專利名稱：：同時含乙肝病毒表面抗原和表面活性劑的疫苗的制造技術同時含乙肝病毒表面抗原和表面活性劑的疫苗的制造本文所引用的所有文獻都已完整納入本文作為參考。
技術領域：
本發(fā)明屬于組合疫苗制造領域，組合疫苗是含有來自一種以上病原體的混合免疫原的疫苗，因此，給予這種疫苗可使對象同時獲得對一種以上病原體的免疫力。具體地說，本發(fā)明涉及在組合疫苗的制造期間使用表面活性劑。
背景技術：
：單劑量中含有一種以上病原生物的抗原的疫苗被稱為"多價"或"組合"疫苗。在歐洲和美國已有許多組合疫苗被批準用于人類，其中包括抵抗白喉、破傷風和百日咳的三價疫苗("DTP"疫苗)和抵抗麻疹、腮腺炎和風疹的三價疫苗("MMR"疫苗)。組合疫苗對患者的益處在于能減少注射次數(shù)，從而帶來順應性提高的臨床優(yōu)勢(例如參見參考文獻1的第29章)，兒科接種時尤其如此。然而同時，由于以下因素其制造較為困難抗原和其他組分之間的物理和生化屬性不相容；免疫干擾；以及穩(wěn)定性。疫苗中必須含有非抗原組分，但這可能造成困難。表面活性劑尤其會給組合疫苗造成問題，這是由于一種抗原可能需要能獲得最佳活性的表面活性劑，而這種表面活性劑可能會對其他抗原造成負面影響。此外，兒科疫苗中所含的表面活性劑對一些患者群體可能會造成影響，盡管通常認為這些表面活性劑是安全的。在疫苗領域中特別感興趣的是聚氧乙烯山梨糖醇酐酯類表面活性劑，尤其是聚山梨醇酯20(也稱為"吐溫20"，或聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯)和聚山梨醇酯80(也稱為"吐溫80"，或聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)。聚山梨醇酯20已用于單價HAVRIXtm甲肝疫苗，聚山梨醇酯80已用于組合疫苗，如5TRIPEDIAtm和INFANRIXtm系列的疫苗。這兩種表面活性劑也已被用于穩(wěn)定液態(tài)輪狀病毒疫苗[2]。聚山梨醇酯還被用于制造含有乙肝表面抗原('HbsAg，)的組合疫苗，例如參考文獻3和4描述了制造四價D-T-P-HBsAg疫苗的方法，其中通過加入非離子型表面活性劑如吐溫20、吐溫80或TritonX-100以避免干擾HbsAg的磷脂組分。參考文獻3和4圖2(本文的圖l)中的數(shù)據(jù)顯示，表面活性劑是維持HBsAg抗原性所必需的，但對于其他組分則不十分重要。在20|ig/mlHbsAg時檢測到的最高表面活性劑濃度為10pg/ml，這時也得到最佳抗原性。在參考文獻3和4的方法中，非離子型去污劑在已將HbsAg純化之后加入。然而在純化HbsAg之后加入去污劑不是最佳的，因為這在制造過程中需要單獨的加工步驟，從而延長了加工時間并增加了在HBsAg中引入污染物的風險。如果在制造組合疫苗時使用污染的組分，則最終的損失將大于制造單價疫苗時丟棄HBsAg，例如，如果將污染的HBsAg組分與干凈的D-T-P組分混合則不得不將全部D-T-P-HbsAg混合物丟棄。因此，對于含有非離子型表面活性劑的組合疫苗而言，仍舊需要有在制造過程中不需要將表面活性劑作為單獨組分加入的制造方法。發(fā)明概述相比將非離子型表面活性劑加入已純化的抗原[3，4]，本發(fā)明在抗原純化期間使用它們。因此，這種表面活性劑可在最終的組合疫苗中發(fā)揮其功能，但污染風險(以及制得之后丟棄所有組合疫苗的風險)被降低。因此，本發(fā)明提供了一種制備組合疫苗的方法，其中所述疫苗包含(i)非離子型表面活性劑，(ii)乙肝病毒(HBV)表面抗原，和(iii)至少一種非-HBV病原體的抗原，其中，所述方法包括(i)從重組酵母細胞純化HBV表面抗原，其中所述純化包括在存在非離子型表面活性劑時破壞酵母細胞，以得到純化的HBsAg組分的步驟；和(ii)將純化的HBsAg組分與至少一種其他非-HBV病原體的抗原組合，以得到所述組合疫苗。為避免上述污染難題，該方法不包括在HBsAg純化之后將非離子型表面活性劑作為單獨組分加入的步驟。表面活性劑(或其他離子型或非離子型表面活性劑)也可能存在于其他抗原組分中，HBsAg將與所述其他抗原組分組合以得到組合疫苗，但應避免在HBsAg中加入作為單獨組分的表面活性劑。因此，表面活性劑不作為單獨組分加入純化的HBsAg組分，且不在抗原組合期間加入。本發(fā)明還提供了一種制備組合疫苗的方法，其中所述疫苗包含(i)非離子型表面活性劑，(ii)乙肝病毒(HBV)表面抗原，和(iii)至少一種非-HBV病原體的抗原，其中，所述方法包括將純化的HBV表面抗原與至少一種其他非-HBV病原體的抗原組合，以得到組合疫苗的步驟，其中所述純化的HBV表面抗原是通過在存在非離子型表面活性劑時破壞表達重組HBsAg的酵母細胞的方法制備的。同樣，避免單獨加入表面活性劑。本發(fā)明還提供了一種免疫原性組合物，其包含(i)非離子型表面活性劑，(ii)乙肝病毒(HBV)表面抗原，和(iii)至少一種非-HBV病原體的抗原，其中所述HBV表面抗原是通過在存在非離子型表面活性劑時破壞表達重組HBsAg的酵母細胞的方法制備的。同樣，制備HBsAg時避免單獨加入表面活性劑。