專利名稱：：羊膜制品和純化的組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及使用可以在羊膜制法。
背景技術(shù)：
：胎盤為妊娠過(guò)程中包裹胎兒的暫時(shí)器官。胎盤能夠轉(zhuǎn)運(yùn)氣體和營(yíng)養(yǎng)物，并且還提供其它代謝和內(nèi)分泌功能。胎盤由幾種類型組織組成。臍帶將胎盤與胎兒連接并且將氧輸送給胎兒。臍帶具有兩條動(dòng)脈和一條靜脈。Wharton膠凍(jelly)，即專用凝膠狀結(jié)締組織材料包圍臍帶以防止其在胎兒活動(dòng)和發(fā)育過(guò)程中受到損害。胎盤的夕卜"殼"稱作"絨毛膜"。胎盤的絕大部分由絨毛膜絨毛組成，它們?yōu)榻q毛膜絨毛樹的延伸。通過(guò)這些結(jié)構(gòu)，發(fā)生胎兒營(yíng)養(yǎng)交換。羊膜(AM)為充滿羊水的無(wú)血管膜嚢。該膜為包裹羊膜腔中的胎兒的最內(nèi)層膜。這種組織由上皮層和其下相鄰的無(wú)血管基質(zhì)層組成。發(fā)明概述本說(shuō)明書描述了純化的組合物和羊膜制品(即由羊膜材料制備的組合物，該羊膜材料包括羊膜，羊膜基質(zhì)和羊膜膠凍)。在某些實(shí)施方案中，純化組合物中的至少一種成分獲自羊膜制品。本文還描述了純化的組合物，其中純化組合物中的至少一種成分獲自人胎盤和絨毛膜。本文還描述了制備上述純化組合物和制品中的任一種的方法。本文還描述了儲(chǔ)藏和保存上述純化純化組合物和制品中的任一種的方法。本文還描述了使用上述純化組合物和制品中的任一種的方法，包括保存方法，細(xì)胞培養(yǎng)方法，組織培養(yǎng)方法，治療方法，預(yù)防方法和美容方法。在一個(gè)方面中為純化的組合物，其包含交聯(lián)高分子量乙酰透明質(zhì)酸(HA);肺瘤壞死因子-刺激基因6(TSG-6);五聚環(huán)蛋白(PTX-3);和血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，純化組合物中的至少部分成分由選自人羊膜，人羊膜膠凍，人羊膜基質(zhì)或其組合(combination)的人羊膜材料制備。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該純化的組合物還包含Smad7。在純化的組合物的另一個(gè)或可選擇的實(shí)施方案中，HA的交聯(lián)包含與間-a-胰蛋白酶抑制劑的重鏈的共價(jià)鍵。在純化的組合物的另一個(gè)或可選擇的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)與HA之比小于約100。在純化的組合物的另一個(gè)或可選擇的實(shí)施方案中，純化的組合物的制備方法包括獲得冷凍或預(yù)先冷凍的人胎盤；融化胎盤并且從融化的胎盤中分離人羊膜材料；和在合適的緩沖液中勻漿人羊膜材料。在另一個(gè)或可選擇的實(shí)施方案中，所述的制備方法還包括冷凍人羊膜材料；和研磨冷凍的羊膜材料。在另一個(gè)或可選擇的實(shí)施方案中，所述的制備方法還包括凍干勻漿物；或離心勻漿物并且從離心的勻漿物中分離上清液。在另一個(gè)或可選擇的實(shí)施方案中，所述的制備方法還包括將上清液凍干成粉末。在另一個(gè)或可選擇的實(shí)施方案中，純化的組合物還包含用于非固體劑型或延長(zhǎng)釋放的固體劑型的藥學(xué)上可接受的載體。本文所述的另一個(gè)方面為抑制受治療者瘢痕形成的方法，包括對(duì)有抑制瘢痕形成需要的受治療者提供有效量的抑制瘢痕形成組合物的步驟；其中該抑制瘢痕形成組合物包含由選自從羊膜提取的人羊膜，人羊膜膠凍，人羊膜基質(zhì)或其組合的人羊膜材料制備的至少一種成分。在這類方法的另一個(gè)或可選擇的實(shí)施方案中，至少一種成分由人羊膜材料提取。在這類方法的另一個(gè)或可選擇的實(shí)施方案中人羊膜材料為人羊膜基質(zhì)。在這類方法的另一個(gè)或可選擇的實(shí)施方案中，提取方法包含獲得冷凍或預(yù)先冷凍的人胎盤；融化胎盤并且從融化的胎盤中分離人羊膜材料；在合適的緩沖液中勻漿人羊膜材料；任選將勻漿物凍干成粉末；和將勻漿物或粉末與用于非固體劑型或延長(zhǎng)釋放的固體劑型的藥學(xué)上可接受的載體混合。在另一個(gè)或可選擇的實(shí)施方案中，制備方法中使用如下步驟取代了凍干勻漿物的步驟離心勻漿物，從離心的勻漿物中分離上清液，并且任選將上清液凍干成粉末。在另一個(gè)方面中為逆轉(zhuǎn)受治療者瘢痕形成的方法，包括對(duì)形成瘢痕的受治療者提供有效量的逆轉(zhuǎn)瘢痕組合物的步驟；其中該逆轉(zhuǎn)瘢痕組合物包含由選自從羊膜提取的人羊膜，人羊膜膠凍，人羊膜基質(zhì)或其組合的人羊膜材料制備的至少一種成分。在這些方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種成分由人羊膜材料提取。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，人羊膜材料為人羊膜基質(zhì)。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，提取方法包括獲得冷凍或預(yù)先冷凍的人胎盤；融化胎盤并且從融化的胎盤中分離人羊膜材料；在合適的緩沖液中勻漿人羊膜材料；任選將勻漿物凍干成粉末；和將勻漿物或粉末與用于非固體劑型或延長(zhǎng)釋放的固體劑型的藥學(xué)上可接受的載體混合。在另一個(gè)的實(shí)施方案中，所述的制備方法使用如下步驟取代了凍干勻漿物的步驟離心勻漿物，從離心的勻漿物中分離上清液，并且任選將上清液凍干成粉末。在另一方面為抑制受治療者血管發(fā)生的方法，包括對(duì)有抑制血管發(fā)生需要的受治療者提供有效量的抑制血管發(fā)生組合物的步驟；其中該抑制血管發(fā)生組合物包含由選自從羊膜提取的人羊膜，人羊膜膠凍，人羊膜基質(zhì)或其組合的人羊膜材料制備的至少一種成分。在這些方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種成分由人羊膜材料提取。在這些方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，人羊膜材料為人羊膜基質(zhì)。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，所述的組合物包含交聯(lián)高分子量乙酰透明質(zhì)酸(HA);腫瘤壞死因子-刺激基因6(TSG-6);五聚環(huán)蛋白(PTX-3);和血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1).在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，提取方法包括獲得冷凍或預(yù)先冷凍的人胎盤；融化胎盤并且從融化的胎盤中分離人羊膜材料；在合適的緩沖液中勻漿人羊膜材料；任選將勻漿物凍干成粉末；和可接受的載體混合。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，制備方法中使用如下步驟取代了凍干勻漿物的步驟離心勻漿物，從離心的勻漿物中分離上清液，并且任選將上清液凍干成粉末。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，需要的受治療者為患有癌癥的人。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，需要的受治療者為患有與年齡相關(guān)的黃孩王變'性的人。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，提供了非固體劑型或延長(zhǎng)釋放的固體劑型形式的抑制血管發(fā)生組合物。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，該抑制血管發(fā)生組合物具有如下特性誘導(dǎo)涉及血管形成的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；防止涉及血管形成的內(nèi)皮細(xì)胞遷移；和防止涉及血管形成的內(nèi)皮細(xì)胞管形成。減輕或預(yù)防受治療者炎癥的方法，包括對(duì)需要炎癥抑制或預(yù)防的受治療者提供有效量的炎癥抑制組合物的步驟；其中該炎癥抑制組合物包含由選自從羊膜提取的人羊膜，人羊膜膠凍，人羊膜基質(zhì)或其組合的人羊膜材料制備的至少一種成分。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，至少一種成分由人羊膜材料提取。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，人羊膜材料為人羊膜。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，所述的組合物包含交聯(lián)高分子量乙酰透明質(zhì)酸(HA);腫瘤壞死因子-刺激基因6(TSG-6);五聚環(huán)蛋白(PTX-3);和血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，提取方法包括獲得冷凍或預(yù)先冷凍的人胎盤；融化胎盤并且從融化的胎盤中分離人羊膜材料；在合適的緩沖液中勻漿人羊膜材料；任選將勻漿物凍干成粉末；和可接受的載體混合。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，所述的制備方法中使用如下步驟取代了凍干勻漿物的步驟離心勾漿物，從離心的勾漿物中分離上清液，并且如任選上清液凍干成粉末。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，所述的人患有關(guān)節(jié)炎。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，所述的人在至少一只眼中患有炎癥。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，將炎癥抑制組合物以非固體劑型或延長(zhǎng)釋放的固體劑型提供。在這些方法的另一個(gè)的實(shí)施方案中，該炎癥抑制組合物具有如下特性中的至少兩種誘導(dǎo)炎癥部位上巨噬細(xì)胞凋亡；增加炎癥部位上前列腺素D2與前列腺素El之比；抑制炎癥部位上的TGF-pi活性；或抑制炎癥部位上的干擾素-y信號(hào)傳導(dǎo)。各種AM制品在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和完整哺乳動(dòng)物組織中發(fā)揮大量生理學(xué)顯著作用。這類作用包括抑制TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)，增加巨噬細(xì)胞凋亡，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，減少其細(xì)胞遷移并且增加其細(xì)胞凋亡，防止角膜和緣上皮細(xì)胞和角膜細(xì)胞因儲(chǔ)藏或分散酶處理誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和減輕組織中的炎癥。除完整AM片外，本文所述的其它制品包括AM基質(zhì)片，加工的(例如研磨或粉碎的)AM或AM基質(zhì)和完整AM和AM基質(zhì)的各種提取物。AM提取物可以為液體或凍干粉末形式。所述組合物還包括可以通過(guò)混合AM提取物與增稠劑，諸如一種或多種ECM成分，諸如膠原蛋白，透明質(zhì)酸(HA)和血纖蛋白。盡管與本文所述類似或等效的制品，材料和方法可以用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但是本文描述了合適的制品，方法和材料。將本文提及的所有公開文獻(xiàn)完整地引入作為參考。如果出現(xiàn)矛盾的情況，那么本說(shuō)明書,包括定義可以限制。此外，如下討論的具體實(shí)施方案僅為例證性的并不用來(lái)起限定作用。某些定義在本文所用的制劑，組合物或組分方面術(shù)語(yǔ)的"可接受的"意指不會(huì)對(duì)所治療的受治療者一般健康產(chǎn)生持久的有害作用。"抗氧化劑，，包括，例如丁羥甲苯(BHT)，抗壞血酸鈉，抗壞血酸，偏亞硫酸氫鈉和生育酚。在某些實(shí)施方案中，如果需要，抗氧化劑增強(qiáng)化學(xué)穩(wěn)定性。"粘合劑，，具有(impart)粘性并且包括，例如藻酸及其鹽；纖維素衍生物，諸如羧曱基纖維素，曱基纖維素(例如Methocef)，羥丙基曱基纖維素，羥乙基纖維素，羥丙基纖維素(例如幻ucef)，乙基纖維素(例如Ethocef)和微晶纖維素(例如Avicel);微晶右旋糖；直鏈淀粉；硅酸鎂鋁；多糖酸；膨潤(rùn)土；明膠；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；交聚維酮；聚維酮；淀粉；預(yù)膠化淀粉；黃蓍膠，糊精，糖，諸如蔗糖(例如Dipac)，葡萄糖(glucose)，右旋糖(dextrose),糖蜜，甘露醇，山梨醇，木糖醇(例如乂丫1^6*)和乳糖；天然或合成樹膠，諸如阿拉伯樹，黃蓍膠，印度膠，車前子殼翻液，聚乙烯吡咯烷酮(例如Polyvidone⑧CL，KollidonCL,PolyplasdoneXL-10),落葉松阿拉伯半乳聚糖，Veegum,聚乙二醇，蠟,藻酸鈉等。本文所用的術(shù)語(yǔ)"載體"意指有利于將化合物摻入細(xì)胞或組織的相對(duì)無(wú)毒性的化學(xué)化合物或試劑。"載體物質(zhì)"包括藥學(xué)中任何常用的賦形劑并且應(yīng)基于與本文公開的化合物的相容性和所需劑型的釋放分布特性進(jìn)行選擇。典型載體物質(zhì)包括，例如粘合劑，助懸劑，崩解劑，填充劑，表面活性劑，增溶劑，穩(wěn)定劑，潤(rùn)滑劑，濕潤(rùn)劑，稀釋劑等。"藥學(xué)上相容性載體物質(zhì)"可以包括，但不限于阿拉伯膠，明膠，膠體二氧化硅，甘油磷酸鈣，乳酸鈣，麥芽糖糊精，甘油，硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，膽固醇，膽固醇酯類，酪蛋白酸鈉，大豆卵磷脂，牛磺膽酸，磷脂酰膽堿，氯化鈉，磷酸三鈣，磷酸氫二鉀，纖維素和纖維素輒合物，硬脂酰乳酸鈉糖類(sugarssodiumstearoyllactylate),角叉菜膠，單酸甘油酯，二酸甘油酯，預(yù)膠化淀粉等。例如，參見ie/m'"gto":7TzeSc/ewce和尸raWceo/尸/wmaqy，NineteenthEd(Easton，Pa.:MackPublishingCompany,1995);Hoover,JohnE.,iem/"gto"&/Tzarmacez^/ca/Sc/e"ces，MackPublishingCo.，Easton，Pennsylvania1975;Liberman,H.A.禾口Lachman，L.，Eds.，P/wrm(3ceMWca/Z)asagejPw7w,MarcelDecker,NewYork,N.Y.，1980;和尸/^(3r謹(jǐn)ce"^2/Z)os"geForms和DrugDeliverySystems,SeventhEd.(LippincottWilliams&Wilkins1999)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"共同給藥"等意指包括對(duì)單一患者給予選擇的各種藥物治療并且意指包括治療方案，其中通過(guò)相同或不同給藥途徑或在相同或不同時(shí)間給予藥物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"延長(zhǎng)釋放(delayedrelease)"意指遞送藥物，使得處于比那些如果沒(méi)有延長(zhǎng)釋放所能達(dá)到的位置更遠(yuǎn)的一些可預(yù)測(cè)的位置上釋放。"分散劑，，和/或"粘度調(diào)節(jié)劑，，包括通過(guò)液體介質(zhì)或制粒方法或摻合方法控制擴(kuò)散和均勻性的物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，這些試劑還有利于包衣或可蝕性基質(zhì)的有效性。典型的擴(kuò)散促進(jìn)劑/分散劑包括，例如親水性聚合物，電解質(zhì)，Tween②60或80，PEG，聚乙烯吡咯烷酮(PVP;商業(yè)上稱作Plasdone)和基于碳水化合物的分散劑，諸如，例如羥丙基纖維素(例如HPC，HPC-SL和HPC-L)，羥丙基甲基纖維素(例如HPMCK100,HPMCK4M，HPMCK15M和HPMCK100M)，羧甲基纖維素鈉，曱基纖維素，羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，鄰苯二曱酸羥丙基曱基纖維素，乙酸硬脂酸羥丙基曱基纖維素(HPMCAS)，非晶纖維素，硅酸鎂鋁，三乙醇胺，聚乙烯醇(PVA)，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，4-(l,l,3，3-四曱基丁基)-苯酚與環(huán)氧乙烷和曱醛的聚合物(也稱作泰洛沙泊)，泊洛沙姆(例如PluronicsF68,F88和F108,其為環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物);和poloxamines(例如Tetronic908,也稱作Poloxamine908，其為衍生自環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷依次加成到乙二胺上的四官能嵌段共聚物(BASFCorporation,Parsippany,N丄))，聚乙烯吡咯烷酮K12，聚乙烯吡咯烷酮K17，聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30,聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630),聚乙二醇，例如聚乙二醇可以具有約300-約6000或約3350-約4000或約7000-約5400的分子量，羧曱基纖維素鈉，曱基纖維素，聚山梨醇酯-80,藻酸鈉，樹膠，諸如，例如黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠，瓜爾膠，黃原膠(xanthans),包括黃原膠(xanthangum)，糖類，纖維素，諸如，例如羧曱基纖維素鈉，曱基纖維素，羧曱基纖維素鈉，聚山梨醇酯-80，藻酸鈉，聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯，聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯，聚維酮，卡波姆，聚乙烯醇(PVA),藻酸鹽，脫乙酰殼多糖及其組合。增塑劑，諸如纖維素或三乙基纖維素也可以用作分散劑。特別用于脂質(zhì)體分散體和自乳化分散體的分散劑為二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿，來(lái)自蛋類的天然磷酯酰膽堿，來(lái)自蛋類的天然磷脂酰甘油，膽固醇和肉豆蔻酸異丙酯。本文所用的術(shù)語(yǔ)"稀釋劑"意指在遞送前用于稀釋所關(guān)注的化合物的化學(xué)化合物。稀釋劑還可以用于穩(wěn)定化合物，因?yàn)樗鼈兛梢蕴峁└€(wěn)定的環(huán)境。溶于緩沖溶液的鹽(也可以提供pH控制或維持)用作本領(lǐng)域中的稀釋劑，包括，但不限于磷酸鹽緩沖鹽水溶液。在某些實(shí)施方案中，稀釋劑增加組合物的體積以便有利于壓制或生成用于膠嚢填充的均勻性摻合物的足夠體積。這類化合物包括，例如乳糖，淀粉，甘露糖醇，山梨醇，葡萄糖，微晶纖維素，諸如Avicel;磷酸氫鉤，磷酸二鈣二水合物；磷酸三鈣，磷酸鈣；無(wú)水乳糖，噴霧干燥的乳糖；預(yù)膠化淀粉，可壓縮糖，諸如Di-Pac(Amstar);甘露糖醇，羥丙基曱基纖維素，乙酸硬脂酸羥丙基曱基纖維素，基于蔗糖的稀釋劑，特細(xì)精糖粉；硫酸氫鈣一水合物，硫酸釣二水合物；乳酸鉤三水合物；葡聚糖結(jié)合劑；水解谷類固體，直鏈淀粉；粉狀纖維素，碳酸鉤；甘氨酸，高嶺土；甘露糖醇，氯化鈉；肌醇，膨潤(rùn)土等。"腸溶衣"為在胃中基本上保持完整，但在小腸或結(jié)腸中溶出和釋放藥物的物質(zhì)。一般而言，腸溶衣包含在胃的低pH環(huán)境下防止釋放，而在較高pH，一般在pH6-7下離子化且由此在小腸或結(jié)腸中充分溶出以便在其中釋放活性劑的聚合物材料。"填充劑"包括化合物，諸如乳糖，碳酸鉤，磷酸釣，磷酸氬鉤，硫酸4丐，微晶纖維素，纖維素粉，葡萄糖，葡聚糖結(jié)合劑，葡聚糖，淀粉，預(yù)膠化淀粉，蔗糖，木糖醇，拉克替醇，甘露糖醇，山梨醇，氯化鈉，聚乙二醇等。本文所用的術(shù)語(yǔ)"有效量"或"治療有效量"意指將所治療的疾病或疾患的—種或多種癥狀緩解至一定程度而給予的藥物或化合物的足夠量。結(jié)果可以為疾病體征，癥狀或或原因的減輕和/或緩解或生物系統(tǒng)的任何其它所需改變。例如，治療應(yīng)用的"有效量"為在無(wú)過(guò)度不良副作用的情況下在臨床上對(duì)疾病癥狀顯著減輕而所需的包括如本文公開的化合物的組合物用量。可以使用技術(shù)，諸如劑量按比例上升研究測(cè)定在任何個(gè)體情況中合適的"有效量"。本文所用的術(shù)語(yǔ)"治療有效量"包括，例如預(yù)防有效量。本文披露的化合物的"有效量"為在無(wú)過(guò)度不良副作用的情況下有效實(shí)現(xiàn)所需藥理學(xué)作用或治療改善的用量。應(yīng)理解"有效量"或"治療有效量"可以因受治療者與受治療者的不同，組合物代謝的變化，受治療者年齡，體重，一般健康狀況，所治療的疾患，所治療的疾患的嚴(yán)重性和開據(jù)處方的臨床醫(yī)師的判斷的不同而改變。本文所用的術(shù)語(yǔ)"增強(qiáng)"或"強(qiáng)化"意指增加或延長(zhǎng)所需作用的功效或時(shí)間。因此，就強(qiáng)化治療劑的作用而言，本文所用的術(shù)語(yǔ)"強(qiáng)化"意指在功效或時(shí)間上增加或延長(zhǎng)其它治療劑對(duì)系統(tǒng)的作用的能力。本文所用的"強(qiáng)化有效量"意指促進(jìn)另一種治療劑在所需系統(tǒng)中的作用的用量。本文所用的術(shù)語(yǔ)"試劑盒"和"制品，，作為同義詞使用。本文所用的術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"意指直接或間接與靶標(biāo)相互作用，以改變靶標(biāo)的活性，包括僅作為實(shí)例的促進(jìn)靶標(biāo)的活性，抑制靶標(biāo)的活性，限制靶標(biāo)的活性或延長(zhǎng)耙標(biāo)的活性。本文所用的術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)劑"意指改變分子活性的化合物。例如調(diào)節(jié)劑可以導(dǎo)致分子某些活性的大小比在沒(méi)有該調(diào)節(jié)劑存在下的活性大小增加或下降。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑為降低分子的一種或多種活性大小的抑制劑。在某些實(shí)施方案中，抑制劑完全阻止分子的一種或多種活性。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑為增加分子的至少一種活性大小的活化劑。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑的存在產(chǎn)生在沒(méi)有該調(diào)節(jié)劑存在下不會(huì)產(chǎn)生的活性。本文所用的術(shù)語(yǔ)"非水溶性稀釋劑"表示一般用于藥物制劑中的化合物，諸如磷酸鈣，硫酸鈣，淀粉，改性淀粉和微晶纖維素和微纖維素(microcellulose)(例如具有約0.45g/cn^的密度，例如Avicel的粉狀纖維素)和滑石粉。本文中對(duì)于諸如載體或稀釋劑，使用的"藥學(xué)上可接受的"意指不會(huì)消除化合物的生物活性或特性并且為相對(duì)無(wú)毒性的材料，即該材料可以對(duì)個(gè)體給予，但不會(huì)產(chǎn)生不需要的生物作用或以有害方式與它所包含在其中的組合物中的任何成分相互作用。本文所用的術(shù)語(yǔ)"藥物組合"意指由混合或組合一種以上活性組分得到的產(chǎn)品并且包括活性組分的固定和不固定組合。本文所用的術(shù)語(yǔ)"固定組合"意指將活性組分，例如本文所述的AM制品和純化的組合物和活性助劑以單一實(shí)體或劑量的形式同時(shí)給予患者。本文所用的術(shù)語(yǔ)"不固定的組合"意指將活性組分，例如本文所述的AM制品和純化的組合物和聯(lián)用藥物(co-agent)以單獨(dú)的實(shí)體同時(shí)，共同或依次，但沒(méi)有具體介入時(shí)間限制的情況下給予患者，其中這類給藥在患者體內(nèi)提供了兩種化合物的有效水平。后者還應(yīng)用于雞尾酒療法，例如給予三種或三種以上活性組分。"增塑劑，，為用于軟化微嚢材料或薄膜包衣以使它們減少脆化的化合物。合適的增塑劑包括，例如聚乙二醇類，諸如PEG300,PEG400,PEG600，PEG1450,PEG3350和PEG800,硬脂酸，丙二醇，油酸，三乙基纖維素和三醋精。在某些實(shí)施方案中，增塑劑還可以起分散劑或濕潤(rùn)劑的作用。本文所用的術(shù)語(yǔ)"多肽"或"蛋白質(zhì)"可以為全長(zhǎng)多肽或多肽片段或區(qū)段，并且可以包括全長(zhǎng)多肽中至少約8個(gè)氨基酸，一般為至少10個(gè)氨基酸，更一般為至少20個(gè)氨基酸，通常為至少30個(gè)氨基酸，更通常為至少50個(gè)氨基酸或50個(gè)氨基酸以上的氨基酸殘基的一段序列。"增溶劑，，包括化合物，諸如三醋精，檸檬酸三乙酯，油酸乙酯，辛酸乙酯，十二烷基碌u酸鈉，多庫(kù)酯鈉(sodiumdoccusate)，維生素ETPGS,二曱基乙酰胺，N-曱基吡咯烷酮，N-羥乙基吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基曱基纖維素，羥丙基環(huán)糊精，乙醇，正-丁醇，異丙醇，膽固醇，膽汁酸鹽，聚乙二醇200-600，糖原質(zhì)(glycofUrol)，二乙二醇單乙醚(transcutol)，丙二醇和二曱基異山梨醇等。"穩(wěn)定劑"包括化合物，諸如任何抗氧化劑，緩沖劑，酸，防腐劑等。"基本上純"或"純化的"在用于上下文中的生物材料，羊膜材料和/或蛋白質(zhì)時(shí)一般意指分離自其它污染蛋白質(zhì)，核酸和其它來(lái)源于原始來(lái)源生物體的生物制品的材料。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定純度或"分離度"，并且一般至少約10%純度，更一般地至少約20%純度，一般至少約30%純度且更一般至少約40%純度；在其它實(shí)施方案中，至少約50%純或更通常至少約60%純度；在其它實(shí)施方案中，至少約95%純度。"懸浮劑，，包括化合物，諸如聚乙烯吡咯烷S同，例如聚乙烯吡咯烷酮K12，聚乙烯吡咯烷酮K17，聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30，乙烯基吡咯烷S同/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，聚乙二醇，例如聚乙二醇可以具有約300-約6000或約3350-約4000或約7000-約5400的分子量，羧曱基纖維素鈉，曱基纖維素，羥丙基曱基纖維素，乙酸硬脂酸羥曱基纖維素，聚山梨醇酯-80,羥乙基纖維素，藻酸鈉，樹膠，諸如，例如黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠，瓜爾膠，黃原膠(xanthans)，包括黃原膠(xanthangum)，糖類，纖維素，諸如，例如羧曱基纖維素鈉，曱基纖維素，羧曱基纖維素鈉，羥丙基曱基纖維素，羥乙基纖維素，聚山梨醇酯-80，藻酸鈉，聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯，聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯，聚維酮等。"表面活性劑"包括化合物，諸如十二烷基^5克酸鈉，多庫(kù)酯鈉，Tween60或80，三醋精，維生素ETPGS，脫水山梨糖醇單油酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯，聚山梨醇酯類，伯洛沙姆類，膽汁酸鹽，單硬脂酸甘油酯，環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的共聚物，例如Pluronk^(BASF)等。某些其它表面活性劑包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯類和植物油，例如聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚類和烷基苯基醚類，例如辛苯聚醇10，辛苯聚醇40。在某些實(shí)施方案中，可以包括表面活性劑以便增強(qiáng)物理穩(wěn)定性或其它目的。本文所用的術(shù)語(yǔ)"受治療者"用于指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，包括人或非-人。術(shù)語(yǔ)患者和受治療者可以互換使用。本文所用的術(shù)語(yǔ)"治療(treat)","治療(treating)"或"治療(treatment)"包括緩解，消除或改善疾病或疾患癥狀，預(yù)防另外的癥狀，改善或預(yù)防癥狀的潛在代謝原因，抑制疾病或疾患，例如阻止疾病或疾患發(fā)展，緩解疾病或疾患，導(dǎo)致疾病或疾患退化，緩解因疾病或疾患導(dǎo)致的情況或預(yù)防性和/或治療性地終止疾病或疾患癥狀。"濕潤(rùn)劑，，包括化合物，諸如油酸，單硬脂酸甘油酯，脫水山梨糖醇單油酸酯，脫水山梨糖醇單月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯，多庫(kù)酯鈉，油酸鈉，十二烷基硫酸鈉，多庫(kù)酯鈉(sodiumdoccusate)，三醋精，Tween80,維生素ETPGS，銨鹽等。將本說(shuō)明書中提及的所有公開文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)引入本文作為參考，其引用程度與如同將每篇公開文獻(xiàn)或?qū)＠暾?qǐng)各自特別和分別引入作為參考相同。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的新特征具體列在待批權(quán)利要求中。通過(guò)參照如下列出例證性實(shí)施方案的詳細(xì)描述會(huì)更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，其中使用了本發(fā)明的原理，并且在附圖中圖1A為表示各種AM提取物抑制TGF-(31啟動(dòng)子活性的柱形圖的非限制性實(shí)例。PL:塑料對(duì)照。FRO/P:冷凍羊膜，胎盤部分。FRO/F:冷凍羊膜，胎部分。FRE/P:新鮮羊膜，胎盤部分。FRE/F:新鮮羊膜，胎部分。圖1B為比較各種胎盤制品P值的表。圖2為表示TGF-pi啟動(dòng)子活性抑制的劑量響應(yīng)曲線的柱形圖的非限制性實(shí)例。RLU:相對(duì)焚光素酶單位。圖3為表示各種AM提取物制品對(duì)TGF-pi啟動(dòng)子活性抑制的作用的柱形圖的非限制性實(shí)例。圖4為表示各種AM提取物制品對(duì)TGF-(3RI1啟動(dòng)子活性抑制的作用的柱形圖的非限制性實(shí)例。圖5為表示離心后衍生的可溶性AME和膠凍提取物不改變對(duì)TGF-(3啟動(dòng)子活性的抑制作用的柱形圖的非限制性實(shí)例。HA,AM(總(T)，低速(LS),高速(HS》和膠凍(總(T),低速(LS)，高速(HS))在使用P-半乳糖苷酶(galatosidase)活性標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)與PBS對(duì)照物相比顯示出對(duì)TGF-pi啟動(dòng)子活化的抑制。圖6為表示使用各種化合物處理后18或48小時(shí)細(xì)胞形態(tài)改變的人角膜成纖維細(xì)胞的一組顯微鏡影像的非限制性實(shí)例。PBS:PBS對(duì)照物；HA:透明質(zhì)酸；AME:羊膜提取物；L/AME:凍干的羊膜提取物；AMJ:羊膜膠凍；L/AMJ:凍干的羊膜膠凍。圖7為表示使用或不使用凍干的(L)AME(在25或125pg/ml下)對(duì)抑制TGFpi活性的作用的柱形圖的非限制性實(shí)例。以相對(duì)熒光素酶單位(RLU)測(cè)定活性。圖8為表示添加膠原蛋白凝膠(Col)，AM提取物AME或混合了AM提取物的膠原蛋白凝膠(Col+AME)對(duì)抑制TGF-p啟動(dòng)子活性的作用的柱形圖的非限制性實(shí)例。將BSA用作對(duì)照物。圖9為與單獨(dú)使用BSA的對(duì)照組測(cè)定相比，使用AME，HA或HA+AME處理對(duì)抑制TGF卩1活性的作用比較的柱形圖的非限制性實(shí)例。