(shè)計(jì)原理。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)， 一個(gè)多肽是否適用ELBL，與其凈電荷 和長(zhǎng)度有關(guān)。適于ELBL的多肽最好含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸基元，g卩，長(zhǎng)度約5-15個(gè)氨基酸殘基并且具有適于靜電沉積用的合適線性電荷密度的
連續(xù)氨基酸序列?？梢圆捎貌煌姆椒ㄔO(shè)計(jì)適于ELBL的多肽，如直接將
多個(gè)氨基酸序列基元相互連接，或者用接頭將多個(gè)氨基酸序列基元連起 來(lái)。具有合適長(zhǎng)度和電荷特性的多肽可以很容易地通過(guò)沉積形成一層或 多層多肽多層膜。蛋白質(zhì)、肽和寡核苷酸都可能是潛在的治療制劑。但這些生
物分子在體內(nèi)會(huì)受到各種不同降解機(jī)制的攻擊。為延長(zhǎng)功效或控釋需要， 將生物分子和其他生物活性分子封裝到一個(gè)生物相容性環(huán)境內(nèi)，不失為 一種提高靶位點(diǎn)生物活性分子利用度的策略。在被生物分子包覆的基底 上沉積多肽膜，同樣也有可能延長(zhǎng)該生物分子的功效，或者實(shí)現(xiàn)該分子 的控釋。利用靜電層疊納米組裝工藝制成的聚電解質(zhì)多層膜和微膠囊的 穩(wěn)定性高、具有可調(diào)控滲透性。因此，仍然需要發(fā)明其他方法，將蛋白質(zhì)等生物活性大分子 直接而有效地留置在生物可降解工程多肽膜和微膠囊內(nèi)。

發(fā)明內(nèi)容
在一實(shí)施例中， 一種制膜方法包括將第一層聚電解質(zhì)沉積 到基底表面上，形成第一層，然后將第二層聚電解質(zhì)沉積到第一層聚電 解質(zhì)上，形成第二層。在高分子沉淀劑存在條件下，將第一層聚電解質(zhì) 或第二層聚電解質(zhì)沉積到基底上，或者將這兩層聚電解質(zhì)都沉積到基底 上，第一層聚電解質(zhì)和第二層聚電解質(zhì)的凈電荷極性相反。在另一實(shí)施 例中，第一層聚電解質(zhì)或第二層聚電解質(zhì)含有，或者這兩層聚電解質(zhì)都 含有賴氨酸、谷氨酸或其它在中性pH條件下具有帶電側(cè)鏈的氨基酸的同 聚多肽。在另一實(shí)施例中，第一層聚電解質(zhì)或第二層聚電解質(zhì)含有，或 者這兩層聚電解質(zhì)都含有設(shè)計(jì)多肽，其中所述設(shè)計(jì)多肽含有一個(gè)或多個(gè) 第一氨基酸序列基元，所述一個(gè)或多個(gè)第一氨基酸序列基元由5-15個(gè)氨 基酸殘基組成，每個(gè)殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4;所述設(shè)計(jì)多肽不是同聚多肽，有至少15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)，每個(gè)殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4。
在另一實(shí)施例中，在制備聚電解質(zhì)多層膜過(guò)程中改善生物活 性分子功能留置的方法包括將第一層聚電解質(zhì)沉積到基底表面上，形 成第一層，然后將第二層聚電解質(zhì)沉積到第一層聚電解質(zhì)上，形成第二 層。在高分子沉淀劑存在條件下，將第一層聚電解質(zhì)或第二層聚電解質(zhì) 沉積到基底上，或者將這兩層聚電解質(zhì)都沉積到基底上，第一層聚電解 質(zhì)和第二層聚電解質(zhì)的凈電荷極性相反；并且，基底含有生物活性分子。
下面通過(guò)附圖和詳細(xì)說(shuō)明對(duì)上述和其他特征進(jìn)行舉例闡述。


現(xiàn)參見(jiàn)附圖所示的典型實(shí)施例
圖1是帶相反電荷多肽的組裝體示意圖。
圖2是葡萄糖氧化酶(GOx)被吸附到CaC03或三聚氰胺甲 醛(MF)粒子模板上的吸附力與葡萄糖氧化酶濃度和NaCl濃度的函數(shù) 關(guān)系圖。
圖3表示在不含高分子沉淀劑、含40% PEG300和含50% PEG300條件下，聚(L-賴氨酸)/聚(L-谷氨酸)(PLL/PLGA)封裝膜的 沉積過(guò)程中CaC03模板上所吸附GOx的損失與因洗滌液、聚(L-賴氨酸) (PLL)組裝緩沖液和聚(L-谷氨酸)(PLGA)組裝緩沖液中含有釋放出 的GOx而在280nm處產(chǎn)生的吸光度的函數(shù)關(guān)系圖。
圖4表示沉積溶液中含或不含50% PEG 300時(shí)，PLL/PLGA 封裝膜沉積過(guò)程中GOx在CaC03模板上的留置情況。
圖5是用分光光度法測(cè)定多肽微膠囊內(nèi)GOx活性的反應(yīng)示意圖。
圖6是被封裝的GOx的活性測(cè)定值與多肽層數(shù)的函數(shù)關(guān)系圖。
圖7表示(a)模板溶解后微膠囊的共焦顯微圖像。左熒光， 右亮視場(chǎng)；(b)膠囊的熒光密度圖。左負(fù)載膠囊，右模板溶解前 被包覆在內(nèi)的核。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及聚電解質(zhì)多層膜，尤其涉及一種制備聚電解質(zhì)多 層膜的新方法。在一實(shí)施例中，聚電解質(zhì)多層膜含有生物活性分子。在 另一實(shí)施例中，該膜含有一個(gè)或多個(gè)多肽層。
本文中，"層"是指厚度增加體，例如經(jīng)過(guò)吸附步驟后基底上 方厚度增加，形成膜。"多層"是指多個(gè)(即兩個(gè)或兩個(gè)以上)厚度增加 體。"聚電解質(zhì)多層膜"是指包含一個(gè)或多個(gè)由聚電解質(zhì)構(gòu)成的厚度增加 體的膜。多層膜的各個(gè)層在沉積之后可能不再是離散的獨(dú)立層。事實(shí)上， 厚度增加體相互間，尤其是兩個(gè)厚度增加體界面之間的物質(zhì)可能會(huì)有明 顯混合。
"聚電解質(zhì)"包括分子量大于l，OOO、每分子至少帶5個(gè)電荷 的聚陽(yáng)離子或聚陰離子材料。合適的聚陽(yáng)離子材料例如包括聚胺。聚胺 例如包括多肽、聚乙烯胺、聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基丙烯酸酯)、聚 (N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基 氨基丙烯酸酯)、聚(N,N-二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸 酯)、聚(N-甲基氨基-甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、 聚(N，N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N,N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、 聚(乙烯亞胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化銨)、聚(N,N,N-三甲基氨基 丙烯酸酯氯化物)、聚(甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化銨)、幾丁質(zhì)和包 含前述至少一種或多種聚陽(yáng)離子材料的組合。合適的聚陰離子材料例如 包括多肽、核酸、海藻酸、卡拉膠、帚叉藻膠、果膠、黃原膠、透明質(zhì) 酸、肝素、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸葡聚糖、聚(甲 基)丙烯酸、氧化纖維素、羧甲基纖維素、酸性多糖和交聯(lián)羧甲基纖維素、含有側(cè)鏈羧基的合成聚合物和共聚物，以及包含前述至少一種或多 種聚陰離子材料的組合。"氨基酸"是指多肽的結(jié)構(gòu)單位。本文中，"氨基酸"包括20 種常見(jiàn)的天然存在的L-氨基酸、其它所有天然氨基酸、所有非天然氨基
酸和所有類氨基酸，如類肽(peptoid)。"天然存在的氨基酸"是指20種常見(jiàn)的天然L-氨基酸，即甘
氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨 酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、賴 氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸。"非天然氨基酸"是指除20種常見(jiàn)天然L-氨基酸之外的氨基 酸。非天然氨基酸可以是L-型或D-型。"類肽"或N-取代的甘氨酸是指相應(yīng)氨基酸單體的類似物，
與相應(yīng)氨基酸的側(cè)鏈相同，但側(cè)鏈?zhǔn)桥c氮基的氮原子相連，而不是與該
殘基的a碳原子相連。所以，聚類肽單體間的化學(xué)鍵不是肽鍵，可用來(lái)
限制蛋白質(zhì)水解。"氨基酸序列"和"序列"是指有至少兩個(gè)氨基酸長(zhǎng)的多肽 鏈的連續(xù)長(zhǎng)度。"殘基"是指多聚體或寡聚體中的氨基酸；它是可形成多聚 體的氨基酸單體的殘基。多肽合成涉及脫水反應(yīng)，也就是說(shuō)，肽鏈上每 增加一個(gè)氨基酸會(huì)失去一個(gè)水分子。"氨基酸序列基元"是指含有n個(gè)殘基的連續(xù)氨基酸序列，n 是5-15。在一實(shí)施例中，氨基酸序列基元中每個(gè)殘基的凈電荷數(shù)量大于 或等于0.4。在另一實(shí)施例中，氨基酸序列基元中每個(gè)殘基的凈電荷數(shù)量 大于或等于0.5。本文中，凈電荷數(shù)量是指凈電荷的絕對(duì)值，也就是說(shuō)， 所述凈電荷可以是正電荷，也可以是負(fù)電荷。"設(shè)計(jì)出的多肽"(以下簡(jiǎn)稱"設(shè)計(jì)多肽")是指含有一個(gè)或 多個(gè)氨基酸序列基元的多肽，該多肽有至少15個(gè)氨基酸長(zhǎng)，pH7.0時(shí)，相同極性的帶電殘基和與其極性相反的殘基的數(shù)量差與多肽中殘基總數(shù) 的比值大于或等于0.4。換句話說(shuō)，多肽中每個(gè)殘基的凈電荷數(shù)量大于或
等于0.4。在一實(shí)施例中，pH7.0時(shí)，相同極性的帶電殘基和與其極性相 反的殘基的數(shù)量差與多肽中殘基總數(shù)的比值大于或等于0.5。換句話說(shuō)， 多肽中每個(gè)殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.5。雖然多肽長(zhǎng)度沒(méi)有絕對(duì)上 限，但總的來(lái)說(shuō)，適于ELBL沉積的設(shè)計(jì)多肽的實(shí)際長(zhǎng)度上限為1,000個(gè) 殘基。"—級(jí)結(jié)構(gòu)"是指多肽鏈中連續(xù)的線性氨基酸序列，"二級(jí)結(jié) 構(gòu)"是指多肽鏈中基本上規(guī)則的結(jié)構(gòu)類型，通過(guò)非共價(jià)相互作用(通常 為氫鍵)保持穩(wěn)定。二級(jí)結(jié)構(gòu)例如包括oi-螺旋、P-折疊和P-轉(zhuǎn)角。"多肽多層膜"是指含有上述一條或多條設(shè)計(jì)多肽的膜。例 如，多肽多層膜包括含設(shè)計(jì)多肽的第一層和含帶有極性與該設(shè)計(jì)多肽相 反的凈電荷的聚電解質(zhì)的第二層。例如，如果第一層的凈電荷為負(fù)電荷， 則第二層的凈電荷為正電荷。第二層含有另一種設(shè)計(jì)多肽或另一種聚電 解質(zhì)。"基底"是指一種固體材料，具有適于吸附水溶液中聚電解 質(zhì)的表面?；妆砻婊旧峡梢允瞧矫?、球形、棒狀等任何形狀。基底 表面可以是規(guī)則或不規(guī)則的面。基底可以是晶體，可以是生物活性分子， 其尺寸從納米級(jí)到宏觀級(jí)大小不等。另外，基底中也可以含一些微小的 亞粒子?；卓梢杂捎袡C(jī)材料、無(wú)機(jī)材料、生物活性材料或這些材料的 組合制成。基底例如包括但不限于硅晶片；CaC03微粒或三聚氰胺甲醛微 粒等帶電膠體粒子；紅細(xì)胞、肝細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞等生物細(xì)胞； 聚苯乙烯或苯乙烯共聚物等有機(jī)聚合物點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)體(polymer lattice);脂 質(zhì)體；細(xì)胞器和病毒。在一實(shí)施例中，基底是人工起搏器、人工耳蝸或 支架等醫(yī)療器械。如果在膜形成期間或形成之后，將基底分離，或用其它方式 去除，這時(shí)候?qū)⒒追Q為"模板"(用于膜的形成)。模板粒子可以用合 適的溶劑溶解或加熱去除。舉例來(lái)說(shuō)，如果使用部分交聯(lián)的三聚氰胺甲醛模板粒子，可以用較為溫和的化學(xué)方法，如使用DMSO或改變pH值 來(lái)溶解模板。模板粒子溶解后，留下由聚電解質(zhì)層交替構(gòu)成的中空多層 夕卜殼。"微膠囊"是指呈中空外殼或包覆核心的涂層形式的聚電解 質(zhì)膜。所述核心含有各種不同的膠囊填充劑，如蛋白質(zhì)、藥物或其組合。"生物活性分子"是指有生物學(xué)效應(yīng)的分子、大分子或大分 子組裝體。利用合適的試驗(yàn)，并經(jīng)每單位重量或每分子標(biāo)準(zhǔn)化后，可以 測(cè)出生物活性分子的特定生物學(xué)效應(yīng)。可以將生物活性分子裝入膠囊、 固定在后面或者置于聚電解質(zhì)膜內(nèi)。生物活性分子例如包括但不限于藥 物、藥物晶體、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)功能片段、復(fù)合蛋白、脂蛋白、寡肽、 寡核苷酸、核酸、核糖體、活性治療劑、磷脂、多糖、脂多糖。本文中， "生物活性分子"進(jìn)一步包括有生物活性的結(jié)構(gòu)組成，如功能性膜碎片、 膜結(jié)構(gòu)組成、病毒、病原體、細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞器。能被封裝在膠囊 內(nèi)或固定在多肽膜后面的蛋白質(zhì)例如有血紅球蛋白；葡萄糖氧化酶、脲 酶和溶菌酶等酶；纖維連接蛋白、層粘蛋白、玻連蛋白和膠原蛋白等胞 外基質(zhì)蛋白；以及抗體。能被封裝在膠囊內(nèi)或固定在多肽膜后面的細(xì)胞 例如包括移植胰島細(xì)胞、真核細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和酵母細(xì)胞。"生物相容性"是指經(jīng)口服、局部給藥、透皮給藥、皮下注 射、肌內(nèi)注射、吸入、植入或靜脈內(nèi)注射后不會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的不 良影響。例如，生物相容性膜包括那些與免疫系統(tǒng)(如人的免疫系統(tǒng)) 接觸后不會(huì)引起實(shí)質(zhì)性免疫應(yīng)答的膜。"免疫應(yīng)答"是指細(xì)胞或體液免疫系統(tǒng)對(duì)體內(nèi)任何部位出現(xiàn) 的物質(zhì)所產(chǎn)生的反應(yīng)。免疫應(yīng)答可以表現(xiàn)為很多方式，如血流中識(shí)別某 種抗原的抗體數(shù)量增加?？贵w是由B細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，而抗原是誘導(dǎo) 產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物體。人體通過(guò)增加血流或其它部位的抗體數(shù)量來(lái)抵抗 感染和抑制再感染。
"表位"和"抗原決定簇"可互換使用，是指被抗體識(shí)別的 抗原(如蛋白質(zhì)或設(shè)計(jì)肽)的結(jié)構(gòu)或序列。表位通常位于蛋白質(zhì)表面。"連 續(xù)表位"是指表位中包括的若干氨基酸殘基相互連接、而不是在折疊蛋 白中碰巧接觸或處于有限的空間區(qū)域內(nèi)。"高分子沉淀劑"是指一種化學(xué)物質(zhì)，如可溶性聚合物，它 能影響生物活性分子的溶解性。在一實(shí)施例中，高分子沉淀劑是指一種 能降低模板上吸附的生物活性分子水溶性和/或降低模板上制膜所用的聚 電解質(zhì)的水溶性聚合物。水溶液中，高分子沉淀劑能將外部包覆生物活 性分子的模板表面的溶劑水分子吸走，所以在聚電解質(zhì)膜組裝工藝中能 增加留置在模板上的生物活性分子的量。改變跨膠囊壁滲透壓梯度，使 膠囊模板分解時(shí)，這種高分子沉淀劑還有助于保持膠囊的穩(wěn)定性。高分子沉淀劑例如有聚乙二醇(PEG)、聚(丙烯酸)鈉鹽、 聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯垸酮、聚丙二醇(PPG)、 二乙氨基乙基葡
