專利名稱：使用受保護(hù)胺鹽制備含末端胺基團(tuán)的聚合物的方法
使用受保護(hù)胺鹽制備含末端胺基團(tuán)的聚合物的方法 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及活性聚合物例如聚氧化烯的制備方法。具體來說，本發(fā)明涉 及制備高純度含末端胺的線性聚合物的方法。
背景技術(shù)：
水溶性聚氧化烯與治療性部分如蛋白質(zhì)和多肽的結(jié)合作用(conjugation) 是已知的。參見，例如，美國(guó)專利4,179,337號(hào)，該文獻(xiàn)的/>開內(nèi)容在此引入 供參考。該'337專利公開了用PEG改性的生理學(xué)活性多肽在體內(nèi)循環(huán)延長(zhǎng)的 時(shí)間，并且具有降低的致免疫力和抗原性。
為了結(jié)合聚氧化烯結(jié)合，該聚合物的羥基末端基必須首先被轉(zhuǎn)化成活性 官能團(tuán)。這種方法通常稱為"活化"且該產(chǎn)物稱作"活化聚氧化烯"。類似地活 化其它的聚合物。
胺末端聚合物如PEG-NH2是已知的。參見Zalipsky等人的Eur. Polym. J. Vol. 19 No. 12.,ppll77-1183。它們可以"原態(tài)"用于與一些生物活性化合物上 存在的COOH基團(tuán)直接結(jié)合。更通常，當(dāng)希望其它聚合物輸送體系時(shí)， PEG-NH2(或PEG-胺)用作進(jìn)一步官能化的中間體。例如，含有千基消除體系、 三曱基封閉體系等的某些聚合物基藥物輸送平臺(tái)體系(platform system)可以 包括PEG-NH2作為合成過程中的關(guān)鍵中間體。參見Greenwald等人J.Med. Chem.Vol. 42, No. 18,3657-3667; Greenwald等人J. Med. Chem,Vol. 47, No, 3,726-734; Greenwald等人的J. Med. Chem. Vol.43, No. 3,475-487。上述文獻(xiàn) 每一篇的內(nèi)容在此引入作為參考。
PEG-胺還可用于與生物活性小分子和具有可利用醛基的多肽結(jié)合(經(jīng)由 還原胺化)。也參見Nektar Advanced PEGylation catalog 2005-2006，24頁(yè)，該文 獻(xiàn)的內(nèi)容在此引入作為參考。
過去， 一般已知PEG-胺可以如下制備由PEG-OH制備PEG-鹵化物、曱 磺酸酯或曱苯磺酸酯，此后與氨水(Hoffmann反應(yīng))、疊氮化鈉或苯鄰二曱酰亞胺鉀(Gabriel試劑)進(jìn)行親核取代反應(yīng)。PEG面化物與氨的反應(yīng)直接地形成 PEG-胺。更重要地， 一個(gè)主要缺點(diǎn)在于較大百分率的PEG-卣化物在該濃氨 水處理期間水解而形成PEG-OH。當(dāng)形成較高分子量的PEG-胺時(shí)，這是尤其 關(guān)注的。PEG分子量越高，形成PEG-OH越多。例如，在PEG5，,的情況下， 該量大約為5%且在更高分子量PEG如PEG4o，o(M)的情況下，該量可能高達(dá)20%。 因此，所需最終產(chǎn)物的純度可能顯著地降低。
即使當(dāng)使用PEG-疊氮化物作為中間體來制備PEG-胺時(shí)，當(dāng)使用金屬催 化氫化時(shí)，也已觀察到某些缺點(diǎn)。另外，與苯鄰二曱酰亞胺鉀的反應(yīng)提供以 堿保護(hù)的胺，在回流下用在乙醇中的肼將該以堿保護(hù)的胺去保護(hù)。這也具有 缺陷。除去鄰苯二曱?；鶊F(tuán)需要的苛刻條件和需要對(duì)最終產(chǎn)物的強(qiáng)烈純化顯 著地增加了所需產(chǎn)物的成本。
鑒于上文所述，最好是提供改進(jìn)的方法用于制備克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn) 和缺陷的PEG-胺和相關(guān)的含末端胺的聚合物。本發(fā)明滿足了這種需要。
發(fā)明概述
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面中，提供了制備含末端胺的聚合物的改進(jìn)方 法。該方法包括使通式(I)的基本上非抗原性的聚合物
(I) R3-R2-R4
其中
R4是活性聚合物末端基如離去基團(tuán)；
R2是基本上非抗原性的聚合物；和
Ro是封端基團(tuán)或Rr， 與受保護(hù)胺鹽反應(yīng)以形成含末端受保護(hù)胺的聚合物；和此后使該由此得到的 含末端受保護(hù)胺的聚合物與酸反應(yīng)以除去該保護(hù)基和形成含末端胺的聚合 物。
優(yōu)選的活性聚合物末端基的實(shí)例包括離去基團(tuán)如曱苯磺酸酯基 (tosylate)、曱磺酸酯基(mesylate)、對(duì)溴苯磺酸酯基(brosylate)、三氟乙基磺 酸酯基(tresylate)、間硝基苯磺酸酯基(nosylate)、 Br、 Cl等。