由于純化過程中使用的非離子型表面活性劑可保留在HBsAg顆粒中，因此該產品不同于HBsAg是用其他不同方法制得的產品。絲預表臓,本發(fā)明可使用各種非離子型表面活性劑[5]，尤其是疫苗制劑中可找到的那些。優(yōu)選有機表面活性劑。這些通常是環(huán)氧垸(例如環(huán)氧乙烷)與脂肪醇、脂肪酸、烷基酚、烷基胺或其他具有至少一個活性氫原子的合適化合物的反應產物。對于大多數(shù)表面活性劑而言，最常見的醇、胺和酸的碳鏈長度為C8-C18。最常見的烷基酚是壬基酚和辛基酚。含有聚(氧乙烯)殘基的表面活性劑最為優(yōu)選。例如，本發(fā)明可采用的表面活性劑包括，但不限于聚氧乙烯山梨糖醇酐酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，尤其是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80;環(huán)氧乙烷(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，其以商品名DOWFAXtm出售，如線形EO/PO嵌段共聚物；重復乙氧基(氧代-l,2-乙二基)數(shù)目可變的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇-9(TritonX-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);衍生自月桂基、十六烷基、十八烷基和油烯基醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為Brij表面活性劑)，如三乙二醇單月桂基醚(Brij30);和山梨糖醇酐酯(通常稱為SPAN)，如山梨糖醇酐三油酸酯(Span85)和山梨糖醇酐單月桂酸酯。聚山梨醇酯20特別適用于本發(fā)明。該表面活性劑給予人類，包括用于疫苗的安全性已經得到證實。表面活性劑可根據(jù)其'HLB'(親水性/親脂性平衡)分類。優(yōu)選的本發(fā)明的表面活性劑的HLB至少為10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16。非離子型表面活性劑是本發(fā)明組合物的一種組分。為避免給患者施用大劑量的表面活性劑，表面活性劑在組合物中的濃度優(yōu)選不超過30pg/ml，例如《25嗎/ml，《20嗎/ml，《15pg/ml，《10嗎/ml，《5pg/ml，等等。優(yōu)選濃度《10嗎/ml。作為表示表面活性劑濃度的另一種方法，組合物中表面活性劑的量優(yōu)選小于50嗎(例如《40嗎，《30嗎，《25pg，《20嗎，《15嗎，《10嗎，等等)/100嗎HBsAg。類似地，參考文獻3和4建議表面活性劑與HBsAg的質量比小于50%。優(yōu)選每IOO嗎HBsAg含小于25嗎表面活性劑。如下文將更加詳細描述的，優(yōu)選的本發(fā)明方法采用含白喉和破傷風類毒素的預混組分。這種D-T組分優(yōu)選基本不含非離子型表面活性劑，且尤其不含聚山梨醇酯20和80。類似的，預混D-T-Pw組分不含非離子型表面活性劑例如聚山梨醇酯20和80。z:條毒表麟嚴乙肝病毒(HBV)是一種已知的造成病毒性肝炎的物質。HBV病毒顆粒由被外部蛋白質外殼或衣殼包裹的內部核心構成。病毒核心含有病毒DNA基因組。衣殼的主要成份是一種稱為HBV表面抗原，或者更通常稱為'HBsAg'的蛋白質，這是一種分子量約為24kDa的由226個氨基酸構成的蛋白質。所有現(xiàn)有乙肝疫苗均含HBsAg，當這種抗原被給予接種者時它能刺激產生抗-HbsAg抗體從而抵抗HBV感染。為制造疫苗，可用兩種方法制備HBsAg。第一種方法涉及從慢性乙肝攜帶者的血漿中純化特定形式的抗原，這是因為慢性乙肝攜帶者的肝臟中會合成大量HBsAg并在HBV感染期間釋放到血流中。第二種方法涉及通過重組DNA法表達蛋白質。可用任何一種方法制備用于本發(fā)明方法的HBsAg，但優(yōu)選采用通過重組表達制備的HBsAg。具體地說，優(yōu)選HBsAg是通過在酵母如酵母屬(如釀酒酵母(S.cwvWae))或漢森酵母屬(如多形漢森酵母(/^o/;;mow^》中表達制備的。不同于天然HBsAg(即質粒純化產品中的HBsAg)，酵母表達的HBsAg通常是非糖基化的，且這是可用于本發(fā)明的最優(yōu)選的HBsAg形式。酵母表達的HBsAg是高度免疫原性的，且制造時沒有血液產品污染風險。HBsAg通常為基本球形顆粒(平均直徑約20nm)的形式，其中含有包含磷脂的脂質基質。酵母表達的HBsAg顆?？珊性谔烊籋BV病毒顆粒中未發(fā)現(xiàn)的磷脂酰肌醇。該顆粒也可含有非毒性量的LPS以刺激免疫系統(tǒng)[6]。HBsAg優(yōu)選來自HBV亞型adw2。本領域已知許多純化HBsAg的方法(例如見參考文獻7-33)。這些方法被披露用于制造單價HBsAg制品，但不同于參考文獻3和4中描述的方法，這些方法無一涉及純化具體用于組合疫苗的HBsAg。這些以及其他方法都可使用，只要它們適用于在重組酵母細胞中表達之后純化抗原，其中所述純化包括在存在非離子型表面活性劑時破壞酵母細胞的步驟。