聚糖和聚乙烯亞胺(PEI)，以及前述一種或多種高分子沉淀劑的組合。
高分子沉淀劑的優(yōu)選分子量因不同聚合物而異。 一定要注意，分子量是 決定高分子聚合物溶解性的關(guān)鍵因素，分子量越高，其可溶性越低。上
面某些用作生物大分子高分子沉淀劑的聚合物所實(shí)際使用的分子量為
PPG425 Da、 PVA5，000Da、 PEI 40-60 kDa。從科學(xué)文獻(xiàn)中很容易查閱到 有關(guān)這些聚合物溶解性的詳細(xì)內(nèi)容。本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種制備多層膜的方法。該方法包 括在基底上沉積多個(gè)帶相反電荷的聚電解質(zhì)層。沉積這些帶相反電荷 的聚電解質(zhì)層時(shí)，至少有一層的沉積過(guò)程中使用了高分子沉淀劑。某些 實(shí)施例中沉積過(guò)程采用層疊組裝(LBL)工藝完成。依次沉積的各個(gè)層帶 有不同符號(hào)的凈電荷。在一實(shí)施例中， 一個(gè)或多個(gè)層含有設(shè)計(jì)多肽。在 另一實(shí)施例中，帶不同電荷的多肽中，至少有一條多肽含有同聚多肽， 如聚(L-賴氨酸)或聚(L-谷氨酸)。適于靜電層疊沉積工藝用的多肽的設(shè)計(jì)原理在美國(guó)專利(公 開(kāi)號(hào)2005/0069950)有所記載，該文通過(guò)引用并入本文。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，設(shè)計(jì)時(shí)首先要考慮多肽的長(zhǎng)度和電荷。靜電是多肽設(shè)計(jì)時(shí)需要考慮的最重 要因素，因?yàn)樗荅LBL的基礎(chǔ)。如果一個(gè)多肽的電荷特性不合適，那么
它在pH4-10時(shí)基本上不溶于水溶液，所以不能很容易地通過(guò)ELBL工藝 制備多層膜。其他考慮因素包括多肽的物理結(jié)構(gòu)、由多肽形成的膜的物 理穩(wěn)定性，以及膜與組成該膜的多肽之間的生物相容性和生物活性。如上所述，設(shè)計(jì)多肽是指包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列基元的 多肽，其中，所述多肽有至少15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)，pH7.0時(shí)，多肽中每 個(gè)殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4。"氨基酸序列基元"是指含n個(gè)氨 基酸殘基的連續(xù)氨基酸序列，其中n是5-15。 pH7.0時(shí)，天然存在的正電 荷氨基酸(堿性)是Arg、 His和Lys，天然存在的負(fù)電荷氨基酸(酸性) 是Glu和Asp。使用的氨基酸基元中可以包含帶相反電荷的混合氨基酸殘 基，只要整個(gè)電荷比例滿足以上規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)即可。在一實(shí)施例中，設(shè)計(jì) 多肽不是同聚多肽。在一典型實(shí)施例中，氨基酸序列基元含7個(gè)氨基酸。對(duì)長(zhǎng)7 個(gè)氨基酸的基元來(lái)說(shuō)，含4個(gè)帶電氨基酸是較為合適的最低限度，因?yàn)?少于4個(gè)電荷，肽的可溶性和對(duì)ELBL工藝的控制能力會(huì)降低。而且，關(guān) 于生物相容性，基因組數(shù)據(jù)中述及的各氨基酸序列基元都比7個(gè)氨基酸 長(zhǎng)，足以構(gòu)成連續(xù)表位，但并沒(méi)有長(zhǎng)到基本上與蛋白質(zhì)表面和其內(nèi)部的 殘基相對(duì)應(yīng)。所以，氨基酸序列基元的電荷和長(zhǎng)度有助于確?；蚪M數(shù) 據(jù)中提到的序列基元可能出現(xiàn)在該序列基元所來(lái)源的折疊蛋白表面上。 相反，非常短的序列基元在機(jī)體看來(lái)有可能是隨機(jī)序列，或者是非特定 "自體"的隨機(jī)序列，從而會(huì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。某些情況下，設(shè)計(jì)氨基酸序列基元和設(shè)計(jì)多肽時(shí)，需要考慮 形成二級(jí)結(jié)構(gòu)尤其是a-螺旋或P-折疊的傾向性。某些實(shí)施例中，最好能 控制水介質(zhì)中設(shè)計(jì)多肽形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性，如最大程度降低這種可 能性，以便盡可能地控制薄膜層形成工藝。首先，序列基元最好比較短， 約5-15個(gè)氮基酸殘基，因?yàn)殚L(zhǎng)基元在溶液中更有可能形成穩(wěn)定的三維結(jié) 構(gòu)。第二，設(shè)計(jì)多肽中共價(jià)連接相鄰氨基酸序列基元的接頭，如甘氨酸或脯氨酸殘基，會(huì)降低多肽在水溶液中形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向。例如，甘 氨酸的a-螺旋和(3-折疊傾向性很低，非常不利于甘氨酸和其相鄰氨基酸
在水溶液中形成規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)。第三，選擇a-螺旋總體傾向性小于7.5、 卩-折疊總體傾向性小于8的氨基酸序列基元，可將設(shè)計(jì)多肽本身的cc-螺旋 和P-折疊傾向性降到最低。"總體"傾向性是指基元中所有氨基酸的a-螺旋或(3-折疊的傾向性總和。a-螺旋和/或(3-折疊的總體傾向性稍高的氨 基酸序列基元適用于ELBL工藝，尤其是由Gly或Pro等接頭連接時(shí)更是 如此。某些應(yīng)用中，如果作為薄膜制備中的特定設(shè)計(jì)特征，多肽形成二 級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向可以較高。用Chou和Fasman法(參見(jiàn)P. Chou and G. Fasman Biochemistry 13:211 (1974)，其整體通過(guò)引用并入本文)可以計(jì)算出所有 20種天然存在的氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)傾向性。另一考慮因素是多肽ELBL膜的穩(wěn)定性控制。離子鍵、氫鍵、 范德華力和憎水作用都有助于多層膜的穩(wěn)定性。另外，同一層內(nèi)或相鄰 層中多肽的含巰基氨基酸之間形成的共價(jià)二硫鍵可以增加結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。含 巰基的氨基酸包括半胱氨酸和同型半胱氨酸。另外，可以往(3-氨基酸中 加入巰基，如D，L-(3-氨基-P-環(huán)己基丙酸、D，L-3-氨基丁酸或5-(甲基硫 代)-3-氨基戊酸。使用含巰基的氨基酸，通過(guò)改變氧化電位，可以將多肽 多層膜各層"鎖住"(結(jié)合在一起)和"脫離"。另外，設(shè)計(jì)多肽中序列 基元中加入含巰基的氨基酸后，由于分子內(nèi)形成二硫鍵，所以可以在薄 膜制備中使用較短的肽?？梢允褂孟旅鏀⑹龅姆椒◤幕膸?kù)中選取包 括含巰基氨基酸的氨基酸序列基元，或者可以從頭設(shè)計(jì)。在一實(shí)施例中，將無(wú)論是化學(xué)合成還是宿主體內(nèi)產(chǎn)生的含巰 基的設(shè)計(jì)多肽，在含有用于防止二硫鍵過(guò)早形成的還原劑條件下，采用 ELBL法進(jìn)行組裝。然后除去還原劑，再加入氧化劑。氧化劑使巰基之間 形成二硫鍵，將各層內(nèi)多肽"鎖"在一起，而且存在硫醇基團(tuán)時(shí)還會(huì)將 各層之間的多肽"鎖"在一起。合適的還原劑包括二硫蘇糖醇("DTT")、 2-巰基乙醇(2-ME)、還原谷胱甘肽、三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽(TCEP) 和前述一種以上化學(xué)物質(zhì)的組合。合適的氧化劑包括氧化谷胱甘肽、叔丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)、硫柳汞、肼、5，5'-二硫代-雙-(2-硝基-安息香酸)
