專利名稱：：通過誘導(dǎo)免疫耐受治療纖維化疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及纖維化疾病(fibrosingdisease)的治療。具體地，本發(fā)明涉及通過誘導(dǎo)免疫耐受治療纖維化疾病。
背景技術(shù)：
：人中的獲得性纖維化疾病具有幾個常見特征。組織纖維化之前是正常組織的損傷和/或炎癥。T細(xì)胞和單核細(xì)胞對組織的浸潤見于纖維化發(fā)展的早期。系統(tǒng)性硬化癥(Systemicsclerosis)(SSc，硬皮病)是常見的系統(tǒng)性纖維化疾病，其與I,m,IV，VI,VII，XVI,XVIII型膠原蛋白的累積增加有關(guān)。對i,ni禾niv型的細(xì)胞和/或體液免疫已經(jīng)在ssc患者中描述。該疾病主要特征包括皮膚增厚并與下方的結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合。通常涉及的內(nèi)部器官是胃腸道，肺，腎和心臟。T淋巴系統(tǒng)通過合成不同類型的細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)纖維母細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞以及多種其他靶細(xì)胞的功能。對于纖維化，T細(xì)胞產(chǎn)生成纖維因子諸如IL-4，TGF-pi和卩2，可直接刺激培養(yǎng)的纖維母細(xì)胞合成膠原。T細(xì)胞通過合成干擾素(IFN)Y可激活巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可合成多種成纖維細(xì)胞因子，包括血小板來源的生長因子，TGF-(31和卩2，所述細(xì)胞因子可刺激纖維母細(xì)胞合成膠原。.發(fā)明概述本發(fā)明提供了通過口服給藥從正發(fā)生纖維化的組織來源的組織蛋白來治療纖維化疾病的方法。可根據(jù)本發(fā)明治療的纖維化疾病包括但不限于，硬皮病(SSC)，皮膚纖維化，肝硬化，腎纖維化，肺纖維化，心臟纖維化，胃腸纖維化以及血管纖維化。一個實(shí)施方案中，本發(fā)明用于治療患有纖維化疾病至少3年，優(yōu)選至少5年的患者。另一實(shí)施方案中，纖維化疾病通過口服給藥來自正發(fā)生纖維化的組織的膠原蛋白來治療。根據(jù)組織類型，不同類型的膠原蛋白可用于該治療。膠原蛋白可從人患者中正發(fā)生纖維化的組織制備，或者從動物諸如鳥類或哺乳動物的相應(yīng)組織制備。可選，可使用化學(xué)合成或重組制備的膠原蛋白。膠原蛋白的片段或其混合物也可用于本發(fā)明中。一個優(yōu)選實(shí)施方案中，膠原蛋白或膠原蛋白片段通過以大約500ug/天口服給藥大約12個月來提供給患者。附圖簡述圖1是顯示不同SSc患者亞組中不同時間點(diǎn)的MRSS改變的柱圖。圖2顯示在第12個月時，SSc患者百分比相對于MRSS改善百分比。圖3顯示第15個月時SSc患者百分比相對于MRSS改善百分比。圖4顯示用CNBr切割al(I)和a2(1)。發(fā)明詳述本發(fā)明首次證實(shí)了口服給藥的I型膠原蛋白(CI)在系統(tǒng)性硬化癥(SSc)患者中誘導(dǎo)CI耐受性并緩解該疾病的臨床表現(xiàn)。SSc是常見的系統(tǒng)性纖維化疾病，與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白諸如膠原蛋白的累積增加相關(guān)。不受任何具體理論的限制，據(jù)信口服給藥其中T細(xì)胞被各種刺激因素激活的正發(fā)生纖維化的組織位點(diǎn)中存在的組織蛋白(例如膠原蛋白)可下調(diào)T細(xì)胞。因此，T細(xì)胞分泌成纖維細(xì)胞因子以及刺激單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子的作用受到抑制，所述細(xì)胞因子本來會刺激該組織位點(diǎn)的纖維母細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白諸如膠原蛋白。因此，本發(fā)明提供治療纖維化疾病的方法，其通過口服給藥從正發(fā)生纖維化的組織來源的組織蛋白來進(jìn)行。可通過本發(fā)明的方法治療的纖維化疾病包括但不限于SSC,皮膚纖維化，肝硬化，腎纖維化，肺纖維化，心臟纖維化(例如見于充血性心力衰竭)，胃腸纖維化以及例如見于動脈粥樣硬化中的血管纖維化。無論其病因如何，本發(fā)明的方法可治療這些纖維化疾病具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于治療患有纖維化疾病至少3年，優(yōu)選至少5年的患者。