細胞破碎后純化HBsAg的優(yōu)選方法包括超濾；排阻層析；陰離子交換層析；超速離心；脫鹽；和無菌過濾。細胞破碎后可將裂解液沉淀(例如采用聚乙二醇)，將HBsAg留在溶液中以準備超濾。純化之后可對HBsAg進行透析(例如用半胱氨酸)，透析可用來除去任何含汞防腐劑，如制備HBsAg時可能采用的硫柳汞[30，34]。HBsAg的量通常以微克表示，每劑疫苗中HBsAg的典型含量為10嗎。除了序列外，表面抗原可包含全部或部分前-S序列，如全部或部分前-Sl和/或前-S2序列。養(yǎng)朋F拔嚴本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少一種來自至少一種非-HBV病原體的保護性抗原。所述非-HBV病原體可以是病毒和/或細菌。典型的病毒病原體包括，但不限于脊髓灰質炎病毒；甲肝病毒；流感病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；風疹病毒；和水痘帶狀皰疹病毒。典型的細菌病原體包括，但不限于白喉棒狀桿菌(Cw7"e6flc^7'ww梭菌(C/oWr，百日咳博德特氏菌(SoWefe〃a流感嗜血桿菌(i/aewo;^7ws/"y/we"zae)，包括b型和無法分型菌株；腦膜炎奈瑟氏球菌(A^wen'awe"/"g加(^)，包括血清群A、B、C、W135和/或Y;肺炎鏈球菌OS^印tococcws;wewmo"/ae)，包括血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F;以及粘膜炎莫拉氏菌(^0^16//<7catorWafe)。白喉棒狀桿菌造成白喉。可對白喉毒素進行處理(例如采用福爾馬林或甲醛)以除去毒性同時保留在注射后誘導特異性抗-毒素抗體的能力。這些白喉類毒素被用于白喉疫苗并更加詳細地描述于參考文獻1的第13章。優(yōu)選的白喉類毒素是通過甲醛處理的那些?？墒拱缀戆魻顥U菌在可添加有牛提取物的生長培養(yǎng)基(例如，F(xiàn)enton培養(yǎng)基或者Linggoud和Fenton培養(yǎng)基)中生長，然后進行甲醛處理、超濾和沉淀以得到白喉類毒素。然后用包括無菌過濾和/或滲析的方法處理類毒素化的材料。破傷風梭菌造成破傷風?？蓪ζ苽L毒素進行處理以得到保護性類毒素。該類毒素可用于破傷風疫苗并更加詳細描述于參考文獻1的第27章。優(yōu)選的破傷風類毒素是經過甲醛處理的那些?？墒蛊苽L梭菌在生長培養(yǎng)基(例如，衍生自牛酪蛋白的Latham培養(yǎng)基)中生長，然后進行甲醛處理、超濾和沉淀以得到破傷風類毒素。然后可用包括無菌過濾和/或滲析的方法處理該材料。百日咳博德特氏菌會造成百日咳。疫苗中的百日咳抗原是細胞抗原(全細胞，以滅活的百日咳桿菌細胞的形式；'wP')或無細胞抗原('aP')。有細胞百日咳抗原的制備已充分論述[例如見參考文獻1的第21章]，例如可通過熱滅活百日咳桿菌I期培養(yǎng)物來獲得。當釆用無細胞抗原時，優(yōu)選采用以下抗原中的一種、兩種或(優(yōu)選)三種(1)解毒的百日咳毒素(百日咳類毒素，或'PT，)；(2)絲狀血凝素('FHA，)；(3)黏附素(pertactin)(也稱為'69kDa外膜蛋白，)。這三種抗原優(yōu)選從生長在改良的Stainer-Scholte液體培養(yǎng)基中的百日咳桿菌培養(yǎng)物中分離來制備。PT和FHA可從發(fā)酵肉湯中分離(例如通過吸附到羥基磷灰石凝膠上)，而黏附素可通過熱處理和絮凝從細胞中提取(例如采用氯化鋇)。可在連續(xù)層析和/或沉淀步驟中純化抗原。PT和FHA可通過例如疏水層析、親和層析和排阻層析來純化。黏附素可通過例如離子交換層析、疏水層析和排阻層析來純化。FHA和黏附素在用于本發(fā)明之前可用甲醛處理。PT優(yōu)選用甲醛和/或戊二醛處理來解毒。除了這種化學解毒方法，PT還可以是酶活性已通過突變而降低的PT突變體[35]，但優(yōu)選通過化學處理來解毒。b型流感嗜血桿菌('Hib')會造成細菌性腦膜炎。Hib疫苗通?；谇v膜糖抗原[例如參考文獻l的第14章]，其制備已經充分論述[例如參考文獻36-45]。Hib糖類可偶聯(lián)于載體蛋白以增強其免疫原性，尤其是在兒童中的免疫原性。典型的載體蛋白有破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉類毒素的CRM197衍生物、流感嗜血桿菌D蛋白、以及來自血清群B腦膜炎球菌的外膜蛋白復合物。破傷風類毒素是優(yōu)選的載體，如用于通常稱為'PRP-T，的產品。制備PRP-T時可采用溴化氰活化Hib莢膜多糖，將活化的糖類偶聯(lián)于己二酸接頭(如(l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)，通常為鹽酸鹽)，然后使接頭-糖類部分與破傷風類毒素載體蛋白反應。偶聯(lián)物的糖類部分可包含從Hib菌制備的全長聚核糖基核糖醇磷酸(PRP)，和/或全長PRP的片段?？刹捎玫呐悸?lián)物中糖類:蛋白質的比例(w/w)在l:5(即蛋白質過量)和5:1(即糖類過量)之間，例如，比例在1:2和5:1之間以及比例在1:1.25和1:2.5之間。