(DTNB)、 4，4'-二硫代二吡啶、溴酸鈉、過(guò)氧化氫、連四硫酸鈉、 porphyrindin、鄰碘苯甲酸鈉，及前述一種以上化學(xué)物質(zhì)的組合。生物相容性是生物藥學(xué)應(yīng)用中所考慮的一個(gè)因素。這類應(yīng)用 中，首先利用作為多聚體設(shè)計(jì)基礎(chǔ)的基因組或蛋白質(zhì)信息，得到我們需 要的"免疫惰性"多肽。如果生產(chǎn)出的或外覆涂層的物體要與循環(huán)血接 觸，則這一方法特別有用。由于氨基酸序列基元的極性較高，所以它們 通常位于其來(lái)源蛋白質(zhì)天然折疊結(jié)構(gòu)的表面。"表面"是指折疊蛋白質(zhì)中 與溶劑接觸或因水的微粒性而難以單獨(dú)靠近溶劑的那一部分。已鑒定出 的血液蛋白氨基酸序列基元在血液中總是能與細(xì)胞有效接觸。所以，來(lái) 源于血液折疊蛋白質(zhì)的多肽有免疫原性的可能性低于隨機(jī)選擇的序列。 設(shè)計(jì)多肽一般都有生物相容性，但免疫應(yīng)答或其它任何類型的生物應(yīng)答 所達(dá)到的程度可能完全取決于序列基元的具體細(xì)節(jié)?？梢杂煤芏喾椒ㄊ鼓ぁ⑼繉踊蛭⒛z囊具備生物活性。例如， 含設(shè)計(jì)多肽的膜可以含有功能域?；蛘?，具有多肽薄膜涂層或裝在多肽 薄膜膠囊內(nèi)的其它生物活性分子也可能有生物活性。在一實(shí)施例中，所 述模板包含蛋白晶體等生物活性分子。這里提到的功能域是指蛋白質(zhì)中一段有特定生物功能(如結(jié) 合磷酸化酪氨酸)的獨(dú)立耐熱區(qū)域。多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)中可能存在多功能 域，例如，張力蛋白中就包含磷酸酪氨酸結(jié)合域和蛋白酪氨酸磷酸酶域。 多層膜內(nèi)加入的設(shè)計(jì)多肽中包含功能域，可以使膜具有與特異性配體結(jié) 合、體內(nèi)靶定、生物感應(yīng)和生物催化等所需功能。生物活性分子可以是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)功能片段，非設(shè)計(jì)多肽 構(gòu)成部分的蛋白質(zhì)功能片段、復(fù)合蛋白、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖 體、活性治療劑、磷脂、多糖、脂多糖、功能性膜碎片、膜結(jié)構(gòu)組成、 病毒、病原體、細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)、細(xì)胞器、脂、碳水化合物、藥物或抗菌 劑。生物活性分子可以是規(guī)則排列的結(jié)晶型或無(wú)定形。所述蛋白質(zhì)可以 是酶或抗體。所述基底可以包含這類生物活性分子。在一實(shí)施例中，在帶相反電荷的各多肽層沉積前，基底表面含有生物活性分子。在另一實(shí) 施例中，基底是含生物活性分子的晶體。在一實(shí)施例中，氨基酸序列基元采用從頭設(shè)計(jì)。在另一實(shí)施 例中，氨基酸序列基元選自特定生物的基因組或蛋白質(zhì)組信息，如人的
基因組。例如，可以利用補(bǔ)體C3 (gi|68766)或乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(gi|4505043) 的一級(jí)結(jié)構(gòu)，從人血液蛋白中檢索氨基酸序列基元。鑒定多肽內(nèi)第一個(gè)氨基酸序列基元的方法包含選擇多肽的 起始氨基酸殘基；檢査多肽內(nèi)含該起始氨基酸殘基和后面n - 1個(gè)(即n 減l)氨基酸殘基的氨基酸序列中存在的正電荷和負(fù)電荷，其中n是5-15; 如果pH7.0時(shí)，這5-15個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈的凈電荷大于或等于0.4xn，則 將這些氨基酸殘基確定為氨基酸序列基元；或者，如果pH7.0時(shí)，這5-15 個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈的凈電荷小于0.4xn，則舍棄該序列。下面敘述在一實(shí)施例中從氨基酸序列數(shù)據(jù)中檢索含n個(gè)氨基 酸、僅包含中性或負(fù)電荷氨基酸的負(fù)電荷氨基酸序列基元的方法。第一 步，從蛋白質(zhì)序列中選擇起始氨基酸殘基。第二步，檢査起始氨基酸殘 基和后面n-l個(gè)氨基酸殘基中是否含有精氨酸、組氨酸或賴氨酸(中性 pH時(shí)，這三種天然存在的氨基酸可能帶正電荷)，其中n是5-15。第三 步，如果發(fā)現(xiàn)這n個(gè)氨基酸殘基中有一個(gè)或多個(gè)精氨酸、組氨酸或賴氨 酸，則從第二個(gè)氨基酸殘基重新開(kāi)始上述步驟。但如果這n個(gè)氨基酸中 不含精氨酸、組氨酸或賴氨酸，則檢査并確定n個(gè)氨基酸殘基中谷氨酸 (Glu)和/或天冬氨酸(Asp)(中性pH時(shí)這兩個(gè)氨基酸帶負(fù)電荷)出現(xiàn) 的數(shù)量。第四步，如果這n個(gè)殘基中有至少0.4xn個(gè)Glu禾n/或Asp，則將 該序列歸類為負(fù)電荷氨基酸序列基元。但如果發(fā)現(xiàn)負(fù)電荷氨基酸數(shù)量少 于0.4xn個(gè)，則舍棄從第一個(gè)氨基酸殘基開(kāi)始的序列，然后再重新開(kāi)始以 上步驟，例如，立即從與第一個(gè)氨基酸殘基相鄰的第二個(gè)氨基酸殘基開(kāi) 始以上步驟。將基元?dú)w好類后，再?gòu)牡诙€(gè)氨基酸殘基開(kāi)始，重復(fù)以上 步驟。
鑒定正電荷序列基元的方法大致是從蛋白序列數(shù)據(jù)中檢索僅 含中性或正電荷氨基酸、n個(gè)氨基酸長(zhǎng)而且中性pH時(shí)這些氨基酸殘基側(cè) 鏈的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4xn的氨基酸序列。鑒定含n個(gè)氨基酸、允許同時(shí)存在正電荷和負(fù)電荷氨基酸殘 基的負(fù)電荷氨基酸序列基元或正電荷氨基酸序列基元的方法也差不多類
似。例如，鑒定含n個(gè)氨基酸的正電荷氨基酸序列基元的步驟也是從多 肽中選擇起始氨基酸殘基。然后，檢査該氨基酸殘基和后面n- l個(gè)氨基 酸殘基中是否有pH7時(shí)帶正電荷或負(fù)電荷的殘基。確定這n個(gè)氨基酸殘 基側(cè)鏈的凈電荷數(shù)。如果凈電荷的絕對(duì)值小于0.4xn，則舍棄該序列，從 另一個(gè)氨基酸重新開(kāi)始檢索。但如果凈電荷的絕對(duì)值大于或等于0.4xn， 則該序列為一個(gè)氨基酸序列基元。若凈電荷大于0，該基元為正電荷基元， 若小于O，該基元為負(fù)電荷基元。本文述及的氨基酸序列基元的從頭設(shè)計(jì)方法與上面的原理大 體相同，不同在于設(shè)計(jì)用的序列并不限于天然發(fā)現(xiàn)的序列。首先，選 擇基元長(zhǎng)度n和所需的凈電荷符號(hào)和數(shù)量。然后，選定n個(gè)能作為氨基 酸序列基元而得到所需電荷符號(hào)和數(shù)量的氨基酸，這n個(gè)氨基酸的凈電 荷絕對(duì)值大于或等于0.4xn。從頭設(shè)計(jì)氨基酸序列基元的潛在優(yōu)點(diǎn)是，操 作者可以從所有氨基酸(20種天然存在的和所有非天然的氨基酸)中挑 選以獲取所需的凈電荷，而不僅限于特定已知氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)的那些 氨基酸。與從基因組序列中鑒定氨基酸基元相比，大型氨基酸池?cái)U(kuò)大了 基元序列設(shè)計(jì)時(shí)可供選擇的物理、化學(xué)和/或生物學(xué)特征的潛在范圍。