根據(jù)本發(fā)明，纖維化疾病可通過口服給藥來自正發(fā)生纖維化的組織的膠原蛋白來治療。例如，已知SSc與過量累積的I型膠原蛋白有關(guān)，因此I型膠原蛋白或其片段可口服給藥SSc患者。肝硬化與肺纖維化以及間質(zhì)膠原蛋白疾病分別與I，m和V型膠原蛋白的累積有關(guān)。因此，I，III禾口V型膠原蛋白分別可口服給藥患有肝硬化，肺纖維化以及間質(zhì)膠原蛋白疾病的患者。來自膠原蛋白的小合成肽在經(jīng)鼻給予例如通過滴鼻劑或噴鼻劑給予或作為氣溶膠吸入時，也可誘導(dǎo)耐受。膠原蛋白可從人類患者中正發(fā)生纖維化的組織或動物的相應(yīng)組織制備和提取，所述動物諸如鳥類(例如家禽)或哺乳動物(例如?；蜇i)。可選，化學(xué)合成或重組制備的膠原蛋白也可使用。此外，膠原蛋白片段或其混合物也可用于本發(fā)明。例如，CNBr裂解I型膠原蛋白所衍生的肽可以用于SSc患者的治療。膠原蛋白或其片段可通過以以下劑量口服給藥患者來提供大約200-1000jig/天，優(yōu)選約400-600[ig/天，更優(yōu)選約500所述治療可持續(xù)至少6個月，優(yōu)選12個月或更長時間，或直到疾病的臨床表現(xiàn)減輕或緩解。本發(fā)明還通過以下實(shí)施例具體說明。實(shí)施例1為了確定口服給藥500pg/天的牛I型膠原蛋白(CI)是否緩解系統(tǒng)性硬化癥(SSc)的臨床表現(xiàn)，進(jìn)行多中心雙盲安慰劑對照研究?；谝韵聵?biāo)準(zhǔn)篩選用于包括在研究中的患者--至少18歲的男性或女性；-臨床診斷為患有彌漫型(diffose)SSc(根據(jù)1980年的ACR標(biāo)準(zhǔn))3年或以下(早期)，或4-10年(晚期)；-加入研究前6個月之中通過病史或體檢顯示穩(wěn)定的皮膚病變；和-加入研究之前1個月具有穩(wěn)定的改良Rodnan皮膚評分(MRSS):篩選是穩(wěn)定的MRSS>16，隨機(jī)分配時穩(wěn)定的如下MRSS:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>對168名符合上述標(biāo)準(zhǔn)的患者分級并隨機(jī)分配接受日安慰劑[2mlO.lM乙酸(HAc)]或500嗎牛CI，持續(xù)12個月。在基線期以及4，8，12以及15個月以后，測定MRSS作為第一臨床結(jié)果變量。硬皮病健康評估調(diào)査問巻(SHAQ)，短表(shortform)36調(diào)査問巻，醫(yī)生的全面評估，患者的全面評估，血壓，體重和血清肌酐作為第二臨床結(jié)果指標(biāo)在基線期以及4，8，12和15個月之后測定。在不早于基線期以前5周和第12個月時測定患者的FVC和DLCO，作為第二臨床結(jié)果參數(shù)。需要在對接受任何排它性藥物/治療的患者進(jìn)行篩選前訪問。圖1總結(jié)了從基線起第4個月(藍(lán))，第8個月(紅)，第12個月(綠)，第15個月(桔紅)的MRSS改變，分成四個亞組。每個柱表明每個時間點(diǎn)上每組中MRSS改變的分布；上方邊緣是75%;下方邊緣是25%;柱內(nèi)的線表示MRSS改變中間值。在此以外的值通過伸出的線表示。結(jié)果表明CI治療組和安慰劑組在第12個月時的改變平均值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。類似的結(jié)論見于其他臨床和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)(見表1和2)。然而在第15個月，CI治療的晚期患者("晚期膠原蛋白"組)中的MRSS為7.9，與安慰劑組中的晚期患者("晚期安慰劑"組)的2.9相比有非常明顯的差異。如圖1所示，在第15個月，膠原蛋白治療的晚期患者組的桔紅色柱中的中間值明顯低于其他桔紅色柱中的中間值，并且實(shí)際上是所有柱中最低的。這表明CI治療的晚期患者亞組中的MRSS改善最大。接受治療的晚期患者各組中MRSS平均值差異的p值為0.0063;而所有其他實(shí)驗(yàn)對于0.05的水平而言都不明顯。注意到變量MRSS本身不是正態(tài)分布的，但MRSS在第12個月和第15個月與基線相比的改變是正態(tài)分布的。因此，p值獲自t檢驗(yàn)。非參數(shù)檢驗(yàn)也用于確定治療組和安慰劑組之間的MRSS改變，即秩-和檢驗(yàn)，所得p值相似。在MRSS中的改變產(chǎn)生分叉并測定具有皮膚MRSS改變的患者百分比的情況下，獲得兩幅圖(圖2和圖3)。每幅圖顯示四個亞組的每一個中經(jīng)理不同程度的MRSS改善的患者百分比。