然而，在優(yōu)選的疫苗中，糖與載體蛋白的重量比在1:2和1:4之間，優(yōu)選在1:2.5和1:3.5之間。在破傷風類毒素同時作為抗原和載體蛋白的疫苗中，偶聯(lián)物中糖與載體蛋白的重量比可在1:0.3和1:2之間[46]。給予Hib偶聯(lián)物優(yōu)選導致抗-PRP抗體濃度》0.15嗎/ml，更優(yōu)選》lpg/ml，這些是標準的反應閥值。腦膜炎奈瑟氏球菌造成細菌性腦膜炎。根據(jù)生物體的莢膜多糖已經鑒定出腦膜炎奈瑟氏球菌的各種血清群，包括A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z。與疾病最為相關的血清群是A、B、C、W135和Y。目前針對血清群A、C、W135和Y的疫苗基于莢膜糖抗原，但這種方法不適用于血清群B，因此采用蛋白抗原和外膜囊泡作為替代。莢膜糖被偶聯(lián)于載體蛋白以增強免疫原性。典型的載體蛋白是破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉類毒素的CRM197衍生物以及流感嗜血桿菌D蛋白。偶聯(lián)物的糖部分可包含從腦膜炎球菌制備的全長糖類和/或其片段。血清群C糖類可從OAc+或OAc-菌株制備。對于血清群A糖類，在C-3位優(yōu)選至少50%(例如至少60%、70%、80%、90%、95%或更多)的甘露糖胺殘基被O-乙?；？刹捎玫哪X膜炎球菌偶聯(lián)物中糖類:蛋白質的比例(w/w)在1:10(即蛋白質過量)和10:1(即糖類過量)之間，例如，比例可在1:5禾口5:1之間、在1:2.5禾卩2.5:1之間、或在1:1.25禾口1.25:1之間。會合予腦膜炎球菌偶聯(lián)物優(yōu)選導致相關血清組的血清殺菌測定(SBA)效價提高至少4倍，優(yōu)選至少8倍。SBA效價可用幼兔補體或人補體測量[47]。肺炎鏈球菌造成細菌性腦膜炎。對于Hib和腦膜炎球菌而言，現(xiàn)有疫苗基于莢膜糖類。優(yōu)選包含來自一種以上肺炎鏈球菌的血清型的糖類，且尤其至少包含血清型6B、14、19F和23F。此外，血清型優(yōu)先選自1、3、4、5、7F、9V和18C。例如，23種不同血清型多糖的混合物被廣泛使用，與5-ll種不同血清型多糖形成的偶聯(lián)疫苗也被廣泛使用[48]。例如，PrevNarTM[49]含有7種血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的偶聯(lián)抗原。糖類優(yōu)選偶聯(lián)于載體蛋白[例如參考文獻50-52]。典型的載體蛋白是破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉類毒素的CRM197衍生物以及流感嗜血桿菌D蛋白。PrevNarTM產品中的糖類通過還原性胺化單獨偶聯(lián)于CRM197，每0.5ml劑量中含2pg各種糖類(4pg血清型6B)。除了使用肺炎球菌的糖抗原外，組合物中還可包含一種或多種多肽抗原。肺炎球菌若干菌株的基因組序列是可獲得的[53,54]并可對其進行逆向疫苗學研究(reversevaccinology)[55-58]以鑒定合適的多肽抗原[59,60]。例如，組合物可包含以下抗原中的一種或多種PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Spl25、SplOl、Spl28、Spl30和Sp130，如參考文獻61中所定義。組合物可包含一種以上(例如2、3、4、5、6、7、8、910、11、12、13或14)這些抗原。在一些實施方式中，組合物可同時包含肺炎球菌的糖抗原和多肽抗原?？蓪⑺鼈兒唵位旌?，或者可將肺炎球菌糖抗原偶聯(lián)于肺炎球菌蛋白質。用于該實施方式的合適載體蛋白包括上述肺炎球菌蛋白抗原[61]。粘膜炎莫拉氏菌造成中耳炎和竇炎，有時也造成喉炎。其疫苗目前正在研究，如參考文獻62所作的綜述。像HBV—樣，HAV造成肝炎。HAV疫苗描述于參考文獻1的第15章。優(yōu)選的HAV組分基于滅活的病毒，并可通過福爾馬林處理來實現(xiàn)滅活。病毒可生長在人胎肺二倍體成纖維細胞如MRC-5細胞上。優(yōu)選的HAV毒株是HM175，盡管也可采用CR326F。可在允許病毒生長的條件下培養(yǎng)細胞。將細胞裂解，并通過超濾和凝膠滲透層析來純化所得懸浮液。脊髓灰質炎病毒造成骨髓灰質炎。除了使用口服脊髓灰質炎病毒疫苗，本發(fā)明采用了滅活的脊髓灰質炎病毒疫苗(IPV)，如參考文獻1第24章的詳細描述所披露。脊髓灰質炎病毒可在細胞培養(yǎng)物中生長，優(yōu)選的培養(yǎng)物采用衍生自猴腎的Vero細胞系。Vero細胞宜作為培養(yǎng)的微載體。生長之后，可采用諸如超濾、滲濾和層析之類的技術純化病毒粒子。施用于患者之前，脊髓灰質炎病毒必需被滅活，這可通過用甲醛處理來實現(xiàn)。骨髓灰質炎可由三種類型的脊髓灰質炎病毒中的一種造成。這三種類型是類似的并造成相同的癥狀，但它們的抗原性迥異，被一種類型感染不會產生對其他類型感染的抵抗力。