將啟動(dòng)子活性表示為相對(duì)熒光素酶單位(RLU)。圖10為通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離的各種AM提取物中的AM提取物中的乙酰透明質(zhì)酸MW范圍分析的非限制性實(shí)例。使用或不使用透明質(zhì)酸酶處理用緩沖液A，B,C提取的羊膜提取物并且通過(guò)電泳方式用0.5%瓊脂糖凝膠分離。圖11為通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離的各種AM提取物中的AM提取物中的乙酰透明質(zhì)酸MW范圍分析的非限制性實(shí)例。使用或不使用透明質(zhì)酸酶(在Tris-HCl中10個(gè)單位/ml,pH7.5，150mMNaCl)將用緩沖液PBS提取的羊膜在37°C下處理2小時(shí)并且通過(guò)0.5%瓊脂糖凝膠。HA:透明質(zhì)酸陽(yáng)性對(duì)照；L:低速離心后的AM提取物；H:高速離心后的AM提取物。圖12為表示間-a-胰蛋白酶抑制劑(Ial)存在于AM提取物中的蛋白質(zhì)印跡照片的非限制性實(shí)例。Ial存在于AM提取物A和C中，不過(guò)，bikunin的信號(hào)極弱(39kDa)。在轉(zhuǎn)至蛋白質(zhì)印跡前，用4-15%變性丙烯酰胺凝膠分離提取物。圖13為表示即使在低速(LS)或高速(HS)離心后間-a-胰蛋白酶抑制劑(Ial)也存在于AM提取物中的免疫印跡的非限制性實(shí)例。圖14為使用(+)或不使用(-)透明質(zhì)酸酶處理的TSG-6(腫瘤壞死因子-刺激基因6)的免疫印跡的非限制性實(shí)例。樣品包括不進(jìn)行離心的總AM提取物(T)，在等滲的低鹽緩沖液(緩沖液A)提取后的AM提取物；高鹽緩沖液(B)提取后的AM提取物；或4M胍HC1(C)中提取后的AM提取物，如實(shí)施例2中詳述。TSG-6存在于總提取物，緩沖液A提取物和緩沖液C提取物中。添加透明質(zhì)酸酶不會(huì)改變提取物中的TSG-6水平。圖15為TSG-6在AM中去糖基化的免疫印跡分析的非限制性實(shí)例。在37°C下使用(+)或不使用(-)20個(gè)單位/ml的PNGaseF將AM提取物A，B和C處理3小時(shí)。然后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析TSG-6在AM中的糖基化。將人角膜成纖維細(xì)胞(HCF)的細(xì)胞裂解物用作陽(yáng)性對(duì)照。圖16為通過(guò)用^e克酸軟骨素ABC裂解酶消化對(duì)可能的TSG-6復(fù)合物在AM中的免疫印跡分析的非限制性實(shí)例。在37°C下使用(+)或不使用(-)1個(gè)單位/ml的ABC裂解酶將AM提取物A，B和C處理2小時(shí)。然后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡，使用抗-TSG-6抗體RAH-1:1:1000分析TSG-6復(fù)合物的可能破壞。圖17為通過(guò)用硫酸軟骨素ABC裂解酶消化對(duì)可能的TSG-6復(fù)合物在AM中的免疫印跡分析的非限制性實(shí)例。它與如圖16中所示的實(shí)驗(yàn)相同，但使用不同的TSG-6抗體。此處，抗-TSG-6抗體獲自R&DSystems(cat#MAB2104)。圖18為表示使用獲自AlexisBiochemicals的大鼠單克隆抗-PTX3抗體在AM中存在五聚環(huán)蛋白(PTX3)的免疫印跡的非限制性實(shí)例。HCF:人角膜成纖維細(xì)胞，T,A，B,C:分別為總，A，B，C的AM提取物；HAse，透明質(zhì)酸酶。圖19為表示AM中存在TSP-1的免疫印跡的非限制性實(shí)例。表明單體TSP-1(180kDa)和推定的三聚體TSP-1(540kDa)。陽(yáng)性對(duì)照TSP-1自人血小板純化(Calbiochem,Cat#605225)和并且加載至100ng/泳道。圖20為表示AM中存在Smad7的免疫印跡的非限制性實(shí)例。使用PBS或尿素(2M尿素在50mMTris-HCl中，pH7.5)提取AM。對(duì)每種提取物而言使20|ig總蛋白質(zhì)上樣。使用山羊抗-人Smad7(AF2029，1:1000,R&DSystems)檢測(cè)Smad7。Smad7以~51kDa帶遷移。圖21為羊膜基質(zhì)細(xì)胞(AMSC)在AM中的顯微鏡影像的非限制性實(shí)例。A:AMSCs顯示樹突形態(tài)并且在原位維持胞間接觸。B:使用活與死測(cè)定法為測(cè)定細(xì)胞存活(viability)進(jìn)行染色。通過(guò)該方法顯示樹突形態(tài)和胞間接觸更好。C:AMSCs不表達(dá)a-SMA。D:AMSCs不表達(dá)結(jié)蛋白。相反，作為陽(yáng)性對(duì)照，臍帶間充質(zhì)細(xì)胞顯示出對(duì)a-SMA和結(jié)蛋白的強(qiáng)染色(分別為C和D的插入片段(insert))。E:所有AMSCs均表達(dá)波形蛋白。虛線表示AM上皮與AM基質(zhì)層之間分離。分別用DAPI(C，D)和PI(E)進(jìn)行核對(duì)比染色。條代表50,。圖22為體外AMSCs成肌纖維細(xì)胞快速分化的非限制性實(shí)例。P0=初級(jí)AMSC纟田胞。Pl:第l代；P2:第2代。PO，Pl，P2分另'J指第0，l和2代。A和E:P0(4天)；B和F:P0(7天)；C和G:Pl;D和H:P2。用小鼠抗-aSMA單克隆抗體對(duì)E，F(xiàn),G,H中的細(xì)胞進(jìn)行免疫染色；A:在含有10%FBS的DMEM中的塑料上培養(yǎng)的AMSCs顯示出典型成纖維細(xì)胞形狀。條代表100pm。圖22I為線性圖的非限制性實(shí)例，該線形圖表示a-SMA-陽(yáng)性成肌纖維細(xì)胞顯著地從1周初級(jí)培養(yǎng)物的71.9±3.7%增加至第1代的93.9±4.10/0和第2代的98.5±1.7%。圖22J為顯示a-SMA和ED-A纖連蛋白(Fn)的蛋白質(zhì)表達(dá)增加的免疫印跡分析的非限制性實(shí)例。PO和P2分別指的是第0代和第2代。將(3-肌動(dòng)蛋白用作對(duì)照物。圖23A-23H為表示在AM基質(zhì)上反向培養(yǎng)時(shí)分化的成肌纖維細(xì)胞從AMSCs逆轉(zhuǎn)至成纖維細(xì)胞的顯微鏡影像的非限制性實(shí)例。在含有10%FBS的DMEM中的I型膠原蛋白(A，C，E，G)或AM基質(zhì)(B，D，F(xiàn)，H)上將來(lái)源于P2的AMSCs的成肌纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)7天。條^表100|am。活與死測(cè)定顯示在膠原蛋白(C)和AM基質(zhì)(D)上的細(xì)胞保持100%的存活率，并且顯示不同的細(xì)胞形狀。鬼筆環(huán)肽和a-SMA雙染色在膠原蛋白培養(yǎng)物上的成肌纖維細(xì)胞中顯示鮮明的應(yīng)力纖維(E)和強(qiáng)a-SMA表達(dá)(G)。相反，鬼筆環(huán)肽染色變得較弱和有斑點(diǎn)(F)且a-SMA在AM基質(zhì)(H)上傳代培養(yǎng)的細(xì)胞中變得模糊。I:免疫印跡分析顯示ED-A纖連蛋白(Fn)表達(dá)減少，并且與接種在I型膠原蛋白上的那些相比在AM基質(zhì)上接種的AMSCs的a-SMA的表達(dá)不能才全測(cè)到。圖24A-24H為表示AM基質(zhì)提取物(ASE)預(yù)防的AMSCs的成肌纖維細(xì)胞分化的顯微鏡影像的非限制性實(shí)例。進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色(上組)和a-SMA染色(下組)。A和E:不使用ASE培養(yǎng)4天的細(xì)胞；B和F:使用ASE培養(yǎng)4天的細(xì)胞；C和G:不使用ASE培養(yǎng)10天的細(xì)胞；D和H:使用ASE培養(yǎng)IO天的細(xì)胞。用FITC綴合的鬼筆環(huán)肽染色A，B,C和D中的細(xì)胞，而用小鼠抗-a-SMA單克隆抗體染色E，F(xiàn),G和H中的細(xì)胞。在不使用(A)或使用(B)ASE的DMEM/10°/。FBS中的塑料上培養(yǎng)4天后，AMSCs維持了紡錘狀的成纖維細(xì)胞形狀。然而，此時(shí)，不使用ASE(E)的細(xì)胞已經(jīng)開始表達(dá)a-SMA，而在添加ASE時(shí)(F)不表達(dá)a-SMA。當(dāng)培養(yǎng)延長(zhǎng)10天時(shí)，細(xì)胞變擴(kuò)展并且在不使用ASE下顯示出突出的應(yīng)力纖維(C)和強(qiáng)a-SMA表達(dá)(G)。相反，在添加ASE時(shí)AMSCs聚集成不同大小的球體。這些球體不表示應(yīng)力纖維(D)，而表示弱的a-SMA染色(H)。條代表100jum。圖25A和25B為表示羊膜基質(zhì)提取物(ASE)反向分化的成肌纖維細(xì)胞的顯微鏡影像的非限制性實(shí)例。通過(guò)添加ASE將在DMEM/10°/。FBS中的塑料上從第2代AMSCs分化的成肌纖維細(xì)胞培養(yǎng)1周。A:從扁平形狀恢復(fù)至長(zhǎng)或紡錘形狀的細(xì)胞。B:a-SMA染色顯著減少。C:顯示ED-A纖連蛋白和a-SMA水平比不使用ASE的對(duì)照組下降的免疫印跡分析。條表示100pm。像的非限制性實(shí)例。如所示的不使用(A，B，C，D)或使用ASE(E，F(xiàn)，G,H)在DMEM/ITS中將AMSCs(第2代)培養(yǎng)0，2，4或6天。在添加ASE(I，J，K,L)后第0天到第6天表達(dá)a-SMA的應(yīng)力纖維逐步下降并且與形態(tài)改變相關(guān)(E-H)。圖27A-27D為顯微鏡影像的非限制性實(shí)例，該影像表示AM提取物抑制成纖維細(xì)胞從人緣外植塊(explant)遷移并且導(dǎo)致向外生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞較少。A,B:從在SHEM(Ctrl)和SHEM/AME(AME)中培養(yǎng)的人緣外植塊中向外生長(zhǎng)。C,D:在培養(yǎng)物中14天后，從培養(yǎng)孔中取出人緣外植塊，包埋，切片并且用蘇木精和伊紅染色。圖28A為表示AME抑制成纖維細(xì)胞向外生長(zhǎng)的48孔測(cè)定平板的照片的非限制性實(shí)例。A.分別收集在SHEM(Ctrl(對(duì)照))和含有25pg/mlAME(AME)的SHEM中生長(zhǎng)14天后從人緣外植塊向外生長(zhǎng)物并且以2000個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔中。將來(lái)自Ctrl的細(xì)胞接種在第1-3列(l:Ctrl;2:PBS;3:AME;并且將來(lái)自AME的那些接種在第4陽(yáng)6列(l:Ctrl;2:PBS;3:AME。在10天培養(yǎng)后進(jìn)行MTT測(cè)定。圖28B為表示AME對(duì)成纖維細(xì)胞向外生長(zhǎng)的相對(duì)抑制的測(cè)定和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的柱形圖的非限制性實(shí)例。圖29A和29B為從在SHEM對(duì)照組(圖29A)和含有AME的SHEM(圖29B)中培養(yǎng)14天的人緣外植塊向外生長(zhǎng)的顯微鏡影像的非限制性實(shí)例。圖30為在使用或不使用IFN-y刺激的塑料或完整羊膜上培養(yǎng)的細(xì)胞中相對(duì)NO產(chǎn)生的柱形圖的非限制性實(shí)例。將Raw264.7細(xì)胞以2.5x105接種在DMEM/ITS中的24孔中的每一個(gè)中(每組n=3)。使用或不使用200^i/mlIFN-y剌激細(xì)胞并且收集培養(yǎng)基用于NO測(cè)定。Pl:塑料。iAM:完整羊膜。圖31為對(duì)在使用或不使用IFN-y刺激的塑料或iAM上培養(yǎng)的raw264.7細(xì)胞中測(cè)定前列腺素D2(PGD2)和前列腺素E2(PGE2)水平的一組柱形圖的非限制性實(shí)例。A:PGD2合成。B:PGE2合成。C:在塑料和iAM上培養(yǎng)的Raw264.6中的PGD2/PGE2之比。圖32為表示在使用或不使用IFN-y刺激的塑料或iAM上培養(yǎng)的Raw264.7細(xì)胞中TGF-(31啟動(dòng)子活性的柱形圖的非限制性實(shí)例。圖33為表示AME誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡的顯微鏡影像的非限制性實(shí)例。將Raw264.7細(xì)胞以2x105接種在24孔中每個(gè)孔的DMEM/10。/o胎牛血清中。1小時(shí)后，向培養(yǎng)基中加入125pg/mlPBS(對(duì)照組-圖33A)或在PBS中的125嗎/mlAME(AME-圖33B)。圖34A-34C為表示ASE優(yōu)選抑制HUVEC細(xì)胞的柱形圖的非限制性實(shí)例。A:存活HUVEC細(xì)胞的測(cè)定。B:存活HCF細(xì)胞的測(cè)定。C:存活RCE細(xì)胞的測(cè)定。圖35為HUVEC細(xì)胞的顯微鏡影像的非限制性實(shí)例。結(jié)果證實(shí)HUVEC細(xì)胞在不添加ASE的對(duì)照組中存活(圖35Aa),而在ASE處理后顯示明顯的細(xì)胞死亡(圖35Ad)。相反，HCF和RCE細(xì)胞在不使用(分別為圖35Ab和35Ac)或使用(分別為35Ae和35Af)ASE處理的培養(yǎng)物中未顯示出任何明顯的細(xì)胞死亡。Hoechst-33342染色顯示ASE-處理的HUVECs具有61.6±7.7%凝集和碎片化的核(圖35Bd)，這一結(jié)果明顯高于不使用ASE處理的對(duì)照組的3.1±1.8%(圖35Ba,另外參見2C，pO.OOl)。相反，在不使用(分別為圖35Ab和35Ac)或使用(分別為35Ae和35Af)ASE處理的HCFs或RCEs中未見明顯的細(xì)月包凋亡。圖36為添加ASE增加HUVEC細(xì)胞凋亡數(shù)量的柱形圖的非限制性實(shí)例。圖37為表示ASE對(duì)VEGF刺激的抑制HUVEC遷移的作用的非限制性實(shí)例。A:對(duì)照組(無(wú)VEGF或ASE)。B:添加VEGF增加細(xì)胞遷移。C:添22加VEGF和200|ag/mlASE。添加ASE阻滯VEGF-誘導(dǎo)的遷移。圖37D為對(duì)在圖37A,37B和37C中出現(xiàn)的測(cè)定細(xì)胞遷移的柱形圖。圖38為顯示添加ASE抑制管形成的一組顯微鏡影像(A-C)和柱形圖(D)的非限制性實(shí)例。為了進(jìn)行體外管形成測(cè)定，將HUVEC細(xì)胞接種在基質(zhì)膠上。A:在對(duì)照組培養(yǎng)物中形成管類物質(zhì)。B:將100^g/mLASE添加到培養(yǎng)物中抑制管形成。C:將200ng/mLASE添加到培養(yǎng)物中抑制管形成。D:測(cè)定來(lái)自A,B和C的每個(gè)視野中形成的管數(shù)量的柱形圖。發(fā)明詳述組合物本文描述了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和完整哺乳動(dòng)物組織中具有許多生理學(xué)顯著作用的純化的組合物。該純化的組合物包含至少4種成分交聯(lián)高分子量乙酰透明質(zhì)酸(hyaluronan,HA);腫瘤壞死因子-刺激基因6(TSG-6);五聚環(huán)蛋白(PTX-3);和血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)。本文所述的純化的組合物中的任何或所有成分均可以由人羊膜材料制備，所述人羊膜材料包括人羊膜膠凍制品和提取物(如本文所述)，人羊膜制品和提取物(如本文所述)和人羊膜基質(zhì)制品和提取物(如本文所述)。這4種成分(含有或不含有Smad7)可以共同抑制TGF-(3啟動(dòng)子活性；增加巨噬細(xì)胞的凋亡；減少增殖；減少遷移和增加人血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡；降低人成纖維細(xì)胞活力；減輕炎癥；和防止接觸儲(chǔ)藏和損傷的上皮細(xì)胞的凋亡。透明質(zhì)酸(HA)為在滑膜關(guān)節(jié)液，眼玻璃體液，軟骨，血管，胞外基質(zhì)，皮膚和臍帶中存在的天然糖。HA的交聯(lián)可以通過(guò)共價(jià)鍵與另一種分子，諸如蛋白質(zhì)結(jié)合。例如，HA可以與間-a-胰蛋白酶抑制劑的重鏈共價(jià)結(jié)合。本文所述的AM制品和純化的組合物中蛋白質(zhì)與HA之比可以小于約200:1,小于約100:1,小于約50:1或小于約10:1。TSG-6為在胞外基質(zhì)重塑，細(xì)胞增殖和白細(xì)胞遷移中起作用的乙酰透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白。TSG-6可以與絲氨酸蛋白酶抑制劑間-a-抑制形成復(fù)合物。PTX-3(五聚環(huán)蛋白)為具有五聚盤形結(jié)構(gòu)并且存在于血漿中的Ca2+依賴性配體結(jié)合蛋白。TSP-1(血小板反應(yīng)蛋白I)為具有有效的抗生成血管和其它生物活性的同三聚糖蛋白。TSP-1由各種細(xì)胞類型分泌入胞外基質(zhì)。這些成分可以獲自任何合適的來(lái)源。例如，這些成分中的至少一種可以獲自人組織，諸如羊膜，羊膜膠凍，羊膜基質(zhì)或其組合。這些成分中的至少一種可以獲自商業(yè)來(lái)源。這些成分中的至少一種可以分離自轉(zhuǎn)基因生物體。蛋白質(zhì)序列可以與人蛋白質(zhì)序列具有至少90%,93%,95%，97%，99%或99.5%的相似性。這些成分可以純化，基本上純化，部分純化，或還可以存在于粗提取物中。還可以由哺乳動(dòng)物羊膜組織制備這些成分，因?yàn)檫@4種成分種的每一種均存在于羊膜組織中。在其它方面中，蛋白質(zhì)Smad7也存在于組合物中。Smad7可以獲自任何合適的來(lái)源，諸如獲自羊膜，獲自商業(yè)來(lái)源，分離自轉(zhuǎn)基因生物體。Smad7蛋白質(zhì)可以純化，基本上純化，部分純化，或可以存在于粗提取物中。來(lái)源于胎盤材料的AM制品在某些方面中，成分HA，TSG-6，PTX-3，TSP-1，任選的Smad7中的至少一種可以獲自羊膜制品?？蛇x擇地，可以制備包含HA,TSG-6，PTX-3,TSP-1和任選的Smad7的粗羊膜制品。制備各種AM制品的典型方法如本文所述?？梢垣@得人胎盤材料，例如來(lái)自諸如Bio-Tissue,Inc.(Miami,FL)和BaptistHospital(Miami,FL)(得到IRB批準(zhǔn))的這類來(lái)源。一般以新鮮或冷凍狀態(tài)獲得該組織?？梢韵礈煸摻M織以便除去過(guò)量的儲(chǔ)藏緩沖液，血液或污染物。例如，可以使用簡(jiǎn)單的離心步驟或通過(guò)其它方式除去過(guò)量的液體。例如，可以使用液氮或其它冷卻方式冷凍組織，以便有利于隨后的勻漿。AM組織來(lái)源可以為人。然而，可以使用AM組織的其它來(lái)源，諸如?；蜇iAM組織。AM可以用于制備組合物。AM制品可以包括純化自或提取自完整AM，AM基質(zhì)，HA,AM膠凍和間-a胰蛋白酶抑制劑(HA-ITI))的成分或部分。如果需要，可以在加工過(guò)程中的任何時(shí)間從制品中分離AM制品的某些成分。例如，可以從制品中分離富集了特異性蛋白質(zhì)或AM蛋白質(zhì)的提取物。在勻漿組織后，可以分離出較大顆粒或可以使它們保留在制品中。如果需要，可以干燥制品。典型制備方法如實(shí)施例1中所述。所述的成分還可以自AM膠凍獲得。AM膠凍可以自新鮮AM組織獲得或可以在冷凍加工之前或之后獲得。可以冷凍AM膠凍并且可以在如本文所述對(duì)AM制品處理后冷凍磨碎。可以離心膠凍并且還可以凍干。在另外的實(shí)施方案中，制備基本上由基質(zhì)層制備的組合物。為了制備該組合物，從新鮮，冷凍，融化或其他處理的AM膜的層中分離基質(zhì)層。例如，可以通過(guò)酶法，機(jī)械方法或通過(guò)其它方法取出基質(zhì)?；|(zhì)層材料可以為新鮮的或冷凍的?？梢栽谌绫疚乃鰧?duì)AM制品處理后磨碎或冷凍磨碎基質(zhì)材料。如果需要，可以離心基質(zhì)材料并且還可以冷凍。在研磨過(guò)程前冷凍組織?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適的冷卻方法進(jìn)行冷凍步驟。例如，使用液氮速凍組織?？蛇x擇地，將該材料置于異丙醇/干冰浴中或可以在其它冷卻劑中速凍。可以使用工業(yè)上通用的速凍法。另外，可以將材料置于冷藏箱中并且使其更緩慢地平衡至儲(chǔ)藏溫度，而不是速凍。將組織儲(chǔ)存在任何所需溫度下。例如，可以將-20。C或-80。C或其它溫度用于儲(chǔ)存。在冷凍的同時(shí)磨碎組織，而不是在冷凍前研磨組織是制備組織的一種可選擇方法。另一方面，可以在研磨步驟中使用新鮮，部分融化或融化的組織。然后可以使用合適的裝置，諸如解剖刀將組織(新鮮，冷凍或融化的)切成所需大小的片，隨后4吏用BioPulverizer(BiospecProducts,Inc.,Bartlesville,OK)或其它合適的裝置研磨成細(xì)顆粒，并且使用勻漿裝置，諸如TissueTearor(BiospecProducts,Inc.,Dremel,WI)在合適的溶液中勻漿。典型溶液包括，但不限于磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBS)，DMEM，NaCl溶液和水?？梢愿鶕?jù)需要調(diào)整溶液的pH。在某些實(shí)施方案中，pH范圍在約5.5或6.0-約8.5。在某些實(shí)施方案中，在具有約6.3,約6.6或約7.0-約7.4,約7.6或約7.8pH的溶液中研磨冷凍組織。任何合適的緩沖液或液體均可以用于制備制劑。實(shí)施例2檢驗(yàn)了各種提取緩沖液(高鹽，低鹽，PBS等)對(duì)在制品中總蛋白質(zhì)含量和HA的用途(表X)。實(shí)施例2還使用幾種提取法檢驗(yàn)了特異性蛋白質(zhì)TSG-6(圖14),PTX-3(圖18),TSP-1(圖19)和Smad7(圖20)的水平。然后以任何合適的速度，溫度或其它參數(shù)混合勻漿物?；旌峡梢栽诶缂s1。C，或3。C,至約6。C，10。C，15°C，或20。C的溫度下進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，混合在約4。C下進(jìn)行。例如，可以將勻漿物混合少于約1分鐘，IO分鐘，或20分鐘-約l,2，3小時(shí)或3小時(shí)以上。如果需要，然后可以離心勻漿物以便除去任何遺留的大顆粒?？梢愿鶕?jù)需要使用任何合適范圍的時(shí)間，溫度，蛋白質(zhì)濃度，緩沖液和速度進(jìn)行離心。例如，離心可以以約1,000，5,000或lO，OOOxg-約20,000xg進(jìn)ff。在某些實(shí)施方案中，離心以約15，000xg進(jìn)行。離心可以進(jìn)行少于l分鐘，5分鐘，IO分鐘，20分鐘，至約40分鐘，60分鐘，1.5小時(shí)或1.5小時(shí)以上。然后可以收集上清液并且將以等分部分儲(chǔ)存在-80。C下。如果需要，可以使用合適的工業(yè)蛋白質(zhì)分析試劑盒，諸如BCA測(cè)定法(Pierce,Rockford，IL)對(duì)總蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例2，表X和圖13描述了4氐速或高速離心后AM制品的分析。為了生化表征和純化，可以使用蛋白酶抑制劑補(bǔ)充上述溶液。蛋白酶抑制劑的典型混合物如下1pg/ml抑肽酶，1pg/ml亮抑蛋白酶肽，1pg/ml胃酶抑素A和1mMPMSF。然而，一般而言，如果將制劑加入到活細(xì)胞或組織中，則不向制品中添加蛋白酶抑制劑。可以測(cè)試制劑以便證實(shí)存在特異性成分或蛋白質(zhì)。例如，可以測(cè)試制劑中存在的分子，包括，但不限于HA，TSG-6，PTX-3，TSP-1，Smad7等。還可以測(cè)試制劑以便證實(shí)在制備過(guò)程中的任何點(diǎn)上均不存在病原體。AM制品可以為液體，混懸液或凍干粉(例如研磨或磨碎的)或其它形式?？梢约尤肟刮⑸飫T如抗生素或抗-真菌藥。可以將其它物質(zhì)加入到組合物中以便穩(wěn)定和/或保護(hù)組合物?？梢栽谑褂们皩⒉牧习b和儲(chǔ)存，例如，在室溫或例如在-20。C或-80。C下儲(chǔ)存。在某些實(shí)施方案中，將制品以干粉制劑存在?？梢詫⒏煞壑苿┮孕◇w積儲(chǔ)存，并且可能無(wú)需相同的低溫儲(chǔ)存要求就可防止制劑隨時(shí)間降解。可以儲(chǔ)存干粉制劑并且在使用前再溶解(reconstitute)。例如，可以通過(guò)如本文所述制備冷凍研磨的AM組織，然后除去組合物中的至少部分水制備干粉制劑?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適的方式從制品中除去過(guò)量的水。除去水的典型方法通過(guò)使用商購(gòu)凍干器或凍干機(jī)凍干來(lái)進(jìn)行?？梢哉业胶线m的設(shè)備，例如通過(guò)Virtis,Gardiner,NY;FTSSystems,StoneRidge,NY;和SpeedVac(SavantInstrumentsInc.,Farmingdale，NY)進(jìn)行。除去的水量可以在約5%，10%，20%,30%-約60,70,80,90，95或99%或99%以上。在某些實(shí)施方案中，基本上除去了所有過(guò)量的水。然后可以儲(chǔ)存凍干的粉末。儲(chǔ)存溫度可以在低于約-196。C-80。C，-50。C或-20。C-約23。C以上之間改變。如果需要，可以在儲(chǔ)存前表征粉末(重量，蛋白質(zhì)含量等)。可以在使用前在合適的溶液或緩沖液中再溶解凍干粉。典型的溶液包括，但不限于PBS，DMEM和BSS?？梢愿鶕?jù)需要調(diào)整溶液的pH。可以根據(jù)需要改變AM的濃度。在某些制備過(guò)程中，更濃的制品是有用的，而在其它制備過(guò)程中，具有低濃度AM的溶液是有用的?？梢詫⒘硗獾幕衔锛尤氲浇M合物中?？梢约尤氲皆偃芙庵苿┲械牡湫突衔锇?，但不限于pH調(diào)節(jié)劑，緩沖劑，膠原蛋白，HA,抗生素，表面活性劑，穩(wěn)定劑，蛋白質(zhì)等。還可以將凍干的AM粉末加入到制備的霜?jiǎng)浉鄤┗蛳磩┲幸员惝a(chǎn)生所需濃度?？梢愿鶕?jù)需要將另外的成分加入到組合物中。在某些實(shí)施方案中，可以將水溶性或粉末AM制品與ECM成分，如膠原蛋白，血纖蛋白或HA混合。膠原蛋白為在體內(nèi)存在的主要結(jié)構(gòu)蛋白。它提供對(duì)骨的組織，結(jié)締組織的支撐并且提供身體結(jié)構(gòu)。當(dāng)身體處于愈合過(guò)程中時(shí)，膠原蛋白在幫助構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面起作用。透明質(zhì)酸為在滑膜關(guān)節(jié)液，眼玻璃體液，軟骨，血管，胞外基質(zhì)，皮膚和臍帶中存在的天然糖。血纖蛋白為涉及血凝固的蛋白質(zhì)?？梢詫⑺苄訟M制品與膠原蛋白，血纖蛋白或HA混合。類似地，可以將凍干粉末AM制品與膠原蛋白，血纖蛋白或HA混合。膠原蛋白，血纖蛋白和HA可以為合適的遞送賦形劑(vehicle)，因?yàn)樽C實(shí)混合了膠原蛋白或HA的AM制品可對(duì)TGF-(3啟動(dòng)子活性產(chǎn)生抑制作用。盡管在本文所述的實(shí)驗(yàn)中將AM制品與膠原蛋白凝膠和HA凝膠混合，但是可以使用膠原蛋白和HA或其它ECM成分(例如血纖蛋白)的任何可溶性形式(例如液體)。膠原蛋白，血纖蛋白或HA可以來(lái)源于任何合適來(lái)源的生物體。當(dāng)加入膠原蛋白，血纖蛋白或HA時(shí)，這些化合物與AM之比可以根據(jù)需要改變。例如，可以使用的AM與膠原蛋白(或血纖蛋白或HA)之比小于約0.001:1，0.01:1,0.05:1或0.1:1，至約l:l，1.5:1,2:1,5:1，10:1，100:1或1000:1或更高。例如，如實(shí)施例1中所述，可以通過(guò)用0.1N乙酸稀釋儲(chǔ)備溶液(4mg/ml)并且通過(guò)將其與適當(dāng)體積比的20XDMEM或合適的緩沖液和1NNaOH混合制備膠原蛋白凝膠。例如，制品中存在的膠原蛋白在小于約2mg/ml到大于約4mg/ml的范圍。例如，可以通過(guò)在DMEM或合適的緩沖液中稀釋工業(yè)制備的HA(HealonTM(10mgHA/ml)(Pharmacia,LaJolla,CA)制備高M(jìn)WHA的各種稀釋液?？梢栽谌芤海T如PBS,DMEM或其它溶液中將AM制品的凍千粉和水溶性形式稀釋成所需膠原蛋白濃度。例如，HA在制品中的存在范圍在小于約2嗎/ml到高于約129ng/ml。下列方法代表了制備本文所述和使用的羊膜制品和純化的組合物的例證方法。保存的人AM的制備在選擇的剖腹生產(chǎn)術(shù)時(shí)采集人胎盤(Heiligenhaus等，InvestOphthalmolVisSci.42:1969-1974，2001,Lee和Tseng,AmJOphthalmol.123:303-312，1997,Prabhasawat等，Ophthalmology,104:974-985,1997，Tseng等，ArchOphthalmol.116:431-441，1998)。將AM在硝化纖維紙(HybondN+，Amersham，England)上平展，使上皮表面向上。將AM樣品儲(chǔ)存在-80。C下的DMEM/甘油1:2(v/v)中，直到使用為止。羊膜提取物制備新鮮和冷凍人胎盤獲自io-Tissue，Bio-Tissue,Inc.(Miami，F(xiàn)L)。制備總?cè)薃M提取物(AME)的完整方法在無(wú)菌下進(jìn)行，以便用于隨后基于細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)-瞼。將AM切成適合于BioPulverizer(BiospecProducts,Inc.,Bartlesville，OK)的桶的小切片，冷凍在液氮中，粉碎成細(xì)粉并且稱重。將包含蛋白酶抑制劑(蛋白酶抑制劑混合物，P8340,Sigma，并且補(bǔ)充了1mMPMSF)和磷酸酶抑制劑(50mM氟化鈉和0.2mM釩酸鈉)的pH7.4的冷IXPBS緩沖液以l:l(ml/g)加入到粉末中。將該混合物保持在冰上并且使用TissueTearor(BiospecProducts,Inc.,Dremel,WI)勻漿5次，每次1分4中，其中有2分鐘的冷卻間隔。將這些水溶性提取物稱為"總"AM提取物(AME)。將總AM提取物分入兩個(gè)50ml圓錐形離心管中。在4。C下以高速(HS,48,000xg)離心一個(gè)并且以低速(LS，15,000Xg)離心另一個(gè)。將HS和LS上清液的等分部分轉(zhuǎn)入無(wú)菌1.5ml埃彭道夫管中并且分別稱為AM/HS,AM/LS。將所需的AM/H樣品冷凍在-20。C下1小時(shí)，此后凍干。然后將樣品放入在蓋上帶有孔的FreeZone室(Labconco,KansasCity,MO)中。在-50。C下和0.85mBar真空中將樣品凍干5小時(shí)。在使用前，使用無(wú)菌蒸餾H20將樣品再溶解成相同體積。同樣的方法還用于由易于從AM基質(zhì)上粘附的物質(zhì)上刮取的AM膠凍制備提取物。總可溶性人羊膜和羊膜膠凍提取物制備冷凍人胎盤材料獲自Bio-Tissue，Bio-Tissue，Inc.(Miami,FL)。制備總?cè)薃M提取物(AME)的完整方法在無(wú)菌下進(jìn)行，以便用于隨后基于細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)-瞼。將AM切成適合于BioPulverizer(BiospecProducts,Inc.,Bartlesville，OK)的桶的小切片，冷凍在液氮中，粉碎成細(xì)粉并且稱重。將包含蛋白酶抑制劑(蛋白酶抑制劑混合物，P8340,Sigma，并且補(bǔ)充了lmMPMSF)和磷酸酶抑制劑(50mM氟化鈉和0.2mM4凡酸鈉)的pH7.4的冷IXPBS1￡沖液以l:l(ml/g)加入到粉末中。將該混合物保持在冰上并且使用TissueTearor(BiospecProducts,Inc.,Dremel，WI)勻漿5次，每次1分鐘，其中有2分鐘的冷卻間隔。將這些水溶性提取物稱為"總"AM提取物(AME)。將總水溶性提取物在4。C下混合1小時(shí)，隨后通過(guò)在4。C下兩種不同速度的離心30分鐘，即15000xg和48000xg，進(jìn)行分級(jí)分離，且將所得上清液分別稱為L(zhǎng)和H。將每種上清液分成等分部分并且儲(chǔ)存在-80。C下。該使用不同緩沖液和分級(jí)分離方法的總可溶性人羊膜和羊膜膠凍提取物在檢驗(yàn)不同提取緩沖液中的制品中，稱重由上述制備的粉末并且通過(guò)在4。