本文所述的設(shè)計(jì)多肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列基元。設(shè)計(jì) 用于ELBL工藝的多肽時(shí)，可以重復(fù)同一基元，或者將不同基元連在一起。 在一實(shí)施例中，氨基酸序列基元之間共價(jià)連接，無(wú)插入序列。在另一實(shí) 施例中，設(shè)計(jì)多肽包含兩個(gè)或兩個(gè)以上由接頭共價(jià)連接的氨基酸序列基 元。該接頭可以是氨基酸型接頭，如一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，如賴氨酸 或脯氨酸，或者可以是適于共價(jià)連接兩個(gè)氨基酸序列基元的其它任何化 合物。在一實(shí)施例中，接頭包含l-4個(gè)氨基酸，如l-4個(gè)賴氨酸和/或脯氨酸殘基。該接頭包含合適的長(zhǎng)度或組成，使設(shè)計(jì)多肽中每個(gè)殘基的凈電 荷數(shù)量大于或等于0.4。在一實(shí)施例中，設(shè)計(jì)多肽的長(zhǎng)度大于或等于15個(gè)氨基酸殘基。
在其它實(shí)施例中，設(shè)計(jì)多肽的長(zhǎng)度大于18、 20、 25、 30、 32或35個(gè)氨 基酸。實(shí)際使用的多肽長(zhǎng)度上限為1,000個(gè)殘基。氨基酸序列基元被選出或從頭設(shè)計(jì)后，即可利用本領(lǐng)域熟知 的方法，如固相合成和F-moc化學(xué)合成法，或者通過(guò)基因克隆、轉(zhuǎn)化及 細(xì)菌異源表達(dá)的方法，合成帶有氨基酸型接頭的設(shè)計(jì)多肽?？梢晕须?合成公司如SynPep公司(Dublin, California),在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用肽合成器合 成，或者采用重組DNA的方法合成。任何新型開(kāi)發(fā)的肽合成法可能會(huì)增 加肽的產(chǎn)量，但對(duì)本文所述的肽設(shè)計(jì)方法應(yīng)該不會(huì)有實(shí)質(zhì)性改變。制備聚電解質(zhì)多層膜的方法包含將多個(gè)帶相反電荷的聚電 解質(zhì)層沉積到基底上，其中至少一個(gè)層含有設(shè)計(jì)多肽。在一實(shí)施例中， 至少一種聚電解質(zhì)含有多肽，如一種帶電荷的同聚多肽或一種設(shè)計(jì)多肽。 依次沉積的聚電解質(zhì)的凈電荷相反。圖1是ELBL沉積過(guò)程的示意圖。在 一實(shí)施例中，設(shè)計(jì)多肽(或其它聚電解質(zhì))的沉積過(guò)程包括將基底暴露 在水溶液中，水溶液中含有設(shè)計(jì)多肽(或其它聚電解質(zhì))，其pH值使設(shè) 計(jì)多肽帶有適于進(jìn)行ELBL工藝的凈電荷。在另一實(shí)施例中，將設(shè)計(jì)多肽 或其它聚電解質(zhì)沉積到基底上的方法是將帶有相反電荷的多肽溶液先后 噴涂到基底上。在其它實(shí)施例中，沉積到基底上的方法是將帶有相反電 荷的多肽溶液同時(shí)噴涂到基底上。在形成多層膜的ELBL方法中，相鄰層的相反電荷能驅(qū)動(dòng)組裝 發(fā)生。其關(guān)鍵因素不是相對(duì)層中聚電解質(zhì)的凈線性電荷密度相同，而是 相對(duì)層帶有相反電荷。 一種用于沉積的標(biāo)準(zhǔn)膜組裝程序包括在能使聚 電解質(zhì)以離子形式存在的pH值(即pH4-10)條件下，形成聚電解質(zhì)水 溶液，然后選用帶有表面電荷的基底，最后將基底交替浸入帶電荷的聚 電解質(zhì)溶液內(nèi)。視情況可以在各層交替沉積步驟之間洗滌基底。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地確定適于聚電解質(zhì)沉積的
聚電解質(zhì)濃度。典型的濃度為0.1-10mg/mL。 一般來(lái)說(shuō)，制出的層厚基本
上不受沉積過(guò)程中所述范圍內(nèi)聚電解質(zhì)溶液濃度的影響。對(duì)于典型的非
多肽聚電解質(zhì)如聚(丙烯酸)和聚(烯丙胺鹽酸鹽)，層厚通常約3-5A， 具體視溶液離子強(qiáng)度而定。較短的聚電解質(zhì)通常比較長(zhǎng)的電解質(zhì)形成的 層薄。聚電解質(zhì)膜的厚度與濕度、層數(shù)和膜組成有關(guān)。例如，50nm厚的 PLL/PLGA膜經(jīng)氮?dú)飧稍锖笫湛s到1.6nm。 一般來(lái)說(shuō)，可以形成l-100nm 或更厚的膜，具體取決于膜的水合狀態(tài)和組裝體中所用聚電解質(zhì)的分子另外，形成穩(wěn)定聚電解質(zhì)多層膜所需的層數(shù)取決于膜內(nèi)的聚 電解質(zhì)。對(duì)僅含有低分子量多肽層的膜來(lái)說(shuō)，通常要有4個(gè)或4個(gè)以上 帶相反電荷的多肽雙層。而對(duì)于含高分子量聚電解質(zhì)如聚(丙烯酸)和 聚(烯丙胺鹽酸鹽)的膜來(lái)說(shuō)，含一個(gè)帶相反電荷聚電解質(zhì)的雙層就可 以保持穩(wěn)定。如本文所述，在含有高分子沉淀劑，通常在pH4-10的水溶液 中，將一種或多種聚電解質(zhì)沉積到基底上。使用高分子沉淀劑的一個(gè)優(yōu) 點(diǎn)例如是，能最大程度的減少多層膜內(nèi)所含生物活性分子的損失。對(duì)于所給定的整個(gè)沉積條件，可以選擇具特定分子量的高分 子沉淀劑的用量，使模板吸附的生物活性分子的損失盡可能減少，同時(shí) 不影響適合特定沉積工藝的沉積溶液粘度。 一般來(lái)說(shuō)，高分子沉淀劑的 合適濃度依沉淀劑的分子結(jié)構(gòu)及其分子量而定。通常，高分子沉淀劑的 濃度越高，大分子的可溶性越低。高分子沉淀劑實(shí)際使用的具有代表性 的濃度值可列舉如下對(duì)于分子量3500-4000 Da的PEG、分子量425 Da 的PPG、分子量5000 Da的PVA和分子量40-60 kDa的PEI，其使用濃度 為5-15重量％。 300 Da的PEG的可溶性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)地高于3500-4000 Da的 PEG，前一PEG在水溶液中的溶解度達(dá)到約50重量％。特定沉淀劑能夠 發(fā)揮效用的濃度上限會(huì)隨共沉淀劑濃度增加而降低。例如，如果同時(shí)含 有PVA， PEG 300的有效濃度會(huì)有所降低。如果含高分子沉淀劑和肽的溶液過(guò)于粘稠，則無(wú)法很好地控制溶液的噴涂操作。對(duì)于LBL方法，粘度 能影響沉積溶液中聚電解質(zhì)的擴(kuò)散速度。可以權(quán)衡任何一整套特定沉積 條件對(duì)所吸附生物活性分子的留置和對(duì)沉積溶液粘度的影響，以此確定 其他聚合物用作高分子沉淀劑的濃度和分子量。以PEG作高分子沉淀劑為例，在使溶液保持液態(tài)的整個(gè)溫度
范圍內(nèi)(對(duì)純水來(lái)說(shuō)，約latm氣壓下，標(biāo)稱溫度約0-10(TC)，溶液中 PEG300濃度可以達(dá)到約50% (v/v)。當(dāng)溶液中含有沉淀劑而且生物活性 分子的功能活性不會(huì)發(fā)生非可逆失活時(shí)，溫度范圍可以稍微再寬些。要 確定能夠在這些方法中、在整個(gè)給定沉積條件下發(fā)揮作用的特定分子量 PEG的濃度，至少一定程度上應(yīng)根據(jù)該濃度是否維持適當(dāng)?shù)娜芤赫扯榷?定。在一實(shí)施例中，多層膜或微膠囊中含有生物活性分子。在一 實(shí)施例中，將生物活性分子與一個(gè)或多個(gè)聚電解質(zhì)層進(jìn)行共沉積。在另 一實(shí)施例中，基底含有生物活性分子，例如，基底可以是含有液態(tài)或結(jié) 晶生物活性分子的模板，如藥物或蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，生物活性 分子包覆在基底外部。例如，在進(jìn)行聚電解質(zhì)層沉積前，先將生物活性 分子包覆在惰性核如CaC03粒子外部。聚電解質(zhì)沉積完后可以除去CaC03 粒子，形成含有生物活性分子的中空微膠囊。 —實(shí)施例中，在制膜時(shí)，高分子沉淀劑有助于聚電解質(zhì)的沉 積，能降低所吸附生物活性分子的可溶性，從而增加被封裝材料的量。 在根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定所用高分子沉淀劑的合適濃度時(shí)，可以使用一種合適的 分析法來(lái)測(cè)定生物活性分子從模板上脫離的損失。例如，可以用熒光基 團(tuán)如熒光素或CY3、熒光菁藍(lán)化合物(Amersham Biosciences),或者用 具有吸附光譜特征的基團(tuán)如酪氨酸標(biāo)記生物活性分子。利用試驗(yàn)方法確 定附著在模板上的熒光或吸收量，以此評(píng)價(jià)含或不含特定濃度的給定高 分子沉淀劑時(shí)生物活性分子的留置情況。