通式(I)的聚合物與受保護(hù)胺鹽的反應(yīng)優(yōu)選在溶劑如二曱基曱酰胺中進(jìn)
下反應(yīng)，這最終在該聚合物上形成該末端胺。在本發(fā)明更優(yōu)選的方面中，轉(zhuǎn)變成胺衍生物的聚合物是PEG-曱苯磺酸酯并且該曱苯磺酸酯基團(tuán)可以在該
PEG的至少一個(gè)或多個(gè)末端上。
在本發(fā)明的另 一個(gè)方面中，優(yōu)選的受保護(hù)胺鹽是亞氨二碳酸曱基-叔丁
酯的鉀鹽(KNMeBoc)或亞氨二碳酸二叔丁酯的鉀鹽(KNBoc2)。
大于98%,更優(yōu)選大于99%。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)之一在于所得的含末端胺的聚合物如其聚氧化烯衍 生物是以高純度制備的。因此，不存在大量的產(chǎn)物污染物，即起始物料如 mPEG-OH,也就是說，污染物的量小于大約5%，優(yōu)選小于大約2%，最優(yōu)選 小于大約1%。當(dāng)優(yōu)選的PEG-胺以高純度更經(jīng)濟(jì)地形成時(shí)，技術(shù)人員可以更 有效且低成本地制備包括該P(yáng)EG-胺的最終產(chǎn)物?？梢云仁怪苽湓揚(yáng)EG-胺的 反應(yīng)完成并且可以通過重結(jié)晶除去過量的小分子試劑。獲得了效率，部分地 因?yàn)樗璧陌纺┒司酆衔锱c起始醇或活性中間體(例如曱^ 黃酸酯)的分離是 不需要的。另夕卜，不需要冗長(zhǎng)的柱或離子交換或HPLC技術(shù)來提供希望的PEG-胺。因此，本發(fā)明在沒有昂貴的柱純化的情況下提供高度純的PEG-胺。
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是以下事實(shí)由本文所述的方法制成的胺完全不會(huì)改變PEG 的骨架。因此，它將與PEG胺的現(xiàn)在和將來的應(yīng)用相適應(yīng)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的方法一般涉及其上含至少一種末端胺的聚合物的制備。在本發(fā) 明的大多數(shù)方面中，可以使用本文所述方法改性的聚合物是基本上非抗原性 的聚合物。在這種聚合物中，聚氧化烯是優(yōu)選的并且聚乙二醇(PEG)是最優(yōu) 選的。為了簡(jiǎn)化描述而不是限制，有時(shí)使用PEG作為原型(prototypical)聚合 物描述本方法。然而，應(yīng)當(dāng)理解，該方法適用于可以是線性、基本上線性、 支鏈等的各種聚合物。僅有的要求之一是該聚合物在其上含有用于將所需活 性聚合物末端基共價(jià)連接的基團(tuán)(means)并且可以經(jīng)得起在本文所述條件下 將甲笨璜?；蚱渌虚g體轉(zhuǎn)化成胺所要求的處理。
根據(jù)上述，本發(fā)明的制備含末端胺的聚合物的一個(gè)優(yōu)選的方面包括
a)使通式(I)的基本上3 一抗原性的聚合物
(I) R3-R2-R4
其中Ri是活性聚合物末端基；
R2是基本上非抗原性的聚合物；和
R3是封端基團(tuán)或Rj; 與受保護(hù)胺鹽反應(yīng)以形成含末端受保護(hù)胺的聚合物；和
b)使由此得到的該含末端受保護(hù)胺的聚合物與酸反應(yīng)以除去該保護(hù)基 和形成含末端胺的聚合物。
對(duì)本發(fā)明來說，應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語(yǔ)"活性聚合物末端基"當(dāng)在上下文中與R！ 一起使用時(shí)是指離去基團(tuán)如相關(guān)領(lǐng)域中已知的那些。適合的離去基團(tuán)的非限 制性實(shí)例(list)包括曱苯磺酸酯基、曱磺酸酯基、對(duì)溴M酸酯基、三氟乙基 磺酸酯基、間硝基苯磺酸酯基、Br、 Cl等。
如上所述，在一個(gè)實(shí)施方案中，R3可以是封端基團(tuán)。對(duì)本發(fā)明來說，封 端基團(tuán)應(yīng)當(dāng)理解是指在聚合物的末端上存在的基團(tuán)。在一些方面中，它可以 選自任何一個(gè)C02H、 d-6烷基(CH3是優(yōu)選的)、OH等或普通技術(shù)人員了解的 其它末端基。
R2還優(yōu)選是在室溫下水溶性的聚合物如聚氧化烯(PAO),更優(yōu)選聚乙二 醇如mPEG或雙活化的PEG。此類聚合物的非限制性實(shí)例因此包括聚氧化烯 均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧亞乙基化多元醇、其共聚物和其 嵌段共聚物，條件是該嵌段共聚物的水溶性得到維持。
為了舉例說明而非限制，R2的聚乙二醇(PEG)殘基部分可以選自 -CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CH2-和 -S-CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CH2S-
其中
x是聚合度即大約10-大約2,300。