C下攪拌1小時(shí)與緩沖液A(等滲低鹽)100mMTris-HCl，pH7.6,150mMNaCl，4mMEDTA，1%TritonX-100以AM與緩沖液(ml)1:1的濕重(g)比混合。在以48000xg離心后，隨之通過(guò)在4。C下攪拌1小時(shí)用緩沖液B(高鹽)100mMTris-HCl,pH7.6,1MNaCl,4mMEDTA，1%TritonX-100提取所得沉淀。再以48000xg離心后，最終通過(guò)在4。C下攪拌24小時(shí)用緩沖液C(4M胍鹽酸鹽)100mM乙酸鈉，pH5.8，4M胍鹽酸鹽，4mMEDTA,1。/。TritonX-100提取沉淀。使用下列蛋白酶和磷酸酶抑制劑補(bǔ)充所有上述三種緩沖液lpg/ml抑肽酶，1pg/ml亮抑蛋白酶肽，1pg/ml胃酶抑素A，0.5mMPMSF，50|aM氟化鈉和0.2pM正釩酸鈉。在4。C下將分別稱為提取物A，B和C的所得上清液對(duì)補(bǔ)充了0.5mMPMSF的透析緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.5,0.15MNaCl)透析6小時(shí)并且改變兩次透析緩沖液，每次使用500x(體積比-透析緩沖液:樣品)。在透析后，測(cè)定每種樣品的體積并且使用透析緩沖液調(diào)整至相同體積。同樣的方法也用于由為易于刮取的AM基質(zhì)上粘附的物質(zhì)的AM膠凍制備提取物。在PBS中的總可溶性人羊膜提取物的制備制備總可溶性人AM提取物(T)的完整方法在無(wú)菌下進(jìn)行，以便用于隨后基于細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)。冷凍人胎盤獲自Bio-Tissue，Inc.(Miami,FL),從其中耳又出AM。將AM切成適合于BioPulverizer(BiospecProducts,Inc.,Bartlesville，OK)的桶的小切片，冷凍在液氮中，粉碎成細(xì)粉。稱重粉末并且與包含蛋白酶抑制劑(蛋白酶抑制劑混合物，P8340，Sigma，并且補(bǔ)充了1mMPMSF)和磷酸酶抑制劑(50mM氟化鈉和0.2mM釩酸鈉)的冷IXPBS緩沖液(通過(guò)將蒸餾H20加入到1xPBS中制備，pH7.4,來(lái)自10xPBS,cat#70011-044,Invitrogen，Carlsbad,CA)以l:l(ml/g)混合。將該混合物保持在冰上并且使用TissueTearor(BiospecProducts,Inc.,Dremel,WI)勻漿5次，每次1分鐘，其中有2分鐘的冷卻間隔。將該水溶性提取物稱為"總"(T)。將總水溶性提取物在4。C下混合1小時(shí)，在4°C下以48000xg離心30分鐘。將上清液分成等分部分并且儲(chǔ)存在-80。C下。水溶性AM基質(zhì)提取物的制備使用無(wú)菌技術(shù)，用HBSS簡(jiǎn)單將獲自Bio-Tissue，Inc.(Miami,FL)的冷凍人AM洗滌2-3次以便除去原始的保存介質(zhì)。用藥刀刮取AM基質(zhì)，冷凍在液氮的氣相中并且用BioPulverizer(BiospecProducts,Inc.,Bartlesville,OK)研磨成細(xì)顆粒，隨后使用TissueTearor(BiospecProducts,Inc.,Dremel,WI)在水上的pH7.4的PBS中勻漿1分鐘。通過(guò)旋轉(zhuǎn)1小時(shí)混合勻漿物并且在4。C下以14,000xg離心30分鐘。然后收集在PBS中的上清液并且以等分部分儲(chǔ)存在-80。C下。通過(guò)BCA測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。稱為羊膜基質(zhì)提取物(ASE)的該羊膜水溶性蛋白質(zhì)提取物用于本文所述的實(shí)驗(yàn)。AM基質(zhì)提取物制備以無(wú)菌方式實(shí)施制備蛋白質(zhì)提取物的完整方法。使用HBSS(Invitrogen,Carlsbad,CA)簡(jiǎn)單將獲自Bio-Tissue,Inc.(Miami,FL)的冷凍人AM洗滌2-3次以便除去保存介質(zhì)。用藥刀從AM基質(zhì)側(cè)上刮取AM基質(zhì)以便進(jìn)行基質(zhì)提取物制備。用HBSS將獲自BaptistHospital(Miami,FL)的人胎盤以及絨毛膜沖洗3次以便除去血液。為了制備水溶性蛋白質(zhì)提取物，將總AM，刮取的AM基質(zhì),除去基質(zhì)的AM,胎盤和絨毛膜各自冷凍在液氮的氣相中并且用BioPulverizer(BiospecProducts，Inc.,Bartlesville,OK)各自研磨成細(xì)茅貞4立，隨后使用TissueTearor(BiospecProducts,Inc.,Dremel,WI)在冰上的PBS(pH7.4)中勻漿1分鐘。混合各勻漿物1小時(shí)并且在4。C下以14,000xg離心30分鐘。然后收集各上清液(在PBS中)并且以等分部分(0.5ml)儲(chǔ)存在-80。C下。將BCA測(cè)定法(Pierce,Rockford，IL)用于測(cè)定不同提取物中的總蛋白質(zhì)。制備人AM提取物的水溶性和凍干粉形式在制備人AM提取物的典型方法中，以無(wú)菌方式實(shí)施完整方法。除非另作陳述，可以在方法的步驟中在室溫下處理AM提取物。首先，優(yōu)選從Bio-Tissue，Inc.(Miami，F(xiàn)L)獲得新鮮或冷凍人AM。用HBSS(Invitrogen，Carlsbad,CA)將冷凍AM簡(jiǎn)單洗滌2-3次以便除去保存的介質(zhì)。用HBSS將新鮮人胎盤或絨毛膜沖洗3次以便除去血液。為了制備AM提取物的水溶性形式，將AM(例如AM基質(zhì)，除去基質(zhì)的AM，胎盤，絨毛膜)轉(zhuǎn)入無(wú)菌50ml離心管并且在4°C下以5000xg離心5分鐘以便除去過(guò)量流體。稱重AM,轉(zhuǎn)至100mm或150mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中并且冷凍在液氮容器的氣相中20分鐘以便有利于隨后的勻漿。使用一次性解剖刀將冷凍AM切成小片或4吏用BioPulverizer(BiospecProducts,Inc.，Bartlesville,OK)或其它合適的裝置研磨成細(xì)顆粒且在中性pH下用TissueTearor(BiospecProducts,Inc.,Dremel,WI)或其它合適的裝置在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或不含酚紅的DMEM(Invitrogen，Carlsbad,CA)中勻漿。為了進(jìn)行生化表征和純化，使用下列蛋白酶抑制劑補(bǔ)充上述溶液lpg/ml抑肽酶，1ng/ml亮抑蛋白酶肽，1pg/ml胃酶抑素A和1mMPMSF。然而，如果將提取物直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中，那么不加入蛋白酶抑制劑。在4°C下將勻漿物混合30分鐘并且以15,000xg離心30分鐘。收集上清液(即AM提取物)并且以等分部分(0.5ml)儲(chǔ)存在-80。C下。將BCA測(cè)定法(Pierce，Rockford，IL)用于測(cè)定各AM提取物中的總蛋白質(zhì)。為了制備AM提取物的凍干粉末形式，使用BioPulverizer(BiospecProducts,Inc.,Bartlesville,OK)或其它合適的裝置將冷凍AM研磨成細(xì)顆粒并且如本文所述進(jìn)一步勻漿。在4。C下用SpeedVac(SavantInstrumentsInc.,Farmingdale,NY)將約0.5ml的等分部分凍干4小時(shí)以便使重量從280mg減至32mg(減少89。/。)。稱重凍干粉末并且儲(chǔ)存在-80。C下。在使用前，用合適的緩沖液將凍干粉再溶解。為了制備AM基質(zhì)提取物，從完整的總AM的基質(zhì)表面上刮取AM基質(zhì)，從而得到完整基膜和羊膜上皮，并且使用如本文所述BioPulverizer研磨冷凍AM基質(zhì)。在中性pH和4。C下用PBS(例如1.4mg/ml)將基質(zhì)提取30分鐘并且以15,000xg離心30分鐘。收集上清液并且以等分部分(0.5ml)儲(chǔ)存在-80。C下。將BCA測(cè)定法(Pierce,Rockford，IL)用于測(cè)定AM基質(zhì)^是取物中的總蛋白質(zhì)。涉及普通分子生物學(xué)技術(shù)的方法在本文中描述。這類技術(shù)一般為本領(lǐng)域中^i^知的并且詳細(xì)描述在方法學(xué)專題論文中，諸如MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.，vol.1-3，ed.Sambrook等，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,2001;和CurrentProtocolsinMolecularBiology,ed.Ausubel等，GreenePublishingandWiley畫Interscience,NewYork,2003(最新期刊)。用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的各種技術(shù)為本領(lǐng)域中公知的并且描述在CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,4thed.,R.IanFreshney,Wiley-Liss，Hoboken，NJ,2000和AnimalCellCultureTechniques(SpringerLabManual)，M.Clynos，Springer—Verlag，NewYork，NY，1998中。涉及蛋白質(zhì)分析和純化的方法也為本領(lǐng)域中公知的并且描述在ProteinAnalysisandPurification:BenchtopTechniques,2nded.，IanM.Rosenberg,Birkhauser，NewYork,NY，2004中。藥物組合物為給藥目的可以將AM制品配制成非固體劑型，例如，通過(guò)與遞送賦形劑混合而產(chǎn)生組合物，諸如溶液，滴劑，混懸液，糊劑，噴霧劑，軟膏劑，油，乳劑，氣溶膠，涂敷繃帶，貼劑，霜?jiǎng)?，洗劑，凝膠等。所用的制劑取決于具體應(yīng)用。凝膠用于給予組合物，因?yàn)樗鼈兡軌蚋玫厥够钚越M分保留在導(dǎo)入部位，從而使活性組分將其作用較長(zhǎng)時(shí)間，此后將活性組分清除?？蛇x擇地，將AM制品可配制成延長(zhǎng)釋放固體劑型(包括口服劑型)。本文提供了典型的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑和稀釋劑以及藥物制劑的描述，并且還可以在本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)教科書Remington'sPharmaceuticalSciences和USP/NF中找到?？梢允褂靡环N或多種生理學(xué)上可接受的載體，按照通用方法配制藥物組合物，所述的生理學(xué)可接受的載體包括有利于將活性化合物加工成可以在藥學(xué)上使用的制劑的賦形劑和助劑。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于選擇的給藥途徑。任何眾所周知的技術(shù)，載體和賦形劑可以合適的和為本領(lǐng)域中理解的使用。例如，可以在如下文獻(xiàn)中找到本文所述的藥物組合物的概述Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,NineteenthEd(Easton，Pa.:MackPublishingCompany,1995);Hoover,JohnE.,Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.，Easton,Pennsylvania1975;Liberman,H,A.和Lachman，L.，Eds.,PharmaceuticalDosageForms,MarcelDecker,NewYork,N.Y.,1980;和PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,SeventhEd.(LippincottWilliams&Wilkins;1999),將這些文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑，賦形劑或載體。此外，可以將本文所述的AM制品和純化的組合物以藥物組合物形式給藥，其中將本文所述的AM制品和純化的組合物與作為組合療法中的其它活性組分混合。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物可以包括其它藥用或藥物活性劑，載體，佐劑，諸如防腐劑，穩(wěn)定劑，濕潤(rùn)劑或乳化劑，溶解促進(jìn)劑，用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑。此外，藥物組合物還可以包含其它治療上有價(jià)值的物質(zhì)。本文所用的藥物組合物意指本文所述的AM制品和純化的組合物與其它化學(xué)成分，諸如載體，穩(wěn)定劑，稀釋劑，分散劑，懸浮劑，增稠劑和/或賦形劑的混合物。藥物組合物有利于將化合物給予生物體。在實(shí)施本文提供的治療或使用方法中，以藥物組合物的形式將治療有效量的本文所述的AM制品和純化的組合物給予患有所要治療的疾病，病癥或疾患的哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，所述的哺乳動(dòng)物為人。治療有效量可以根據(jù)疾病的嚴(yán)重性，受治療者的年齡和相對(duì)健康狀況，所用的化合物的功效和其它因素的不同而廣泛改變?？梢詥为?dú)或與作為混合物中成分的一種或多種治療劑組合使用所述的化合物。局部用制劑本文所述的AM制品和純化的組合物的制劑包括那些適合于局部給藥的制劑。可以將這些制劑便利地制成單位劑型并且可以通過(guò)制藥領(lǐng)域眾所周知的任何方法制備。可以與載體物質(zhì)混合以便得到單一劑型的活性組分的量取決于所治療的宿主，特定給藥方式?；鞈乙嚎梢园瑧腋?，例如，乙氧基化異十八烷醇類，聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨糖醇酯類，孩i晶纖維素，偏氬氧化鋁(aluminummetahydroxide),膨潤(rùn)土，瓊脂和黃蓍膠及其混合物。本文所述的局部用組合物包括各種物理形式。它們包括，但不限于溶液，洗劑，霜?jiǎng)?，油，凝膠，棒狀物，噴霧劑，軟膏劑，香膏，洗發(fā)劑和糊劑。一般而言，可以將這類載體系統(tǒng)描述為溶液，乳劑，凝膠，固體和氣溶膠。可以將組合物直接施用于皮膚或可以施用透皮遞送裝置形式，諸如本領(lǐng)域中公知的顯微操作針，貼劑，繃帶或紗布?jí)|。軟膏劑，糊劑，霜?jiǎng)┖湍z除包含本文所述的AM制品和純化的組合物外還可以包含賦形劑，諸如動(dòng)物和植物脂肪，油，蠟，石蠟，淀粉，黃蓍膠，纖維素衍生物，聚乙二醇類，硅氧烷，膨潤(rùn)土，硅酸，滑石粉和氧化鋅或其混合物。粉末和噴霧劑除包含本文所述的AM制品和純化的組合物外還可以包含賦形劑，諸如乳糖，滑石粉，硅酸，氫氧化鋁，磷酸鉀和聚酰胺粉末或這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑還可以包含常用的拋射劑，諸如氯氟烴類和揮發(fā)性未被取代的烴類，諸如丁烷和丙烷。溶劑一般用于制備合適的局部用組合物。這類溶劑可以為基于水或有機(jī)物的。溶劑必須能夠使活性組分分散于或溶于其中，而不會(huì)對(duì)所治療的動(dòng)物產(chǎn)生刺激。水構(gòu)成所有含水溶劑的基礎(chǔ)，而合適的有機(jī)溶劑包括丙二醇，丁二醇，聚乙二醇，聚丙二醇，甘油，1,2,4-丁三醇，山梨醇酯類，1,2，6-己三醇，乙醇，異丙醇，丁二醇及其混合物。在整個(gè)組合物中可以包括的溶劑量在0.1%-99°/0且優(yōu)選2.0%-75%。在某些實(shí)施方案中，生產(chǎn)包含軟化劑(emolHent)的組合物形式的組合物。各種合適的軟化劑為公知的并且可以在本文使用。在某些實(shí)施方案中，將組合物配制成包含約0.01%-10%本文所述的AM制品和純化的組合物的洗劑。在其它實(shí)施方案中，用溶液載體系統(tǒng)將組合物配制成霜?jiǎng)Ｋ獎(jiǎng)┙M合物可以優(yōu)選包含約0.1%-15%且優(yōu)選1%-5%的本文所述的AM制品和純化的組合物。將洗劑和霜?jiǎng)┡渲瞥扇閯┖腿芤?。還可以以液體形式給予組合物，包括懸浮于液體中的脂質(zhì)體形式，如這種工業(yè)領(lǐng)域中可利用的不同噴霧劑類型。在其它實(shí)施方案中，將活性組分配制成軟膏劑。合適的軟膏劑可以包含動(dòng)物或植物油或半固體烴類(油脂性的)單一基質(zhì)。合適的軟膏劑還可以包含吸收水而形成乳劑的吸收軟膏基質(zhì)。軟膏劑載體還可以為水溶性的。軟膏劑可以包含1%-99%的軟化劑和約0.1%-99%的增稠劑。所述組合物中本文所述的AM制品和純化的組合物的比例可以在約0.01wt.%-約100wt.%,更優(yōu)選約0.1wt.%-約99.9wt.%且尤其是約1.0wt.%-約99.0wt.%之間改變。"載體，，或"賦形劑"優(yōu)選意指適合于局部給藥的載體物質(zhì)并且包括本領(lǐng)域中公知的任何這類物質(zhì)，諸如任何液體，凝膠溶劑，液體稀釋劑，增溶劑等，其為無(wú)毒性的并且不以有害方式與組合物中的其它成分發(fā)生相互作用。本文使用的合適的載體的實(shí)例包括水，硅氧烷，液體糖類，蠟，油，石油膠凍和各種其它物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，載體或賦形劑包括一種或多種溶劑，油，表面活性劑，保濕劑，增稠劑，抗氧化劑，螯合劑，緩沖劑和防腐劑。溶劑的實(shí)例包括C2-C10醇類，諸如己醇，環(huán)己醇，千醇，1,2-丁二醇，甘油，和戊醇；C5-C10烴類，諸如正-己烷，環(huán)己烷和乙基苯；C4-C10醛類和酮類，諸如庚醛，環(huán)己酮和苯曱醛；C4-C10酯類，諸如乙酸戊酯和丙酸節(jié)酯；芳香油，諸如桉樹油，蕓香油，小茴香子油，檸檬烯，麝香草酚和l-蒗烯；具有2-8個(gè)碳原子的卣代烴類，諸如l-氯己烷，1-溴己烷和氯環(huán)己烷。油的實(shí)例包含脂肪和油，諸如橄欖油和氫化油；蠟，諸如蜂蠟和羊毛脂；烴類，諸如液體石蠟，地蠟和角鯊?fù)?；脂肪酸，諸如硬脂酸和油酸；醇類，諸如鯨蠟醇，十八烷醇，羊毛脂醇和十六醇;和酯類，諸如肉豆蔻酸異丙酯，棕櫚酸異丙酯和硬脂酸丁酯。表面活性劑的實(shí)例包括陰離子型表面活性劑，諸如硬脂酸鈉，十六烷基硫酸鈉，聚氧乙烯月桂基醚磷酸酯，N-乙?；劝彼徕c；陽(yáng)離子型表面活性劑，諸如硬脂酰二曱基千基氯化銨和硬脂酰三曱基氯化銨；兩性表面活性劑，諸如烷氨基乙基甘氨酸鹽酸鹽溶液和卵磷脂；和非離子型表面活性劑，諸如單硬脂酸甘油酯，失水山梨糖醇單硬脂酸酯，蔗糖脂肪酸酯類，丙二醇單硬脂酸酯，聚氧乙烯油基醚，聚乙二醇單硬脂酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇單棕櫚酸酯，聚氧乙烯椰子油脂肪酸一乙醇酰胺，聚亞丙基二醇(例如在商標(biāo)"Pluronic"下銷售的物質(zhì))，聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯羊毛脂。保濕劑的實(shí)例包括甘油，1,3-丁二醇和丙二醇；增稠劑的實(shí)例包括黃原膠，羥丙基纖維素，羥丙基曱基纖維素，聚乙二醇和羧曱基纖維素鈉；抗氧化劑的實(shí)例包括丁羥甲苯，丁羥茴香醚，掊酸丙酯，檸檬酸和乙氧(三曱)喹啉；螯合劑的實(shí)例包括乙二胺四乙酸二鈉和二磷酸羥乙酯(ethanehydroxyldiphosphate);緩沖劑的實(shí)例包含檸檬酸，杵檬酸鈉，硼酸，硼砂和磷酸氫二鈉;且防腐劑的實(shí)例為對(duì)羥基苯曱酸曱酯，對(duì)羥基苯曱酸乙酯，曱基乙酰吡喃二酮，水楊酸和苯曱酸。在某些實(shí)施方案中，載體/賦形劑由上述物質(zhì)構(gòu)成以便實(shí)現(xiàn)對(duì)皮膚的受控35封閉，由此在最低的皮膚刺激下導(dǎo)致生物活性部分通過(guò)皮膚滲透的最佳強(qiáng)化。在某些實(shí)施方案中，載體/賦形劑可以包括有助于維持分散于連續(xù)相中的活性組分的顆粒相的分散劑。在其它實(shí)施方案中，非-離子賦形劑，諸如月桂醇，丙二醇一月桂酸酯，乳酸肉豆蔻酯，乳酸月桂酯等有利于分散?？梢杂猛钙みf送促進(jìn)劑增加通過(guò)表皮表面的生物活性部分的比例。合適的透皮遞送促進(jìn)劑包括接受質(zhì)子的溶劑，諸如二曱亞砜和二曱基乙酰胺。其它合適的透皮遞送促進(jìn)劑包括2-吡咯烷，N，N-二乙基-間-曱苯曱酰胺，1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-S同，N，N-二曱基曱酰胺，N-曱基-2-吡咯烷，萜類，表面活性劑和巰基乙酸4丐。合適的皮膚滲透促進(jìn)劑包括對(duì)-氨基苯曱酸的1-5個(gè)碳的脂肪酸酯類，椋櫚酸異丙酯，肉豆蔻酸異丙酯，乙醇，異丁醇，異丁醇，十八烷醇，甘油，2-吡咯烷酮，尿素，丙二醇，油酸，棕櫚酸，二曱亞砜，N，N-二曱基乙酰胺，N,N-二曱基曱酰胺，2-吡咯烷酮，l-曱基-2-p比咯烷酮，5-曱基-2-p比咯烷酮，1,5-二曱基-2-吡咯烷酮，l-乙基-2-p比咯烷酮，2-吡咯烷酮-5-曱酸，N，N-二曱基-間-曱苯曱酰胺，尿素，乙酸乙酯，l-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-S同，油酸，咪唑啉，丁基脲和吡咯烷酮羧酸酯類。濕潤(rùn)劑，乳化劑，表面活性劑和潤(rùn)滑劑，諸如十二烷基^5克酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑，釋放劑，包衣劑，甜味劑，矯味劑和香味劑，防腐劑和抗氧化劑也可以存在于所述組合物中。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸，鹽酸半胱氨酸，碌u酸氫鈉，焦亞碌u酸鈉，亞好b酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯，丁羥茴香醚(BHA)，丁羥曱苯(BHT),卵磷脂，掊酸丙酯，a-生育酚等;和(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA),山梨醇，酒石酸，磷酸等。作為局部應(yīng)用的合適的組合物，可以列舉所有常用于局部給予治療劑的組合物，例如霜?jiǎng)?，膠凍劑，敷料，洗發(fā)劑，酊劑，糊劑，軟膏劑，油膏，粉劑，液體或半液體制劑等。所述組合物的使用可以通過(guò)氣溶膠進(jìn)行，例如含有拋射劑，諸如氮，二氧化碳，氟利昂或不含拋射劑的氣溶膠，諸如泵式噴霧劑，滴劑，洗劑或半固體，諸如可以用拭子涂布的增稠的組合物。在具體的組合物中，便利地使用半固體組合物，諸如油膏，霜?jiǎng)?，糊劑，膠凍劑，軟膏劑等。眼用制劑可以以各種方式給予本文所述的AM制品和純化的組合物，包括局部遞送至眼部的所有劑型。另外，可以通過(guò)全身，諸如口服或靜脈內(nèi)給予本文所述的AM制品和純化的組合物。可以通過(guò)將本文所述的AM制品和純化的組合物局部施用于眼部并且可以將其配制成各種可局部給藥的眼用組合物，諸如溶液，混懸液，凝膠或軟膏劑。因此，"眼部給藥"包括，但不限于眼內(nèi)注射，視網(wǎng)膜下注射，玻璃體內(nèi)注射，眼周給藥，結(jié)膜下(subconjuctival)注射，眼球后注射，房?jī)?nèi)注射(包括進(jìn)入前房或玻璃體房)，sub-Tenon注射或植入物，眼用溶液，眼用混懸液，眼用軟膏劑，眼用植入物和眼用嵌入劑，眼內(nèi))容液，應(yīng)用離子透入，摻入手術(shù)灌洗液和藥包Cf又作為實(shí)例，插入宮窿的浸透的官窿)。包含本文所述的AM制品和純化的組合物的組合物作為例證采用液體形式，其中活性劑以溶液，混懸液或它們兩者的形式存在。一般而言，當(dāng)將組合物作為溶液或混懸液給藥時(shí)，活性劑的第一部分以溶液的形式存在，而活性劑的第二部分以顆粒形式，在液體基質(zhì)中的混懸液形式存在。在某些實(shí)施方案中，液體組合物可以包括凝膠制劑。在其它實(shí)施方案中，液體組合物為含水的?？蛇x擇地，組合物可采用軟膏劑形式。有用的組合物可以為水溶液，混懸液或溶液/混懸液，可以將它們制成滴眼劑形式。可以通過(guò)已知的許多滴劑將所需劑量給藥于眼。例如，就25(al體積的滴眼劑而言，給予1-6滴遞送25-150|al的組合物。含水組合物一般包含約0.01%-約50%,更一般地約0.1%-約20%,更一般地約0.2%-約10%且最一般地約0.5%-約5%重量/體積的本文所述的AM制品和純化的組合物。一^L而言，含水組合物具有眼科可接受的pH和同滲質(zhì)量摩爾濃度。就制劑，組合或組分而言的"眼科可接受的"一般意指對(duì)治療的眼或其功能或?qū)κ苤委熣咭话憬】禒顩r沒(méi)有持久的有害作用。暫時(shí)的作用，諸如最小的刺激或"螫刺"感在使用活性劑的局部眼部給藥是常見的并且與所述制劑，組合物或組分一致性是"眼科可接受的"。有用的含水混懸液還可以包含一種或多種聚合物作為懸浮劑。有用的聚合物包括水溶性聚合物，諸如纖維素聚合物，例如鞋丙基曱基纖維素，和水不溶性聚合物，諸如含交聯(lián)羧基的聚合物。有用的組合物還可以包含眼科可接受的粘膜粘著性聚合物，例如，選自羧曱基纖維素，卡波姆(丙烯酸聚合物)，聚(曱基丙烯酸曱酯)，聚丙烯酰胺，聚卡波菲，丙烯@^/丙烯酸丁酯共聚物，藻酸鈉和葡聚糖。有用的組合物還可以包括眼科可接受的增溶劑以便有助于本文所述的AM制品和純化的組合物中的成分的溶解性。本文所用的術(shù)語(yǔ)"增溶劑"一般包括導(dǎo)致活性劑的膠束溶液或真溶液形成的試劑。某些眼科可接受的非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯80可以用作增溶劑，因?yàn)樗鼈兛梢詾檠劭瓶山邮艿亩碱?，聚乙二醇，例如聚乙二?00和乙二醇醚類。有用的組合物還可以包括一種或多種眼科可接受的pH調(diào)節(jié)劑或緩沖劑，包括酸，諸如乙酸，硼酸，檸檬酸，乳酸，磷酸和鹽酸；堿，諸如氫氧化鈉，磷酸鈉，硼酸鈉，檸檬酸鈉，乙酸鈉，乳酸鈉和三-羥曱基氨基曱烷；和緩沖劑，諸如檸檬酸鹽/葡萄糖，碳酸氫鈉和氯化銨。以將組合物的pH維持在眼部可接受范圍所需的量包括這類酸，堿和緩沖液。有用的組合物還可以包括一種或多種眼科可接受的鹽，其用量使組合物的同滲質(zhì)量摩爾濃度達(dá)到眼科可接受的范圍所需要的。這類鹽包括具有鈉，鉀或銨陽(yáng)離子和氯根，檸檬酸根，抗壞血酸根，硼酸根，磷酸根，碳酸氫根，硫酸根，硫代硫酸根或亞硫酸氬根陰離子的那些鹽；合適的鹽包括氯化鈉，氯化鉀，石克代-克酸鈉，亞碌L酸氫鈉和-危酸銨。其它有用的組合物還可以包括一種或多種眼科可接受的防腐劑以便抑制微生物活性。合適的防腐劑包括含汞的物質(zhì)，諸如硼酸苯汞和硫柳汞；穩(wěn)定的二氧化氯;和季銨化合物，諸如苯扎氯銨，溴化十六烷基三曱銨和氯化十六烷基吡咬錯(cuò)。其它有用的組合物可以包括一種或多種眼科可接受的表面活性劑以便增強(qiáng)物理穩(wěn)定性或用于其它目的。合適的非離子型表面活性劑包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯類和植物油，例如聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚類和烷基苯基醚類，例如辛苯昔醇IO，辛苯昔醇40。如果需要，其它有用的組合物可以包括一種或多種抗氧化劑以便增強(qiáng)化學(xué)穩(wěn)定性。僅作為實(shí)例，合適的抗氧化劑包括抗壞血酸和焦亞硫酸鈉?？梢詫⒑鞈乙航M合物包裝在單劑量的不能再封閉的容器中。另一方面，可以使用多劑量可再封閉的容器，其中典型的是在組合物中包括防腐劑。眼用組合物還可以釆用可以插入在眼與眼瞼之間或結(jié)膜嚢中的固體制品，其中它釋放本文所述的AM制品和純化的組合物。釋放至沖洗角膜表面的淚液或直接釋放至角膜，在其中一般與固體制品緊密接觸。適合于以這類方式植入眼的固體制品一般主要由聚合物組成并且可以為生物可降解的或不能生物降解的。注射制劑適合于肌內(nèi)，皮下或靜脈內(nèi)注射的制劑可以包括生理學(xué)可接受的無(wú)菌水或非水溶液，分散液，混懸液或乳液和再溶解成無(wú)菌注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。合適的含水和非水載體，稀釋劑，溶劑或賦形劑的實(shí)例包括水，乙醇，多元醇類(丙二醇，聚乙二醇，甘油，克列莫佛等)，其合適的混合物，植物油(諸如橄欖油)和可注射的有機(jī)酯類，諸如油酸乙酯。例如，可以通過(guò)使用包衣材料，諸如卵磷脂，就分散液而言通過(guò)維持所需顆粒大小并且通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。適合于皮下注射的制劑還可以包含添加劑，諸如防腐劑，濕潤(rùn)劑，乳化劑和分散劑?？梢杂酶鞣N抗菌和抗真菌劑，諸如對(duì)羥基苯曱酸酯類，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等確保防止微生物生長(zhǎng)。還需要包括等滲劑，諸如糖類，氯化鈉等。可以通過(guò)使用延緩吸收的試劑，諸如單硬脂酸二羥基鋁和明膠使注射藥物劑型延長(zhǎng)吸收。就靜脈內(nèi)注射劑而言，可以將本文所述的AM制品和純化的組合物配制成在生理學(xué)相容性緩沖液中的水溶液，所述的生理學(xué)相容性緩沖液諸如Hank溶液，林格液，生理鹽水緩沖液或其它合適的溶液。就跨粘膜給藥而言，將適合于透過(guò)屏障的滲透劑用于制劑中。這類滲透劑一般為本領(lǐng)域中公知的。就其他非腸道注射劑而言，合適的制劑可以包括水或非水溶液，優(yōu)選含有生理學(xué)相容性緩沖液或賦形劑。這類賦形劑一般為本領(lǐng)域中公知的。非腸道注射可以包括快速濃注或連續(xù)輸注?？梢詫⒂糜谧⑸涞闹浦瞥蓡挝粍┬?，，例如在添加了防腐劑的安瓿或多劑量容器中。本文所述的藥物組合物可以為適合于非腸道注射的形式，如在含油或含水賦形劑中的無(wú)菌混懸液，溶液或乳劑并且可以包含配制試劑，諸如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于非腸道給藥的藥物制劑包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，可以將活性化合物的混懸液制備成合適的含油注射混懸液。合適的親脂性溶劑或賦形劑包括脂肪油，諸如芝麻油或合成脂肪酸酯類，諸如油酸乙酯或甘油三酯類或脂質(zhì)體。含水注射混懸液可以包含增加混懸液粘度的物質(zhì)，諸如羧曱基纖維素鈉，山梨醇或葡聚糖。該混懸液還可以任選包含合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度的試劑以便能夠制備高濃縮溶液?？蛇x擇地，活性組分可以為在使用前用合適的賦形劑，例如無(wú)菌無(wú)熱原水溶解(constitution)的粉末形式。透皮制劑可以使用本領(lǐng)域中已經(jīng)描述的各種裝置給予本文所述的透皮制劑。例如，這類裝置包括，但不限于美國(guó)專利US3,598,122，3,598,123，3,710,795,3,731,683,3,742,951，3,814,097，3,921,636，3,972,995，3,993,072，3,993,073，3，996，934，4,031,894，4,060,084，4，069，307,4,077,407,4,201,211,4，230，105，4,292,299，4,292,303，5,336,168，5,665,378,5,837,280，5，869，090，6,923,983,6,929,801和6,946,144,特別將這些文獻(xiàn)各自完整地引入作為參考。本文所述的透皮劑型可以摻入某些本領(lǐng)域中常用的藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的透皮制劑包括至少三種成分(1)如本文所述制劑；(2)透皮促進(jìn)劑;和(3)含水佐劑。此外，透皮制劑可以包括另外的成分，諸如，但不限于膠凝劑，霜?jiǎng)┖蛙浉鄤┗|(zhì)等。在某些實(shí)施方案中，透皮制劑可以還包括針織或針織裱背材料以便促進(jìn)吸收并且防止透皮制劑從皮膚上除去。在其它實(shí)施方案中，本文所述的透皮制劑可以維持促進(jìn)擴(kuò)散入皮膚的飽和或過(guò)飽和狀態(tài)。適合于本文所述的AM制品和純化的組合物的透皮給藥的制劑可以使用透皮遞送裝置和透皮遞送貼劑，并且可以為溶于和/或分散于聚合物或粘合劑中的親脂性乳劑或緩沖的水溶液?？梢詷?gòu)成這類貼劑用于連續(xù)，搏動(dòng)或根據(jù)需要遞送藥物活性劑。此外，本文所述的AM制品和純化的組合物的透皮遞送可以通過(guò)離子透入貼劑等進(jìn)行。另外，透皮貼劑可以提供組合物的受控遞送。可以通過(guò)使用控制速率的膜或通過(guò)將化合物截留在聚合物基質(zhì)或凝膠內(nèi)減緩吸收速率。相反，吸收促進(jìn)劑可以用于增加吸收。吸收促進(jìn)劑或載體可以包括可吸收的藥學(xué)上可接受的溶劑以便有助于通過(guò)皮膚。