例如，在圖2中，晚期膠原蛋白組中幾乎50%的患者在第12個月的MRSS減少20%。反之早期膠原蛋白組中僅僅大約19%經(jīng)歷類似的改善。兩幅圖都明顯顯示與其他亞組相比，晚期患者從膠原蛋白治療中獲益最多。在膠原蛋白組中，卡方檢驗(yàn)證實(shí)了在第15個月時，與早期患者相比，晚期患者中MRSS改善至少25%的比例明顯更高?？偠灾?，上述研究顯示口服給藥500pg/天的CI持續(xù)12個月在研究第15個月時可明顯降低病程大于等于4-10年的患者中的MRSS，表明口服膠原蛋白治療對皮膚纖維化具有延遲效果。在該研究中，口服CI對于PFT或HAQ沒有明顯效果，并且沒有CI治療導(dǎo)致的副作用?？诜z原蛋白治療的延遲效果與一旦T細(xì)胞剌激被中和纖維母細(xì)胞需要一些時間來"逐漸平靜"("winddown")有關(guān)。這些結(jié)果也表明僅僅在晚期患者中T細(xì)胞提供成纖維信號的主要來源。實(shí)施例2該實(shí)施例描述了用于測定500pg/天的口服CI治療在加入實(shí)施例1所述研究的患者中是否誘導(dǎo)CI耐受性的實(shí)驗(yàn)。血清和PBMC獲自治療之前和口服牛CI治療12月之后的患者，或在3個月或以上到11個月或以下退出的患者(drop-out)。PBMC在有或無牛al(I)鏈，牛(x2(I)鏈,天然牛CI，或al(I)或a2(I)的CB(CNBr)肽的情況下收集。CB肽通過用CNBr裂解?；蛉薬l(I)和a2(I)(圖4和表3所示)并通過離子交換層析純化來分離。在給藥CI或安慰劑之前的基線期以及第12個月時，純化的al(I)和a2(I)的CB肽以及未分離的al(I)和a2(I)的CB肽用于培養(yǎng)SSc患者的PBMC。在第0和12個月，PBMC上清通過ELISA分析IFNy禾口IL-IO。鏈刺激的PBMC在口服給藥CI之后產(chǎn)生的IFNy減少或IL-10增加作為第一免疫學(xué)結(jié)果變量。結(jié)果總結(jié)于表4-9。如表5-6所示，在口服CI治療12個月的總和早期疾病階段患者群中，觀察到al(I)CB肽混合物以及al(I)CB7導(dǎo)致PBMC的IFN丫產(chǎn)生明顯減少。此外，在總和早期疾病階段患者群中，觀察到人a2(I)以及al(I)CB7導(dǎo)致PBMC的IL-10產(chǎn)生明顯增加(表7-8)。這些結(jié)果表明口服牛CI通過調(diào)節(jié)TH1/TH2產(chǎn)生而對于治療患彌漫性SSc大于等于4年的患者而言是有效的?？乖禺愋訧L-10產(chǎn)生的上調(diào)提示在LD患者中誘導(dǎo)了CI耐受性。對于總SSc人群，患病期和以下物質(zhì)導(dǎo)致的IL-lO產(chǎn)生之間成反比al(I)CB3(p=-0.0059.N=153);al(I)CB7(p=-0.0335,N=150);人al(I)(p=-0.0166，N=152);a2(I)CB混合物(p--0.0032.N=154)。對于早期患者，MRSS和a2(I)CB2導(dǎo)致的IFNY產(chǎn)生之間成反比(p:-0.026，N=94)。對于總SSc人群，SF-36和al(I)CB4導(dǎo)致的IFNy產(chǎn)生之間成反比^=-0.0448,N=143)。對于晚期患者，SF」36和al(I)CB4和PHA導(dǎo)致的IFN^y產(chǎn)生成反比(分別為p=-0.0364，N=57;p=-0.028,N=58)。對于總彌漫性SSc人群，F(xiàn)VC和與al(I)CB4和人a2(I)—起培養(yǎng)的PBMC的IL-10產(chǎn)生成正比(分別為p=0.0122,N=I52;p=0.0072，N=94)。對于早期患者，F(xiàn)VC與人a2(I)導(dǎo)致的IL-10成正比(p-0.0062,N=94)。對于早期患者，F(xiàn)EB1和a2(1)CB4和al(I)CB混合物導(dǎo)致的IL-10產(chǎn)生成反比(分別為p;0.0067，N=92;p=-0.0041,N=94)。對于總彌漫性SSc人群，F(xiàn)EV1和al(I)CB混合物導(dǎo)致的IL-lO成反比(p-0.0241,N=154)。在早期患者中，DLCO和al(I)CB7導(dǎo)致的IFNy產(chǎn)生成正比(p-0.0367，N-90)。晚期患者中，DLCO和a2(1)CB2導(dǎo)致的IFNY產(chǎn)生成正比(p-0.0383,N=59)?？偠灾?，用CI和CI衍生肽培養(yǎng)患者PBMC進(jìn)行的免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示，總體上，培養(yǎng)的PBMC產(chǎn)生的IFNy和IL-10增多見于早期疾病患者(<4年病程)?？