在本發(fā)明的另一方面中，當(dāng)希望雙活化的聚合物時(shí)，R3與R,相同，并且 所得反應(yīng)物用于制備雙胺封端聚合物化合物。此種雙活化聚合物可以具有通 式(Ia):
(Ia)R廣CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CH2-R4 其中R^優(yōu)選是曱^t酸酯基，x和上述相同。
聚合物的聚合度表示聚合物鏈中重復(fù)單元的數(shù)目并且取決于聚合物的 分子量。雖然基本上非抗原性的聚合物，PAO和PEG在重均分子量方面可以 顯著地變化，但是，優(yōu)選地，R2在本發(fā)明的大多數(shù)方面中具有大約200-大約100,000 Da的重均分子量。更優(yōu)選，該基本上非抗原性的聚合物具有大約 2,000-大約48,000道爾頓的重均分子量。
R2也可以是"星形-PEG "或多臂PEG例如Shearwater公司的2001目錄 "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application "中描述的那 些，該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此引入作為參考。
在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R2是對(duì)應(yīng)于本發(fā)明聚合物的支鏈聚合物的
一部分。特別地，R2可以具有通式<formula>formula see original document page 9</formula>其中n是大約10-大約340的整數(shù)，以優(yōu)選提供總分子量大約12，000-大約 40,000的聚合物；并且該殘基的至少l個(gè)，但是至多3個(gè)末端部被曱基或其它 低級(jí)烷基封端并且其余末端基是R3基團(tuán)。也參見上述Nektar目錄，26頁(yè)M-臂 PEG"。在末端胺^:之前此類化合物優(yōu)選包括
<formula>formula see original document page 9</formula>其中R4是
<formula>formula see original document page 9</formula>1和
<formula>formula see original document page 9</formula>其中R7優(yōu)選是曱基，所有其它變量如本文前面所限定。能夠進(jìn)行本文描述的 胺化過程的一種具體聚合物是
這一實(shí)施方案的其它方面當(dāng)然可能有末端甲基中的一個(gè)或兩個(gè)被曱苯 磺?；娲沟门c上面的A對(duì)應(yīng)。
在本發(fā)明范圍內(nèi)還考慮各種其它PEG-基化合物，包括共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專 利號(hào)5,605,976、 5,643,575、 5，919，455和6，113,卯6中描述的那些支鏈聚合物殘 基上的末端胺的形成，每篇的公開內(nèi)容在此引入作為參考。 一些具體化合物 的代表性實(shí)例包括
<formula>formula see original document page 10</formula><formula>formula see original document page 11</formula>其中
R7
'R7
R7優(yōu)選是甲基； z是l-大約120的整數(shù)；
"和L3是獨(dú)立選擇的雙官能連接基，如以下非限制性化合物之一:-NH(CH2CH20)y(CH2)qNR9-， -NH(CH2CH20)yC(0)-, -NH(CI^oR")qOC(0)-， ((OXCR^OqNHqOXCR^R^qNfV,
-C(0)0(CH2)qO-,
-C(O)(CR10R")qNR9-
-C(0)NH(CH2CH20)y(CH2)qNR9-，
-C(0)CT(CH2CH20)yNR9-， -C(O)NH(CR化R")qO-， -C(O)O(CRwR")qO-， -C(0)NH(CH2CH20)y-,
-NH(CR10R")q
-NH(CR化R")q
(CR13R12)tOC(0)-
(CR13R12)tNR9C(0)-
119.13獨(dú)立地選自與限定上面R4的基團(tuán)相同的基團(tuán)，優(yōu)選H或CH3;
R6選自與限定R4的基團(tuán)相同的基團(tuán)、N02、 (^.6卣代烷基和卣素；和