例如，透皮裝置為繃帶形式，其包含裱背部分，包含化合物與任選載體的儲(chǔ)器，任選的速率控制屏障以便以受控和預(yù)定速率在延長(zhǎng)時(shí)間期限內(nèi)將化合物遞送至宿主皮膚和將裝置與皮膚固定的用具。固體口服劑型本文所述的藥物固體劑型可以包括一種或多種藥學(xué)上可接受的添加劑，諸如相容性載體，粘合劑，填充劑，懸浮劑，矯味劑，甜味劑，崩解劑，分散劑，表面活性劑，潤(rùn)滑劑，著色劑，稀釋劑，增溶劑，濕潤(rùn)劑，增塑劑，穩(wěn)定劑，滲透促進(jìn)劑，濕潤(rùn)劑，消泡劑，抗氧化劑，防腐劑，或其一種或多種的組合。在其它方面中，使用標(biāo)準(zhǔn)包衣方法，諸如描述在Remington'sPharmaceuticalSciences,20thEdition(2000)中的那些。壓制片為通過(guò)壓制本文所述制劑的疏松摻合物制備的固體劑型。在各種實(shí)施方案中，為在口腔中溶解設(shè)計(jì)的壓制片包括一種或多種矯味劑。在其它實(shí)施方案中，壓制片包括包圍在最終壓制片周圍的薄膜。在某些實(shí)施方案中，薄膜包衣可以提供組合物從制劑中的延緩釋放。在其它實(shí)施方案中，薄膜包衣有助于患者的配合性(例如Opadry包衣或糖衣)。包括Opadry⑧的薄膜包衣一般占片重的約1%-約3%。在其它實(shí)施方案中，壓制片包括一種或多種賦形劑。例如，通過(guò)將本文所述的組合物制劑的疏松摻合物放入膠嚢內(nèi)制備膠嚢。在某些實(shí)施方案中，將制劑(非水混懸液和溶液)放入軟膠嚢。在其它實(shí)施方案中，將制劑放入標(biāo)準(zhǔn)膠囊或非膠嚢中，諸如包含HPMC的膠嚢。在其它實(shí)施方案中，將制劑放入撒布膠嚢(sprinklecapsule),其中膠嚢可以為完整可吞咽的，或可以為開放的并且在食用前將內(nèi)含物撒布于食物上。在某些實(shí)施方案中，將治療劑量分入多(例如2，3或4)膠嚢中。在某些實(shí)施方案中，以膠嚢形式遞送制劑的完整劑量。在各種實(shí)施方案中，將組合物的顆粒和一種或多種賦形劑干燥摻合并且壓制成團(tuán)，諸如片劑，它們具有足以提供藥物組合物的硬度，這些藥物組合物基本上在在口服給藥后少于約30分鐘，少于約35分鐘，少于約40分鐘，少于約45分鐘，少于約50分鐘，少于約55分鐘或少于約60分鐘內(nèi)崩解，由此將制劑釋放入胃腸液。在另一個(gè)方面中，劑型可以包括微嚢化制劑。在某些實(shí)施方案中，一種或多種其它相容性物質(zhì)存在于微嚢化材料中。典型的物質(zhì)包括，但不限于pH調(diào)節(jié)劑，蝕解促進(jìn)劑，消泡劑，抗氧化劑，矯味劑和載體物質(zhì)，諸如粘合劑，懸浮劑，崩解劑，填充劑，表面活性劑，增溶劑，穩(wěn)定劑，潤(rùn)滑劑，濕潤(rùn)劑和稀釋劑。可以進(jìn)一步配制包括本文所述的AM制品和純化的組合物的藥物固體劑型以便提供組合物的控釋。控釋意指組合物從劑型中釋放，其中根據(jù)在延長(zhǎng)時(shí)間期限內(nèi)的所需特性摻入它?？蒯屘匦园?，例如，緩釋，延長(zhǎng)釋放，脈沖式釋放和延緩釋放特性。與即刻釋放組合物相反，控釋組合物能夠按照預(yù)定特性在延長(zhǎng)時(shí)間期限內(nèi)將活性劑遞送至受治療者。這類釋放速率可以將反應(yīng)，同時(shí)與常規(guī)速釋劑型相比將副作用減少到最低限度。這類較長(zhǎng)的反應(yīng)期限提供了許多固有的有益性，而這些有益性無(wú)法使用相應(yīng)的短效即刻釋放制劑實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，可以將本文所述的固體劑型配制成腸溶衣延緩釋放口服劑型，即，如本文所述使用腸溶衣影響胃腸道的小腸中的釋放的藥物組合物的口服劑型。腸溶衣劑型可以為壓制或模制或擠壓片/塑模(包衣或未包衣的)，它們包含活性組分和/或其它組合物成分的粒劑，粉末，丸粒，珠或顆粒，其自身為包衣或未包衣的。腸溶衣口服劑型還可以為膠嚢(包衣或未包衣的)，它們包含固體載體或組合物的丸粒，珠或顆粒，其自身為包衣或未包衣的。在其它實(shí)施方案中，使用搏動(dòng)劑型遞送本文所述的組合物。搏動(dòng)劑型能夠在受控的延滯時(shí)間后或在具體部位上提供一種或多種即刻釋放脈沖。可以使用本領(lǐng)域中公知的各種搏動(dòng)制劑給予搏動(dòng)劑型。例如，這類制劑包括，但不限于美國(guó)專利US5,011,692,5,017,381,5,229,135和5,840,329中所述的那些，特別將這些文獻(xiàn)各自引入作為參考。適用于本發(fā)明制劑的其它搏動(dòng)釋放劑型包括，但不限于，例如，美國(guó)專利US4，871，549,5，260，068，5,260,069，5,508,040，5,567,441和5,837,284，特別將所有這些文獻(xiàn)引入作為參考?？蒯屜到y(tǒng)的許多其它類型為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且適用于本文所述的制劑。這類遞送系統(tǒng)的實(shí)例包括，例如基于聚合物的系統(tǒng)，諸如聚乳酸和聚乙醇酸，聚酸酐類和聚已內(nèi)酯；多孔基質(zhì)，為脂質(zhì)的基于非聚合物的系統(tǒng)，包括固醇類，諸如膽固醇，膽固醇酯類和脂肪酸或中性脂肪，諸如甘油一酯類，甘油二酯類和甘油三酯類；水凝膠釋放系統(tǒng)；硅橡膠系統(tǒng)；基于肽的系統(tǒng)；蠟包衣材料，生物蝕解的劑型，使用常用粘合劑的壓制片等。例如，參見Liberman等，PharmaceuticalDosageForms,2Ed.,Vol,1,pp.209-214(1990》Singh等,EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology,2ndEd.，pp.751-753(2002);美國(guó)專利US4,327,725，4,624，848，4,968,509，5,461,140，5,456,923,5,516,527，5,622,721，5,686,105，5,700,410,5,977,175，6，465，014和6,932,983,特別將這些文獻(xiàn)各自引入作為參考。在某些實(shí)施方案中，提供了藥物制劑，它們包括本文所述的組合物顆粒和用于對(duì)受治療者給藥的至少一種分散劑或懸浮劑。這些制劑可以為用于混懸和在與水混合時(shí)獲得基本上均勻混懸液的粉末和/或顆粒。本文所述的含水混懸液和分散液可以4呆持如TheUSPPharmacists'Pharmacopeia(2005edition,chapter905)中定義的均勻狀態(tài)至少4小時(shí)。這種均勻性應(yīng)通過(guò)與有關(guān)測(cè)定組合物整體均勻性一致的試驗(yàn)方法測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)持續(xù)物理攪拌少于1分鐘將含水混懸液重新懸浮成均勻混懸液中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)持續(xù)物理攪拌少于45秒將含水緩沖液重新懸浮成均勻混懸液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)持續(xù)物理攪拌少于30秒將含水緩沖液重新懸浮成均勻混懸液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不需要攪拌就可以維持均勻含水混懸液。用于本文所述的含水混懸液或分散液的合適的粘度促進(jìn)劑包括，但不限于甲基纖維素，黃原膠，羧曱基纖維，羥丙基纖維素，羥丙基曱基纖維素，PlasdonS-630,卡波姆，聚乙烯醇，藻酸鹽，阿拉伯膠，脫乙酰殼多糖及其組合。粘度促進(jìn)劑的濃度取決于選擇的試劑和所需的粘度。除上述添加劑外，液體制劑還可以包括本領(lǐng)域中常用的惰性稀釋劑，諸如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑。典型的乳化劑為乙醇，異丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，千醇，苯曱酸千酯，丙二醇，1,3-丁二醇，二曱基曱酰胺，十二烷基硫酸鈉，多庫(kù)酯鈉(sodiumdoccusate),膽固醇，膽固醇酯類，?；悄懰?，磷脂酰膽堿(phosphotidylcholine),油，諸如棉子油，落花生油，玉米胚油，橄欖油，蓖麻油和芝麻油，甘油，四氫化糠醇，聚乙二醇類，脫水山梨糖醇脂肪酸酯類或這些物質(zhì)的混合物等?？梢岳斫庠谟糜诒疚乃龅暮稚⒁夯蚧鞈乙旱纳鲜鎏砑觿┲g存何幾種不同功能。因此，應(yīng)將上述添加劑僅視為包括在本文所述的制劑中的添加劑類型中的典型，而非限制性的。這類添加劑的用量易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所需的具體特性確定。鼻內(nèi)用制劑鼻內(nèi)用制劑為本領(lǐng)域中公知的并且描述在，例如，美國(guó)專利US4,476,116，5,116,817和6,391,452中，特別將這些文獻(xiàn)各自引入作為參考?？梢詫凑者@些和其它本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)制備制劑，制成在鹽水中的溶液，其中使用本領(lǐng)域中公知的節(jié)醇或其它合適的防腐劑，氟烴類和/或其它增溶劑或分散劑。例如，參見Ansel，H.C.等，PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,SixthEd.(1995)?？梢允褂煤线m的無(wú)毒性藥學(xué)上可接受的組分制備這些組合物和制劑。這些組分為制備鼻用劑型技術(shù)人員公知的并且它們中的某些可以在本領(lǐng)域中的普通教科書REMINGTON:THESCIENCE和PRACTICEOFPHARMACY,21stedition,2005中找到。對(duì)合適的載體的選擇高度依賴于所需鼻用劑型的確切性質(zhì)，例如溶液，混懸液，軟膏劑或凝膠。鼻用劑型一般包含大量水與活性組分。還可以存在少量其它組分，諸如pH調(diào)節(jié)劑，乳化劑或分散劑，防腐劑，表面活性劑，膠凝劑或緩)卞劑和其它穩(wěn)定劑和增溶劑。為了通過(guò)吸入給藥，本文所述的組合物可以為氣溶膠，煙霧劑或粉末的形式。便利地以使用合適的拋射劑的氣霧劑形式從加壓藥包或噴霧器中遞送本文所述的藥物組合物，所述的拋射劑，例如二氯二氟曱烷，三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合適的氣體。就加壓氣霧劑而言，可以通過(guò)安裝遞送計(jì)量量的閥測(cè)定劑量單位。可以配制包含本文所述的AM制品和純化的組合物和合適的粉末基質(zhì)，諸如乳糖或淀粉的粉末混合物的用于吸入器或吹入器的膠囊和藥筒，諸如，僅作為實(shí)施例。其它制劑還可以將本文所述的AM制品和純化的組合物配制成直腸用組合物，諸如灌腸劑，直腸凝膠，直腸泡沫，直腸氣溶膠，栓劑，膠凍栓劑或保留灌腸劑，它們包含常用栓劑基質(zhì)，諸如可可脂或其它甘油酯類以及合成聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷S同，PEG等。在組合物的栓劑劑型中，首先熔化低熔點(diǎn)蠟，諸如，但不限于脂肪酸甘油酯類，任選與可可脂的組合的混合物。給藥方法和治療方案可以通過(guò)任何合適的技術(shù)給予組合物。一般而言，將組合物直接給藥至耙點(diǎn)(例如眼表面，皮膚)。將制劑給藥至眼表面為本領(lǐng)域眾所周知的。如果需要將AM制品遞送至皮膚，那么可以使用局部給藥。還關(guān)注可注射組合物。給藥還可以為非腸道的(例如皮下)。在化妝品和藥物應(yīng)用中的其它遞送方法，例如脂質(zhì)體遞送，從浸漬了組合物的裝置中擴(kuò)散和基于微乳劑的透皮遞送為本領(lǐng)域中公知的?？梢詾轭A(yù)防和/或治療給藥包含本文所述的AM制品和純化的組合物的組合物。在治療應(yīng)用中，將組合物以足以治愈或至少部分阻止疾病或疾患癥狀的用量給予已經(jīng)患病或疾患的患者。用于這一應(yīng)用的有效量依賴于疾病或疾患的嚴(yán)重性和病程，在先的療法，患者的健康狀況，體重和對(duì)藥物的反應(yīng)以及治療的臨床醫(yī)師的判斷。在本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍內(nèi)可以充分考慮到通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)(包括，但不限于劑量按比例上升臨床試驗(yàn))測(cè)定這類治療有效量。在預(yù)防應(yīng)用中，將包含本文所述的AM制品和純化的組合物的組合物給予易感，或者處于特定疾病，病癥或疾患風(fēng)險(xiǎn)中的患者。將這類用量定義為"預(yù)防有效量或劑量"。在這種應(yīng)用中確切量也依賴于患者的健康狀況，體重等。在本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍內(nèi)可以充分考慮到通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)(包括，但不限于劑量按比例上升臨床試驗(yàn))測(cè)定這類預(yù)防有效量。當(dāng)用于患者時(shí)，這一應(yīng)用的有效量依賴于疾病，病癥或疾患的嚴(yán)重性和過(guò)程，在先的療法，患者的健康狀況，體重和對(duì)藥物的反應(yīng)以及治療的臨床醫(yī)師的判斷。就患者疾患未改善的情況而言，在醫(yī)生判定時(shí)，可以長(zhǎng)期給予所述化合物，即延長(zhǎng)時(shí)間期限，包括在患者整個(gè)生命期過(guò)程中，以便改善，或者控制或限制患者疾病或疾患的癥狀。就患者疾患確實(shí)改善的情況而言，在醫(yī)生判定時(shí)，可以連續(xù)給予所述化合物；可選擇地，可以暫時(shí)減少給藥劑量或暫停一定時(shí)間期限(即"休藥期")。休藥期的長(zhǎng)度可以在2天-1年之間改變，包括2天，3天，4天，5天，6天，7天，10天，12天，15天，20天，28天，35天，50天，70天，100天，120天，150天，180天，200天，250天，280天，300天，320天，350天或365天，僅作為實(shí)例。在^f木藥期過(guò)程中的劑量減少可以為10%-100%，包括10%,15%,20%，25%，30%,35%,40%,45%，50%,55%，60%，65%,70%，75%,80%，85%，90%，95%或100%,《又作為實(shí)例。一旦患者的病情已經(jīng)發(fā)生改善，如果必要，就給予維持劑量。隨后可以將作為癥狀函數(shù)的給藥劑量或頻率或它們兩者降至保持疾病，步驟或疾患改善的水平。然而，患者可能需要在任何癥狀復(fù)發(fā)時(shí)基于長(zhǎng)期的間歇療法。相當(dāng)于這類用量的指定活性劑的用量根據(jù)如下因素的而改變諸如特定的化合物，疾病或疾患及其嚴(yán)重性，需要治療的受治療者或宿主的鑒定(例如體重)，然而可以通過(guò)本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方式，按照圍繞該情況的特定環(huán)境確定，包括，例如給予的具體活性劑，給藥途徑，所治療疾病，和所治療的受治療者或宿主。然而，一般而言，用于成年人治療的劑量一般在0.02-5000mg/天，優(yōu)選1-1500mg/天?？梢詫⑺鑴┝勘憷刂瞥蓡蝿┝炕蜃鳛橥瑫r(shí)給予的分次劑量(或在短期內(nèi))或在適當(dāng)間隔，例如作為2，3,4或4次以上亞-劑量/天。本文所述的藥物組合物可以為適合于確切劑量單一給藥的單位劑型。在單位劑型中，將制劑分成包含適量的一種或多種化合物的單位劑量。該單位劑量可以為包含單一量制劑的包裝形式。非限制性實(shí)例為在小瓶或安瓿中包裝的片劑或膠嚢和粉末?？梢詫⒑畱腋∫航M合物包裝在單劑量不能再封閉的容器中。可選擇地，可以使用多劑量可再封閉的容器，在這種情況中，一般在組合物中包括防腐劑。僅作為實(shí)例，可以將用于非腸道注射的制劑制成單位劑型，包括，但不限于添加了防腐劑的安瓿或在多劑量容器中。適合于本文所述的AM制品和純化的組合物的每日劑量為約0.01-2.5mg/kg/體重。較大哺乳動(dòng)物，包括，但不限于人的所示每日劑量為約0.5mg-約100mg,便利地以分次劑量給予，包括，但不限于最多每天4次或以延長(zhǎng)釋放劑型給予。用于口服給藥的合適的單位劑型包括約1-50mg活性組分。上述范圍僅為推薦性的，因?yàn)橛嘘P(guān)個(gè)體治療方案方面的變量數(shù)^f艮大并且非常遠(yuǎn)離這些推薦值并非不常用。可以根據(jù)許多變量的不同改變這類劑量，但不限于所用化合物的活性，所治療的疾病或疾患，給藥方式，個(gè)體受治療者的需要，所治療疾病或疾患的嚴(yán)重性和從業(yè)醫(yī)師的判斷。可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥物方法測(cè)定這類治療方案的毒性和治療功效，包括，但不限于LD50(致50%群體死亡的劑量)和ED50(在50%群體中治療有效的劑量)的測(cè)定。毒性與治療作用之間的劑量比為治療指數(shù)并且可以將其表示為L(zhǎng)D50與ED50之比。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的化合物。獲自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可以用于確定用于人的劑量范圍。這類化合物的劑量?jī)?yōu)選在包括具有最低毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍。該劑量可以根據(jù)所用劑型和所用給藥途徑的不同在這一范圍內(nèi)改變。聯(lián)合療法本文所述的組合物和方法還可以與針對(duì)所治療的疾患選擇的特別有用的其它眾所周知的治療試聯(lián)用。一般而言，本文所述的組合物，且在使用聯(lián)合療法的實(shí)施方案中，不必將其它活性劑在同一藥物組合物中給予，并且因?yàn)椴煌奈锢砗突瘜W(xué)特性而必須通過(guò)不同途經(jīng)給予。如果可能，給藥方式和在同一藥物組合物中給藥的合理性的確定完全在有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)師的知識(shí)范圍內(nèi)。最初的給藥可以根據(jù)本領(lǐng)域中公知的確定方案進(jìn)行，且然后基于觀察到的作用，有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)師可以改變給藥劑量，方式和次數(shù)。所用化合物的具體選擇依賴于主治醫(yī)師的診斷及其病情的判斷和適當(dāng)?shù)闹委煼桨??？梢酝瑫r(shí)(例如同時(shí)，基本上同時(shí)或在相同治療方案內(nèi))或依次給予所述化合物，這取決于疾病，病癥或疾患的性質(zhì)，患者的病情和所用化合物的實(shí)際選擇。在治療方案中每種治療劑的給藥順序和給藥的重復(fù)次數(shù)的確定完全在有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)師在評(píng)價(jià)所治療的疾病和患者病情后的知識(shí)范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知治療有效劑量可以在將藥物用于聯(lián)合治療時(shí)改變。以實(shí)驗(yàn)方式測(cè)定用于聯(lián)合治療方案的藥物和其它活性劑的治療有效劑量的方法描述在文獻(xiàn)中。例如，文獻(xiàn)中已經(jīng)廣泛描述了節(jié)拍器給藥的應(yīng)用，即提供更頻繁的較低劑量，以便將毒性副作用降至最低限度。聯(lián)合療法還包括在不同時(shí)間開始和終止的定期治療以便有助于對(duì)患者的臨床控制。就本文所述的聯(lián)合療法而言，共同給予的化合物的劑量當(dāng)然根據(jù)共同使用的藥物類型，所用的具體藥物，所治療的疾病或疾患的等的不同而改變。此外，當(dāng)與一種或多種生物活性劑共同給藥時(shí)，可以與該生物活性劑同時(shí)或依次給予本文提供的化合物。如果依次給藥，那么主治醫(yī)師會(huì)決定按照適當(dāng)?shù)捻樞蚪o予蛋白質(zhì)與生物活性劑。在任何情況下，可以以任何順序乃至同時(shí)給予多種治療劑。如果同時(shí)進(jìn)行，那么可以將多種治療劑以同一標(biāo)準(zhǔn)劑型或多種劑型(僅作為實(shí)例，如單一丸劑或兩種單獨(dú)的丸劑)給藥?？梢砸远鄤┝拷o予治療劑之一或可以將兩者均以多劑量給藥。如果不同時(shí)進(jìn)行，那么多劑量之間的時(shí)限可以在大于0周到小于4周以內(nèi)之間改變。此外，聯(lián)合方法，組合物和制劑并不限于僅應(yīng)用兩種活性劑；還關(guān)注多種治療組合的應(yīng)用。應(yīng)理解治療，預(yù)防或改善尋找緩解的疾患的劑量方案可以根據(jù)各種因素的不同而改變。這些因素包括受治療者患有的病癥以及受治療者的年齡，體重，性別，膳食和醫(yī)療條件。因此，實(shí)際所用的劑量方案可以廣泛改變且由此可以從本文列出的劑量方案中得到。構(gòu)成本文披露的聯(lián)合療法的藥物活性劑可以為指定用于基本上同時(shí)給藥的組合劑型或單獨(dú)劑型。還可以通過(guò)稱作兩步給藥方案將構(gòu)成聯(lián)合療法的藥物活性劑與給予的化合物中依次給予。兩步給藥方案要求依次給予活性劑或間隔給予單獨(dú)的活性劑。多種給藥步驟之間的時(shí)間期限可以在幾分鐘到幾小時(shí)，這取決于每種藥物活性劑的特性，諸如藥物活性劑的功效，溶解度，生物利用度，血漿半衰期和動(dòng)力學(xué)特性。靶分子濃度的生理節(jié)律變化也可以決定最佳劑量間隔。此外，本文所述的AM制品和純化的組合物還可以與可以對(duì)患者提供另外或協(xié)同有益性的方法組合。僅作為實(shí)例，預(yù)計(jì)患者發(fā)現(xiàn)本文所述方法中的治療和/或預(yù)防有益性，其中將本文披露的化合物的藥物組合物和/或與其它治療劑的組合藥物與遺傳測(cè)試聯(lián)用以便確定個(gè)體是否為已知與某些疾病或疾患相關(guān)的突變基因攜帶者?？梢栽诩膊』蚣不及l(fā)生前，過(guò)程中或之后給予本文所述的AM制品和純化的組合物和進(jìn)行聯(lián)合療法，并且包含化合物的組合物的定時(shí)給藥可以改變。因此，例如，可以將化合物用作預(yù)防劑并且可以對(duì)具有發(fā)生疾患或疾病傾向的受治療者連續(xù)給藥，以便預(yù)防疾病或疾患的發(fā)生?？梢栽诎Y狀發(fā)作過(guò)程中或之后盡可能快速地給予化合物和組合物?？梢栽诎Y狀發(fā)作最初48小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選在癥狀發(fā)作最初48小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選在癥狀發(fā)作最初6小時(shí)內(nèi)，且最優(yōu)選在癥狀發(fā)作最初3小時(shí)內(nèi)開始給予化合物。最初給藥可以通過(guò)任何途徑實(shí)施，諸如，例如，靜脈內(nèi)注射，快速濃柱，在5分鐘-約5小時(shí)內(nèi)輸注，丸劑，膠嚢，透皮貼劑，口含遞送等，或其組合。優(yōu)選一:s^險(xiǎn)測(cè)到或懷疑疾病或疾患后就實(shí)施給藥并且持續(xù)治療疾病所必需的時(shí)間期限，諸如，例如，約1個(gè)月-約3個(gè)月。治療期限可以針對(duì)每一受治療者而改變并且可以使用公知標(biāo)準(zhǔn)確定期限。例如，可以將化合物或包含化合物的制劑給予至少2周，優(yōu)選約1個(gè)月-約5年，且更優(yōu)選約1個(gè)月-約3年。試劑盒/制品為了用于本文所述的治療應(yīng)用，本文還描述了試劑盒和制品。這類試劑盒可以包括載體，包裝或分隔以便容納一個(gè)或多個(gè)諸如小瓶、管等的容器的貯存器，容器各自包含用于本文所述方法的各成分之一。合適的容器包括，例如，瓶，小瓶，注射器和試管。容器可以由各種材料，諸如玻璃或塑料構(gòu)成。這里提供的制品包含包裝材料。用于包裝藥物產(chǎn)品的包裝材料為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，參見美國(guó)專利US5,323,907，5,052,558和5,033,252。藥物包裝材料的實(shí)例包括，但不限于泡罩包，瓶，管，吸入器，泵，袋，小瓶，容器，注射器，瓶和適合于選擇的制劑和指定給藥和治療方式的任何包裝材料。關(guān)注作為治療任何疾病，病癥或疾患的各種治療方法的這里提供的化合物和組合物的各類制劑。例如，容器可以包括本文所述的一種或多種AM制品和純化的組合物，任選在組合物中或與如本文披露的與另一種活性劑組合藥物中。容器任選具有無(wú)菌入口(例如，容器可以為靜脈內(nèi)溶液袋或帶有皮下注射針頭可插入的塞的小瓶)。這類試劑盒任選包含化合物與鑒定說(shuō)明書或標(biāo)記或涉及在本文所述方法中的應(yīng)用的說(shuō)明書。試劑盒一般可以包括一種或多種另外的容器，它們各自具有從本文所述的AM制品和純化的組合物的商品和使用者觀點(diǎn)來(lái)看需要的各種物質(zhì)中的一種或多種(諸如試劑，任選濃縮形式，和/或裝置)。這類物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括，但不限于緩沖劑，稀釋劑，過(guò)濾劑，針頭，注射器；載體，包裝，容器，小瓶和/或管，列出內(nèi)含物和/或使用說(shuō)明書的標(biāo)簽和具有使用說(shuō)明的包裝插頁(yè)。一般還包括一組說(shuō)明書。標(biāo)簽可以位于容器上或貼在其上。標(biāo)簽可以位于容器上，此時(shí)構(gòu)成標(biāo)簽的字母，數(shù)字或其它符號(hào)貼在，模塑在或蝕刻在容器自身上；標(biāo)簽可以貼在容器上，此時(shí)它存在于也容納容器的貯存器或載體內(nèi)，例如為包裝插頁(yè)。標(biāo)簽可以用于指示用于具體治療應(yīng)用的內(nèi)含物。標(biāo)簽還可以指示內(nèi)含物在諸如本文所述方法中的使用指導(dǎo)原則。在某些實(shí)施方案中，可以將藥物組合物制成藥包或配藥器，它們可以包含一種或多種包含本文提供的化合物的單位劑型。例如，藥包可以包含金屬或塑料箔，諸如泡罩包。藥包或配藥器中可以附帶有給藥說(shuō)明書。藥包或配藥器中還可以附帶有貼在容器上的由管理部門開據(jù)形式的注意事項(xiàng)，它涉及藥物的生產(chǎn)，使用或銷售，該注意事項(xiàng)反映出用于人或獸給藥的藥物形式得到管理部門批準(zhǔn)。例如，這類注意事項(xiàng)可以為美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局(U.S.FoodandDrugAdministration)批準(zhǔn)的有關(guān)處方藥的標(biāo)簽或批準(zhǔn)的產(chǎn)品插頁(yè)。還可以制備包含在相容性藥用載體中配制的本文提供的化合物的組合物，將其放入適當(dāng)?shù)娜萜鞑⑶覙?biāo)記用于治療所示的疾患。治療方法本文所述的AM制品和純化的組合物具有許多用途，包括研究和臨床應(yīng)用?；诒疚乃龅慕Y(jié)果，可以將本文所述的AM制品和純化的組合物施用于組織或細(xì)胞，以便獲得所需的生理學(xué)調(diào)節(jié)?？梢詫⒈疚乃龅腁M制品和純化的組合物進(jìn)一步加入到細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物中以便獲得所需作用(如本文所述)。本文所述的AM制品和純化的組合物抑制TGF啟動(dòng)子活性本文所述的AM制品和純化的組合物的抗瘢痕形成，抗炎和抗血管形成活性通過(guò)如本文所述抑制TGF-pl啟動(dòng)子活性得以證實(shí)。冷凍羊膜的胎部分具有顯著高于新鮮羊膜的抗瘢痕形成作用；冷凍羊膜的胎盤部分也具有顯著高于新鮮羊膜的抗瘢痕形成作用(實(shí)施例1)。因此，冷凍AM，無(wú)論是胎盤還是胎部分均顯示比新鮮AM更有效的在TGF-P中的抑制作用。獲自冷凍AM的總AM提取物介導(dǎo)的這種抑制作用在0.4-125pg/ml范圍內(nèi)為劑量依賴性的。此外，這類抑制作用不能被單獨(dú)的高M(jìn)WHA取代(超過(guò)IOOX等量AM提取物)并且在用透明質(zhì)酸酶消化后消失，認(rèn)為它由HA-Ial的復(fù)合物介導(dǎo)。以低速或高速離心不會(huì)顯著影響這一抑制作用。然而，隨后的凍干和再溶解產(chǎn)生了更有效的抑制作用。另外，對(duì)AM的總抑制作用比AM膠凍更有效。TGF-卩為涉及組織炎癥以及傷口愈合和瘢痕形成的原型細(xì)胞因子。參見Border等，J.Clin.Invest.,卯:1-7(1992);Grande,Pro"Soc.Exp.Biol.Med.，214:27-40(1997);Jester等，Prog.Retin.EyeRes.,18(3):311-356(1999);和Marek等，Med.Sci.Monit.，8(7):RA145陽(yáng)151(2002)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)三種不同的TGF-(3s:TGF-P1,TGF-J32和TGF-|33。TGF-P為最有效的促進(jìn)成肌纖維細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，通過(guò)增量調(diào)節(jié)許多細(xì)胞類型，包括成纖維細(xì)胞中a-SMA，整聯(lián)蛋白a5(31和包含EDA結(jié)構(gòu)域的纖連蛋白(Fn)的表達(dá)來(lái)進(jìn)行。參見Tseng等，OcularSurfaceJ.，2(3):177-187(2004);Ronnov-Jessen等，Lab.Invest.,68:696-707(1993);Verbeek等，Am.J.Pathol.，144:372-82(1994);Hales等,Curr.EyeRes.,13:885-90(1994);Jester等，Comea,15:505-16(19%);Serini等，J.Cell.Biol.，142:873-81(1998);Grande,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,214(1):27-40(1997);和Jester等，Prog.Retin.Eye.Res.，18:311陽(yáng)56(1999)。TGF-P也增量調(diào)節(jié)諸如膠原蛋白和蛋白聚糖類這類基質(zhì)成分的表達(dá)，減量調(diào)節(jié)蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶并且增量調(diào)節(jié)其抑制劑。這些作用共同導(dǎo)致細(xì)胞-基質(zhì)相互作用和粘著性增加以及瘢痕組織沉積和形成。參見Tseng等，OcularSurfaceJ.,2(3):177-187(2004);Grande,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，214(1):27-40(1997);Jester等，Prog.Retin.Eye.Res.，18:311陽(yáng)56(1999);和Lawrence,Eur.CytokineNetw.，7:363-74(1996)。TGF-(3s通過(guò)結(jié)合細(xì)胞膜上的TGF-|3受體(TGF-(3Rs)發(fā)揮其作用。在人細(xì)胞中，存在三種TGF畫(3Rs，即TGF-卩RI型(TGF-卩RI)，II型(TGF畫(3RII)和III型(TGF-卩RIII)。用作配體的TGF-卩s結(jié)合絲氨酸，TGF-卩RI和TGF-卩RII構(gòu)成的蘇氨酸激酶受體復(fù)合物；這類結(jié)合得到非絲氨酸，蘇氨酸激酶受體的TGF-pRIII促進(jìn)。參見Tseng等，OcularSurfaceJ.，2(3):177-187(2004);和Massague等，Genes和Development.，14:627-44(2000)。結(jié)合TGF陽(yáng)卩RII活化了TGF-(3RI,導(dǎo)致稱作Smads的效應(yīng)物家族直接磷酸化，所述的效應(yīng)物調(diào)節(jié)許多參與瘢痕形成的靶基因轉(zhuǎn)錄，包括本文所述的那些。參見Tseng等，OcularSurfaceJ.，2(3):177-187(2004);Massague等，GenesandDevelopment.，14:627-44(2000);和Derynck等，Biochem.Biophys.Acta.,1333:F105-F150(1997)?？梢酝ㄟ^(guò)中和針對(duì)TGF-P的抗體和調(diào)解TGF-P介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的試劑，諸如核心蛋白聚糖來(lái)抑制TGF-P。參見Shahi等，Lancet,339:213-214(1992);Petroll等，Curr.EyeRes.