因此本發(fā)明優(yōu)選采用三種脊髓灰質炎病毒抗原1型脊髓灰質炎病毒(例如Mahoney毒株)、2型脊髓灰質炎病毒(例如MEF-1毒株)，和3型脊髓灰質炎病毒(例如Saukett毒株)。優(yōu)選將病毒單獨培養(yǎng)、純化和滅活，然后合并以得到大量用于本發(fā)明的三價混合物。IPV的量通常用<DU，單位("D-抗原單位"[63])表示。抵抗麻疹、腮腺炎和風疹病毒的抗原通常為活病毒，如在已知的單價和三價('MMR')疫苗中所發(fā)現(xiàn)的。麻疹病毒疫苗更加詳細描述于參考文獻1的第19章。腮腺炎病毒疫苗更加詳細描述于參考文獻1的第20章。風疹病毒疫苗更加詳細描述于參考文獻1的第26章。典型的麻疹病毒株包括Moraten;Co皿aught;Schwarz;Edmonston隱Zagreb;CAM隱70;AIK-C;TD97;Leningrad-16;Shanghai-191;等等。Schwarz和Moraten毒株在美國和歐洲最常使用。典型的腮腺炎病毒株包括JerylLynn;RIT4385;Urabe;Hoshino;Rubim;Leningrad-3;Leningrad-Zagreb;Miyahara;Torii;NKM-46;S-12;等等。JerylLynn、RIT4385、Urabe和Leningrad-Zagreb毒株是全世界最常見的毒株。典型的風疹病毒株包括RA27/3;Matsuba;TCRB19;Takahashi;Matsuura;TP-336;等等。RA27/3是西方國家最常使用的毒株。抵抗禽痘的VZV抗原通常是基于病毒Oka毒株的活病毒。VZV疫苗更詳細描述于參考文獻l的第28章。流感病毒抗原更詳細描述于參考文獻1的第17和18章。廣而言之，流感病毒疫苗可基于活病毒或滅活病毒，而滅活疫苗可基于全病毒、'裂解'病毒或純化的表面抗原(包括血凝素和神經氨酸酶)。用來制備疫苗的病毒可生長在雞蛋或細胞培養(yǎng)物上。流感病毒的疫苗株可隨季節(jié)而改變。在目前的國際大流行期間，疫苗通常包含兩種甲型流感病毒株(H1N1和H3N2)和一種乙型流感病毒株，通常為三價疫苗。本發(fā)明還可使用流行性毒株的病毒(即疫苗接受者和普通人群對其無免疫力的毒株)，如H2、H5、H7或H9毒株亞型(尤其是甲型流感病毒)，且針對流行性毒株的流感疫苗可以是單價的或者可基于添加有流行性毒株的常規(guī)三價疫苗。流感病毒可以是重配株，并且可通過反向遺傳學技術獲得。病毒可以是減毒的。病毒可以是溫敏的。病毒可以是冷適應的。用于疫苗的這些病原體的抗原性組分通常用以下縮寫名稱表示'D'表示白喉類毒素；T表示破傷風類毒素；'P'表示百日咳抗原，'Pa'為無細胞的，而'Pw'為細胞的；'Hib'表示b型流感嗜血桿菌莢膜糖；'MenA'、'MenB'、'MenC'、'MenW'和'MenY'表示各種腦膜炎球菌血清群；'IPV'表示滅活的脊髓灰質炎病毒；而'Spn'表示月巿炎球菌。當將抗原性組分與HBsAg組合以制備多價組合物時，抗原可分別加入或在與HBsAg組合之前將它們預混。當使用D和T抗原時，優(yōu)選使用預混的D-T組分。這種二價組分可用于本發(fā)明方法，例如可將它與HBsAg組合以制造三價D-T-HBV組分。替代方法為，可將D-T組分與其它非-HBV抗原(例如與無細胞百日咳抗原)組合，然后可將該組分與HBsAg組合，等等。當使用D、T和Pw抗原時，優(yōu)選使用預混的D-T-Pw組分，然后將該組分用于本發(fā)明方法。當本發(fā)明組合物中含有佐劑時，佐劑可在各種階段加入。通常，先將抗原與佐劑組合然后再用于本發(fā)明方法(例如可將二價D-T混合物吸附到鋁鹽佐劑上，然后再用于本發(fā)明方法，可通過單獨制備類毒素、將它們各自吸附到氫氧化鋁佐劑上、然后混合兩種吸附的類毒素(任選加入其他佐劑)，從而得到用于本發(fā)明方法的材料)，但也可以先混合抗原然后再加入佐劑，或者將抗原加入佐劑(例如從水性佐劑開始，然后加入單獨的或預混的抗原)。如下文所述，優(yōu)選將HBsAg組分吸附到磷酸鋁佐劑上，然后再與非-HBV抗原性組分混合。除HBsAg外，優(yōu)選的本發(fā)明組合物至少包含D、T和P抗原(見參考文獻3和4)。特別優(yōu)選的組合物具有以下組合-HBsAg、D、T-HBsAg、D、T、Pw-HBsAg、D、T、Pw、Hib<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>-HBsAg、Hib-HBsAg、甲肝病毒這些組合物可由所列抗原構成，或者還可含有其他病原體的抗原。因此它們可單獨使用或作為其他疫苗的組分。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述組合物不是5價D-T-Pa-HBV-IPV[30]。因此該組合物可包含Pw組分和/或至少一種偶聯(lián)物。絲優(yōu)選的本發(fā)明的免疫原性組合物包含佐劑，且該佐劑優(yōu)選包括一種或多種鋁鹽，且尤其是磷酸鋁佐劑和/或氫氧化鋁佐劑。用于本發(fā)明方法的抗原性組分優(yōu)選在使用前含有鋁佐劑，即它們被'預混合'或'預吸附'到佐劑上。