本發(fā)明進(jìn)一步包括用本發(fā)明的方法制備的膜。制備工藝中將 某些高分子沉淀劑加到膜內(nèi)，是有可能的。某些情況下，這種加入可能 是有益或有用的。另一方面，本發(fā)明提供了在制備聚電解質(zhì)多層膜過(guò)程中改善 生物活性分子留置的方法。在某些實(shí)施例中，這一方法包括將多個(gè)帶 相反電荷的聚電解質(zhì)層沉積到含有生物活性分子的基底上，其中， 一種 或多種帶相反電荷的聚電解質(zhì)的沉積過(guò)程是在含有高分子沉淀劑的條件 下進(jìn)行。在一實(shí)施例中， 一種或多種聚電解質(zhì)含有多肽。在另一實(shí)施例 中，這一方法包括將生物活性分子吸附到基底上，然后將多個(gè)帶相反 電荷的聚電解質(zhì)層沉積到外面包覆生物活性分子的基底上。 一種或多種 帶相反電荷的聚電解質(zhì)的沉積過(guò)程和/或生物活性分子的吸附過(guò)程均在含 有高分子沉淀劑條件下進(jìn)行。含高分子沉淀劑時(shí)沉積一層聚電解質(zhì)過(guò)程 中生物活性分子的留置量與不含高分子沉淀劑相比，至少增加15%、30%、 50%、 67%、 100%或200%。某些實(shí)施例中，帶相反電荷的聚電解質(zhì)的沉積是在水溶液中 通過(guò)LBL沉積工藝完成。在另一實(shí)施例中，沉積在模板上的帶相反電荷 的聚電解質(zhì)含有氨基酸序列基元，其中，氨基酸序列基元含有n個(gè)氨基 酸，氨基酸基元中相同電荷的電荷平衡值大于或等于0.4xn。在另一實(shí)施 例中，帶相反電荷的多肽中，至少一個(gè)多肽含有PLL或PLGA。生物活性分子例如是蛋白質(zhì)、寡肽、核酸、寡核苷酸、月旨、 碳水化合物、藥物、抗菌劑、膜結(jié)構(gòu)組成、細(xì)胞、病毒、組織，或其組 合。蛋白質(zhì)可以是酶。在某些實(shí)施例中，酶是葡萄糖氧化酶。某些實(shí)施例中，將生物活性分子沉積到模板上。合適的模板 包括有機(jī)基底和/或無(wú)機(jī)基底。模板可以含有一種材料，改變基底或含基 底的溶液的化學(xué)或物理特性，可以使這種材料溶解或崩解。例如，某些 實(shí)施例中，模板含有CaC03微粒，與EDTA混合后，CaC03微粒能被溶 解。另一實(shí)施例中，模板是結(jié)晶生物活性分子，如蛋白質(zhì)或藥物。
本發(fā)明的這一方面進(jìn)一步提供利用這些方法制得的留置生物 活性分子的多肽膜?，F(xiàn)用以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例l:葡萄糖氧化酶(GOx)吸附到CaC03和MF粒子上考慮到要利用GOx的酶學(xué)特性，所以選用GOx作模板蛋白質(zhì)。 GOx吸附實(shí)驗(yàn)中，將5mgCaC03粒子(德國(guó)PlasmChem GmbH公司)或 三聚氰胺甲醛(MF)粒子與100 pL、含有來(lái)自A m'gw的37,300 U/glI-S 型GOx (美國(guó)SIGMA公司)的10mM Tris緩沖液(pH7.4)混合。進(jìn)行 GOx吸附的溫度為使GOx溶液保持液態(tài)的溫度(對(duì)純水來(lái)說(shuō)，約l atm 氣壓下，標(biāo)稱溫度約0-10(TC)，而且該溫度下，GOx的酶活性不會(huì)非可 逆失活。粒子終濃度是5% (w/v)。使用Jasco V-430分光光度計(jì)(日本)， 280nm，測(cè)定液相吸光度，通過(guò)吸光度減小，來(lái)確定微粒表面對(duì)酶的吸附 量。離心，將多肽吸附溶液中負(fù)載有GOx的微粒分離出來(lái)。粒子吸附量 與進(jìn)料溶液中GOx濃度和鹽濃度的函數(shù)關(guān)系如圖2所示。假定粒子體積 為4.6 x 10—"cm3，則負(fù)載到CaC03粒子上的GOx最大量約為76 ng/mg 粒子或9.4 x 10—''2克酶/粒子。圖2顯示，在所不沉積條件卜任一模板在 不加單價(jià)鹽時(shí)的吸附量達(dá)到最大。
實(shí)施例2:將酶封裝到多肽微膠囊內(nèi)本例封裝試驗(yàn)研究中，由于從市場(chǎng)上很容易買到聚(L-賴氨酸) (PLL) (MW約14.6 kDa)和聚(L-谷氨酸)(PLGA) (MW約13.6 kDa)， 所以選用它們作為帶相反電荷的多肽，進(jìn)行層沉積操作。用設(shè)計(jì)多肽代 替PLL和/或PLGA進(jìn)行封裝的過(guò)程也基本類似。Li和Haynie (2004) Aowacramo/ecw/^ 5:1667-1670中記載了一對(duì)發(fā)揮同樣作用的帶相反電荷 肽的例子。
使GOx吸附到CaC03微粒上的操作如下向5mg CaC03微粒 中加入0.10mL5mg/mLGOx溶液，充分混合2小時(shí)，1000 x g離心5分 鐘，除去液相。各多肽多層沉積到吸附了 GOx的CaC03微粒上的操作過(guò)程包 括4°C、輕微搖動(dòng)10分鐘，進(jìn)行自組裝；離心，將粒子與液相中未結(jié) 合的肽分開(kāi)。在4°C ，將O.lmL含lmg/mL PLL(MW約14.6 kDa)或PLGA (MW約13.6kDa)、 10 mM Tris和0.5 M NaCl的溶液(pH7.4)加到微 粒中，充分混合。將PLL層和PLGA層交替沉積到微粒上。多肽溶液中 含有50% (v/v) PEG 300 (Fluka)。如果PEG的平均分子量太高，形成 的溶液相對(duì)本例來(lái)說(shuō)，會(huì)過(guò)于粘稠。繼各多肽吸附、液相與粒子分離步 驟之后，對(duì)組裝液上清進(jìn)行芳烴吸光度分析。PLL和PLGA中不含芳烴 殘基，所以在280nm無(wú)吸光度；而GOx可以吸收這個(gè)波長(zhǎng)的光。在各個(gè) 多肽組裝循環(huán)之間，用4"C去離子水洗滌兩次。重復(fù)這一過(guò)程，直到獲得 所需的沉積層數(shù)(一般6個(gè)雙層)。最后一層多肽組裝完后，漂洗被包覆 的粒子，并離心收集。然后用0.2MEDTA (pH7.4)處理，使粒子核溶 解。溶解過(guò)程需要10-20分鐘。2000 xg離心5分鐘，收集微粒，去離子 水漂洗，重懸在0.25mL、 10mMTris緩沖液中。各份樣品的酶活性分析 如下所述。后續(xù)實(shí)驗(yàn)用的樣品濃度估測(cè)為1.5 x 1()S個(gè)膠囊/mL。用Cy3 標(biāo)記的GOx代替GOx，按相同程序進(jìn)行共焦熒光實(shí)驗(yàn)，如圖7所示。圖3顯示，分別在不含高分子沉淀劑、含40% PEG300和含 50e/。PEG300的緩沖液中組裝時(shí)，由于洗滌液、PLL組裝緩沖液和PLGA 組裝緩沖液中含有釋放出來(lái)的GOx，所以通過(guò)280nm處吸光度來(lái)反映在 PLL/PLGA封裝膜的沉積過(guò)程中CaC03模板上所吸附GOx的損失。40% 或50%的PEG 300存在時(shí)，第一個(gè)PLGA層沉積過(guò)程中因GOx釋放而產(chǎn) 生的280nm吸光度明顯小于不含PEG300的吸光度。將沉積緩沖液中的 PEG300的濃度從10%增加到50%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膜組裝過(guò)程中從模板上解 吸附的GOx量減少。