，1739:736-747(1998);Yamaguchi等，Nature,346(6281):281-284(1990);和Logan等,Exp.Neurol.，159:504-510(1999)。大部分文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)抑制TGF-P在調(diào)節(jié)TGF-|3活化，結(jié)合其受體或其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平上得以實(shí)現(xiàn)。已經(jīng)證實(shí)羊膜可以在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)這類抑制，即切斷TGF-p基因轉(zhuǎn)錄。特別地，已經(jīng)證實(shí)羊膜抑制人角膜和緣成纖維細(xì)胞和人結(jié)膜和翼狀胬肉體成纖維細(xì)胞中的TGF-p信號(hào)傳導(dǎo)。參見Tseng等，JCellPhysiol.，179:325-335(1999);和Lee等,Curr,EyeRes.，20(4):325-334(2000)。本文所述的AM制品和純化的組合物的應(yīng)用可以用于降低TGF-J3產(chǎn)生或活性。如實(shí)施例1中詳細(xì)描述的制備幾種類型的AM組合物，諸如AME(總?cè)薃M提取物)，離心后的AME上清液，AM膠凍和AM基質(zhì)。檢驗(yàn)了各種緩沖液，諸如PBS,低鹽緩沖液，高鹽緩沖液和胍HCl對(duì)TGF-(3活性的作用。另外，檢驗(yàn)了各種冷凍-研磨方法對(duì)TGF-卩活性的作用。透明質(zhì)酸酶消化后失去了對(duì)TGF-卩活性的抑制，從而表明這種抑制作用可以由HA-相關(guān)復(fù)合物介導(dǎo)(圖3)。通過(guò)添加HA無(wú)法恢復(fù)這種抑制作用。離心步驟無(wú)法改變對(duì)TGF-p活性的抑制，無(wú)論是在AME還是在AM膠凍提取物中(圖5)。凍干增強(qiáng)了AME和膠凍提取物對(duì)TGF-P活性的抑制(圖6)。圖8和圖9表明膠原蛋白和HA在加入到AME中時(shí)可以增強(qiáng)對(duì)TGF-P活性51的抑制。因此，將膠原蛋白和HA添加到基于AM的組合物中可以用于治療涉及TGF-(3的各種疾病。正如本文說(shuō)明的，用披露的組合物減量調(diào)節(jié)TGF-P。因此，本文所述的組合物可以用于治療涉及TGF-I3減量調(diào)節(jié)的各種疾病，諸如血管發(fā)生，傷口愈合和組織炎癥。本文所述的AM制品和純化的組合物可以預(yù)防細(xì)胞凋亡本文所述的AM制品和純化的組合物可以用于預(yù)防，減少或治療組織中的細(xì)胞凋亡。在某些實(shí)施方案中，本文所述的AM制品和純化的組合物可以減少或預(yù)防已經(jīng)受損組織中的細(xì)胞凋亡。這種抗-細(xì)胞凋亡作用表明這些組合物可以用于延長(zhǎng)植入前保存的器官壽命。這些組合物還可以用于治療或預(yù)防外科手術(shù)過(guò)程中和之后的損害。實(shí)施例3使用眼損害的鼠模型證實(shí)了AM提取物的抗-細(xì)胞凋亡作用。采集小鼠眼并且通過(guò)酶處理或機(jī)械損傷造成損害，給予AM提取物并且使用測(cè)量對(duì)核的細(xì)胞凋亡損害的測(cè)定法測(cè)定對(duì)細(xì)胞損害的作用。發(fā)現(xiàn)與AM提取物培養(yǎng)可降低細(xì)胞凋亡水平。由于AM制品發(fā)揮抗-細(xì)胞凋亡作用，所以預(yù)計(jì)AM制品和組合物用于保護(hù)植入前的組織(例如角膜)。將AM制品添加到保存的組織中可以有助于減輕因保存過(guò)程產(chǎn)生的細(xì)胞損害。例如，本文所述的AM制品和純化的組合物可以用于降低植入或外科手術(shù)前保存的組織中發(fā)生的降解量。可以將本文所述的AM制品和純化的組合物與或不與膠原蛋白和/或HA加入到保存介質(zhì)中。保存的組織，諸如眼，器官，皮膚等可以得益于加入AM組合物時(shí)發(fā)生的細(xì)胞凋亡減少。一旦采集到了供體組織，一般就將其保存在儲(chǔ)藏介質(zhì)中，直到植入時(shí)為止。可以將所述組合物加入到保存介質(zhì)中以防止細(xì)胞凋亡。例如，可以將組合物加入到保存介質(zhì)中以保護(hù)緣上皮干細(xì)胞。類似地，可以將包含AM制品的組合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)基或消化培養(yǎng)基中以防止細(xì)胞(例如角膜細(xì)胞)凋亡。因?yàn)楸疚乃龅难芯孔C實(shí)在分散酶消化過(guò)程中培養(yǎng)AM制品(分別模擬手術(shù)和病理學(xué)損傷的處理，諸如在PRK和復(fù)發(fā)性角膜糜爛中的受激子消融)顯著減少了上皮細(xì)胞和角膜細(xì)胞凋亡，還可以將這些組合物給予接受機(jī)械刮術(shù)或準(zhǔn)分子激光光揮發(fā)術(shù)的眼，以嘗試減少角膜細(xì)胞凋亡和由此減輕角膜混濁。作為另一個(gè)實(shí)例，還可以將包含AM制品的組合物用于手術(shù)疾患或疾病，諸如復(fù)發(fā)性角膜糜爛或基膜溶解的圓錐形角膜，以便減少角膜細(xì)胞凋亡。本文所述的AM制品和純化的組合物可以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)瘢痕形成和可以用于輔助傷口愈合在成年人和其它哺乳脊推動(dòng)物中，組織，諸如皮膚中的傷口愈合一般為修補(bǔ)性過(guò)程，與在胎和胚胎組織愈合中發(fā)生的再生過(guò)程相反。傷口修復(fù)過(guò)程的結(jié)果似乎受許多不同因素的影響，包括內(nèi)在參數(shù)，例如組織氧合；和外在參數(shù)，例如傷口敷料。然而，存在大量證據(jù)證實(shí)在成年人和其它哺乳動(dòng)物中，傷口損害組織的愈合和修復(fù)的總過(guò)程，包括必須的細(xì)胞通訊以協(xié)調(diào)的方式受到大量特異性可溶性生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)，它們?cè)趥诃h(huán)境內(nèi)釋放并且其中似乎誘導(dǎo)新生血管形成，白細(xì)胞趨化性，成纖維細(xì)胞增殖，遷移和膠原蛋白和其它胞外基質(zhì)分子在傷口內(nèi)沉積。這類已經(jīng)得到鑒定和分離的生長(zhǎng)因子一般為專用可溶性蛋白或多肽類，并且包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a(TGF-a),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(3(TGF-卩1，TGF-卩2，TGF-卩3等)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF),表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II(IGFI和IGFII)和酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子C酸性FGF和堿性FGF)。成肌纖維細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞之間的表型中間體。成肌纖維細(xì)胞在大部分器官和組織中的形態(tài)發(fā)生和癌發(fā)生，炎癥，傷口愈合和纖維化中起重要作用。在正常傷口愈合過(guò)程中，成纖維細(xì)胞遷移至傷口區(qū)域并且在生長(zhǎng)因子，諸如TGF-pi影響和在指定組織中發(fā)生的機(jī)械應(yīng)力下分化成成肌纖維細(xì)胞。一般而言，成肌纖維細(xì)胞因消退期中細(xì)胞凋亡而逐步消失。然而，在某些病理學(xué)情況下，成肌纖維細(xì)胞持續(xù)和連續(xù)重塑胞外基質(zhì)，從而導(dǎo)致瘢痕形成。因此，控制成肌纖維細(xì)胞分化的能力可以用于預(yù)防傷口愈合過(guò)程中的各種組織的瘢痕形成。本文所述的AM制品和純化的組合物能夠預(yù)防和逆轉(zhuǎn)瘢痕形成并且由此可以用于治療可能發(fā)生瘢痕形成的任何疾病。在某些實(shí)施方案中，本文所述的AM制品和純化的組合物可以減少或預(yù)防瘢痕組織形成。這種作用在實(shí)施例4中得以證實(shí)。在塑料，膠原蛋白或AM組織表面材料上培養(yǎng)AMSCs。在塑料上培養(yǎng)的AMSC在體外快速分化成成肌纖維細(xì)胞。然而，這些分化的成肌纖維細(xì)胞在AM基質(zhì)上傳代培養(yǎng)時(shí)可以逆轉(zhuǎn)為AMSCs(圖23)。在將羊膜基質(zhì)提取物加入到分化的成肌纖維細(xì)胞中時(shí)也可以觀察到成肌纖維細(xì)胞分化的逆轉(zhuǎn)(圖25)。此外，還發(fā)現(xiàn)AM基質(zhì)提取物預(yù)防AMSCs的成肌纖維細(xì)胞分化(圖26)。因此，本文所述的AM制品和純化的組合物可以用于預(yù)防或逆轉(zhuǎn)由任何方式導(dǎo)致的瘢痕形成。可以給予這些組合物以便治療鈹紋，牽張痕，手術(shù)疾痕，傷口疤痕，因燒傷或枳4戎損傷產(chǎn)生的疤痕等。本文所述的AM制品和純化的組合物可以用于治療或預(yù)防因傷口導(dǎo)致的瘢痕形成。傷口為因諸如機(jī)械這類物理方式，化學(xué)，病毒，細(xì)菌，真菌和其它病原生物體或熱方式導(dǎo)致的體內(nèi)和體外損傷或損害，它們可破壞組織結(jié)構(gòu)的正常連續(xù)性。傷口可以因意外傷害，手術(shù)，致病生物體或外科手術(shù)導(dǎo)致。另外，本文所述的AM制品和純化的組合物可以抑制成纖維細(xì)胞遷移。正如實(shí)施例5和圖27-29中所示，發(fā)現(xiàn)AME抑制成纖維細(xì)胞遷移。在補(bǔ)充了AME的SHEM或SHEM中培養(yǎng)人緣外植塊(HLE)以便研究AME的生物活性。AME(在25嗎/ml下)延緩了上皮從緣外植塊向外生長(zhǎng)發(fā)作。AME抑制了外植塊成纖維細(xì)胞從基質(zhì)遷移，導(dǎo)致具有少得多的成纖維細(xì)胞的上皮層向外生長(zhǎng)。此外，在包含AME的SHEM中擴(kuò)充的上皮層具有平滑的邊緣，這是在含有10jliMSB203580-MAPKp38抑制劑的SHEM中培養(yǎng)HLE時(shí)類似的現(xiàn)象。在向外生長(zhǎng)后剩余的外植塊的組織切片顯示如果不使用AME，那么基質(zhì)的溶解就會(huì)顯著增加。因此，AME能夠通過(guò)防止基質(zhì)裂解而抑制成纖維細(xì)胞遷移。這些發(fā)現(xiàn)表明AME可以用于研發(fā)新產(chǎn)品，以便以定向的人角膜干細(xì)胞擴(kuò)充和抗炎癥，瘢痕形成和血管發(fā)生的方式促進(jìn)傷口愈合。本文所述的AM制品和純化的組合物可以在手術(shù)過(guò)程中或之后使用，以便改善愈合并且減少因?qū)M織的機(jī)械損傷導(dǎo)致的組織損害數(shù)量。本文所述的組合物和方法的適當(dāng)應(yīng)用是廣泛的并且包括，但不限于所有類型的手術(shù)，諸如整形，脊髓或剖腹產(chǎn)術(shù)；疾病，諸如癌癥，充血性心力衰竭和腎疾病;和作為燒傷，痤瘡或其它損傷結(jié)果的疾患。臨床醫(yī)師可以在重建或整形手術(shù)中使用本文所述的方法。本文所述的AM制品和純化的組合物還可以局部施用于身體表面或組織以便獲得短期和長(zhǎng)期治療作用。本文所述的AM制品和純化的組合物可以用于治療或預(yù)防因眼病導(dǎo)致的損害?？梢酝ㄟ^(guò)給予本文所述的AM制品和純化的組合物治療的疾病類型包括，但不限于千眼，角膜損傷，角膜潰瘍，斯耶格倫綜合征，因隱形眼鏡導(dǎo)致的損害，真菌感染，病毒感染或細(xì)菌感染，機(jī)械損傷，手術(shù)損傷，燒傷損害，結(jié)膜炎，眼類天皰瘡，斯-約綜合征，化學(xué)損傷等。本文所述的AM制品和純化的組合物還可以用于治療表皮疾病。可以通過(guò)給予本文所述的AM制品和純化的組合物治療的表皮疾病類型包括，但不限于真菌病，病毒病，細(xì)菌病，滲，濕滲，牛皮癬，魚鱗癬，表皮角化過(guò)度等。血管發(fā)生-相關(guān)疾病的治療和預(yù)防如本文所述，使用由超低溫保存的AM的無(wú)血管基質(zhì)制備的可溶性蛋白質(zhì)提取物證實(shí)本文所述的AM制品和純化的組合物的抗生成血管活性。發(fā)現(xiàn)AM基質(zhì)提取物(ASE)通過(guò)抑制增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減弱遷移和抑制管形成對(duì)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)具有有效的抗生成血管作用。實(shí)施例8證實(shí)羊膜基質(zhì)提取物(ASE)具有抗生成血管特性。發(fā)現(xiàn)ASE抑制HUVEC細(xì)胞增殖(圖34)。還發(fā)現(xiàn)ASE誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡(圖35)。使用跨孔試驗(yàn)證實(shí)ASE對(duì)VEGF-誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移的抑制作用(圖37)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ASE抑制HUVEC細(xì)胞的管形成(圖38)。這些結(jié)果共同證實(shí)本文所述的AM制品和純化的組合物可以用于治療血管發(fā)生-相關(guān)疾病?？梢灾委煹牡湫偷难馨l(fā)生-相關(guān)疾病包括，但不限于胂瘤生長(zhǎng)，癌癥和眼科疾患，諸如角膜移植排斥，眼新生血管形成，視網(wǎng)膜新生血管形成，包括損傷或感染后新生血管形成，糖尿病性視網(wǎng)膜病，黃斑變性，晶狀體后的纖維增生癥，新生血管性青光眼，^L網(wǎng)膜缺血，玻璃體出血等。可以使用本文所述的AM制品和純化的組合物治療的典型癌癥類型包括，但不限于急性淋巴細(xì)胞白血病，急性髓細(xì)胞性白血病，腎上腺皮質(zhì)癌，AIDS-相關(guān)癌，AIDS-相關(guān)淋巴瘤，直腸癌，星形細(xì)胞瘤，基底細(xì)胞癌，膽管癌，膀胱癌，膀胱癌，骨癌，腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤，腦瘤，乳腺癌，支氣管腺瘤，伯基特淋巴瘤，類癌腫瘤，癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤，小腦星形細(xì)胞瘤，宮頸癌，慢性淋巴細(xì)胞性白血病，慢性髓性白血病，慢性骨髓增生病，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤，子宮內(nèi)膜癌，室管膜瘤，食管癌，性腺外生殖細(xì)胞瘤，眼癌，眼內(nèi)黑素瘤，眼癌，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，膽嚢癌，胃腸類癌瘤，胃腸基質(zhì)瘤(GIST)，胚細(xì)胞瘤(顱外)，胚細(xì)胞瘤(性腺外)，胚細(xì)胞瘤(卵巢)，妊娠滋養(yǎng)層腫瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，多毛細(xì)胞白血病，頭頸癌，肝細(xì)胞(肝)癌，何杰金淋巴瘤，下咽癌，下丘腦和^L路神經(jīng)膠質(zhì)瘤，眼內(nèi)黑素瘤，胰島細(xì)胞癌(內(nèi)分泌胰腺)，卡波西肉瘤，腎(腎細(xì)胞)癌，喉癌，白血病(急性淋巴細(xì)胞性)，白血病(急性髓細(xì)胞性)，白血病(慢性淋巴細(xì)胞性)，白血病(慢性髓性)，唇和口腔癌，肝癌，肺癌(非小細(xì)胞)，肺癌(小細(xì)胞)，淋巴瘤，(皮膚T-細(xì)胞)，淋巴瘤(非-何杰金)，骨的惡化纖維組織細(xì)胞瘤/骨肉瘤，髓母細(xì)胞瘤，黑素瘤，默克爾細(xì)胞癌，間皮瘤，具有初級(jí)隱藏的轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌，多內(nèi)分泌性腺瘤形成綜合征，多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞腫瘤，蕈樣真菌病，骨髓增生異常綜合征，脊髓發(fā)育不良/骨髓增生疾病，髓細(xì)胞性白血病，髓樣白血病，骨髓增生病癥，鼻腔和鼻旁竇癌，鼻咽癌，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤/骨的骨惡性纖維組織細(xì)胞瘤，卵巢癌，卵巢上皮癌，卵巢生殖細(xì)胞瘤，卵巢低度潛在惡性腫瘤，胰腺癌，曱狀旁腺癌，陰莖癌，嗜鉻細(xì)胞瘤，松果體母細(xì)胞瘤和幕上原始神經(jīng)外胚瘤，垂體瘤，漿細(xì)胞腫瘤/多發(fā)性骨髓瘤，胸膜肺母細(xì)胞瘤，前列腺癌，直腸癌，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，橫紋肌肉瘤，涎腺癌，肉瘤(卡波西)，肉瘤(子宮)，塞澤里綜合征，皮膚癌(非-黑素瘤)，皮膚癌(黑素瘤)，皮膚癌(默克爾細(xì)胞)，小腸癌，軟組織肉瘤，鱗狀細(xì)胞癌，胃(Gastric)癌，T-細(xì)胞淋巴瘤，睪丸癌，胸腺瘤，曱狀腺癌，滋養(yǎng)細(xì)胞瘤，Gestational,尿道癌，子宮癌，子宮內(nèi)膜，子宮肉瘤，陰道癌，視路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤，外陰癌，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，維爾姆斯瘤等。炎癥的治療本文所述的AM制品和純化的組合物可以用于減輕炎癥。AM包含許多可以有助于/介導(dǎo)其抗炎能力的因子，諸如白細(xì)胞介素-10(IL-10)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-P(TGF-p)超家族成員，蛋白酶抑制劑和IL-1受體拮抗劑(IL-1RA)。已知IL-10抑制和抵抗促炎細(xì)胞因子，諸如IL-6，TNFa和IL-8。參見Foutunato等，Am.J.Obstet.Gynecol.，175:1057-65(1996);Foutunato等，Am.J.Obstet.Gynecol"177:803-9(1997);和Foutunato等，Am.J.Obstet.Gynecol"179:794-9(1998)。為TGF-p超家族成員的活化素和抑制素由AM產(chǎn)生。不同劑量的活化素產(chǎn)生不同效果。在低劑量活化素下，刺激IL-6，IL-8和前列腺素E2(PGE2)產(chǎn)生，而在高劑量下，它抑制產(chǎn)生。參見Petraglia等，J.Clin.Endocrinol.Metab.,77:542-8(1993);Riley等，Hum.Reprod.15:578-83(2000);和Keelan等，Placenta,31:38-43(2000)。AM還包含可以起抗炎作用的蛋白酶抑制劑，諸如al抗-胰蛋白酶。參見Na等，TrophoblastRes.，13:459-66(1999)。IL-IRA為IL-1的抑制劑且由此抑制IL-1介導(dǎo)的炎癥。參見Romero等，Am.J.Obstet.Gynecol.,171:912-21(1994)。本發(fā)明者已經(jīng)證實(shí)AM減量調(diào)節(jié)IL-1表達(dá)和產(chǎn)生并且增量調(diào)節(jié)IL-1RA。參見Tseng等，OcularSurfaceJ.,2(3):177-187(2004)?；罨木奘杉?xì)胞在啟動(dòng)，維持和分辨宿主炎癥反應(yīng)中起重要作用。除殺傷病毒，細(xì)菌和寄生蟲并且起清除細(xì)胞作用外，巨噬細(xì)胞還通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量自由基，裂解酶和炎性細(xì)胞因子，共同惡化組織損害并且導(dǎo)致與急性和慢性炎癥相關(guān)的全身癥狀中的許多對(duì)宿主起有害作用。本文所述的AM制品和純化的組合物可以抑制產(chǎn)生炎性作用的巨噬細(xì)胞，如實(shí)施例6和如圖30-33中所示。將小鼠巨謹(jǐn)細(xì)胞細(xì)胞系Raw264.7用作測(cè)試在活化或不活化IFNy下的抗炎作用的模型。超低溫保存的羊膜(AM)抑制Raw264.7纟田胞，尤其是在刺激IFNy下產(chǎn)生NO。此外，與在塑料上培養(yǎng)細(xì)胞相比，在AM上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，PGD2產(chǎn)生比PGE2更有利?？寡鬃饔弥笖?shù)PGD2與PGE2之比在AM上培養(yǎng)的細(xì)胞中顯著高于在塑料上培養(yǎng)的細(xì)胞中。上述抗炎作用與抑制TGF-(3信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，因?yàn)橐种芌aw264.7中的TGF-|31啟動(dòng)子活性在AM上培養(yǎng)時(shí)顯著高于在塑料上培養(yǎng)時(shí)。此外，添加125|ug/mlAME誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞死亡。這些結(jié)果共同表明本文所述的AM制品和純化的組合物可以抑制巨噬細(xì)胞，從而產(chǎn)生抗炎作用。因此，本文所述的AM制品和純化的組合物可以用于治療與組織炎癥相關(guān)的疾病。炎性病癥的特征一般在于疼痛(痛，來(lái)自有毒物質(zhì)生成和神經(jīng)刺激)，熱(灼熱，來(lái)自血管擴(kuò)張)，發(fā)紅(紅，來(lái)自血管擴(kuò)張和血流增加)，腫脹(腫塊，來(lái)自流體過(guò)度流入或受限的流出)和功能缺失(功能喪失，可以為部分或完全的，暫時(shí)或永久的)體征中的一種或多種。炎癥有許多形式并且包括，但不限于如下一種或多種的炎癥急性，粘連，萎縮，卡他性，慢性，硬變，彌散，播散，滲出性，含纖維的，纖維的，病灶性，肉芽腫的，增生的，肥大的，間質(zhì)性，轉(zhuǎn)移性，壞死性，閉塞性，實(shí)質(zhì)性的，整形的，產(chǎn)生性的，增殖性的，假膜的，化膿性，致硬化的，漿液纖維蛋白性的，漿液的，單純的，特異性的，亞急性的，化膿性的，中毒的，創(chuàng)傷性的，潰瘍性的等。可以用本文所述的AM制品和純化的組合物治療的典型炎性病癥包括，但不限于關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，脊推關(guān)節(jié)病(spondyloarthopathies),通風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，變性關(guān)節(jié)病(即骨關(guān)節(jié)炎)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，斯耶格倫綜合征，強(qiáng)直性脊柱炎，分化不良型的脊柱炎，貝切特病，溶血性自身免疫性貧血，多發(fā)性硬化，肌萎縮性側(cè)索硬化，淀粉樣變性，急性痛性肩，牛皮癬和青少年關(guān)節(jié)炎)，哞喘，動(dòng)脈粥樣硬化，骨質(zhì)疏松癥，支氣管炎，腱炎，滑嚢炎，皮膚炎性病癥(即牛皮癬，濕滲，燒傷，皮炎)，遺尿癥，嗜曙紅細(xì)胞病，胃腸道病癥(包括炎癥性腸病，消化性潰瘍，區(qū)域性腸炎，憩室炎，胃腸道出血，克羅恩病，胃炎，腹瀉，腸易激綜合征和潰瘍性結(jié)腸炎)，胃食管反流病，嗜酸性急性食管炎，胃輕癱，諸如糖尿病性胃輕癱；食物耐受不良和食物過(guò)敏和其它功能性腸病，諸如非-潰瘍性消化不良，非心源性胸痛等，本文所述的AM制品和純化的組合物還可以用于治療，例如，與如下疾病相關(guān)的炎癥血管疾病，偏頭痛，緊張性頭痛，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，曱狀腺炎，再生障礙性貧血，何杰金病，scierodoma，風(fēng)濕熱，I型糖尿病，重癥肌無(wú)力，結(jié)節(jié)病，腎病綜合征，貝切特綜合征，多肌炎，牙齦炎，超敏反應(yīng)，結(jié)膜炎，多發(fā)性硬化和局部缺血(例如心肌缺血)等。所述的化合物可以用于治療與腦病癥(例如帕金森病和阿爾茨海默病)相關(guān)的腎炎和與顱放射性損傷相關(guān)的慢性炎癥。這些化合物可以用于治療急性炎癥疾患(諸如因感染導(dǎo)致的疾患)和慢性炎癥疾患(諸如因哮喘，關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病導(dǎo)致的疾患)。這在下列實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)提供本文所述的組合物和方法。提供這些實(shí)施例作為例證，但無(wú)論如何不用來(lái)限定本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:各種羊膜制品的抑制活性透明質(zhì)酸酶消化將由冷凍AM制備的AM總水溶性提取物(AME)與或不與10個(gè)單位/ml透明質(zhì)酸酶(Sigma弁H1136)混合在反應(yīng)緩沖液中(補(bǔ)充了上述蛋白酶和磷酸酶抑制劑的50mMHEPES,pH7.5,0.1MNaCl,1%TritonX-100,0,1%BSA)在37。C下2小時(shí)，使用純化自人臍帶的高M(jìn)WHA作為陽(yáng)性對(duì)照(cat弁H1876,Sigma)。細(xì)胞培養(yǎng)和TGF-pi啟動(dòng)子抑制當(dāng)在100mm塑料平皿中的DMEM/10%FBS中培養(yǎng)的人角膜成纖維細(xì)胞達(dá)到80%匯合率(1.0x106個(gè)細(xì)胞)時(shí)，用DMEM/10%FBS將細(xì)胞洗滌兩次。將腺病毒-TGF-pi啟動(dòng)子-熒光素酶(MOI=37.5)和腺-CMV-卩-gal(MOI=30)加入到含有10ml新鮮DMEM/10°/oFBS的培養(yǎng)平板中并且將細(xì)胞在37。C下孵育4小時(shí)且使用4ml預(yù)熱的胰蛋白酶/EDTA進(jìn)行胰蛋白酶消化5分鐘。在使用8mlDMEM/10%FBS中和胰蛋白酶/EDTA活性后，將細(xì)胞收集入15ml試管并且以1,500rpm(~600xg)離心5分鐘。在潷析培養(yǎng)基后，將細(xì)胞重新懸浮于15mlDMEM/10%FBS中并且通過(guò)錐蟲藍(lán)染色測(cè)定細(xì)l包存活率。將存活的3乂104個(gè)細(xì)1包4妾種在塑沖+24孔或AM插入片段(inserts)的基質(zhì)表面上?？傆?jì)準(zhǔn)備4個(gè)孔或插入片段。然后將細(xì)胞在37。C下和C02培養(yǎng)箱內(nèi)將育48小時(shí)。在從各孔中謹(jǐn)慎除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基后，用0.5mlPBS將細(xì)胞沖洗至少兩次，當(dāng)心不要移出附著細(xì)胞。在盡可能多地除去孔中的PBS后，加入100pllx裂解緩沖液以便覆蓋細(xì)胞并且以機(jī)械刮取細(xì)胞并轉(zhuǎn)入微量離心管，置于水上。通過(guò)在室溫下渦旋10.-15秒并且以12,000xg離心15秒收集細(xì)胞裂解物。將稱作細(xì)胞裂解物的上清液儲(chǔ)存在-80。C下，此后測(cè)定熒光素酶活性。用不同AM提取物抑制TGF-(31啟動(dòng)子活性在圖1中，與塑料對(duì)照組(PL)相比，冷凍羊膜的胎盤部分和胎部分(分別為FRO/P和FRO/F)均顯示對(duì)TGF-(31啟動(dòng)子活性的顯著抑制(各PO.Ol)。就新鮮胎盤而言，羊膜的胎盤部分(FRE/P)還顯示對(duì)TGF-(31啟動(dòng)子活性的顯著抑制(P0.05)。然而，新鮮羊膜的胎部分(FRE/F)未顯示任何抑制作用(PK).5)。這些結(jié)果表明新鮮羊膜的胎部分不具有與冷凍羊膜的胎部分相同的抗瘢痕形成作用。就冷凍羊膜而言，胎盤部分(FRO/P)的抑制作用與胎部分沒(méi)有顯著性差異(P4.3)。就新鮮羊膜而言，胎部分(FRE/F)的抑制作用與胎盤部分(FRE/P)沒(méi)有顯著差異(P4.1)。就胎盤部分而言，冷凍羊膜(FRO/P)的抑制作用明顯優(yōu)于新鮮羊膜(FRE/P)(P0.05)。然而，在胎部分中，冷凍羊膜(FRO/F)的抑制作用與新鮮羊膜(FRE/F)的抑制作用無(wú)顯著差異(P-O.l)。TGF-(31啟動(dòng)子活性的抑制為劑量依賴性的并且在使用透明質(zhì)酸酶消化后消失由冷凍AM制備的總水溶性AM提取物對(duì)TGF-pi啟動(dòng)子活性的抑制滿足0.04-125|Lig/ml的劑量響應(yīng)曲線(圖2)。正如TGF-卩1和TGF-J3RII的啟動(dòng)子活性所示，在用透明質(zhì)酸酶預(yù)處理時(shí)，由冷凍AM制備的25昭/ml總水溶性AM提取物的抑制作用消失，表明這類抑制作用由HA-相關(guān)復(fù)合物介導(dǎo)(圖3)。應(yīng)注意25|ig/ml的AM提取物包含低于0.78(ig/ml的HA。因透明質(zhì)酸酶失去的抑制作用不能通過(guò)添加HA而恢復(fù)盡管單獨(dú)的100pg/ml高M(jìn)WHA顯示適度的抑制活性，但其大小仍然顯著低于25pg/ml的AM提取物。這些數(shù)據(jù)共同表示AM提取物的抑制作用由HA-相關(guān)復(fù)合物，即HA-Ial復(fù)合物介導(dǎo)。離心后得到的可溶性AME和膠凍提取物不改變對(duì)TGF-pi啟動(dòng)子活性的抑制作用與PBS對(duì)照組相比，HA，AM(總，低速，高速)和膠凍(總，低速，高速)在使用13-半乳糖苷酶(galatosidase)活性校準(zhǔn)(normalized)時(shí)顯示對(duì)TGF-卩l(xiāng)啟動(dòng)子活化的抑制。P值顯示因?qū)φ战M中的變化而沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)比較總AME和兩種條件的離心可溶性AME，結(jié)果表示不存在顯著性差異。然而，未離心的AME顯示比低或高可溶性AME低的抑制作用。同樣，膠凍/T顯示比膠凍/HS低的TGF-J3抑制活性(圖5)。凍干增強(qiáng)了AME和膠凍提取物的抑制作用人角膜成纖維細(xì)胞在對(duì)照組，單獨(dú)的HA和低濃度AME或膠凍提取物中未顯示細(xì)胞形態(tài)改變(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，在使用高濃度的AME和L/AME處理后，早至接種后18小時(shí)，細(xì)胞顯示顯著改變成細(xì)長(zhǎng)和小細(xì)胞(圖6)。此夕卜，細(xì)胞密度也下降。上述改變甚至在凍干的AME或L/AME中也分別比其在AME或膠凍提取物中的非-凍干相應(yīng)物中顯著(圖6)。為了檢驗(yàn)TGF-P啟動(dòng)子在AME處理過(guò)程中是否得到抑制，進(jìn)行熒光素酶測(cè)定。將(3-半乳糖苷酶用作轉(zhuǎn)染對(duì)照物。結(jié)果表明AME-125,L-AME-25，L-AME-125,L-膠凍-125在抑制TGF-pi啟動(dòng)子活性方面顯示顯著性差異，抑制百分比分別為86%(P<0.01)，55%(P<0.1),950/0(P〈0.01)和46。/o(P0.1)(圖7)。數(shù)據(jù)顯示AME或膠凍(Jelly)在125pg/ml高濃度下的凍干形式比未-凍千AME形式更為有效。盡管最低濃度的商品HA(4ng/ml)與HA在AME/125中的濃度(3.8ng/ml)接近，但在AME/125中的有效抑制遠(yuǎn)比HA更有效(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，AME形式完全解釋了TGF-(3優(yōu)于膠凍形式的抑制作用?；旌狭四z原蛋白凝膠或HA的AM"I是取物對(duì)TGF-pi啟動(dòng)子活性的抑制隨后制備天然1型膠原蛋白凝膠和水溶性AM提取物的混合物。為了制備該混合物，首先通過(guò)用0.1N乙酸稀釋由大鼠尾腱制備的4mg/ml膠原蛋>白儲(chǔ)備溶液(BDBiosciences,SanJose，CA)并且將其與1/20體積比的20XDMEM和1N的NaOH混合制備膠原蛋白凝膠。膠原蛋白凝膠在37。C下孵育后形成。接下來(lái)，用DMEM將水溶性AM提取物(如本文所述制備)稀釋至25ng/ml濃度且然后與膠原蛋白凝膠混合。在與添加單獨(dú)的BSA的對(duì)照物比較時(shí)，1型膠原蛋白凝膠中混合的AM提取物的抑制作用與單獨(dú)使用的AM提取物(AME)的抑制作用類似(圖8,pO.Ol)。盡管單獨(dú)的膠原蛋白凝膠(Col)在與塑料對(duì)照物相比時(shí)也顯示類似的抑制活性(圖8，pO.Ol)，但是在膠原蛋白凝膠中添加AME(Col+AME)導(dǎo)致進(jìn)一步抑制(圖8,pO.Ol)。