在含有HBsAg和白喉類毒素的組合物中，所述白喉類毒素可被吸附于氫氧化鋁佐劑。在含有HBsAg和破傷風類毒素的組合物中，所述破傷風類毒素可被吸附于氫氧化鋁佐劑，但這不是必需的(例如可吸附破傷風類毒素重量的0-10%)。在含有HBsAg和全細胞百日咳抗原的組合物中，所述wP抗原優(yōu)選與氫氧化鋁佐劑和/或磷酸鋁佐劑組合。在含有HBsAg和無細胞百日咳抗原的組合物中，所述百日咳抗原可被吸附于一種或多種鋁鹽佐劑，或者可以未吸附狀態(tài)加入。當組合物中存在黏附素時則優(yōu)選在用于本發(fā)明方法之前吸附于氫氧化鋁佐劑。PT和FHA可被吸附于氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁，然后再用于本發(fā)明的方法。在優(yōu)選的實施方式中，PT、FHA和黏附素可單獨預吸附于氫氧化鋁，然后再用于本發(fā)明的方法。在含有HBsAg和Hib抗原的組合物中，所述Hib偶聯(lián)物可以是未吸附的，但優(yōu)選吸附于磷酸鋁佐劑[64]。用這種方法吸附對于含有D-T-Pw-Hib-HBsAg抗原的疫苗尤其有效。其他偶聯(lián)抗原(例如腦膜炎球菌，肺炎球菌)可類似地吸附于鋁鹽(例如磷酸鹽)或者可以是未吸附的[65]。IPV抗原在用于本發(fā)明方法之前通常不吸附于任何佐劑，但它們可與其他組分一起吸附于鋁佐劑。可采用參考文獻66中描述的方法將組合物中的HBsAg吸附于磷酸鋁。吸附于磷酸鋁不同于熟知的ENGERTX-BTM產品(其中HBsAg被吸附于氫氧化鋁)，但與HEPACCINEtm和RECOMBIVAXTM產品相同。如參考文獻61中所提到的，對于HBsAg而言磷酸鋁是優(yōu)于氫氧化鋁的佐劑。盡管在最終的疫苗中HBsAg可被吸附于氫氧化鋁佐劑(如在熟知的ENGERIX-BTM產品中那樣)，或者可保持未吸附，但通常將吸附于磷酸鋁佐劑。此外，優(yōu)選先預吸附于磷酸鋁再用于本發(fā)明方法。當本發(fā)明方法采用先將白喉和破傷風類毒素混合再將它們與HBsAg組合而得到的組分時，這種D-T混合物優(yōu)選含有吸附有D和T抗原的氫氧化鋁佐劑。當本發(fā)明方法采用先將白喉類毒素、破傷風類毒素和全細胞百日咳抗原混合再將它們與HBsAg組合而得到的組分時，這種D-T-Pw混合物優(yōu)選同時含有吸附有D和T抗原的氫氧化鋁佐劑和磷酸鋁佐劑。目前使用的鋁佐劑通常被稱為"氫氧化鋁"或"磷酸鋁"佐劑。然而這些只是為方便起見而取的名字，它們都沒有準確描述所存在的實際化合物(例如參見16參考文獻68的第9章)。本發(fā)明可采用通常用作佐劑的任何"氫氧化物"或"磷酸鹽,，被稱為"氫氧化鋁"的佐劑通常為鋁的羥基氧化物鹽類，其通常至少部分為晶體狀的。鋁的羥基氧化物可表示為A10(OH)，通過紅外(IR)光譜，尤其是通過1070cm'1出現(xiàn)的吸收帶和3090-3100cm"出現(xiàn)的強肩峰可將其與其它鋁化合物如氫氧化鋁A1(0H)3區(qū)別開[參考文獻68的第9章]。被稱為"磷酸鋁"的佐劑通常為鋁的羥基磷酸鹽，經常還含有少量硫酸鹽。它們可通過沉淀獲得，沉淀期間的反應條件和濃度會影響磷酸根對鹽中羥基的取代程度。羥基磷酸鹽中P04/A1的摩爾比通常在0.3和0.99之間。羥基磷酸鹽因存在羥基而不同于嚴格的A1P04。例如，3164cm"處的IR光譜條帶(例如當加熱至20(TC時)證明存在結構性羥基[參考文獻68的第9章]。磷酸鋁佐劑的P(VA產摩爾比通常為0.3-1.2，優(yōu)選0.8-1.2，更優(yōu)選0.95士0.1。磷酸鋁通常是無定形的，尤其對于羥基磷酸鹽而言。典型的佐劑一般為無定形羥基磷酸鋁，其中P04/A1摩爾比為0.84-0,92，包含0.6mgAl3+/ml。磷酸鋁通常是顆粒?？乖胶笃漕w粒的直徑一般為0.5-20pm(如約5-10pm)。磷酸鋁的PZC與用磷酸根取代羥基的程度成反比，這種取代程度可隨著用于通過沉淀制備鹽的反應條件和反應物濃度而改變。也可通過改變溶液中游離磷酸根離子的濃度(磷酸根越多-PZC的酸性越強)或通過加入緩沖液如組氨酸緩沖液(使PZC的堿性更強)來改變PZC。用于本發(fā)明的磷酸鋁的PZC通常為4.0-7.0,更優(yōu)選5.0-6.5，如約5.7。用于制備本發(fā)明組合物的磷酸鋁溶液可(但不必須)含有緩沖液(如磷酸鹽或組氨酸緩沖液或Tris緩沖液)。磷酸鋁溶液優(yōu)選無菌和無熱原。磷酸鋁溶液可包含游離的水性磷酸根離子，如以濃度為1.0-20mM，優(yōu)選為5-15mM，更優(yōu)選約為10mM存在的水性磷酸根離子。磷酸鋁溶液也可包含氯化鈉。氯化鈉濃度優(yōu)選為0.1-100mg/ml(如0.5-50mg/ml，l-20mg/ml，2-10mg/ml)，更優(yōu)選約為3±1mg/ml。存在NaCl有助于在吸附抗原之前正確測定pH。在一些實施方式中，本發(fā)明可將含有含聚山梨醇酯80、Span85和鯊烯混合物的水包油乳劑的組合物排除在外[69]。在一些實施方式中，本發(fā)明可將含有油、a-生育酚和聚山梨醇酯80混合物的組合物排除在外[70]。