與PEG300相對(duì)應(yīng)的PEG8000濃度所產(chǎn)生的溶液粘度使多肽 層的自組裝過(guò)程耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。具有室溫下為液體的分子量的PEG,如 PEG300，在用作高分子沉淀劑時(shí)，適于在4TM吏用。圖4表示PLL/PLGA封裝膜沉積過(guò)程中CaC03模板上GOx的 留置情況。第一個(gè)點(diǎn)表示負(fù)載在模板上的GOx起始量。后面的點(diǎn)表示后 續(xù)肽組裝和離子漂洗步驟中模板上GOx的剩余量。圖中只表示了兩個(gè)沉 積循環(huán)過(guò)程。所插入小圖中的補(bǔ)充數(shù)據(jù)表示洗滌液和組裝液上清中GOx 負(fù)載模板所釋放出的GOx量。使用以Amplex Red作底物的比色酶聯(lián)分析試驗(yàn)測(cè)定GOx的 活性。圖5是表示該試驗(yàn)的反應(yīng)圖。葡萄糖和氧氣擴(kuò)散到膠囊內(nèi)，被GOx 氧化成葡萄糖醛酸和H202。 11202擴(kuò)散到膠囊外，然后通過(guò)Amplex Red 以間接方式檢測(cè)11202。 AmplexRed試劑最開(kāi)始是無(wú)色的，在辣根過(guò)氧化 物酶(HRP)存在條件下，被11202氧化成試鹵靈(resorufm)，在^ = 563 nm可以測(cè)定出試鹵靈的吸光度。先配制下述母液用DMSO配制10mM AmplexRed試劑(美國(guó)Molecular Probes公司)；50mM磷酸鹽緩沖液(含 0.15MNaCl) (PBS)中含10U/mLHRP; 50 mM PBS中含400mM葡萄糖， 以及50mM PBS中含100 U/mL GOx。將30 jaL Amplex Red、 75 (iL HRP 和450 pL葡萄糖三種溶液混合，制得工作溶液。將100 U/mLGOx母液 稀釋，制備GOx標(biāo)準(zhǔn)溶液，每份500pL，含GOxO-10mU/mL。用50mM PBS緩沖液將膠囊樣品和不含GOx的對(duì)照樣品稀釋到500(iL。將40pL AmplexRed/HRP/葡萄糖工作溶液分別加到裝有標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)照和膠囊樣品的 試管內(nèi)，開(kāi)始反應(yīng)。環(huán)境溫度、黑暗中輕微搖動(dòng)，反應(yīng)30分鐘。測(cè)定試 鹵靈在563nm的吸光度。根據(jù)GOx已知量對(duì)應(yīng)的活性值，將測(cè)定的酶活 性轉(zhuǎn)換成活性GOx的量。圖6表示利用酶學(xué)分析試驗(yàn)測(cè)定出的被封裝活性GOx的量與 多肽層數(shù)的函數(shù)關(guān)系。圖中顯示了模板溶解后，多肽組裝溶液中加入和 未加PEG時(shí)留置在膠囊內(nèi)的材料量。層數(shù)少于6的膠囊在溶液中不穩(wěn)定。 如圖6所示，不含PEG條件下進(jìn)行多肽組裝時(shí)，與微膠囊相關(guān)的GOx活性在PLL/PLGA沉積到2個(gè)雙層時(shí)顯著降低。測(cè)定出的活性往往達(dá)到恒 定值(例如，多肽沉積前約11%)，這個(gè)值在3-6個(gè)雙層范圍內(nèi)不隨層數(shù) 而變化。往PLL和PLGA組裝溶液中加入PEG后，由多肽構(gòu)成的"人工 細(xì)胞"的GOx負(fù)載量顯著增加。6個(gè)雙層沉積完之后，固液相分離前， 有約70%的酶活性留置在細(xì)胞內(nèi)。將含6個(gè)雙層的細(xì)胞用超聲波處理20 分鐘，其效果與使用PEG類似，酶活性沒(méi)有降低。這一結(jié)果暗示，用多 肽多層膜封裝GOx，既不會(huì)抑制酶活性，也不會(huì)阻止小分子(如葡萄糖 (酶底物)和反應(yīng)產(chǎn)物)通過(guò)屏障擴(kuò)散。GOx進(jìn)入人工細(xì)胞壁的程度尚 未確定。通過(guò)以下操作可以確定，所測(cè)定的酶活性事實(shí)上與人工細(xì)胞 相關(guān)。用0.22 pm過(guò)濾器將有6個(gè)雙層的細(xì)胞與液相分離后，測(cè)定溶液中 GOx的活性。在不含PEG時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到濾液中的GOx活性，但檢測(cè)到 人工細(xì)胞內(nèi)的GOx活性。使用PEG時(shí)，檢測(cè)到部分酶(約1.5 x 10—12g/ 膠囊)。這可能是由于反復(fù)離心和洗滌過(guò)程中模板/細(xì)胞出現(xiàn)部分裂解所 致。細(xì)胞重懸后，沒(méi)有在濾液中進(jìn)一步檢測(cè)到活性，表明負(fù)載的GOx沒(méi) 有被濾除。再用相同方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GOx的留置量。用熒光染料Cy3單活性基NHS-酯(英國(guó)Amersham Biosciences)標(biāo)記GOx以便肉眼觀察GOx負(fù)載微粒。將Cy3-GOx吸附 到CaC03微粒上，然后封裝到PLL/PLGA膜內(nèi)。通過(guò)熒光顯微技術(shù)研究 層數(shù)對(duì)人工細(xì)胞穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明，少于3個(gè)雙層的涂層在粒子 核溶解后往往容易分離，而3個(gè)或3個(gè)以上雙層通常在水溶液中能穩(wěn)定 數(shù)周。這一結(jié)果與本文所述的GOx活性測(cè)定值吻合。膜厚與層數(shù)直接相 關(guān)。利用共焦激光熒光顯微技術(shù)進(jìn)一步證明Cy3標(biāo)記的GOx被裝載到含 6個(gè)雙層的PLL/PLGA微膠囊內(nèi)(圖7a，左半塊)。亮視場(chǎng)照明得到的右 半塊顯示，用EDTA處理后，微粒模板完全溶解。含6個(gè)雙層的膠囊的 熒光密度剖視圖揭示，微粒內(nèi)充滿大量不受約束的Cy3標(biāo)記GOx(圖7b， 左)。細(xì)胞直徑與原始模板的直徑近似(圖7b，右)。密度范圍內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)峰，說(shuō)明一些GOX與細(xì)胞"膜"結(jié)合，這可能是由靜電引力和耗散現(xiàn) 象引起。運(yùn)用圓二色譜法進(jìn)一步證明GOx被封裝到多肽細(xì)胞內(nèi)。
實(shí)施例3:將酶封裝到聚電解質(zhì)微膠囊內(nèi)另一實(shí)施例中，在磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.0)中將血紅蛋
白負(fù)載到碳酸鈣粒子上，然后用非肽類聚電解質(zhì)封裝。向蛋白質(zhì)溶液中
加入高分子沉淀劑如40Q/。PEG300，蛋白負(fù)載效率增加。用兩種帶相反電 荷的聚電解質(zhì)，按LBL工藝，對(duì)吸附蛋白進(jìn)行封裝。適合本例用的聚合 物有聚(苯乙烯磺酸酯)、聚陰離子和聚(烯丙胺)、聚陽(yáng)離子。用分光 光度計(jì)在可見(jiàn)光范圍內(nèi)可以證明蛋白質(zhì)已被負(fù)載由于血紅蛋白含有血 紅素，所以在近410nm處有一個(gè)大的吸收譜。本發(fā)明提出一種通過(guò)往組裝緩沖液中加入高分子沉淀劑，而 將功能性生物活性分子高效留置在納米工程聚電解質(zhì)膜內(nèi)的方法。聚電 解質(zhì)多層膜是半透膜，可以阻止生物分子向外泄漏，但不會(huì)阻止小分子 滲透。與LBL工藝制備薄膜時(shí)更普遍使用的不能生物降解的合成聚電解 質(zhì)相比，封裝多肽所固有的生物相容性更有利于在生物醫(yī)藥方面應(yīng)用。本文中"第一"和"第二"等詞不表示任何特定順序，而僅 便于表示例如多個(gè)層。除非另外說(shuō)明，"包含"、"具有"、"包括"和"含 有"等詞均應(yīng)理解為開(kāi)放式用語(yǔ)(即意指"包括但不限于")。文中表示 數(shù)值范圍的方式僅僅是作為單獨(dú)談及落在該范圍內(nèi)的每個(gè)分散數(shù)值的簡(jiǎn) 略表示法，除非本文另外指明，而且每個(gè)分散值就好比文中以一一敘述 的方式被引入本說(shuō)明書(shū)。所有范圍的端點(diǎn)包含在該范圍內(nèi)，而且可獨(dú)立 組合。文中所述所有方法均按合適的順序操作，除非文中另外指明或上 下文清楚地出現(xiàn)不同說(shuō)法。任一和所有實(shí)施例或典型用語(yǔ)(如"例如/如") 僅僅是為了更好地闡述本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明范圍予以限制，除非另外 要求。說(shuō)明書(shū)中任何語(yǔ)言均不應(yīng)解釋為將任何未要求權(quán)利保護(hù)的特征作 為實(shí)施本文所述發(fā)明的必要特征。