q、 t和y各自是獨(dú)立選擇的正整數(shù)例如l-大約12;和乙2是支鏈連接基例如 二氨基烷基或賴氨酸殘基。參見，例如，上述美國(guó)專利號(hào)6,113,906。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，并且作為PAO類聚合物的替代方案，R2任選地選 自一種或多種有效非抗原的材料例如右旋糖苷、聚乙烯醇、碳水化合物類聚 合物、羥基丙基曱基丙烯酰胺(HPMA)、聚氧化烯和/或它們的共聚物。也參 見共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專利6，153,655號(hào)，該文獻(xiàn)的內(nèi)容在此引入作為參考。普通 技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，相同的類型的活化如本文描述了那樣用于PAO如PEG。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到上述實(shí)例僅是說明性的并且具有本文 所述品質(zhì)的所有聚合物材料是被考慮的。
還將理解，如果需要的話，本文描述的任何水溶性聚合物在胺化之前可 以經(jīng)官能化以與R3基團(tuán)，例如甲笨璜酸酯基、甲^"酸酯基連接，而不需要過 度試驗(yàn)。聚合物(例如PEG)末端OH轉(zhuǎn)化或活化成曱苯磺酸酯等已經(jīng)在本領(lǐng)域 中進(jìn)行了報(bào)道。參見，例如美國(guó)專利5,206344號(hào)和美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào) 2003/0149307 ，它們每篇的內(nèi)容在此？ 1入作為參考。
根據(jù)本發(fā)明方法，含末端受保護(hù)胺的聚合物的形成要求使通式(I)的含一個(gè)或多個(gè)Ri基團(tuán)例如活性聚合物末端基如曱苯磺酸酯基、曱磺酸酯基、對(duì)溴
苯磺酸酯基、三氟乙基磺酸酯基、間硝基苯磺酸酯基、Br或Cl的基本上非抗 原性的聚合物與受保護(hù)胺鹽反應(yīng)。該反應(yīng)在適合的溶劑例如但不限于二曱基 曱酰胺(DMF)、四氪呋喃(THF)、 二曱基乙酰胺或類似的試劑和其混合物中 進(jìn)行。優(yōu)選的溶劑是二甲基甲酰胺(DMF)。如普通技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)的那樣， 許多其它適合的溶劑可用于本發(fā)明的方法。適合的溶劑包括是極性溶劑的那 些例如曱醇、乙醇、丁醇、異丙醇、二嘌烷等。這一步驟可以在大約室溫下 進(jìn)行，但是溫度也可以為大約(TC至該溶劑的回流溫度或沸點(diǎn)。
各種受保護(hù)胺鹽可用于本發(fā)明的方法。通常地，該受保護(hù)胺鹽可以對(duì)應(yīng) 于通式
MNP!R4
其中
M是氫或選自鋰、鈉和鉀的金屬；
Pt包括但不限于以下列出的基團(tuán)C(O)H、 C(O)OMe、 C(O)OBzl(Z)、 C(O)OtBu(Boc)、 C(0)OCH2CCl3(Troc)、 P(0)(OEt)2、 CPli3(三苯曱基);和
R4是Pl或例如，Q—6烷基、Cw2支鏈烷基、C3-s環(huán)烷基、d-6取代的烷基、 <:3.8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、Q-6雜烷基、取代的Q-6雜 烷基、CL6烷氧基、苯氧基和C,-6雜烷氧基等。
在上組可能的試劑內(nèi)， 一些優(yōu)選的適合試劑的非限制性實(shí)例包括但不限
于，亞氨二碳酸二叔丁酯的鉀鹽(KNBoc2)、亞氨二碳酸二叔丁酯(LiNBoc2)
的鋰鹽、亞氨二碳酸二叔丁酯的鈉鹽等。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面中，受
保護(hù)胺鹽是亞氨二碳酸二叔丁酯的鉀鹽(KNBoc2)。
在本發(fā)明上述方面的另一方面中，受保護(hù)胺鹽可以選自NR4B0c的鉀、
鈉和鋰鹽，其中R4如上所述，例如d-6烷基等，Boc是叔丁基氧基羰基
(t-buty lcarbonate)。
在本發(fā)明的許多方面內(nèi)，優(yōu)選的受保護(hù)胺鹽是亞氨二碳酸曱基-叔丁基 酯的鉀鹽(KNMeBoc)。
在含受保護(hù)胺的聚合物形成之后，經(jīng)由上述水解除去保護(hù)基(例如Boc) 而得到所需的高純度PEG-胺衍生物。使用其它技術(shù)公認(rèn)的方法除去非Boc保 護(hù)基。
高純度PEG-胺然后可以按任何技術(shù)公認(rèn)的方式使用。例如，且沒有限制，可以使用為普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將它用于與C02H基團(tuán)或在所考慮的生
物活性目標(biāo)上存在的其它適合的活性基團(tuán)直接結(jié)合。另一方面，PEG-胺可以 作為高純度的中間體用于更復(fù)雜的聚合物連接體系例如上述千基清除(RNL) 體系(platform)或甚至作為PEG-脂質(zhì)體體系的一部分。為了舉例說明，RNL 體系可以如下制備使PEG-胺與適合的受保護(hù)苯曱醇反應(yīng)接著使用為普通技 術(shù)人員所知的技術(shù)進(jìn)行脫保護(hù)和活化。也參見下面最后一個(gè)實(shí)施例。