當(dāng)將水溶性AM提取物(AME)混合在HA凝膠中時(shí)，對(duì)TGF-pi啟動(dòng)子活性的抑制作用與單獨(dú)HA相比更明顯(與BSA混合作為對(duì)照物)(圖5，p<0.01)，與單獨(dú)AME相似(圖9)。因此，AM提取物組合物或其與膠原蛋白組合可以用于抑制眼組織中的TGF-p活性。實(shí)施例2:羊膜成分的表征才才津+和方法用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒對(duì)每種提取物中的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定(Pierce，Rockford，IL)。使用基于ELISA的透明質(zhì)酸(HA)定量測(cè)試試劑盒(Corgenix,Westminster,CO)，應(yīng)用HA的系列稀釋液制備的制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定每種提取物中透明質(zhì)酸(HA)的濃度。通過(guò)透明質(zhì)酸酶消化的HA分子量范圍分析通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，按照Lee和Cowman所述的方法分析提取物的HA分子量范圍(LeeH.G.和Cowman,M.K.AnAgaroseGelElectrophoreticMethodforAnalysisofHyaluronanMolecularWeightDistribution.AnalyticalBiochemistry,1994,219,278-287)。對(duì)樣品進(jìn)行0.5%瓊脂糖凝膠電泳，隨后使用在50%乙醇中的0.005%Stains-All(Sigma，cat#23096-0)染色。在室溫下避光覆蓋下將凝膠染色過(guò)夜(3-4小時(shí)的較短染色時(shí)間也可以產(chǎn)生可接受的結(jié)果)。在通過(guò)將凝膠轉(zhuǎn)至H20上脫色并且使其接觸室內(nèi)光約6小時(shí)后HA顯示為藍(lán)色帶。分子量標(biāo)準(zhǔn)物包括MW范圍在0.9_5.7x106的XDNA-BstEII消化的限制片段(cat弁D9793,Sigma)。通過(guò)在37°C下將提取物與或不與約10個(gè)單位/ml透明質(zhì)酸酶(Sigma弁H1136)在反應(yīng)緩沖液(補(bǔ)充了上述蛋白酶和磷酸酶抑制劑的50mMTris-HCl,pH7.5，O.lMNaCl,1%TritonX-100,0.1%BSA)中培養(yǎng)2小時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證HA的可靠性，使用純化自人臍帶的高M(jìn)WHA(cat#H1876，Sigma)作為陽(yáng)性對(duì)照。蛋白質(zhì)印跡分析將上述提取物在4-15°/。變性丙烯酰胺凝膠上電泳并且轉(zhuǎn)入硝化纖維膜且然后使用家兔抗-人間-a-胰蛋白酶抑制劑(家兔多克隆抗體(cat弁A0301，DAKO于1:1000)，家兔抗-人TSG-6多克隆抗體(由Dr.TonyDay提供，以1:1000稀釋)，大鼠單克隆抗-PTX3抗體(AlexisBiochemicals，ALX-804-464，1|ig/ml),獲自Calbiochem(Cat弁BA24)的抗-血小板反應(yīng)蛋白-l抗體和山羊抗-人Smad7抗體(AF2029，1:1000，R&DSystems)進(jìn)行免疫印跡分析。用WesternLightingTMChemiluminesenceReagent(PerkinElmer)才企觀寸免疫反應(yīng)蛋白帶。結(jié)果實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)在90°C下將水溶性AM提取物預(yù)加熱10分鐘時(shí)，對(duì)TGF-卩1啟動(dòng)子活性觀察到的抑制作用消除，表示起作用的成分很可能包含蛋白質(zhì)，其中構(gòu)象是重要的。AM提取物中HA和蛋白質(zhì)的定量測(cè)定下表中概括的結(jié)果表明所有的AM和膠凍提取物均包含HA和蛋白質(zhì)。一般而言，在離心AM后蛋白質(zhì)與HA的重量比在總提取物中高于上清液(例如PBS為L(zhǎng)和H且緩沖液A為A)，表示大部分包含蛋白質(zhì)的物質(zhì)被離心去除。然而，這種趨勢(shì)在AM膠凍中并不顯著，表示與膠凍相比AM提取物包含較多的蛋白質(zhì)(參見PBS中的T和A/B/C中的T)。就AM和AM膠凍而言，蛋白質(zhì)與HA之比從提取物A增加至提取物B和C，進(jìn)一步支持了HA主要存在于可溶性形式中并且反之亦然，在水不溶性成分中發(fā)現(xiàn)了更多的蛋白質(zhì)。此外，在A/B/C中離心后從AM膠凍中除去了大部分HA。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>195[注]:T:總，L:低速離心總提取物后的上清液，H:低速離心總提取物，A,B，C后的上清液提取物，參見正文。不同AM提取物中的HA具有高于1百萬(wàn)道爾頓的分子量高分子量(>106道爾頓)的HA存在于總提取物和提取物A中(圖10)。然而，甚至更高M(jìn)W的HA存在于提取物B中，而在提取物C的窄帶中發(fā)現(xiàn)了具有甚至更高M(jìn)W的HA(圖10)。所有包含HA的成分在透明質(zhì)酸酶消化后均消失，證實(shí)它們實(shí)際上包含HA。與獲自Sigma(cat弁HU36)的HA的陽(yáng)性對(duì)照相比，在低速和高速離心后獲得的上清液中也均發(fā)現(xiàn)了類似高分子量(>1()S道爾頓)的HA(圖11)。再次，這些包含HA的帶在透明質(zhì)酸酶消化后消失。對(duì)AM膠凍獲得了類似的結(jié)果(未顯示)。間-a-胰蛋白酶抑制劑(Ial)存在于不同AM提取物中且其重鏈(HCs)與HA共價(jià)連接圖12表示使用透明質(zhì)酸酶消化前，游離重鏈存在于不同復(fù)合物中并且還存在少量輕鏈(UTI或bikunin)。然而，在所有提取物，即總提取物和提取物A，B和C中，也存在HA與Ial重鏈共價(jià)連接復(fù)合物，因?yàn)楹笳邇H在透明質(zhì)酸酶消化后釋放。在通過(guò)兩種不同速度離心獲得的提取物H和L中獲得了相同的結(jié)果(圖13)。腫瘤壞死因子-刺激基因6(TSG-6)也存在于AM提取物中圖14顯示TSG-6(38kDa)存在于總提取物，提取物A和提取物C中。在提取物A中，存在遷移至接近純化TSG-6(35kD)的38kDa帶。45和55kDa其它帶的鑒定是未知的?？侫M提取物(不進(jìn)行離心)"T"顯示存在兩個(gè)帶(均高于35kD)，較高的帶(55kD)在提取物A(離心后)中，而在提取物C中存在一個(gè)較低的帶(45kD)。在用透明質(zhì)酸酶(圖14)或用F-糖苷酶(圖15)處理樣品時(shí)，所有這些帶均未顯著改變。然而，使用抗體RAH-1(圖16)，用硫酸軟骨素ABC裂解酶消化產(chǎn)生更明顯的38kD帶，而使用抗體MAB2104不產(chǎn)生這種情況(圖n)。五聚環(huán)蛋白(PTX-3)僅存在于水溶性AM提取物中并且與HA形成復(fù)合物圖18表示PTX3還可以存在于AM提取物中并且僅與水溶性提取物A中的HA復(fù)合。血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)存在于不同AM提取物中圖19顯示所有AM提取物均具有TSP-1的高分子量帶，而總提取物(T)和提取物C也具有35-120kDa的某些帶。透明質(zhì)酸酶消化不會(huì)改變反應(yīng)模式，只是某些帶稍變強(qiáng)或弱。Smad7大部分存在于水不溶性AM提取物中在AM的PBS提取物和尿素提取物中存在Smad7(圖20)。實(shí)施例3:水溶性AM提取物預(yù)防儲(chǔ)存和機(jī)械和酶方式導(dǎo)致的損傷誘導(dǎo)角膜上皮細(xì)胞(基底細(xì)胞和角膜細(xì)胞)的細(xì)胞死亡結(jié)果為了證實(shí)AM提取物可以預(yù)防受損組織中的細(xì)胞凋亡，使用鼠模型進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。摘出總計(jì)22只小鼠眼球，將其中的2個(gè)即刻包埋在OCT中用于冷凍切片，作為預(yù)處理的對(duì)照物。將剩余的20只眼球再分成3個(gè)亞組，即1)機(jī)械刮取(『8);2)處理消化(酶促)(『6)和；3)不進(jìn)行處理的對(duì)照(『6)。就每個(gè)組而言，在4。C下將等數(shù)量的眼球在有(+)或沒(méi)有(-)125jig/mlAM提取物存在下的含有確定補(bǔ)充(Gibco，Carlsbad,CA)的不含角膜細(xì)胞血清的培養(yǎng)基(KSFM)中預(yù)孵育24小時(shí)，此后進(jìn)行處理。在KSFM+/-AM提取物(如本文所述制備的)中的前24小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用手術(shù)刀片對(duì)第1亞組中的8只眼球進(jìn)行機(jī)械刮取并且進(jìn)一步分成2個(gè)組(每個(gè)組11=4)且在37°C下的KSFM+/-AM提取物中孵育。在4。C下用10mg/ml分散酶II在KSFM+/-AM提取物中對(duì)第2亞組中的6只眼球進(jìn)行酶消化(每組n-3)18小時(shí)。將來(lái)自每個(gè)組的1只眼球包埋在OCT用于冷凍切片。將來(lái)自每個(gè)組的剩余2只眼球在KSFM+AAM提取物中再孵育24小時(shí)，此后進(jìn)行分析。就未處理的對(duì)照組而言(n^6),將3只眼球在37°C下的KSFM+/-AM提取物中連續(xù)培養(yǎng)2天；在第一天結(jié)束時(shí)取出1只眼球，而在2天結(jié)束時(shí)取出2只眼球。將來(lái)自這些眼球的冷凍切片進(jìn)行TUNEL染色。簡(jiǎn)言之，使用獲自Promega(Madison，WI)的DeadEndTM熒光TUNEL系統(tǒng)，按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行末端脫氧核普?；D(zhuǎn)移酶-介導(dǎo)的FITC連接的dUTP切下的末端DNA標(biāo)記(TUNEL)測(cè)定。在室溫下將切片固定在4%曱醛中20分鐘并且用1%TritonX-100滲透處理。然后在37。C下將樣品與外源性TdT和熒光素-綴合的dUTP—起醉育60分鐘以便修復(fù)切下的3'-羥基DNA末端。用作為陽(yáng)性對(duì)照的DNaseI處理細(xì)胞，同時(shí)將陰性對(duì)照與缺乏rTdT酶的緩沖液一起孵育。用綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞凋亡核并且用DAPI將核復(fù)染為紅色熒光。通過(guò)制備水溶性AM提取物的方法制備AM提取物的水溶性形式。BCA測(cè)定法(Pierce，Rockford,IL)用于對(duì)AM提取物中的總蛋白質(zhì)定量測(cè)定。正常小鼠眼球僅在KSFM中孵育前顯示在未損傷的對(duì)照組角膜上皮淺層中最少量的細(xì)胞凋亡；在基質(zhì)角膜細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。然而，在4。C下KSFM中孵育24小時(shí)后，在淺層基質(zhì)角膜細(xì)胞中存在適度的細(xì)胞凋亡增加。用AM提取物抑制這類角膜細(xì)胞凋亡增加。還證實(shí)AM提取物減少對(duì)細(xì)胞機(jī)械損害后的細(xì)胞凋亡。在機(jī)械刮取后，小鼠眼球顯示角膜細(xì)胞凋亡的顯著增加。然而，在使用機(jī)械刮取后與AM提取物孵育導(dǎo)致角膜細(xì)胞凋亡減少。還以酶促方式處理小鼠眼球以便損害細(xì)胞。在4°C下KSFM中進(jìn)行分散酶消化18小時(shí)不僅在角膜細(xì)胞中，而且在上皮細(xì)胞中導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡；就后者而言，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡不僅存在于淺表上皮細(xì)胞中，而且存在于基底上皮細(xì)胞中。上皮細(xì)胞和角膜細(xì)胞凋亡程度遠(yuǎn)高于在機(jī)械刮取后注意到的細(xì)胞凋亡程度。在分散酶消化過(guò)程中AM提取物孵育顯著減少了上皮細(xì)胞和角膜細(xì)胞凋亡。這是顯著的，因?yàn)榉稚⒚柑幚砟M了可以定向于基底膜的手術(shù)(例如PRK中受激子消融)和病理學(xué)結(jié)果(例如復(fù)發(fā)性角膜糜爛)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)將AM提取物施用于具有受損細(xì)胞的組織可以用于減輕或預(yù)防細(xì)胞損害。實(shí)施例4:羊膜基質(zhì)提取物使成肌纖維細(xì)胞去分化材料Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM),Hank平衡鹽溶液(HBSS)，兩性霉素B,慶大霉素，胎牛血清(FBS),0.25%胰蛋白酶/0.53mMEDTA，活與死細(xì)胞存活率測(cè)定試劑和FITC綴合的鬼筆環(huán)肽購(gòu)自Invitrogen(Carlsbad，CA)。牛血清清蛋白(BSA),胰島素-運(yùn)鐵蛋白-亞硒S殳鈉培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，曱醛，蛋白酶抑制劑混合物，小鼠抗-結(jié)蛋白抗體，F(xiàn)ITC綴合的抗-小鼠，山羊和大鼠IgG，碘化丙錠和Hoechst-33342染料來(lái)自Sigma(St.Louis，MO)?？缈撞迦肫蝸?lái)自CorningIncorporated(Coming，NY)。I型膠原蛋白來(lái)自BDBiosciences(Bedford，MA)。BCATM蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒來(lái)自Pierce(Rockford，IL)。分散酶II和膠原酶來(lái)自Roche(Penzberg,Germany)。小鼠抗-aSMA和Ki67抗體來(lái)自DakoCytomation(Carpinteria,CA)。家兔抗-波形蛋白抗體來(lái)自Abeam(Cambridge,MA)。小鼠抗-EDA纖連蛋白抗體來(lái)自Chemicon(Temecula,CA)。HRP綴合的抗-小鼠IgG來(lái)自BioRad(Hercules,CA)。抗-褪色固定溶液來(lái)自VectorLaboratories(Burlingame,CA)。超J氐溫保存的人AM獲自Bio-Tissue(Miami，F(xiàn)L)。細(xì)胞培養(yǎng)按照赫爾辛基宣言(DeclarationofHelsinki)處理人組織。新鮮人胎盤獲自在IRB-批準(zhǔn)方案下得到通知許可后的剖宮產(chǎn)術(shù)之后的BaptistHospital(Miami，F(xiàn)L)。用包括慶大霉素和兩性霉素B的PBS沖洗2次后，從絨毛膜中以機(jī)械方式剝?nèi)M,切成片(~30mm直徑)并且在37。C下用在含有10%FBS的DMEM中的10mg/mL分散酶II消化20分鐘。此后，通過(guò)在解剖顯微鏡下手術(shù)剝離取出羊膜上皮并且用在37。C下在含有10%FBS的DMEM中的2mg/mL膠原酶將剩余的基質(zhì)進(jìn)一步消化14小時(shí)。通過(guò)以800xg離心5分鐘收集細(xì)胞并且重新懸浮且在37°C下的5。/。C02加濕氣體下在含有10%FBS的DMEM中，并在其中培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)基。在酶消化前再將AM包埋在O.C.T中用于冰凍切片術(shù)。人角鞏膜組織獲自FloridaLionsEyeBank(Miami,FL)，從其中收集角膜成纖維細(xì)胞(HCFs)并且在包含10%FBS的DMEM中培養(yǎng)，將二次傳代(P1)細(xì)胞用于所有實(shí)驗(yàn)。水溶性AM基質(zhì)提取物和AM插入片段的制備使用無(wú)菌技術(shù)，用HBSS將超低溫保存的人AM簡(jiǎn)單洗滌2-3次以便除去儲(chǔ)存介質(zhì)。用藥刀刮出AM基質(zhì)，冷凍在液氮的氣相中并且用BioPulverizer(BiospecProducts,Inc.,Bartlesville，OK)研磨成細(xì)顆粒，隨后在水上用TissueTearor(BiospecProducts,Inc.,Dremel,WI)在pH7.4的PBS中勻漿1分鐘。通過(guò)旋轉(zhuǎn)使勻漿物混合1小時(shí)并且在4°C下以14,000xg離心30分鐘。然后收集在PBS中的上清液并且以等分部分儲(chǔ)存在-80。C下。將BCA測(cè)定法用于定量測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將這種水溶性蛋白質(zhì)提取物稱為羊膜基質(zhì)提取物(ASE)。為了制備AM插入片段，在使用前即刻融化AM,用HBSS洗滌3次，切成約2.5x2.5cm大小的片并且固定在具有基質(zhì)側(cè)向上的培養(yǎng)物插入片段上。.免疫染色在-20。C下將AM的冷凍切片(4-jLim)固定在丙酮中10分鐘；培養(yǎng)的AMSCs和用AMSCs整裝的AM在4°C下固定在4%低聚曱醛中30分鐘。用PBS將切片或培養(yǎng)的細(xì)胞各自沖洗3次，每次5分鐘，且然后在0.2%TritonX-100中孵育10分鐘。在用PBS洗滌3次，每次5分鐘，并且與2%BSA預(yù)孵育以阻斷非特異性染色后，將切片或細(xì)胞與抗-aSMA(l:200)，抗-結(jié)蛋白(l:200)和抗-波形蛋白(l:200)抗體一起孵育1小時(shí)。在用PBS洗滌3次各15分鐘后，將它們與FITC或德克薩斯紅(TexasRed)綴合的二次抗體一起孵育45分鐘。為了標(biāo)記F-肌動(dòng)蛋白，用FITC綴合的鬼筆環(huán)肽以200個(gè)單位/mL的濃度將細(xì)胞進(jìn)一步染色15分鐘。再進(jìn)行3次各15分鐘的PBS洗滌后，用PI(1:2000)將核染色1分鐘或用Hoechst-33342染色15分鐘，然后用熒光顯微鏡分析。為了對(duì)Ki67進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，用0.6%過(guò)氧化氫將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性抑制(block)10分鐘。用1%正常山羊血清將非特異性染色阻斷30分鐘。然后將細(xì)胞與抗-Ki67抗體(1:50)孵育1小時(shí)。在用PBS洗滌3次各15分鐘后，將細(xì)胞與生物素化家兔抗-小鼠IgG(l:100)—起培養(yǎng)30分鐘，隨后與ABC試劑一起孵育30分鐘。用DAB將反應(yīng)產(chǎn)物展開5分鐘并且在光學(xué)顯微鏡下檢驗(yàn)。蛋白質(zhì)印跡分析收集來(lái)自塑料，膠原蛋白或AM表面的培養(yǎng)的AMSCs或成肌纖維細(xì)胞并且在冷的RIPA緩沖液[50mMTris'Cl，pH7.5,150mMNaCl，1。/。NonidetP-40,0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS和蛋白酶抑制劑混合物]中提取。在4%-15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上分離提取自裂解物的等量蛋白質(zhì)且然后以電泳方式轉(zhuǎn)至硝化纖維素膜。在5%脫脂奶中阻斷1小時(shí)后，將印跡與aSMA和ED-A纖連蛋白的初級(jí)抗體一起培養(yǎng)，使用a-肌動(dòng)蛋白作為加載對(duì)照。用抗-小鼠或抗-家兔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-綴合的抗體檢測(cè)特異性結(jié)合并且通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將上述所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次一式三份或更多。使用適當(dāng)版本的斯氏不配對(duì)t-試驗(yàn)比較組平均值。將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)導(dǎo)為雙-尾p值，其中將p〈0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。將概括數(shù)據(jù)報(bào)導(dǎo)為平均值士S.D。結(jié)果AMSCs的體內(nèi)表型在用分散酶II除去羊膜上皮細(xì)胞后，可以在原位觀察到AM中的AMSCs。通過(guò)相差顯孩B竟，它們顯示出樹突形態(tài)并且通過(guò)細(xì)突起(thinprocesses)維持胞間接觸(圖21A)。通過(guò)用活與死測(cè)定法染色更好地顯示了細(xì)胞存活率，樹突形態(tài)和胞間接觸(圖21B)。AM橫切片的免疫染色顯示AMSCs不表達(dá)a-SMA(圖21C)和結(jié)蛋白(圖21D)。相反，作為陽(yáng)性對(duì)照，臍帶間充質(zhì)細(xì)胞顯示對(duì)a-SMA和結(jié)蛋白的強(qiáng)染色(分別參見圖21C和21D的插圖)。然而，所有AMSCs均表達(dá)波形蛋白(圖21E)。這些數(shù)據(jù)共同表明AMSCs在體內(nèi)具有成纖維細(xì)胞表型。體外AMSCs的快速成肌纖維細(xì)胞分化為了研究AMSCs的體外分化，將膠原酶-分離的AMSCs置于塑料平亞上并且在含有10%FBS的DMEM中以200個(gè)細(xì)胞/mm2的密度孵育。在4-5天內(nèi)，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形狀(圖22A)并且保持a-SMA陰性(圖22E)。然而，某些細(xì)胞在1周培養(yǎng)結(jié)束時(shí)開始增加細(xì)胞大小，改變形狀(圖22B)和表達(dá)a-SMA(圖22F)。在相同培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)至另一塑料平皿后，大部分細(xì)胞在第1代1周結(jié)束時(shí)顯示典型的成肌纖維細(xì)胞的細(xì)胞形狀(圖22C)并且最終幾乎所有細(xì)胞均變成成肌纖維細(xì)胞形狀且在第2代1周結(jié)束時(shí)具有顯著的微絲(圖22D)。因此，a-SMA-陽(yáng)性成肌纖維細(xì)胞在1周初級(jí)培養(yǎng)時(shí)從71.9±3.7%顯著增加至第1代培養(yǎng)時(shí)的93.9±4.1%和第2代培養(yǎng)時(shí)的98.5±1.7%(圖221)。然而，結(jié)蛋白的表達(dá)在第2代培養(yǎng)時(shí)仍然為陰性(數(shù)據(jù)未顯示)。蛋白質(zhì)印跡分析揭示出AMSCs在體內(nèi)弱表達(dá)ED-A纖連蛋白，但不表達(dá)a-SMA。然而，a-SMA和ED-A纖連蛋白表達(dá)在初級(jí)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)顯著增加并且在的第2代時(shí)維持(圖22J)。這些結(jié)果表明AMSCs在這種包含血清的培養(yǎng)基中在塑料上快速分化成成肌纖維細(xì)胞。如果在AM基質(zhì)上傳代培養(yǎng)，那么從AMSCs分化的成肌纖維細(xì)胞可以被逆轉(zhuǎn)在我們的上述研究中，我們已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)在來(lái)自初級(jí)培養(yǎng)物的AM基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)，AM可以抑制人或小鼠角膜細(xì)胞的成肌纖維細(xì)胞分化。為了進(jìn)一步研究AM基質(zhì)是否還在調(diào)節(jié)分化的成肌纖維細(xì)胞的表型中有效，使從第2膠原蛋白I-包被的平皿上傳代培養(yǎng)的那些比較。在含有10%FBS的DMEM中培養(yǎng)7天后，膠原蛋白I上的AMSCs仍然維持成肌纖維細(xì)胞形狀(圖23A)。相反，接種在AM基質(zhì)上的細(xì)胞顯示出圓，紡錘，長(zhǎng)和樹突形狀的混合形狀(圖23B)。活與死測(cè)定證實(shí)在膠原蛋白I(圖23C)和AM基質(zhì)(圖23D)上的細(xì)胞保持100%存活率，但在細(xì)胞形狀上表現(xiàn)出顯著性差異。對(duì)鬼筆環(huán)肽的免疫染色顯示了有強(qiáng)的應(yīng)力纖維(圖23E),它還在接種在膠原蛋白I上的成肌纖維細(xì)胞中包含強(qiáng)a-SMA表達(dá)(圖23G)。相反，鬼筆環(huán)肽染色變?nèi)鹾陀邪唿c(diǎn)(圖23F)且a-SMA染色變模糊，同時(shí)將細(xì)胞接種在AM基質(zhì)上(圖23H)。蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)在接種在I型膠原蛋白上時(shí)，來(lái)源于AMSCs的成肌纖維細(xì)胞連續(xù)表達(dá)大量ED-A纖連蛋白和a-SMA(圖231)。相反，在接種在AM基質(zhì)上時(shí)，ED-A纖連蛋白的表達(dá)減少并且a-SMA的表達(dá)變得無(wú)法檢測(cè)到(圖培養(yǎng)時(shí)仍然可以逆轉(zhuǎn)成成纖維細(xì)胞表型。羊膜基質(zhì)提取物防止AMSCs的成肌纖維細(xì)胞分化和逆轉(zhuǎn)分化的成肌纖維細(xì)胞為了進(jìn)一步研究上述AM基質(zhì)的逆轉(zhuǎn)活性是否在水溶性AM基質(zhì)提取物中得以保持，在包含10%FBS含或不含100昭/mlASE的DMEM中在塑料上培養(yǎng)初級(jí)AMSCs(P0)。結(jié)果表明AMSCs在含有或不含有ASE情況下培養(yǎng)4天后維持紡錘成肌纖維細(xì)胞形狀(分別為圖24A和24B)。然而，此時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)在不含有ASE情況下表達(dá)a-SMA(圖24E),而在加入ASE時(shí)保持無(wú)a-SMA表達(dá)(圖2々F)。當(dāng)如圖2中所示將培養(yǎng)延長(zhǎng)至10天時(shí)，AMSCs顯示伸長(zhǎng)的細(xì)胞形狀并且顯著表達(dá)包含a-SMA陽(yáng)性表達(dá)(圖24G)的鬼筆環(huán)肽-陽(yáng)性應(yīng)力纖維(圖24C)。引人注目的是，AMSCs在有ASE存在下聚集成具有較小核的不同大小的球體(圖24D)?；诨钆c死測(cè)定法，這些球形細(xì)胞保持存活(數(shù)據(jù)未顯示)。使某些球體從塑料平皿上脫離，但它們?cè)诜祷谼MEM/10%FBS時(shí)可以附著新的塑料平i而產(chǎn)生新的成肌纖維細(xì)胞生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未顯示)。鬼筆環(huán)肽染色未顯示出任何應(yīng)力纖維(圖24D)，而在球體中的a-SMA表達(dá)較弱(圖24H)。這些結(jié)果表明ASE確實(shí)可以預(yù)防AMSCs的成肌纖維細(xì)胞分化。為了檢驗(yàn)上述AM基質(zhì)的逆轉(zhuǎn)活性是否保持在ASE中，我們向包含具有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中的塑料上的第2代AMSCs培養(yǎng)物上添加了100昭/mlASE1周。如上所述(圖22),到此時(shí)，接近所有的細(xì)胞變成具有鱗狀形態(tài)，應(yīng)力纖維明顯和a-SMA強(qiáng)表達(dá)的成肌纖維細(xì)胞。添加ASE使細(xì)胞恢復(fù)至伸長(zhǎng)或紡錘形狀(圖25A),其中a-SMA表達(dá)顯著減少(圖25B)。蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步證實(shí)EDA纖連蛋白和a-SMA表達(dá)在添加ASE后減少(圖25C)。這些結(jié)果表明AM基質(zhì)包含可以抑制AMSCs的成肌纖維細(xì)胞分化的可溶性因子(如果在先添加的話)，并且可以將分化的成肌纖維細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成成纖維細(xì)胞(如果隨后添加的話)。成肌纖維細(xì)胞逆轉(zhuǎn)與細(xì)胞增殖無(wú)關(guān)為了進(jìn)一步測(cè)定用ASE將上述AMSCs表型從成肌纖維細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成成纖維細(xì)胞是否伴隨細(xì)胞增殖，我們將培養(yǎng)基從DMEM+10。/。FBS轉(zhuǎn)換成不含血清的在第3代培養(yǎng)物中的DMEM/ITS，其中如圖2中所示，接近所有的細(xì)胞變成成肌纖維細(xì)胞。在6天觀察過(guò)程中，對(duì)照組培養(yǎng)物中的細(xì)胞維持與胞質(zhì)中明顯應(yīng)力纖維相同的成肌纖維細(xì)胞形態(tài)(圖26A-26D)。然而，在添加了ASE的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物中的細(xì)胞從第0天時(shí)的較大和扁平形狀(圖24E)逐步改變成第2天和第4天時(shí)的紡錘和伸長(zhǎng)形狀(分別為圖26F和26G)，且最終某些細(xì)胞皺縮成第6天時(shí)的較小的大小(圖26H)。這類因添加ASE導(dǎo)致的顯著形態(tài)改變伴隨表達(dá)a-SMA的應(yīng)力纖維缺失(圖26I-26L)。Ki67染色證實(shí)P3培養(yǎng)物中DMEM/ITS中的成肌纖維細(xì)胞未顯示任何細(xì)胞增殖，無(wú)論是否添力口ASE(分別為圖26M和26N)。作為對(duì)照，Pl培養(yǎng)物中的AMSCs在DMEM/10%FBS中的塑料上培養(yǎng)時(shí)顯示偶然的Ki67-陽(yáng)性核(圖260)，而在DMEM/10%FBS中的塑料上培養(yǎng)的許多人角膜成纖維細(xì)胞顯示Ki67-陽(yáng)性核(圖26P)。這些結(jié)果強(qiáng)烈支持了如下見解ASE不僅預(yù)防AMSCs的成肌纖不影響其細(xì)胞增殖。形態(tài)和Smad信號(hào)傳導(dǎo)的差異和AM基質(zhì)對(duì)TGF-(3啟動(dòng)子活性的抑制用膠原酶新鮮分離的小鼠基質(zhì)細(xì)胞在包含10%FBS的DMEM中的塑料上培養(yǎng)時(shí)顯示出成肌纖維細(xì)胞形態(tài)，而在相同培養(yǎng)基中在AM基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)顯示出樹突形態(tài)。免疫染色顯示甚至在使用10ng/mlTGF-pi攻擊后在含有ITS的DMEM中的AM上培養(yǎng)的樹突角膜細(xì)胞Smad4的核排斥。相反，細(xì)胞百分比從在塑料上培養(yǎng)的13%增加至添加10ng/mlTGF-pi分別3小時(shí)和5天后的67%和85%。這些結(jié)果表示AM基質(zhì)抑制Smad-介導(dǎo)的T-TGF-|3信號(hào)傳導(dǎo)，這有助于維持角膜細(xì)胞表型。將在塑料和完整超低溫保存的AM(如本文為制備超低溫保存的完整AM所述制備的)上培養(yǎng)的小鼠角膜成纖維細(xì)胞與TGF-P2啟動(dòng)子-熒光素酶+CMV-P-半乳糖苷酶或TGF-PRII啟動(dòng)子-熒光素酶+CMV-j3-半乳糖苷酶共轉(zhuǎn)染48小時(shí)。檢測(cè)細(xì)胞提取物的熒光素酶和P-半乳糖苷酶活性。TGF-(32和TGF-(3RI1的啟動(dòng)子活性的相對(duì)熒光素酶單位在AM上培養(yǎng)的細(xì)胞中得到抑制。實(shí)施例5:AM提取物抑制來(lái)自人緣外植塊的成纖維細(xì)胞遷移材泮+和方法總可溶性人羊膜提取物在PBS中的制備以無(wú)菌方式進(jìn)行制備總可溶性人AM提取物(T)的完整方法以便用于隨后基于細(xì)胞培養(yǎng)物的實(shí)驗(yàn)。冷凍人胎盤獲自Bio-Tissue，Inc.(Miami,FL),乂人其中回收AM。將AM切成適合于BioPulverizer(BiospecProducts,Inc.，Bartlesville，OK)的桶的小片，在液氮中冷凍且然后粉碎成細(xì)粉末。稱重該粉末并且與冷PBS緩沖液(通過(guò)將蒸餾H20添加至來(lái)自pH7.4的10xPBS的lxPBS制備，cat#70011-044，Invitrogen,Carlsbad,CA)與l:l(ml/g)的蛋白酶抑制劑(蛋白酶抑制劑混合物，P8340,Sigma并且補(bǔ)充了1mM的PMSF)和磷酸酶抑制劑(50mM氟化鈉和0.2mM釩酸鈉)混合。