在一些實施方式中，本發(fā)明可將含皂苷佐劑(如QS21)和非離子型表面活性劑(如聚山梨醇酯40、60或80)的組合物排除在外。在一些實施方式中，本發(fā)明可將含皂苷佐劑、可代謝的油和非離子型表面活性劑的組合物排除在外[71]。在一些實施方式中，本發(fā)明可將含皂苷佐劑、水包油乳劑和固醇的組合物排除在外[72]。在一些實施方式中，本發(fā)明可將含3d-MPL、QS21、甘油三酯和水包油乳劑的組合物排除在外[73]。錄歸鵬々絲離維遂會本發(fā)明方法包括將純化的HBsAg與至少一種非-HBV病原體的至少一種抗原組合的步驟?？乖梢来螁为毥M合，或者可將它們預混并一起加入。例如，制造4價DTP-HBsAg疫苗的方法可包括在容器中依次加入HBsAg、D、T和P抗原，或者先預混D、T和P抗原然后將HBsAg與DTP混合物組合?？乖越M分可以任何合適順序組合。非-HBV病原體的抗原可包含表面活性劑，這種表面活性劑可與純化HBsAg時使用的非離子型表面活性劑相同或不同。當其他抗原性組分包含表面活性劑時本發(fā)明的方法尤其有用，因為這樣可避免加入表面活性劑的多個單獨步驟。一種或多種非-HBV組分包含聚山梨醇酯80的方法是優(yōu)選的。當本發(fā)明組合物中含有白喉和破傷風類毒素時，優(yōu)選將它們預混后再與HBsAg組合。因此，本發(fā)明方法包括將含有HBsAg的第一組分與含有D和T抗原的第二組分組合。類似地，當組合物中含有白喉類毒素、破傷風類毒素和全細胞百日咳抗原時，優(yōu)選將它們預混，因此本發(fā)明的方法包括將含有HBsAg的第一組分與含有D、T和Pw抗原的第二組分組合。當使用D-T混合物時，本發(fā)明疫苗中白喉類毒素與破傷風類毒素的比例通常在2:l和3:l之間(以Lf為單位測量)，優(yōu)選在2.4:1和2.6:1之間，更優(yōu)選為2.5:1。當本發(fā)明組合物含有佐劑時，佐劑也可以在不同階段加入。通常，先混合抗原與佐劑再用于本發(fā)明方法(例如先將二價D-T混合物吸附于鋁鹽佐劑再用于本發(fā)明方法)，當也可以在將抗原混合之后再加入佐劑或先將抗原加入佐劑(例如從水性佐劑開始，然后加入單獨的或預混的抗原)。如上文所述，優(yōu)選將HBsAg組分吸附到磷酸鋁佐劑，然后再與非-HBV抗原性組分組合。資練勞本發(fā)明組合物可包含(a)抗原性組分；和(b)非抗原性組分。所述抗原性組分可包含上述抗原或由上述抗原構成。所述非抗原性組分可包括載體、佐劑、賦形劑、緩沖劑，等等，下文將更加詳細描述。這些非抗原性組分可具有各種來源。例如，它們可存在于制造期間使用的一種抗原或佐劑材料中或者可獨立于那些組分而加入。優(yōu)選的本發(fā)明組合物包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。為控制張力，優(yōu)選包含生理鹽，如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，其含量可以為l-20mg/ml。組合物的重量克分子滲透濃度將在200mOsm/kg和400mOsm/kg之間，優(yōu)選240-360mOsm/kg，且更優(yōu)選為2卯-320mOsm/kg。之前已報道稱重量克分子滲透濃度對于接種造成的疼痛沒有影響[74]，盡管如此將重量克分子滲透濃度保持在該范圍內是優(yōu)選的。本發(fā)明的組合物可含有一種或多種緩沖液。典型的緩沖液包括磷酸緩沖液；Tris緩沖液；硼酸緩沖液；琥珀酸緩沖液；組氨酸緩沖液；或檸檬酸緩沖液。緩沖液的含量通常為5-20mM。本發(fā)明組合物的pH通常在5.0和7.5之間，為得到最佳的穩(wěn)定性更通常在5.0和6.0之間，或當存在白喉類毒素和/或破傷風類毒素時在6.0和7.0之間。因此，本發(fā)明的方法在包裝之前可包括調節(jié)半成品疫苗的pH的步驟。本發(fā)明的組合物優(yōu)選是無菌的。本發(fā)明的組合物優(yōu)選是無熱原的，例如含有<1EU(內毒素單位，標準測量)/劑，優(yōu)選0.1EU/劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選不含谷蛋白。由于HBsAg的吸附特性，最終的疫苗產品可以是具有絮狀外觀的懸浮液。這種外觀意味著不容易看見微生物污染，因此疫苗中優(yōu)選含有防腐劑。當將疫苗包裝在多劑量容器中時這特別重要。優(yōu)選包含的防腐劑是2-苯氧乙醇和硫柳汞。然而如果可能本發(fā)明方法不使用汞防腐劑(例如硫柳汞)。因此，用于所述方法的一種到所有組分可基本不含汞防腐劑(尤其是二價D-T組分；IPV組分；偶聯(lián)組分)。然而，如果先用這種防腐劑處理組分(尤其是HBsAg)再用于本發(fā)明則不可避免會含有痕量防腐劑。然而為安全起見，優(yōu)選最終組合物中含有少于約25ng/ml汞。更優(yōu)選地，最終疫苗產品含有不可檢測的硫柳汞。這通?？赏ㄟ^先除去抗原制品中的汞防腐劑再將其用于本發(fā)明方法或者在制備用于制造組合物的組分時避免使用硫柳汞而實現(xiàn)。當本發(fā)明方法采用二價D-T混合物時，它應不含硫柳汞。在一些實施方式中，D-T混合物可含有2-苯氧乙醇，但在其他實施方式中它不含硫柳汞和2-苯氧乙醇。