在含末端受保護(hù)胺的聚合物形成之后，將該聚合物去保護(hù)即除去保護(hù) 基，以形成所需的胺封端聚合物。該去保護(hù)可以使用酸例如但不限于，在 Et20(醚)或二哺烷中的HCl溶液，在二氯曱烷(或二氯乙烷)(15%-35°/。)，或其 它適合溶解酸和允許在有機(jī)環(huán)境下去保護(hù)的溶劑中的乙酸、二氯乙酸、曱酸 和三氟乙酸進(jìn)行。在本發(fā)明的許多方面中，在二氯曱烷中的20。/。三氟乙酸是 優(yōu)選的。
本發(fā)明的方法優(yōu)選使用至少大約等摩爾量(equimolar amount)的反應(yīng)物 進(jìn)行。更優(yōu)選，受保護(hù)胺鹽相對(duì)于通式(I)的化合物以摩爾過量存在。優(yōu)選， 受保護(hù)胺鹽相對(duì)于mPEG以至少大約3-5倍摩爾過量存在，即比例為約5至約 1。當(dāng)使用5-PEG(雙PEG或在每一末端上活化的PEG)時(shí)，該摩爾過量大約是 兩倍高，例如大約6-10倍摩爾過量。如果使用支鏈聚合物，則相對(duì)于待添加 的每個(gè)胺基使用類似的比例。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)使用末端支鏈的聚合物時(shí)，優(yōu)選
物結(jié)構(gòu)部分(例如曱苯磺酸酯基等)的數(shù)目。
在本發(fā)明的許多方面中，將聚氧化烯(PAO)例如未封端的PEG-OH(二 -PEG OH)或mPEG轉(zhuǎn)化成通式(IIa)或(IIb)的化合物
在本發(fā)明的許多方面中，將聚氧化烯(PAO)例如未封端的PEG-OH(二 -PEG OH)或mPEG轉(zhuǎn)化成通式(IIa)或(IIb)的化合物<formula>formula see original document page 15</formula>
或 (lib)
<formula>formula see original document page 15</formula>其中
R2是PAO例如PEG或mPEG;
X是O、 S或NHRs,其中Rs是氫、d-6烷基、Cw2支鏈烷基、(33-8環(huán)烷基、 Cw取代的烷基、C^取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C,-6雜烷 基、取代的Cw雜烷基、d，6烷氧基、苯氧基和Cw雜烷氧基等；和
R7是例如曱基、鹵素、硝基、氟代曱基、二氟曱基、三氟曱基、取代的 羧基和多鹵素取代的苯磺?；H3是優(yōu)選的。
在含受保護(hù)胺的聚合物形成之后，經(jīng)由上述水解除去保護(hù)基(例如Boc) 而高純度地得到所需的PEG-胺衍生物。
高純度PEG-胺然后可以按任何技術(shù)公認(rèn)的方法使用。例如，它可以沒有 限制地使用。
實(shí)施例
以下實(shí)施例用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解但無論如何不限制本發(fā)明 的有效范圍。
實(shí)施例l<formula>formula see original document page 15</formula>
a)PEG-曱苯磺酸酯(PEG-OTs)。向40^aAPEG-OH(100 g， 2.5mmo1， l當(dāng) 量)在800mL DCM的溶液中添力。400mL 30%NaOH水溶液和BnEt3NCl(228mg, l.Ommol, 0.2當(dāng)量)。然后，向該劇烈攪拌的混合物中經(jīng) 由加料漏斗在2小時(shí)內(nèi)逐滴添加對(duì)曱苯磺酰氯(2.86 g, 15mmol， 3當(dāng)量)在 500mL DCM中的溶液，并在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物過夜。在添加500mL DCM和200mL飽和NaCl溶液之后，分離有機(jī)相并用200mL飽和NaCl溶液洗滌 兩次。用無水MgS04干燥該有機(jī)相，過濾并在真空下蒸發(fā)而獲得固體，該固 體溶于最低量的DCM中并用乙醚沉淀。過濾得到97 g化③aAPEG-OTs(產(chǎn)率 96%)。 13CNMR: 21.57， 68.47， 69.07， 70,21-71.75 (PEG)， 127.68, 129.55, 132.69: 144.44。
b) PEG-NBoc2。向40^aAPEG-OTs(96 g， 2.38mmo1, l當(dāng)量)在500mL無水 DMF中的溶液中添加Boc2NK(3.65 g， 14.28mmo1， 3當(dāng)量)。將該反應(yīng)混合物 加熱到45。C過夜。在冷卻至室溫后，添力口1.2L乙醚。過濾所得的固體并用足 夠的乙醚洗滌。將粗固體溶于1.2 L DCM并用200mL飽和NaCl溶液洗滌兩次。 用MgS04干燥該有機(jī)層，過濾并在真空下蒸發(fā)。用DCM/乙醚將所得的固體 再結(jié)晶而獲得90 g 40KDaAPEG-NBoc2(產(chǎn)率940/。)。 13C NMR(ppm): 27.93， 45.01, 69.05， 69.68-70.34 (PEG), 81.94, 152.20。