乖咨钪榫鷮?dǎo)致的IFN丫產(chǎn)生不存在于早期和晚期患者中，提示對共同環(huán)境抗原的Thl反應(yīng)受損。天然牛CI引發(fā)早期和晚期患者中IFNy和IL-10產(chǎn)生的明顯增加。不能引發(fā)晚期患者中IFNy或IL-10產(chǎn)生的具體CICB肽包括al(I)CB2，4,5和7,以及a2(I)CB2,3和3-5。早期和晚期患者中最強(qiáng)的一致性IFNy和IL-10反應(yīng)見于al(I)CB8，al(I)CB6,a2(1)CB4，表明al(I)和a2(I)的這些部分含有在大多數(shù)彌散性SSc患者的疾病持續(xù)期中激發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)的表位。對CI和CI衍生肽的特異性的PBMCIFNy或IL-10應(yīng)答提示可能存在這樣的患者亞組，其中應(yīng)答于特定CI表位的具體細(xì)胞因子可能影響疾病表達(dá)。表1基線期到第12和第15個月的硬皮病HAQ改變<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2基線期到第12個月的PFT改變總安慰劑總CI早期安慰劑早期CI晚期安慰劑晚期CI(n)FEVt平均值土SEM(61)"0.46±1.67(47)-2,02±3.05(30)-0.17+3.18(30)-2.07±4.74(31)-0.74±1.23(17)-1.94±1.45P值NSNSNS(n)FVC平均值土SEM(60)-0.68±1.20(40)-4.54±2.41(29)-0.83±2.11(31)-5.42±3.66(31)-0.55土1.25(17)-2.94±1.42P值NSNSNS(n)DLco平均值土SEM(59)-2.66±2.23(47)-5.74±2.58(29)-1.76±3.21(31)-4.81±3.77(30)-3.53±2.59(16)-7.51+3.99P值NSNSNS勢活*被9/16:K表3.人GIGB肽中所含的氨基酸殘基<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4(n)PBS基線期和第12個月時的IFNY產(chǎn)生(n)PHA(n)Cand(n)Ha1(1)(n)Ha2(I)BCI(58)389±71(46)734±111(57)2837±(50)497±113(55)876±139190-(58)671±133(54)769±107(55)766±132(54)685±112(57)728±116f58)970±150(46)407±71(46)508±790.184(46)2844±(38)840±194(44)950±176233(45)539+140(45)767±113(46)2178±0.0460.888(44)848±163(45)749±1030.544(46)638±118(46)655±1260.293(28)239±57(28)648土131(27)2955±250(24)339±124(28i487±115(26)627±147(26)571±82(26)516±119(26)536±92(27)714±187(28)795±194(30)324土81(3。i544±1080.371(30)2982±28(30J2062土291(25)989±283(29)627±2110.246(29)1190±253(29)692±122(29)1042±236(29)684±116(30)672土166(30)709±1770.798(30)528±123(30)2731f30i815土178286(26)644±183(30)842±231(29)1099±222(29)990±220(28)823±196(30)740±146(28)795±195(16)563±133(16)2585±(16)439±1033520.153(16)2397±(13)554±150(16)378±900.245(15)486±102(16)902±2300.106(15)473±103(16)866±2030.061(16)573±143(16)554±1470.240總安慰劑基線第12個月晚期安慰劑基線第12個月200680043061.X勢溢擊被11/16:K月a個c線u值總基割pI月c個期線u值早基第p月c個期線w值晚基第D.