將該混合物保持在冰中并且用TissueTearor(BiospecProducts,Inc.，Dremel，WI)勻漿5次，每次1分鐘，有2分鐘間隔冷卻。將該水溶性提取物稱為"總"(T)。將該總水溶性提耳又物在4°C下混合1小時(shí)，在4。C下以48000xg離心30分鐘。將上清液分成等分部分并且儲(chǔ)存在-80。C下。人角膜緣外植塊培養(yǎng)物按照赫爾辛基宣言的信條處理人組織。邊緣(Limbalrims)獲自供體角膜(MedicalEyeBankofFlorida,Orlando,FL)或植入后的供體角膜(FloridaLionsEyeBank,Miami,FL)。除去過(guò)多的鞏膜，虹膜，角膜內(nèi)皮，結(jié)膜和特農(nóng)嚢并且將剩余的邊緣用SHEM介質(zhì)簡(jiǎn)單沖洗3次，該介質(zhì)由等體積的HEPES-緩沖的DMEM和Ham'sF12構(gòu)成，補(bǔ)充了5%FBS，0.5%DMSO，2ng/ml小鼠EGF，5|ig/ml胰島素，5|ig/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5ng/ml硒，0.5嗎/ml氫化可的松，10nM霍亂毒素，50(ig/ml慶大霉素，1.25嗎/ml兩性霉素B。將每一邊緣等分成兩半并且將每半再等分成6個(gè)外植塊，即每個(gè)邊緣制成12個(gè)外植塊。為了消除年齡，性別和種族的差異，選擇來(lái)自相同供體角膜的相應(yīng)位置的外植塊分別用于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。將外植塊放在上皮側(cè)向上的各6個(gè)孔的中心并且在SHEM或SHEM中與上述25嗎/ml的總AM提取物一起培養(yǎng)。將培養(yǎng)物維持在37。C下和95。/。濕度和5。/。C02中，每隔天改變一次培養(yǎng)基并且使用倒置相差顯微鏡(Nikon,Japan)每天檢測(cè)其向外生長(zhǎng)，持續(xù)14天。每隔天用AdobePhotoshop5.5將向外生長(zhǎng)的面積數(shù)字化處理并且用NIHImageJ1.30v(NIH,Bethesda，MD)分析。MTT測(cè)定MTT測(cè)定(CellProliferationKitI，cat#11465007001，RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)為基于黃色四唑鏘鹽MTT被代謝活性細(xì)胞裂解成紫色甲贈(zèng)晶體的比色測(cè)定。通過(guò)胰蛋白酶/EDTA消化分別收集從在SHEM(Ctrl組)或含有25|ig/mlAME的SHEM(AME組)中培養(yǎng)14天的人緣外植塊中向外生長(zhǎng)的細(xì)胞并且重新懸浮入SHEM培養(yǎng)基中。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)并且以2000個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔中，每個(gè)孔中含有100|il培養(yǎng)基。將每個(gè)組再分成3個(gè)亞組(Ctrl，PBS，AME)，其中在細(xì)胞接種后不即刻添加補(bǔ)充液2|alPBS或2pi1250嗎/mlAME(制成25(ig/mlAME終濃度)。每個(gè)亞組具有總計(jì)16個(gè)孔(來(lái)自復(fù)本)。將細(xì)胞在37°C下和95°/。濕度和5%CO2中培養(yǎng)10天，其中每隔天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)進(jìn)行MTT測(cè)定時(shí)，將10piMTT標(biāo)記i^'J(終濃度CK5mg/ml)加入到96孔的每個(gè)孔中。將96孔平板在相同培養(yǎng)條件下孵育4小時(shí)。然后向每個(gè)孔中加入100iJ增溶溶液并且將該平板在相同條件下再孵育20小時(shí)。使用微量培養(yǎng)板讀出器(FusionTM，Meriden，CT)測(cè)定在550nm波長(zhǎng)樣品的分光光度測(cè)定吸收度，減去650nm參比波長(zhǎng)的吸收度。蘇木精和伊紅(H&E)染色在培養(yǎng)14天后，從孔中取出外植塊并且用OCT(Tissue-Tek)包埋，簡(jiǎn)單冷凍在液氮中并儲(chǔ)存在-80。C下。用MicrotomePlus(TriangleBiomedicalSciences,Durham,NC)在snowcoatX-Tra顯微鏡載玻片(Surgipath,Richmond,IL)上將組織切成6片，固定在10%福爾馬林中10分鐘且在25。C下依次用Harris蘇木精染色5分鐘，1%伊紅淡黃染色1分鐘。用一系列70%，95%和100%的醇使組織脫水，各自至少5分鐘且最終用二曱苯(SUB-XTMXyleneSubstitute,Surgipath)處理，并且用蓋玻片固定。在倒置顯微鏡(ECLIPSE，TE2000-U，Nikon)下觀察載玻片。結(jié)果AM提取物減緩上皮細(xì)胞從人緣外植塊中遷移并且導(dǎo)致向外生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞較少，而祖細(xì)胞較多如下所示的表說(shuō)明上皮細(xì)胞從緣外植塊中開始向外生長(zhǎng)減緩并且產(chǎn)生的上皮細(xì)胞向外生長(zhǎng)包含在添加了AM提取物的培養(yǎng)物中的較少細(xì)胞。72表外植塊向外生長(zhǎng)<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>(來(lái)自4個(gè)外植塊的細(xì)胞)(3.6)(i,o)AM提取物抑制成纖維細(xì)胞從人緣外植塊中遷移并且導(dǎo)致向外生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞較少在圖27A中，從在SHEM(Ctrl)和SHEM/AME(AME)中培養(yǎng)的人緣外植塊中向外生長(zhǎng)形成類似的上皮層。然而，某些成纖維細(xì)胞-樣細(xì)胞僅出現(xiàn)在Ctrl中，而未出現(xiàn)在AME培養(yǎng)物中，表明AME可以抑制成纖維細(xì)胞遷移。在圖27B中，在14天培養(yǎng)后，從培養(yǎng)孔中取出人緣外植塊，包埋，切片并且用H&E染色。在AME中存在遠(yuǎn)多于Ctrl中的基質(zhì)細(xì)胞。這可能是因AME抑制成纖維細(xì)胞遷移所致。AME抑制成纖維細(xì)胞向外生長(zhǎng)分別收集來(lái)自在SHEM(Ctrl)和SHEM/AME(AME)培養(yǎng)14天的人緣外植塊的向外生長(zhǎng)物并且如MTT測(cè)定中所述以2000個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔的每個(gè)孔中。將來(lái)自Ctrl的細(xì)胞接種在第1-3歹'J(1:Ctrl;2:PBS;3:AME;n=8，就本文所示的1個(gè)平板而言，而就具有類似結(jié)果的復(fù)本而言，11=16)并且將來(lái)自AME的那些接種在第4-6列(l:Ctrl;2:PBS;3:AME)。在培養(yǎng)10天后，將細(xì)胞用于MTT測(cè)定。在亞組中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著性差異(Ctrl，PBS和AME),而在來(lái)源于SHEM和SHEM/AME中的向外生長(zhǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞之間的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(圖28A)。因?yàn)槌衫w維細(xì)胞遠(yuǎn)比上皮細(xì)胞生長(zhǎng)快得多，所以這類孔在添加包含成纖維細(xì)胞的MTT試劑后變成粉紅色。對(duì)Ctrl和AME中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示AME顯著抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)(p二0.01)(圖28B)。來(lái)自在SHEM/AME中培養(yǎng)的向外生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)多于僅用SHEM培養(yǎng)的向外生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)僅在SHEM(Ctrl)或在SHEM/AME(100^tg/ml)中培養(yǎng)人緣外植塊。在培養(yǎng)10天后，用胰蛋白酶/EDTA收集向外生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞并且再次計(jì)數(shù)，上皮細(xì)胞生長(zhǎng)得到AME的顯著抑制。即，在來(lái)自SHEM中培養(yǎng)的3個(gè)外植物的細(xì)胞總計(jì)為9x105,而來(lái)自在SHEM/AME中培養(yǎng)的3個(gè)外植塊的細(xì)胞總計(jì)為2.3x105,Ctrl/AME之比=3.9。此時(shí)將這些細(xì)胞以500或1000個(gè)細(xì)胞接種在每個(gè)60mm平亞(~18或36個(gè)細(xì)胞/cm、的SHEM培養(yǎng)基中的用MMC預(yù)處理的swiss3T3滋養(yǎng)層上(4pg/ml，2小時(shí)，在37。C下)。在接種4-5天后，上皮克隆開始形成。來(lái)自上述用SHEM/AME培養(yǎng)的細(xì)胞的克隆比預(yù)先僅用SHEM培養(yǎng)的的細(xì)胞克隆更多和更大(P〈0.05)。^使克隆生長(zhǎng)至第10天且然后用結(jié)晶紫染料染色克隆以便顯示克隆的數(shù)量和大小。AME抑制MAPKp38的向外生長(zhǎng)來(lái)自在SHEM(Ctrl)和SHEM/AME(AME)中培養(yǎng)14天的人緣外植塊的向外生長(zhǎng)物形成類似的上皮層。然而，上皮層的邊緣不同Ctrl上皮層的邊緣顯得粗糙，而AME的邊緣平滑(圖29，Ctrl-左側(cè)組；AME-右側(cè)組)。這種現(xiàn)象類似于MAPKp38抑制劑(在SHEM中10pMSB203580)對(duì)人緣外植塊的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。它提供了AME包含可以抑制MAPKp38的成分的另一個(gè)證據(jù)。實(shí)施例6:羊膜制品抑制巨噬細(xì)胞功能材泮+和方法細(xì)胞培養(yǎng)和IFN-y刺激Raw264.7細(xì)胞，即小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞抹獲自ATCC并且將其在100mm培養(yǎng)皿中不含酚紅的補(bǔ)充了10%胎牛血清，50jLig/ml慶大霉素和1.25|ag/ml兩性霉素B的Dulbecco改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞變成70%-80%匯合率時(shí)，除去培養(yǎng)基并且在25。C下將細(xì)胞用胰蛋白酶/EDTA處理10分鐘。在消化后，細(xì)胞仍然牢固地粘附在培養(yǎng)亞上，由此除去胰蛋白酶/EDTA溶液。然后向培養(yǎng)皿中加入含有胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞竭酸鈉的5mlDMEM(ITS;在1000ml中包括5mg胰島素，5mg人轉(zhuǎn)鐵蛋白和5jig亞硒酸鈉.Sigma，St.Louis，MO)，并且通過(guò)吸移收集細(xì)胞。在以500xg離心5分鐘后，除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞沉淀重新懸浮于DMEM/ITS培養(yǎng)基中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并且將細(xì)胞密度調(diào)整至0.5xl06/ml。為了接種細(xì)胞，將0.5ml(0.25xl0"的細(xì)胞混懸液加入到24孔的每個(gè)孔中。在1小時(shí)保持細(xì)胞貼壁后，將5ul的IFN-y(2xl04U)加入到各孔中以便達(dá)到IFN-y終濃度200U/ml。48小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基用于NO和PGD2/PGE2測(cè)定。將細(xì)胞用于活與死測(cè)定或收集用于蛋白質(zhì)印跡。活與死測(cè)定除去培養(yǎng)基并且向每個(gè)孔中加入200(xl合并的LIVE/DEAD測(cè)定試劑(MolecularProbes,Eugene,OR)。在室溫下將細(xì)胞孵育15分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞?；罴?xì)胞在胞質(zhì)中產(chǎn)生強(qiáng)烈的均勻綠色熒光，而死細(xì)胞在核中產(chǎn)生亮紅色熒光。NO測(cè)定在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，分別采集每個(gè)孔中的細(xì)胞培養(yǎng)基并且在4。C下以12,000xg離心10分鐘。將澄清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入新管并且進(jìn)行直接測(cè)定或儲(chǔ)存在-80。C下，此后進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)使用Griess試劑，按照制造商的方案測(cè)定穩(wěn)定降解產(chǎn)物亞硝酸鹽評(píng)價(jià)NO產(chǎn)生。簡(jiǎn)言之，將50iil澄清培養(yǎng)基與100piGriess試劑(ICNBiomedicals,Aurora,Ohio)混合，15分鐘后，在550nm處使用Fusion通用微量培養(yǎng)板分析儀(Packard,Meriden，CT)測(cè)量吸收度。根據(jù)亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算亞硝酸鹽的量(NaN02;Sigma,St.Louis,MO)。前列腺素D2(PGD2)和前列腺素E2(PGE2)測(cè)定在使用或不使用IFN-y刺激后48小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。使用EIA試劑盒(分別為cat#512021和514010，CaymanChemical,AnnArbor，MI)測(cè)定PGD2和PGE2濃度，其中按照供應(yīng)商的說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。TGF-pl啟動(dòng)子測(cè)定TGF-P啟動(dòng)子活性測(cè)定涉及包含人TGF-pi啟動(dòng)子(-1362至+11)-熒光素酶，TGF-卩2啟動(dòng)子(-1729至+63,Noma等，生長(zhǎng)因子，4:247-255，1991)和TGF-卩3啟動(dòng)子(-1387至+110)的質(zhì)粒。將TGF-卩2啟動(dòng)子和TGF-卩3啟動(dòng)子插入pGL3-基的KpnI和HindIII中。通過(guò)使用人角膜成纖維細(xì)胞的基因組DNA作為模版，正向引物5'-GTACGGTACCCATCAAAGAAGTTATGGTTC-3'和反向引物5'-GTACAAGCTTACTCAACTTCAACTCAGCGC畫3'的PCR擴(kuò)增人TGF-pRII啟動(dòng)子(-1883至+50，Bae等，JBiolChem.,270:29460-29468,1995)。然后用KpnI和HindIII消化擴(kuò)增的TGF-卩RII啟動(dòng)子片段，進(jìn)行凝膠-純化(Qiagen,Valencia,CA)并且插入PGL3-基的相同位點(diǎn)。由CoreLabofUniversityofMichigan4安照在先7〉布的方法(Chen等，JImmunol.167:1297-1305，2001;He等，ProcNatlAcadSciUSA95:2509-2514，1998)生產(chǎn)用于各啟動(dòng)子構(gòu)建體的復(fù)制缺陷腺病毒。在2x100mm塑料平皿中，在DMEM/10%FB中培養(yǎng)人角膜成纖維細(xì)胞(第l-4代)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到-80%的匯合率(~8x105個(gè)細(xì)胞/平皿)時(shí)，除去培養(yǎng)基并且用相應(yīng)培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌2次。將包括含有各自連接熒光素酶的TGF-pi,TGF-(32,TGF-{33或TGF-|3RII啟動(dòng)子的復(fù)制缺陷腺病毒(感染復(fù)數(shù)(MOI)各自為100)和包含CMV-(3-半乳糖苷酶的對(duì)照腺病毒(M01為30)的新鮮培養(yǎng)基與細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)。然后除去包含腺病毒的培養(yǎng)基并且在室溫下與預(yù)熱的胰蛋白酶/EDTA進(jìn)行胰蛋白酶消化5分鐘。將細(xì)胞收集入15ml無(wú)菌管并且以1000rpm(~600xg)離心5分鐘。謹(jǐn)慎除去培養(yǎng)基并且用相應(yīng)的培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌一次。將細(xì)胞沉淀以所需密度重新懸浮入培養(yǎng)基中。將具有或不具有不同量(例如25i!g/ml)水溶性AM提取物(通過(guò)本文為制備水溶性AM提取物所述的方法制備)或其它試劑的100pl細(xì)胞混懸液總體積(5000個(gè)細(xì)胞)轉(zhuǎn)入96-孔平板的每個(gè)孔中。將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)44小時(shí)(腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)總計(jì)48小時(shí))。此后，除去培養(yǎng)基并且用PBS將細(xì)胞沖洗一次。在50|il細(xì)胞培養(yǎng)裂解試劑(Promega.Madison,WI)中裂解來(lái)自96孔的每個(gè)孔的細(xì)胞。將細(xì)胞裂解物渦旋15秒并且通過(guò)在4。C下以12,000xg離心2分鐘清除。將上清液轉(zhuǎn)入澄清管。將20pl上清液用于熒光素酶測(cè)定或P-半乳糖苷酶測(cè)定。為了進(jìn)行熒光素酶測(cè)定，將100pi熒光素酶測(cè)定試劑(Promega,Madison,WI)分配入每個(gè)孔并且加入20|il細(xì)胞裂解物，且通過(guò)吸移3次混合。按照熒光素酶分析儀(FusionTM,PackardInstrumentCompany,Boston,MA)的禾呈序i殳i十進(jìn)4亍10-秒測(cè)定。就高靈敏度(3-半乳糖苷酶測(cè)定(Stratagene,LaJolla,CA)而言，將20pl細(xì)胞裂解物與130pl氯酚紅-P-D-p比喃半乳糖苷(CPRG)底物在每個(gè)孔中混合并且在37。C下孵育30分鐘-2小時(shí)，直到樣品變成紅色為止。終止反應(yīng)并且在570nm處讀取每一樣品的吸光度。計(jì)算每一樣品的|3-半乳糖苷酶活性并且用于將熒光素酶活性校準(zhǔn)為相對(duì)焚光素酶活性。結(jié)果AM減少了由巨嗟細(xì)胞Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO將Raw264.7細(xì)胞以在DMEM/ITS中2.5x105接種在24孔的每個(gè)孔中(每組11=3)。在用或不用200u/mlIFN-y刺激細(xì)胞后，收集培養(yǎng)基用于如方法中所述的NO測(cè)定。不使用IFN-y刺激，巨噬細(xì)胞在塑料或完整羊膜(iAM)基質(zhì)表面上培養(yǎng)時(shí)幾乎不產(chǎn)生可檢測(cè)到的NO(圖30)。在IFN-y刺激后，巨噬細(xì)胞在兩種培養(yǎng)物中均產(chǎn)生大量NO，而在iAM的基質(zhì)表面上培養(yǎng)巨噬細(xì)胞時(shí)顯著低于在塑料上培養(yǎng)巨噬細(xì)胞時(shí)(p-0.048)(圖30)。AM有利于PGD2合成而減量調(diào)節(jié)PGE2產(chǎn)生不使用IFN-y刺激，Raw264.7細(xì)胞在塑料上培養(yǎng)時(shí)幾乎不產(chǎn)生PGD2,而在iAM上培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生很多，推斷是因PGD2從AM上皮細(xì)胞中釋放所致(圖31A)。使用IFN-y刺激，在塑料和iAM上培養(yǎng)的Raw264.7細(xì)胞中的PGD2產(chǎn)生增加(圖31a)。不使用IFN-y刺激，Raw264.7細(xì)胞在塑料上培養(yǎng)時(shí)幾乎不產(chǎn)生PGE2，而在iAM上培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生^艮多，推斷是因PGE一人AM上皮細(xì)胞中釋放所致(圖31B)。使用IFN-y刺激，在塑料上培養(yǎng)的Raw264.7細(xì)胞中的PGE2產(chǎn)生顯著增加，而在iAM上培養(yǎng)的PGE2產(chǎn)生幾乎沒(méi)有改變(圖31B)。作為抗炎指數(shù)的PGD2/PGE2之比在使用或不使用IFN-y刺激的iAM上培養(yǎng)時(shí)遠(yuǎn)高于在Rraw264.7中的(圖31C)。AM抑制巨噬細(xì)胞中的TGF-|31啟動(dòng)子活化不使用IFN-y刺激，Raw264.7細(xì)胞中的TGF-pl啟動(dòng)子活性在iAM上比在塑料上受到抑制，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p岣.4)(圖32)。使用IFN-y刺激，Raw264.7細(xì)胞中的TGF-(31啟動(dòng)子活性在塑料和iAM上均下降。然而在與在塑料上培養(yǎng)的相比時(shí)tgf-|31啟動(dòng)子活性的乙酯大的多，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(pO.Ol)(圖32)。AME誘導(dǎo)巨嗟細(xì)胞死亡將Raw264.7細(xì)胞以2x105接種在24孔的每個(gè)孔中的DMEM/10%胎牛血清中。在1小時(shí)后,將125嗎/mlAME(在PBS中)加入到培養(yǎng)基中,同時(shí)將相同體積的PBS加入到Ctrl.中。在24小時(shí)培養(yǎng)后，在Ctrl中Raw264.7細(xì)胞充分粘壁，而在加入AME時(shí)大量細(xì)^9包漂浮且出現(xiàn)死亡(圖33)。測(cè)定巨噬細(xì)胞凋亡的體外測(cè)定體外巨噬細(xì)胞凋亡測(cè)定用于測(cè)定AM如何發(fā)揮基于有利于IFN卞活化的小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞抹(Raw264.7細(xì)胞)的細(xì)胞凋亡的抗炎作用。細(xì)胞死亡檢測(cè)ELISAPLUS試劑盒獲自RocheDiagnostics(Mannheim，Germany)。4姿照制造商的說(shuō)明對(duì)培養(yǎng)后相當(dāng)于104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞裂解物和條件培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞死亡檢測(cè)ELISAPLUS測(cè)定。這種ELISA為光度酶聯(lián)免疫測(cè)定，其用于使用小鼠單克隆抗-組蛋白和抗-DNA抗體進(jìn)行的細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡產(chǎn)生的胞質(zhì)組蛋白-連接的-DNA-片段(單-和寡核小體)的定性和定量體外測(cè)定。包括如制造商提供的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，并且使用FusionTM通用微量培養(yǎng)板分析儀在405nm處測(cè)定吸收度。在超低溫保存的完整AM的基質(zhì)側(cè)上培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，所述的超低溫保存的完整AM通過(guò)下列步驟制備釆集人胎盤，從胎盤中收集AM,將AM平展在具有上皮側(cè)向上的硝化纖維紙(HybondN+，Amersham,England)上并且將AM儲(chǔ)存在-80°C下的DMEM/甘油(1:2v/v)中至使用為止。為了在AM基質(zhì)上培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，將巨噬細(xì)胞接種在完整超低溫保存的AM的基質(zhì)側(cè)面上。結(jié)果表明在DMEM+ITS中48小時(shí)后在塑料培養(yǎng)物中檢測(cè)到了少量細(xì)胞凋亡，而在用IFN-y活化巨噬細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡下降。在超低溫保存的完整AM上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞也顯示一定的細(xì)胞凋亡，但在AM與塑料之間無(wú)顯著性差異。相反，由IFN-y活化的巨噬細(xì)胞在AM上培養(yǎng)時(shí)顯示顯著的細(xì)胞凋亡增加。這一測(cè)定結(jié)果與通過(guò)如本文所述的LIVE/DEAD測(cè)定染色(MolecularProbes,Carlsbad,CA),Hoechst-33342核染色和DeadEndTM熒光末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶-介導(dǎo)的dUTP-地高辛配基切口末端(TUNEL)標(biāo)記法(Promega,Madison,WI)相關(guān)。在均勻分布的塑料(PL)上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞大部分為卵形，但在用200u/mlIFN-y(PL/IFN-力活化后，細(xì)胞變大和紡錘形。相反，在AM基質(zhì)上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞聚集成簇并且保持圓形且在IFN-y活化(AM/IFN-力時(shí)，細(xì)胞皺縮并且變性成碎片。這些由AM導(dǎo)致的明顯形態(tài)改變與使用或不使用IFN-y活化48小時(shí)的細(xì)胞死亡檢測(cè)ELISA測(cè)定的巨噬細(xì)胞凋亡顯著加速相關(guān)(圖1，PL與AM相比,p>0.05,PL與PL/IFN-y相比和AM與AM/IFN-丫相比，p<0.05，PL/IFN-與AM/IFN-y相比，p<0.01)。這一結(jié)果表明在AM基質(zhì)上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞改變了其形態(tài)，表示用IFN-y活化后細(xì)胞死亡。為了測(cè)定上述在AM培養(yǎng)物上的形態(tài)改變確實(shí)代表了細(xì)胞死亡，對(duì)平行實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞進(jìn)行LIVE/DEAD測(cè)定。在使用或不使用IFN-y活化的塑料上培養(yǎng)的細(xì)胞和在不使用IFN-y活化的在AM上培養(yǎng)48小時(shí)的細(xì)胞主要為存活的(即產(chǎn)生綠色熒光)。相反，在IFN-y活化，AM上的大量細(xì)胞死亡(即產(chǎn)生紅色熒光)。為了測(cè)定上述細(xì)胞是否由細(xì)胞凋亡介導(dǎo)，對(duì)平行實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞進(jìn)行Hoechst-33342染色。發(fā)現(xiàn)在AM/IFN-y中具有強(qiáng)Hoechst染色的碎片核多于不使用IFN-y的AM及其塑料對(duì)照組。Hoechst-33342-陽(yáng)性細(xì)胞凋亡核的百分比為12.4±2.7%(PL)，16.5±3.1%(PL/IFN-y)，14.7±1.1。/c)(AM)和63.8±7.9%(AM/IFN-力。在PL與PL/IFN-y之間和PL與AM之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為p>0.05)，而在AM與AM/IFN-y之間和PL/IFN-y與AM/IFN-y之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為p<0.001)。此外，Hoechst-33342染色還發(fā)現(xiàn)在用IFN-y活化時(shí)的塑料培養(yǎng)物中的多核巨細(xì)胞。相反，在AM/IFN-y培養(yǎng)物中不存在這類巨細(xì)月包。為了驗(yàn)證這類碎片核確實(shí)由DNA裂解導(dǎo)致，對(duì)平行實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞進(jìn)行TUNEL測(cè)定染色。TUNEL-陽(yáng)性碎片核在PL,PL/IFN-y和無(wú)IFN-y的AM培養(yǎng)物中是散在的，但在AM/IFN-y培養(yǎng)物中顯著增加。這一結(jié)果與通過(guò)Hoechst-33342染色顯示的結(jié)果一致。AM通過(guò)打斷NF-kB和Akt介導(dǎo)的存活途徑誘導(dǎo)體外IFN-y活化的巨噬細(xì)月包凋亡性細(xì)胞死亡。為了確定NO是否導(dǎo)致在AM基質(zhì)上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的上述細(xì)胞凋亡，在24小時(shí)到72小時(shí)不同培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)收集的條件培養(yǎng)基中測(cè)定亞硝酸鹽濃度，同時(shí)還檢測(cè)TNF-a產(chǎn)生。結(jié)果證實(shí)在不使用IFN-y活化的PL或AM上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生低水平的NO和TNF-a并且在整個(gè)培養(yǎng)期中塑料與AM之間的NO產(chǎn)生無(wú)差異(均為p>0.05),而在AM上的TNF-a濃度在所有時(shí)間點(diǎn)時(shí)均高于在塑料上(均為p<0.05)。然而，當(dāng)使用IFNy活化時(shí)，在塑料上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞從24小時(shí)到72小時(shí)連續(xù)產(chǎn)生增加水平的NO和TNF-a。相反，盡管在AM上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞從24小時(shí)到48小時(shí)也增加了NO和TNF-a產(chǎn)生，但是在48小時(shí)到72小時(shí)之間其水平?jīng)]有增加(p〉0.05)，表明NO和TNF-a的產(chǎn)生在48小時(shí)后停止。NO濃度在24小時(shí)和48小時(shí)在AM上高于在塑料上(pO.Ol),而TNF-a濃度僅在24小時(shí)在AM上較高(p<0.01)。在使用或不使用IFN-y的培養(yǎng)基中單獨(dú)孵育AM48小時(shí)的對(duì)照組在上清液中未顯示出任何可檢測(cè)到水平的NO或TNF-a，表明AM自身不會(huì)產(chǎn)生NO和TNF-a。這些數(shù)據(jù)共同表明AM與IFN-y以協(xié)同作用方式起作用產(chǎn)生更多的NO，而AM自身誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TNF-a產(chǎn)生的能力較弱。在48小時(shí)，在AM上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)IFN-y促進(jìn)的亞硝酸鹽水平明顯高于塑料(p<0.01)，這是完全與細(xì)胞凋亡有關(guān)的發(fā)現(xiàn)。