c) PEG-胺鹽(PEG曙NH2.TFA)。向40KDaAPEG-NBoc2(90 g， 2.23mmol)在 900rnL DCM中的溶液中添加225mL TFA。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物4小時(shí) 然后在真空下蒸發(fā)。將所得的固體溶于300mLDCM并通過添加2 L乙醚沉淀。 在過濾之后，重新用DCM/乙醚將所得的固體再結(jié)晶而獲得88 g 40KDa八pEG一NH2.TFA(產(chǎn)率980/0)。 13C畫R(ppm): 39.87， 66.77, 69.71-70.72 (PEG)。
實(shí)施例2 膽a雙-PEG-胺
丁sa, DCM
BnEtjNCI(催fli劑)Bo&NK 20%TFA
鵬APEG刁H-咖APB3-OTs-觀APEG^NB。Cj- ~ MKAPEG-NH2 TFA
30% NaOH/H20 DMF, 45 °C DCM
5 6 7 8
由按上面相同方法制備的^KDaAPEG-OTs制得相應(yīng)的加KDaAPEG-胺，只是 使用PEG 20KDa代替PEG 40KDa。
在與實(shí)施例1中2的相同條件下制得化合物6。通過NMR證實(shí)6的結(jié)構(gòu)。 在與實(shí)施例1中3的相同條件下制得化合物7。通過NMR證實(shí)7的結(jié)構(gòu)。在實(shí)施例1中4的相同條件下制得化合物8。通過NMR證實(shí)8的結(jié)構(gòu)。 實(shí)施例3
40KDa雙一PEG-N-甲胺 <formula>formula see original document page 0</formula>a) PEG-曱苯磺酸酯(PEG-OTs)。重復(fù)實(shí)施例l的方法。
b) PEG-NMeBoc。在與實(shí)施例I相同的條件下制得化合物IO，只是使用相 當(dāng)量的BocMeNK^/辜Boc2NK。通過NMRi正實(shí)10的結(jié)構(gòu)。
c) PEG-N-曱胺(PEG-NHMe)。在與實(shí)施例l相同的條件下制得化合物11 ， 只是使用相等量的化合物10代替化合物3 。通過NMR證實(shí)結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例4 3斷mPEG畫胺
TsGI, DCM
BnEt3NCK催化劑) Bo&NK,股 ， 20%TFA
咖mPEG-OH-^加KmPEG-OTs-^ 鵬mPEG-NB。C;;-MKmPEG-NH2 TFA
30%NaOH/H2O DMF，45。C DCM
12 13 14 15
a) 3。③amPEG畫曱苯磺酸酯(孤DamPEG-OTs)。向3o③amPEG-OH(85 g, 2.83 毫摩爾，1當(dāng)量)在800mL DCM中的溶液中添加400mL 30。/。NaOH水溶液和 BnEt3NCl(257mg, 1.13， 0.4當(dāng)量)。然后，向該劇烈攪拌的混合物中經(jīng)由加 料漏斗在2小時(shí)內(nèi)逐滴添加對(duì)曱苯石黃酰氯(1.62g， 8.49mmo1， 3當(dāng)量)在600mL DCM中的溶液，并在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物過夜。在添加800mL DCM和 200mL飽和NaCl溶液之后，分離有機(jī)相并用200mL飽和NaCl溶液洗滌兩次。 用無水MgS04干燥該有機(jī)相，過濾并在真空下蒸發(fā)而獲得固體，該固體溶于 最低量的DCM中并用乙醚沉淀。過濾得到80 g ^③amPEG-OTs(產(chǎn)率940/0)。
13C NMR: 21.57, 58.83， 68.41， 69.07， 69畫69-72.95(PEG), 127,62, 129.52， 132.68, 144.40。
b) 30KDamPEG-NBoc2。向3QKDamPEG-OTs(78 g, 2.59mmo1, l當(dāng)量)在800mL 無水DMF中的溶液中添加Boc2NK(1.99g， 7.8mmo1, 3當(dāng)量)。將該反應(yīng)混合 物加熱到45。C過夜。在冷卻至室溫后，添加3 L乙醚。過濾所得的固體并用 足夠的醚洗滌。將粗固體溶于1.2 L DCM并用200mL飽和NaCl溶液洗滌兩次。用MgS04干燥該有機(jī)層，過濾并在真空下蒸發(fā)。用DCM/乙醚將所得的固體 再結(jié)晶而獲得67 g 30③amPEG-NBoc2(產(chǎn)率86。/())。 13C NMR(ppm): 27.93, 45.01 ,58.83， 69.04, 69.66-71.70(PEG)， 81.94，152,20。