表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>基線期和第12個月時SScPBMG的IL-10產(chǎn)生(n)PBS(n)PHA(n)Cand(n)BCI(n)Hoc1(1)(n)Ho2(1)(65)382+93(65)277±36(64)1500+177(63)1131±135(52)168±40J64)195±23(64)537±83(65)240±25(65)827土99(61)579±85(65)641+85(61)433±47(51)247±48(51)293±430.565(51)1263±219(51)1438±2190.172(41)"M8土24(50)260±500.778(51)398±91(51)256±370.234(49)604±87(49)536±660.093(49)425+71(49;466±660.052(34)308土77(34)328±59(33)1656±258(32)"80土189(28)205±69(33)212±33(33)577±128(34264土38(34)984土155(32)57B土109(34)700±135(32)463±71(34)271±64(34)281±430.922(34)1314±264(34)1290±1190.541(27)136±34(33)235±570鄰6(34)478±127(34)239±420.826(33)665±"2(33)495±780.314(33)462+96(33)400±590.376(31)463±175《31i220±37(31)1334+242(31J1082±194(24)125土30(31)177±32(31)493±106(31)213±32(31)655±113581±136(31)577±99(29)400±6275(17)199±64(1力319+980.457(17)1161±403J17)1734±4760.1肪(14)83±24(17)310±1000.明8(17)239±96(17)289±750.070(16)479±131(16)621±1230.122(16)348+90(16)602±1590.039200680043061.X勢溢也^H/165X表月個月個劑安月I個c月個安線ua線u值期線u期線u值總基第總基第s:早基第早基第p慰月I月安個a個期線u期線u值晚基第晚基第p基線期和第12個月時用牛nc1fl、CB肽培養(yǎng)的SScPBMC的IL-10產(chǎn)生<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表8表9<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>權(quán)利要求1.治療患者中的纖維化疾病的方法，包括口服給藥患者從正發(fā)生纖維化的組織來源的組織蛋白。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述纖維化疾病選自以下疾病組成的組硬皮病(SSC)，皮膚纖維化，肝硬化，腎纖維化，肺纖維化，心臟纖維化，胃腸纖維化和血管纖維化。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者已經(jīng)患有所述纖維化疾病至少3年。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述組織蛋白是膠原蛋白。5.權(quán)利要求2的方法，其中所述纖維化疾病是SSc。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述組織蛋白是I型膠原蛋白或其片段。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述膠原蛋白源自人或除人以外的動物種類。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述膠原蛋白或其片段以大約500^g/天口服給藥所述患者。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述患者被治療大約12個月。10.權(quán)利要求l的方法，其中所述組織蛋白的口服給藥在所述患者中誘導(dǎo)耐受性。全文摘要本發(fā)明首次證實(shí)口服給藥的I型膠原蛋白(CI)在患有系統(tǒng)性硬化癥(SSc)的患者中誘導(dǎo)CI耐受性，并緩解所述疾病的臨床表現(xiàn)。因此，本發(fā)明提供了通過口服給藥從正發(fā)生纖維化的組織來源的組織蛋白例如膠原蛋白來治療纖維化疾病的方法。文檔編號A61K35/12GK101309694SQ200680043061公開日2008年11月19日申請日期2006年11月16日優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日發(fā)明者A·E·波斯?fàn)査鬼f特,A·H·康申請人:田納西大學(xué)研究基金會