雖然參照典型實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)當(dāng)明白，在本發(fā)明范圍內(nèi)可以進(jìn)行各種改動(dòng)而且可以將本發(fā)明的特 征用等同特征替代。另外，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)有可能在本發(fā)明的范圍內(nèi) 進(jìn)行多種改進(jìn)以適應(yīng)特定情況或材料，所以，本發(fā)明并非要局限于本文 公開(kāi)的作為實(shí)施本發(fā)明最佳模式的特定實(shí)施例，而是要包括權(quán)利要求范 圍內(nèi)的所有實(shí)施例。本發(fā)明涵蓋上述特征所有可能變化形式的任一組合， 除非本文另外指明或有清楚的相反敘述。
權(quán)利要求
1.一種制膜方法，該方法包括將第一層聚電解質(zhì)沉積到基底表面上，形成第一層；以及將第二層聚電解質(zhì)沉積到第一層聚電解質(zhì)上，形成第二層；其中，在高分子沉淀劑存在條件下，將第一層聚電解質(zhì)或第二層聚電解質(zhì)沉積到基底上，或者將這兩層聚電解質(zhì)都沉積到基底上；以及第一層聚電解質(zhì)和第二層聚電解質(zhì)的凈電荷極性相反。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一層聚電解質(zhì)或第二 層聚電解質(zhì)含有，或者這兩層聚電解質(zhì)都含有設(shè)計(jì)多肽，其中所述設(shè)計(jì)多肽含有一個(gè)或多個(gè)第一氨基酸序列基元，所述一個(gè)或多 個(gè)第一氨基酸序列基元由5-15個(gè)氨基酸殘基組成，每個(gè)殘基的凈電荷數(shù) 量大于或等于0.4;所述設(shè)計(jì)多肽不是同聚多肽，有至少15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)，每個(gè)殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一層聚電解質(zhì)或第二 層聚電解質(zhì)，或者這兩層聚電解質(zhì)在生物活性分子存在條件下被沉積。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述基底含有生物活性分子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述生物活性分子以基底表 面的涂層形式存在。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述基底含有適于在聚電解 質(zhì)多層膜沉積完后發(fā)生崩解的模板。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述生物活性分子以核的形 式存在。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括在沉積第一層聚電 解質(zhì)之前，將生物活性分子沉積到所述基底的表面上。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述高分子沉淀劑包含聚乙 二醇、聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙二醇，或者前述 一種或多種高分子沉淀劑的組合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述膜是微膠囊形式。
11. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中，生物活性分子被所述微膠 囊封裝在內(nèi)。
12. —種在聚電解質(zhì)多層膜制備過(guò)程中改善生物活性分子留置的方 法，該方法包括將第一層聚電解質(zhì)沉積到基底表面上，形成第一層；以及將第二層聚電解質(zhì)沉積到第一層聚電解質(zhì)上，形成第二層；其中，在高分子沉淀劑存在條件下，將第一層聚電解質(zhì)或第二層聚 電解質(zhì)沉積到基底上，或者將這兩層聚電解質(zhì)都沉積到基底上；第一層聚電解質(zhì)和第二層聚電解質(zhì)的凈電荷極性相反；以及所述基底含有生物活性分子。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述第一層聚電解質(zhì)或第 二層聚電解質(zhì)含有，或者這兩層聚電解質(zhì)都含有設(shè)計(jì)多肽，其中所述設(shè)計(jì)多肽含有一個(gè)或多個(gè)第一氨基酸序列基元，所述一個(gè)或多 個(gè)第一氨基酸序列基元由5-15個(gè)氨基酸殘基組成，每個(gè)殘基的凈電荷數(shù) 量大于或等于0.4;所述設(shè)計(jì)多肽不是同聚多肽，有至少15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)，每個(gè)殘基 的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，在沉積第一層聚電解質(zhì)之 前，將生物活性分子沉積到所述基底的表面上。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法 表面的涂層形式存在。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法解質(zhì)多層膜沉積完后發(fā)生崩解的模板。
17. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法 形式存在。
18. —種制膜方法，該方法包括在高分子沉淀劑存在條件下，將生物活性分子沉積到基底表面上； 將第一層聚電解質(zhì)沉積到基底表面上，形成第一層；以及 將第二層聚電解質(zhì)沉積到第一層聚電解質(zhì)上，形成第二層； 其中，所述第一層聚電解質(zhì)和第二層聚電解質(zhì)的凈電荷極性相反。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述第一層聚電解質(zhì)或第 二層聚電解質(zhì)，或者這兩層聚電解質(zhì)在高分子沉淀劑存在條件下被沉積。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述基底含有適于在聚電 解質(zhì)多層膜沉積完后發(fā)生崩解的模板。，其中，所述生物活性分子以基底 ，其中，所述基底含有適于在聚電 ，其中，所述生物活性分子以核的
全文摘要
本文公開(kāi)了一種制膜方法，該方法包括將第一層聚電解質(zhì)沉積到基底表面上，形成第一層；以及將第二層聚電解質(zhì)沉積到第一層聚電解質(zhì)上，形成第二層。第一層聚電解質(zhì)或第二層聚電解質(zhì)，或者這兩層聚電解質(zhì)在高分子沉淀劑存在條件下被沉積。第一層聚電解質(zhì)和第二層聚電解質(zhì)的凈電荷極性相反。本文還公開(kāi)了在聚電解質(zhì)多層膜制備過(guò)程中改善生物活性分子留置的方法。
文檔編號(hào)A61K9/28GK101309670SQ200680042346
公開(kāi)日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2006年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月14日
發(fā)明者唐納德·坦普爾頓·海尼, 郅政亮 申請(qǐng)人:路易斯安那科技大學(xué)研究基金會(huì)