為了確定高水平的NO和細(xì)胞凋亡相關(guān)原因，通過(guò)添加為NO合酶抑制劑的NG-—曱基-L-精氨酸乙酸鹽(L-NMMA)或L-N6-(l-亞氨基乙基)賴氨酸鹽酸鹽(L-NIL)阻斷NO產(chǎn)生。結(jié)果證實(shí)500|aM的L-NMMA或L-NIL顯著減弱了高于在AM上培養(yǎng)細(xì)胞50%的IFN-y誘導(dǎo)的亞硝酸鹽水平，即，就L-NMMA和L-NIL而言，分別從基線46.2±4.3到19.8±4.9和14.0±9.8iuM(均為p<0.01)。然而，通過(guò)Hoechst33342染色測(cè)定的巨噬細(xì)月包凋亡程度并非因此而明顯減弱。這些結(jié)果共同表明在IFN-y活化下，AM上的巨噬細(xì)胞凋亡并非因NO過(guò)度產(chǎn)生而介導(dǎo)。為了進(jìn)一步研究AM上巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制，研究了兩種主要的細(xì)胞存活信號(hào)傳導(dǎo)途徑，即NF-kB和Akt-FKHR信號(hào)傳導(dǎo)途徑。通過(guò)測(cè)定來(lái)自使用或不使用IFN-y的塑料或AM上培養(yǎng)24小時(shí)的巨噬細(xì)胞的NF-kB,Akt,磷酸基-Akt(Ser473)和phospho-FKHR(Thr24)/FKHRL1(Thr32)的總IKK畫a，IKK-P，p65(RelA)亞單位的表達(dá)來(lái)研究這些途徑，此時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡的定量ELISA并不明顯。蛋白質(zhì)印跡分析顯示NF-kB和總Akt的p65(RelA)亞單位在使用IFN-y活化的塑料上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中得到輕微地增量調(diào)節(jié)。IKK-a，IKK-卩總Akt和phosphor-Akt(Ser473)水平在使用IFN-y活化的AM上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中僅得到減量調(diào)節(jié)，而NF-kB和phospho-FKHR(Thr24)/FKHRLl(Thr32)的p65(RelA)亞單位在不使用IFN-y活化的AM上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中得到減量調(diào)節(jié)并且在使用IFN-y活化時(shí)進(jìn)一步得到減量調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明這兩種信號(hào)傳導(dǎo)途徑均涉及在AM上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞凋亡。實(shí)施例7:使用膠原蛋白或HA作為載體遞送兩種不同AM提取物的相^j"功步l比專交為了測(cè)定AM提取物的水溶性和凍干形式(通過(guò)本文分別為制備AM提取物的水溶性和凍干形式所述的方法制備)的最佳濃度并且比較包含適當(dāng)濃度的每種AM提取物的兩種不同載體之間分別在抑制TGF-P啟動(dòng)子活性和促進(jìn)巨p笪細(xì)胞凋亡中的相對(duì)功效，通過(guò)在I型膠原蛋白凝膠或HA中系列稀釋液比較這兩種AM提取物形式并且由此監(jiān)測(cè)其蛋白質(zhì)濃度。就I型膠原蛋白凝膠而言，蛋白質(zhì)濃度在0.05-2mg/ml之間改變；就HA凝膠而言，該濃度在0.05-10mg/ml之間改變。將這兩種形式的AM提取物的這些系列稀釋溶液或凝膠預(yù)包被在塑料平皿上，此后接種人角膜成纖維細(xì)胞或?qū)⒓?xì)胞接種在塑料上的同時(shí)將其直接加入到含有10%FBS的DMEM中。通過(guò)下列步驟測(cè)定抗-瘢痕形成作用測(cè)定TGF-(31，(32，p3和RII的啟動(dòng)子活性，并且比較啟動(dòng)子活性與陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照，其中將細(xì)胞分別接種在含有或不含指定形式的AM提取物(無(wú)載體)的塑料上。細(xì)胞接種在含有DMEM+10%FBS的塑料上的陽(yáng)性對(duì)照顯示了高的啟動(dòng)子活性。相反，細(xì)胞接種在含有DMEM+10%FBS，但添加了25嗎/mlAM提取物的塑料上的陰性對(duì)照顯示啟動(dòng)子活性至少下降了50%。基于這些對(duì)照數(shù)值，可以測(cè)定使用不同濃度的混合了膠原蛋白凝膠或HA的AM提取物的實(shí)驗(yàn)組。一旦測(cè)定了這兩種形式的AM提取物在膠原蛋白或HA中的最有效濃度，就通過(guò)重復(fù)在不含血清的DMEM中的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果，所述的DMEM中包含添加了10pg/ml-5ng/mlTGF-(31的ITS?？?瘢痕形成作用進(jìn)一步與通過(guò)Smads2,3和4和a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA),即成肌纖維細(xì)胞標(biāo)記的免疫細(xì)胞定位抑制Smad-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)(GabbianiG.，JPathol.200:500-503，2003;Jester和Petroll,ProgRetinEyeRes.18:311-356,1999)。另一種陽(yáng)性對(duì)照通過(guò)將10jLig/ml中和抗體加入到TGF-(3的所有三種同工型中獲得。通過(guò)下列步驟在使用或不使用200u/mlIFN-y活化的含有ITS的DMEM中的鼠巨噬細(xì)胞中類似地測(cè)試抗炎作用使用細(xì)胞死亡檢測(cè)ELISAPLUS試劑盒(Roche，Mannheim,Germany)測(cè)定細(xì)胞凋亡程度并且將數(shù)據(jù)與通過(guò)如近來(lái)報(bào)導(dǎo)的(Li等，ExpEyeRes.2005，InPress)細(xì)胞形態(tài)LIVE/DEAD測(cè)定(MolecularProbes,Carlsbad,CA),Hoechst-33342核染色和TUNEL測(cè)定(Promega,Madison，WI)獲得的那些數(shù)據(jù)建立相關(guān)性。實(shí)施例8:羊膜基質(zhì)提取物具有抗-生成血管特性才才泮+和方法材料HUVECs和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基來(lái)自PromoCellGmbH(Heidelberg，Germany)。細(xì)胞增殖試劑盒I(MTT)來(lái)自Roche(Penzberg，Germany)。BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒來(lái)自Pierce(Rockford,IL)。Dulbecco改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基(DMEM),Ham，s/F12培養(yǎng)基，HEPES緩沖液，Hank平衡鹽溶液(HBSS),磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),兩性霉素B,慶大霉素，胎牛血清(FBS),血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF),0.25%胰蛋白酶/0.53mMEDTA，LIVE/DEAD測(cè)定試劑購(gòu)自Invitrogen(Carlsbad，CA)。硤化丙錠，Hoechst-33342染料，tritonX-100,牛血清清蛋白(BSA),胰島素，氫化可的松，曱醛，結(jié)晶紫，F(xiàn)ITC綴合的抗-小鼠，山羊和大鼠IgG來(lái)自Sigma(St.Louis，MO)?？缈撞迦肫蝸?lái)自CorningIncorporated(Corning,NY)?；|(zhì)膠來(lái)自BDBiosciences(Bedford,MA)。細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充了2。/。胎牛血清，0.1ng/mLEGF，ljug/mL氫化可的松和1ng/mL角鞏膜組織獲自FloridaLionsEyeBank(Miami，F(xiàn)L)，從其中收集角膜成纖維細(xì)胞(HCFs)并且在包含10%FBS的DMEM中培養(yǎng)。將第2代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。使PeterReinach博士(DepartmentofBiologicalScience,CollegeofOptometry,StateUniversityofNewYork,NewYork)友情提供的SV40-無(wú)限增殖化家兔角膜上皮細(xì)胞(RCEs)生長(zhǎng)在包含10%FBS,5ng/mL胰島素和5ng/mLEGF的DMEM/F12中。水溶性AM基質(zhì)提取物的制備使用無(wú)菌技術(shù)，用HBSS簡(jiǎn)單將獲自Bio-Tissue，Inc.(Miami，F(xiàn)L)的冷凍人AM洗滌2-3次以便除去原始的保存介質(zhì)。用藥刀刮取AM基質(zhì)，冷凍在液氮的氣相中并且用BioPulverizer(BiospecProducts,Inc.,Bartlesville，OK)研磨成細(xì)顆粒，隨后4吏用TissueTearor(BiospecProducts,Inc.,Dremel,WI)的pH7.4的PBS中在冰上勻漿1分鐘。通過(guò)旋轉(zhuǎn)1小時(shí)混合勻漿物并且在4。C下以14,000xg離心30分鐘。然后收集在PBS中的上清液并且以等分部分儲(chǔ)存在-80。C下。通過(guò)BCA測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。稱為羊膜基質(zhì)提取物(ASE)的該水溶性蛋白質(zhì)提取物用于本文所述的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖測(cè)定將細(xì)胞以2,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度與增加濃度的ASE—起接種在96-孔平板中的上述相應(yīng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(11=6)并且培養(yǎng)48小時(shí)。通過(guò)基于MTT(3-[4，5-二曱基p塞峻-2-基]畫2，5-二苯基四峻錄溴化物(dephenyltetrazoliumbromide))的細(xì)胞增殖測(cè)定，按照制造商提供的方案測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞凋亡測(cè)定將LIVE/DEAD測(cè)定和Hoechst-33342染色用于檢測(cè)凋亡細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，在培養(yǎng)48小時(shí)后，從培養(yǎng)物中除去各相應(yīng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，添加200pl合并的LIVE/DEAD測(cè)定試劑并且在室溫下培養(yǎng)15分鐘?；罴?xì)胞通過(guò)細(xì)胞質(zhì)的綠色熒光染色區(qū)分，而死細(xì)胞在核中染色為紅色熒光。為了表征核形態(tài)作為評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的方式，將Hoechst-33342染料以10嗎/mL的終濃度加入到各相應(yīng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中并且在37°C下孵育15分鐘。Hoechst-33342染色了活細(xì)胞核并且通過(guò)熒光增加和核裂解或濃縮確定凋亡細(xì)胞。遷移測(cè)定使用跨孔測(cè)定對(duì)HUVECs測(cè)試ASE對(duì)VEGF-誘導(dǎo)的趨化性的抑制作用。使HUVECs生長(zhǎng)在完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中36小時(shí)。在胰蛋白酶消化，洗滌并且在補(bǔ)充了0.5%FBS的不完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中重新懸浮細(xì)胞后，將200nL中的60,000個(gè)細(xì)胞接種在被8pm孔徑的聚碳酸酯膜分隔的含有或不含200|Lig/mLASE的3夸孑L"I悉入片,殳的(8mm直徑)內(nèi)側(cè)。將在補(bǔ)充了1%FBS和10ng/mLVEGF的800fiL體積中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑(chemotactant)直接加入到跨孔插入片段外部的24-孔平板中。將補(bǔ)充了0.5%FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基直接加入到24-孔中作為陰性對(duì)照。在37°C與5%C02和95%濕度下孵育4.5小時(shí)后，抽吸未遷移的細(xì)胞，同時(shí)用PBS洗滌膜，固定在PBS中的4%曱醛中，用結(jié)晶紫染色并且在顯微鏡下觀察。計(jì)數(shù)遷移至膜另一側(cè)的細(xì)胞。內(nèi)皮管形成測(cè)定將基質(zhì)膠以320iuL加入到24-孔平板的每個(gè)孔中并且使其在37。C下聚合30分鐘。將在含有10%FBS的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中的HUVECs(50,000個(gè)細(xì)胞/孔)接種在有不同濃度ASE存在下的基質(zhì)膠上。將對(duì)照組細(xì)胞與相同濃度的BSA—起培養(yǎng)。將細(xì)胞在37。C下培養(yǎng)24小時(shí)并且在顯微鏡(Nikon,Japan)下照相。對(duì)每個(gè)孔的10個(gè)隨機(jī)40x纟見野進(jìn)行拍照，并且計(jì)管數(shù)，取平均值并且比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將上述所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次一式三份或更多。使用適當(dāng)版本的斯氏不配對(duì)t-檢驗(yàn)比較組平均值。將檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)導(dǎo)為雙-尾p值，其中將p〈0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。將概括數(shù)據(jù)報(bào)導(dǎo)為平均值士S.D。結(jié)果ASE優(yōu)選抑制HUVEC細(xì)胞增殖我們首先測(cè)試了ASE加入到培養(yǎng)基中是否可以抑制細(xì)胞增殖。與不添加ASE的對(duì)照組相比，HUVECs增殖明顯受到50-200嗎/mLASE的抑制(圖34A，p<0.001)。然而，RCEs和HCFs增殖受到僅在200|ag/mL濃度下的ASE的顯著抑制(分別為圖34B和34C,各自p<0.01)。結(jié)果表明ASE優(yōu)選抑制HUVECs增殖。ASE誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡相差影像顯示HUVEC細(xì)胞從紡錘形皺縮至小和圓形的形狀并且細(xì)胞密度在使用200昭/mLASE處理48小時(shí)時(shí)顯著下降。相反，在使用200pg/mLASE處理48小時(shí)時(shí)，HCF和RCE細(xì)胞形態(tài)和密度均未改變(ft據(jù)未顯示)。為了測(cè)定200jig/mLASE導(dǎo)致的HUVEC細(xì)胞中這類改變是否伴隨細(xì)胞死亡，在用200嗎/mLASE孵育48小時(shí)后進(jìn)行LIVE/DEAD測(cè)定和Hoechst-33342染色。結(jié)果表明HUVEC細(xì)胞在不添加ASE的對(duì)照組中存活(圖35Aa)，而在ASE處理后顯示顯著細(xì)胞死亡(圖35Ad)。相反，HCF和RCE細(xì)胞在不使用(分別為圖35Ab和35Ac)或使用(分別為35Ae和35Af)ASE處理的培養(yǎng)物中未顯示出任何顯著的細(xì)胞死亡。Hoechst-33342染色顯示ASE-處理的HUVECs具有61.6±7.7%的濃縮和裂解的核(圖MBd)，明顯高于不^f吏用ASE處理的對(duì)照組的3.1±1.8%(圖35Ba，也參見2C，p<0.001)。相反，在不使用(分別為圖35Bb和35Bc)或使用(分別為圖35Be和35Bf)ASE處理的HCFs或RCEs中無(wú)明顯的細(xì)胞凋亡(也參見圖36,分別為p=0.84和0.30)。這些數(shù)據(jù)表明ASE通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制HUVECs增殖。ASE在使用或不使用VEGF刺激下抑制HUVEC細(xì)胞遷移我們隨后測(cè)試了ASE是否可以抑制VEGF刺激的HUVEC遷移。在4.5小時(shí)的測(cè)試期中，某些細(xì)胞在不含VEGF作為化學(xué)引誘劑的對(duì)照組中通過(guò)聚碳酸酯膜的孔遷移(圖37A)。在用作為化學(xué)引誘劑的VEGF處理時(shí)，細(xì)胞遷移顯著增加(圖37B，p<0.001)。然而，當(dāng)用200昭/mLASE處理HUVECs時(shí)，在VEGF影響下的細(xì)胞遷移數(shù)量與使用VEGF的陽(yáng)性對(duì)照(p〈0.001)或不使用VEGF的陰性對(duì)照(pO.Ol)相比時(shí)明顯受阻(圖37C)。這些結(jié)果表明ASE不僅消除了VEGF的趨化因子功能，而且抑制了實(shí)質(zhì)上存在于HUVECs中的遷移。ASE抑制HUVEC細(xì)胞的管形成為了進(jìn)一步研究ASE的抗-生成血管作用，我們進(jìn)行了體外管形成測(cè)定。當(dāng)將HUVECs接種在基質(zhì)膠，即基底膜蛋白的固體凝膠上時(shí)，它們快速排列并且在24小時(shí)后形成空心管樣結(jié)構(gòu)(圖38A)。相反，當(dāng)將ASE加入到培養(yǎng)物中時(shí)，在100嗎/mL(圖38B)或200ing/mL(圖38C)(均為pO.001)濃度下HUVECs的管形成明顯受到抑制。這兩種ASE劑量之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖38D)。這些結(jié)果共同表明ASE也通過(guò)抑制生成血管過(guò)程中的管形成起其抗-生成血管作用。實(shí)施例9:包含AM提取物的皮膚洗劑組合物通過(guò)下列方法制備皮膚洗劑。在150。F下將0.25g羥基苯曱酸曱酯和7.5g甘油(gycerin)溶于75ml水中。在150。F下熔化0.7g脫水山梨糖醇單月桂酸酯，0.7g聚山梨醇酯20和1.0g十八醇十六醇混合物且然后混合成溶液。在混合的同時(shí)冷卻該混合物。當(dāng)該混合物達(dá)到低于約90°F的溫度下時(shí)，在混合的同時(shí)加入4ml本文所述的AM制品和純化的組合物。另外在混合的同時(shí)加入痕量的香料。將該洗劑包裝成10ml的等分部分并且儲(chǔ)存在室溫下。實(shí)施例10:局部用AM基質(zhì)凝膠組合物和皮膚炎癥的治療為了制備局部用凝膠藥物組合物，將100mg冷凍-研磨的凍干的AM基質(zhì)材料與1.75g羥丙基纖維素，10mL丙二醇，10mL肉豆蔻酸異丙酯和100mL純化的乙醇(USP)混合。然后將所得凝膠混合物加入適合于局部給藥的容器，諸如管中。將該凝膠施用于發(fā)炎的皮膚，每天2次。通過(guò)使用該方法，皮膚炎癥減輕。實(shí)施例11:眼用溶液組合物和眼病的治療通過(guò)將100mg研磨的凍干的AM提取物與0.9gNaCl在100mL純水中混合制備滴眼液并且使用0.2微米過(guò)濾器過(guò)濾。然后將所得等滲溶液加入適合于眼科給藥的眼用遞送裝置，諸如滴眼液容器。將2滴該組合物施用于燒灼損害的眼，每天4次。通過(guò)使用該方法，眼恢復(fù)到正常的健康狀況。實(shí)施例12:眼用軟膏組合物使用該組合物治療眼病通過(guò)將90克白凡士林，10克液體石蠟和0.5克凍干的AM粉末混合制備無(wú)菌眼用軟膏組合物。將該混合物進(jìn)行巴氏滅菌并且包裝入每個(gè)2.0g管容器中。為了使用該組合物治療眼病，將約0.1g的等分部分緩慢直接從管中涂布于底部眼瞼的內(nèi)部邊緣。將該軟膏每天涂布4次。眼科專家隔周一次監(jiān)測(cè)患者進(jìn)展。通過(guò)使用該方法，眼病改善。實(shí)施例13:使用AM制品治療人眼病鑒定具有眼燒灼損害的個(gè)體。制備1%AM,0.5%膠原蛋白在DMEM中的制品。用2滴該組合物每天4X治療個(gè)體。通過(guò)使用該方法，眼損害比未治療的燒灼損害的眼改善。實(shí)施例14:使用AM制品治療人皮膚病鑒定具有牛皮癬的個(gè)體。用補(bǔ)充了來(lái)源于商品源的1mg/ml純化的Smad7的5。/。再溶解(reconstituted)的AM制品治療個(gè)體。將該制劑溶于洗劑組合物。每天給予2次治療。通過(guò)使用該方法，牛皮癬得到緩解或消失。實(shí)施例15:包含AM提取物的直腸凝膠組合物通過(guò)混合100mg商購(gòu)HA和TSG-6(純化的)與如實(shí)施例1所述由冷凍AM膜材料制備的5ml無(wú)菌AM提取物制備直腸凝膠組合物。向該混合物中加入2,5g曱基纖維素(1500mPa),100mg對(duì)羥基苯曱酸曱酉旨(methylparapen)，5g甘油和95mL純水。然后將所得凝膠混合物加入適合于直腸給藥的直腸遞送裝置，諸如注射器。實(shí)施例16:治療皮膚炎癥的試劑盒制備治療皮膚炎癥的非處方藥試劑盒。該試劑盒由下述包裹構(gòu)成，所述的包裹包含糊劑中的AM提取物的lml容器，涂藥器和說(shuō)明書插頁(yè)。實(shí)施例17:延長(zhǎng)釋放的固體劑型和在減輕關(guān)節(jié)炎炎癥中的應(yīng)用通過(guò)混合100mg凍干的，冷凍-研磨的AM基質(zhì)與800mg曱基纖維素微嚢化材料作為彈丸植入關(guān)節(jié)炎患者的發(fā)炎的膝關(guān)節(jié)皮下。每周一次重復(fù)植入過(guò)程。通過(guò)使用該方法，膝蓋炎癥減輕。實(shí)施例18:非胃腸組合物通過(guò)混合HA，TSG-6，PTX-3和TSP-lA各10mg制備用于肌內(nèi)給藥的非腸道組合物，其中所述的各成分獲自商業(yè)來(lái)源，其中將100mg本文所述的化合物的水溶性鹽溶于DMSO且然后與10mL0.9%無(wú)菌鹽水混合。將該混合物加入適合于注射給藥的單位劑型中。實(shí)施例19:通過(guò)直接注射AM非腸道制劑治療人腫瘤鑒定具有約2cm寬皮下腫瘤的患者。在4°C下將10克液體AM提取物與10%PEG300水溶液混合2小時(shí)。將該混合物通過(guò)0.20|am過(guò)濾器過(guò)濾并且等分入用橡皮塞封閉并且用鋁帽密封的無(wú)菌玻璃小瓶。使用前將小瓶?jī)?chǔ)存在4。C下達(dá)2周。通過(guò)將0.50ml溶液直接通過(guò)皮膚注入肺瘤部位治療患者，其中將給藥體積分成用于腫瘤塊的4個(gè)單獨(dú)的區(qū)(對(duì)4個(gè)位點(diǎn)各自約125pl)。將該組合物每隔48小時(shí)給藥一次。然后每周監(jiān)測(cè)腫瘤大小。通過(guò)使用該方法，肺瘤體積減小。盡管本文已經(jīng)說(shuō)明和描述了優(yōu)選的實(shí)施方案，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不脫離本發(fā)明的情況下進(jìn)行大量變化，改變和替代。應(yīng)理解對(duì)本文所述的本發(fā)明實(shí)施方案的各種可選擇方案均可以用于實(shí)施本發(fā)明。指定下列權(quán)利要求限定本發(fā)明的范圍且由此覆蓋這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等同方案。權(quán)利要求1.純化的組合物，包含●交聯(lián)高分子量乙酰透明質(zhì)酸(HA)；●腫瘤壞死因子-刺激基因6(TSG-6)；●五聚環(huán)蛋白(PTX-3)；和●血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)。2.權(quán)利要求1所述的純化的組合物，其中至少部分成分由選自人羊膜，人羊膜膠凍，人羊膜基質(zhì)或其組合的人羊膜材料制備。3.權(quán)利要求1所述的純化的組合物，還包含Smad7。4.權(quán)利要求1所述的純化的組合物，其中HA的交聯(lián)包含與間-a-胰蛋白酶抑制劑重鏈的共價(jià)鍵。5.權(quán)利要求1所述的純化的組合物，其中蛋白質(zhì)與HA之比小于約100。6.權(quán)利要求2所述的純化的組合物，其中制備方法包括獲得冷凍或預(yù)先冷凍的人胎盤；融化胎盤并且從融化的胎盤中分離人羊膜材料；和在合適的緩沖液中勻漿人羊膜材料。7.權(quán)利要求6所述的純化的組合物，其中制備方法還包括冷凍人羊膜材料；和研磨冷凍的羊膜材料。8.權(quán)利要求6所述的純化的組合物，其中制備方法還包括凍干勻漿物；或離心勻漿物并且從離心的勻漿物中分離上清液。9.權(quán)利要求8所述的純化的組合物，其中制備方法還包括將上清液凍干成粉末。10.權(quán)利要求1所述的純化的組合物，還包含用于非固體劑型或延長(zhǎng)釋放的固體劑型的藥學(xué)上可接受的載體。11.抑制受治療者瘢痕形成的方法，包括對(duì)有抑制瘢痕形成需要的受治療者提供有效量的抑制瘢痕形成組合物的步驟；其中該抑制瘢痕形成組合物包含由選自從羊膜提取的人羊膜，人羊膜膠凍，人羊膜基質(zhì)或其組合的人羊膜材料制備的至少一種成分。12.權(quán)利要求11所述的方法，其中至少一種成分由人羊膜材料提取。13.權(quán)利要求12所述的方法，其中人羊膜材料為人羊膜基質(zhì)。14.權(quán)利要求12所述的方法，其中提取方法包括獲得冷凍或預(yù)先冷凍的人胎盤；融化胎盤并且從融化的胎盤中分離人羊膜材料；在合適的緩沖液中勻漿人羊膜材料；任選將勻漿物凍干成粉末；和可接受的載體混合。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中制備方法中使用如下步驟取代了凍干勻漿物的步驟離心勻漿物，從離心的勻漿物中分離上清液并且任選將上清液凍千成粉末。16.逆轉(zhuǎn)受治療者瘢痕形成的方法，包括對(duì)瘢痕受治療者提供有效量的逆轉(zhuǎn)瘢痕組合物的步驟；其中該逆轉(zhuǎn)瘢痕組合物包含由選自從羊膜提取的人羊膜，人羊膜膠凍，人羊膜基質(zhì)或其組合的人羊膜材料制備的至少一種成分。17.權(quán)利要求16所述的方法，其中至少一種成分由人羊膜材料提取。18.權(quán)利要求17所述的方法，其中人羊膜材料為人羊膜基質(zhì)。19.權(quán)利要求17所述的方法，其中提取方法包括獲得冷凍或預(yù)先冷凍的人胎盤；融化胎盤并且從融化的胎盤中分離人羊膜材料；在合適的緩沖液中勾漿人羊膜材料；任選將勻漿物凍干成粉末；和將勻漿物或粉末與用于非固體劑型或延長(zhǎng)釋放的固體劑型的藥學(xué)上可接受的載體混合。20.權(quán)利要求19所述的方法，其中制備方法中使用如下步驟取代了凍干勻漿物的步驟離心勻漿物，從離心的勻漿物中分離上清液并且任選將上清液凍干成粉末。21.抑制受治療者血管發(fā)生的方法，包括對(duì)有抑制血管發(fā)生需要的受治療者提供有效量的抑制血管發(fā)生組合物的步驟；其中該抑制血管發(fā)生組合物包含由選自從羊膜提取的人羊膜，人羊膜膠凍，人羊膜基質(zhì)或其組合的人羊膜材料制備的至少一種成分。22.權(quán)利要求21所述的方法，其中至少一種成分由人羊膜材料提取。23.權(quán)利要求22所述的方法，其中人羊膜材料為人羊膜基質(zhì)。24.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的組合物包含交聯(lián)高分子量乙酰透明質(zhì)酸(HA);腫瘤壞死因子-刺激基因6(TSG-6);五聚環(huán)蛋白(PTX-3);和血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)。25.權(quán)利要求22所述的方法，其中提取方法包含獲得冷凍或預(yù)先冷凍的人胎盤；融化胎盤并且從融化的胎盤中分離人羊膜材料；在合適的緩沖液中勾漿人羊膜材料；任選將勻漿物凍干成粉末；和可接受的載體混合。26.權(quán)利要求25所述的方法，其中制備方法中使用如下步驟取代了凍干勻漿物的步驟離心勻漿物，從離心的勻漿物中分離上清液并且任選將上清液凍干成粉末。27.權(quán)利要求21所述的方法，其中需要的受治療者為患有癌癥的人。28.權(quán)利要求21所述的方法，其中需要的受治療者為患有年齡相關(guān)性黃斑變，1"生的人。29.權(quán)利要求21所述的方法，其中將抑制血管發(fā)生組合物以非固體劑型或延長(zhǎng)釋放固體劑型的形式提供。30.權(quán)利要求21所述的方法，其中抑制血管發(fā)生組合物具有如下特性誘導(dǎo)涉及血管形成的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；預(yù)防涉及血管形成的內(nèi)皮細(xì)胞遷移；和預(yù)防涉及血管形成的內(nèi)皮細(xì)胞的管形成。31.減輕或預(yù)防受治療者炎癥的方法，包括對(duì)有抑制或預(yù)防炎癥需要的受治療者提供有效量的炎癥抑制組合物的步驟；其中該炎癥抑制組合物包含由選自從羊膜提取的人羊膜，人羊膜膠凍，人羊膜基質(zhì)或其組合的人羊膜材料制備的至少一種成分。32.權(quán)利要求31所述的方法，其中至少一種成分由人羊膜材料提取。33.權(quán)利要求32所述的方法，其中人羊膜材料為人羊膜。34.權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述的組合物包含交聯(lián)高分子量乙酰透明質(zhì)酸(HA);肺瘤壞死因子-刺激基因6(TSG-6);五聚環(huán)蛋白(PTX-3);和血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)。35.權(quán)利要求32所述的方法，其中提取方法包含獲得冷凍或預(yù)先冷凍的人胎盤；融化胎盤并且從融化的胎盤中分離人羊膜材料；在合適的緩沖液中勻漿人羊膜材料；任選將勻漿物凍干成粉末；和將勻漿物或粉末與用于非固體劑型或延長(zhǎng)釋放的固體劑型的藥學(xué)上可接受的載體混合。36.權(quán)利要求35所述的方法，其中制備方法中使用如下步驟取代了凍干勻漿物的步驟離心勻漿物，從離心的勻漿物中分離上清液并且任選將上清液凍干成粉末。37.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的人患有關(guān)節(jié)炎。38.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的人的至少一只眼患有炎癥。39.權(quán)利要求31所述的方法，其中將炎癥抑制組合物以非固體劑型或延長(zhǎng)釋放的固體劑型提供。40.權(quán)利要求31所述的方法，其中炎癥抑制組合物具有如下特性中的至少兩種誘導(dǎo)炎癥部位上巨噬細(xì)胞凋亡；增加炎癥部位上前列腺素D2與前列腺素El之比；抑制炎癥部位上的TGF-pi活性；或抑制炎癥部位上的干擾素-Y信號(hào)傳導(dǎo)。全文摘要已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有特異性生物成分組合的組合物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有許多有用的作用，包括調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞凋亡和增殖以及減輕小鼠炎癥。這些成分可以商購(gòu)獲得，或可以由生物組織，諸如胎盤組織制備。本文所述的胎盤羊膜(AM)制品包括AM片，AM提取物，AM膠凍，AM基質(zhì)，和這些組合物與另外成分的混合物。這些組合物可以用于治療各種疾病，諸如傷口愈合，炎癥和與血管發(fā)生-相關(guān)疾病。文檔編號(hào)A61K35/12GK101316602SQ200680044389公開日2008年12月3日申請(qǐng)日期2006年9月27日優(yōu)先權(quán)日2005年9月27日發(fā)明者華何,煒李,謝弗·岑格申請(qǐng)人:組織技術(shù)公司