c)皿DamPEG-胺鹽(艦DamPEG畫NH2.TFA)。向30KDamPEG-NB。c2(67 g， 2.22mmol)在670mL DCM中的溶液中添加335mL TFA。在室溫下?lián)璋柙摲磻?yīng) 混合物4小時(shí)然后在真空下蒸發(fā)。將所得的固體溶于300mL DCM并通過添加 2L乙醚沉淀。在過濾之后，重新用DCM/乙醚將所得的固體再結(jié)晶而獲得64 g 30KDamPEG-NH2TFA(產(chǎn)率98%) 。 13C NMR(ppm): 39.81, 58.83, 66.90， 69.63-71.70 (PEG)。
實(shí)施例5-8
重復(fù)實(shí)施例l-4的方法，只是使用等摩爾量相應(yīng)的PEG-C1衍生物代替曱
苯磺酸酯。
實(shí)施例9
3C)KDamPEG RNL 9連接物
在這一實(shí)施例中，才艮據(jù)以下反應(yīng)圖解將實(shí)施例4的犯化amPEG-NH2轉(zhuǎn)化成 活化的PEG連接物。
<formula>formula see original document page 18</formula>a)30KDamPEGRNL9OTBDMS23。向醇22(238mg, lmmol， 6當(dāng)量)在無 水CH3C1中的溶液中，添加DSC(235mg， 0.92mmo1， 5.5當(dāng)量)和吡啶(88pL， 1.08mmo1， 6.5當(dāng)量)。將所得的懸浮液力口熱到回流過夜，冷卻至室溫并添加 到30^amPEG-麗2.TFA(下文中21)(5 g， 0.17mmo1， 1當(dāng)量)和吡啶(17(iL， 0.21mmo1, 1.25當(dāng)量)在25mL無水CH3Cl中的溶液中。在室溫下攪拌3天之后， 在真空下蒸發(fā)溶劑。將所得的固體溶于最低量的二氯曱烷，然后通過添加醚 沉淀，過濾和用CH3CN/IPA再結(jié)晶而獲得4.85g(產(chǎn)率94。/。)。 GPC: 98.39%。"C畫R(75.4固z， CDC13) 5 154.47， 149.59, 137.90, 126.52， 121.02, 69.09-71.65 (PEG), 64.24, 58.83, 40.83, 25.84， 18.27,5.28。
b) 30KDamPEG RNL90H 24。向23(4.85 g, 0.16mmol)在20mL CHsCN和 10mL水中的溶液中添加50mL水乙酸。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后 在真空下蒸發(fā)。將殘余物溶于75mLCH2Cl2。用15mL水洗滌有^L相兩次，用 MgS04干燥，過濾和在真空下蒸發(fā)。將所得的固體溶于最低量的CH2Cl2，然 后通過添加乙醚沉淀而獲得4.49g(產(chǎn)率94。/。)。 GPC: 98.35%。 13C NMR(75.4 MHz, CDC13) S 154.36， 149.90， 138.18, 127.37， 121,15, 69.42-71.69 (PEG), 63.93,58.80, 40.83。
c) 30KDamPEG RNL9NHS 25。向24(4.49 g, 0.15mmol， l當(dāng)量)在50mL無 水CH2Cl2和5mL無水DMF中的溶液中添加DSC(305mg, 1.19mmol, 8當(dāng)量)。 將該混合物冷卻至0。C,然后添加吡啶(87iaL， 1.07mmol, 7.2當(dāng)量)。在室溫 下攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后在真空下蒸發(fā)。將所得的固體溶于最低量的 CH2C12,然后通過添加醚沉淀，過濾和用CH3CN/IPA再結(jié)晶而獲得4.26g(產(chǎn) 率94%)。 GPC: 97,04%。 13C NMR(75.4 MHz, CDC13) 5 168.33, 154,01， 151.51， 151.22, 129.80, 129.53, 121.68， 69.88-73.08 (PEG), 58.83, 40.89, 25.32。
最終產(chǎn)物可以用于與許多在其上具有用于結(jié)合的可利用胺或羥基的生 物活性多肽、酶、蛋白質(zhì)、小分子等結(jié)合。這些結(jié)合反應(yīng)的方法已經(jīng)例如， 在共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專利6,180,095號(hào)(其內(nèi)容在此引入作為參考)，或上述 Greenwald等人的J. Med. Chem. Vol. 42, No.l8,3657-3667中進(jìn)行了描述。
權(quán)利要求
1.含末端胺的聚合物的制備方法，包括a)使通式(I)的基本上非抗原性的聚合物(I) R3-R2-R1其中R1是活性聚合物末端基；R2是基本上非抗原性的聚合物；和R3是封端基團(tuán)或R1；與受保護(hù)胺鹽反應(yīng)以形成含末端受保護(hù)胺的聚合物；和b)使該由步驟a)得到的含末端受保護(hù)胺的聚合物與酸反應(yīng)以除去該保護(hù)基和形成含末端胺的聚合物。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中Ri是選自曱^t酸酯基、曱磺酸酯基、對(duì)溴苯 磺酸酯基、三氟乙基磺酸酯基、間硝基^ 黃酸酯基、Br和Cl的離去基團(tuán)。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)步驟a)在選自二曱基曱酰胺(DMF)、四氫 p夫喃(THF)、 二甲基乙酰胺和它們的混合物的溶劑中進(jìn)行。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中該離去基團(tuán)是曱苯磺酸酯基。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中該受保護(hù)胺鹽選自亞氨二碳酸二叔丁酯的鉀鹽 (KNBoc2)、亞氨二碳酸二叔丁酯的鋰鹽(LiNBoc2)和亞氨二碳酸二叔丁酯的鈉 鹽。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中該受保護(hù)胺鹽是亞氨二碳酸二叔丁酯的鉀鹽 (KNBoc2)。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中該受保護(hù)胺鹽選自NR4B0c的鉀、鈉和鋰鹽，其中R4選自氫、Ci-6烷基、Cw2支鏈烷基、C3-8環(huán)烷基、C^取代的烷基、C3_8 取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、d—6雜烷基、取代的d-6雜烷基、Q-6烷氧基、苯氧基和Cw雜烷氧基；Boc是叔丁基氧基羰基。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中該受保護(hù)胺鹽是亞氨二碳酸曱基-叔丁基酯的 鉀鹽(KNMeBoc)。
9. 權(quán)利要求1的方法，其中用來除去所述保護(hù)基的酸選自鹽酸、乙酸、二氯乙酸、曱酸和三氟乙酸。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中該酸是三氟乙酸。
11. 權(quán)利要求l的方法，其中R3封端基團(tuán)是CH3。
12. 權(quán)利要求1的方法，其中R3是Rj。
13. 權(quán)利要求1的方法，其中R2是聚氧化烯。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中該聚氧化烯選自聚乙二醇和聚丙二醇。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述聚氧化烯是通式-0-(CH2CH20)x-的聚乙 二醇，其中x是大約10-大約2，300的整數(shù)。
16. 權(quán)利要求1的方法，其中該基本上非抗原性的聚合物具有大約2,00-大 約100,000道爾頓的重均分子量。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中該基本上非抗原性的聚合物具有大約2,000-大約48，000道爾頓的重均分子量。
18. 權(quán)利要求1的方法，其中通式(I)的化合物是(<formula>formula see original document page 3</formula>R2是聚氧化烯；X是O、 S或NHR8，其中Rs選自氫、d-6烷基、Cw2支鏈烷基、<:3.8環(huán)烷基、CL6取代的烷基、(33.8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、d.6雜烷基、取代的d-6雜烷基、Cw烷氧基、苯氧基和Cw雜烷氧基；和R7是曱基、鹵素、硝基、氟代曱基、二氟曱基、三氟甲基、取代的羧基或多卣素取代的M?；?。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中R2是聚乙二醇，X是O， R7是曱基。
20. 權(quán)利要求1的方法，其中通過所述方法形成的含末端胺的聚合物的純度大于大約95%。
21 .權(quán)利要求20的方法，其中通過所述方法形成的含末端胺的聚合物的純 度大于98%。
22.權(quán)利要求21的方法，其中通過所述方法形成的含末端胺的聚合物的純 度大于99%。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備高純度線性聚合物例如含末端胺的聚氧化烯的方法。一種優(yōu)選的方法包括使含末端甲苯磺酸酯基的聚氧化烯例如聚乙二醇與受保護(hù)胺鹽反應(yīng)以形成含末端受保護(hù)胺的聚合物，此后將該含末端受保護(hù)胺的聚合物去保護(hù)以形成含末端胺的聚合物。所得聚合物-胺具有足夠的純度以致避免了為藥物級(jí)聚合物所需要的昂貴和耗時(shí)的純化步驟。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101321516SQ200680045582
公開日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月4日
發(fā)明者貝倫·魯比奧, 洪 趙 申請(qǐng)人:安佐制藥股份有限公司