當本發(fā)明方法采用三價D-T-Pw混合物時，它可不含2-苯氧乙醇，但可含有硫柳汞。制造期間，通常用WPI(注射用水)稀釋組分以得到所需的最終濃度。以A產表示，本發(fā)明組合物中磷酸鋁的濃度優(yōu)選小于5mg/ml，例如《4mg/ml，《3mg/ml，《2mg/ml，《1mg/ml，等等。本發(fā)明組合物中HBsAg的濃度優(yōu)選小于60pg/ml，例如《55嗎/ml，《50^g/ml，《45pg/ml，《40嗎/ml，等等。典型濃度約20)ig/ml。本發(fā)明組合物中白喉類毒素的濃度通常至少為50IU/ml。本發(fā)明組合物中破傷風類毒素的濃度通常至少為100IU/ml。本發(fā)明組合物中白喉類毒素與破傷風類毒素的比例通常在2:1和3:1之間(以Lf為單位測量)，優(yōu)選在2.4:1和2.6:1之間，更優(yōu)選為2.5:1。本發(fā)明組合物中wP抗原的量通常至少為8IU/ml。以糖計，本發(fā)明組合物中Hib偶聯(lián)物的量通常在10和30pg/ml之間。以EU(Elisa單位)計，HAV抗原的量通常至少為600EU/ml。IPV抗原的量取決于毒株的血清型。對于1型病毒，組合物通常含有約80DU/ml。對于2型病毒，組合物通常含有約16DU/ml。對于3型病毒，組合物通常含有約65DU/ml。以糖計，本發(fā)明組合物中腦膜炎球菌偶聯(lián)物的量通常在每毫升各血清群5-25嗎之間。以糖計，本發(fā)明組合物中肺炎球菌偶聯(lián)物的量通常在每毫升各血清型2-20嗎之間。本發(fā)明的組合物優(yōu)選以0.5ml的劑量給予患者。當提及0.5ml的劑量時應理解為包括正常的偏差，如0.5ml士0.05ml。本發(fā)明可提供適合包裝成單次劑量的半成品，然后可將該單次劑量分配給患者。上面提到的濃度通常是最終包裝劑中的濃度，因此半成品疫苗的濃度可能較高(例如通過稀釋降至最終濃度)。本發(fā)明組合物將通常為水性形式。在用本發(fā)明所述方法制造的最終疫苗中可能還保留有痕量的各種抗原性組分的殘余物質。例如，如果采用甲醛來制備白喉、破傷風和百日咳的類毒素，則最終的疫苗產品可能保留有痕量的甲醛(例如少于1(Hig/ml，優(yōu)選〈5pg/ml)。在制備脊髓灰質炎病毒時可能采用培養(yǎng)基或穩(wěn)定劑(例如培養(yǎng)基199)，這些物質可能被攜帶入最終的疫苗。類似地，游離氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和/或甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸和/或羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或纈氨酸)、維生素(例如膽堿、抗壞血酸等)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鈣、葡萄糖、腺嘌呤硫酸、酚紅、乙酸鈉、氯化鉀等可保留在最終的疫苗中，其各自的濃度《100ng/ml，優(yōu)選〈10iig/ml?？乖苽渲械钠渌M分，如新霉素(例如硫酸新霉素，尤其來自IPV組分)、多粘菌素B(例如硫酸多粘菌素B、尤其來自IPV組分)等也可以，例如，每劑亞納克級的量存在。源自抗原制劑的最終疫苗的其他可能組分來源于未對抗原進行充分純化。因此可能存在小量百日咳博德特氏菌、白喉棒狀桿菌、破傷風梭菌和/或釀酒酵母的蛋白質和/或基因組DNA。為使這些殘余組分的量最小化，優(yōu)選先處理抗原制劑以去除所述殘余組分再將抗原用于本發(fā)明方法。當采用IPV組分時，通常使其在Vero細胞上生長。最終的疫苗優(yōu)選含有小于10ng/ml，優(yōu)選《lng/ml，例如《500pg/ml或《50pg/mlVero細胞DNA，例如少于1Ong/mlVero細胞DNA，所述DNA的長度》50個堿基對。錄微會離包麥將HBsAg與佐劑組合之后，本發(fā)明方法可包括取出0.5ml混合物樣品并將其包裝入容器的步驟。對于多劑量情況，可取出多個劑量并將它們一起包裝在單個容器內。本發(fā)明方法還可包括將疫苗包裝入容器以供使用的進一步的步驟。合適的容器包括藥瓶和一次性針筒(優(yōu)選無菌針筒)。當將本發(fā)明的組合物包裝入藥瓶時，優(yōu)選這些藥瓶是用玻璃或塑料材料制成的。藥瓶在加入組合物之前優(yōu)選被滅菌。為避免對乳膠過敏患者造成問題，可用不含乳膠的塞子密封藥瓶。藥瓶中可裝有單劑量疫苗或者可裝有一劑以上疫苗('多劑量'藥瓶)，例如，10劑。當采用多劑量藥瓶時，各劑量應在嚴格無菌條件下用無菌針頭和針筒取出，同時要小心避免污染藥瓶的內容物。優(yōu)選的藥瓶由無色玻璃制成。藥瓶可具有適配的蓋子(例如，Luer鎖緊套口)，從而可將預裝針筒插入該蓋，將針筒的內容物排入藥瓶內(例如以重建其中的凍干材料)，并可將藥瓶的內容物重新吸回針筒。從藥瓶上取下針筒之后，可加上針頭并可將組合物施用于患者。所述蓋優(yōu)選位于封口或覆蓋物內側，從而在接觸蓋子之前封口或覆蓋物己被除去。當組合物被包裝入針筒時，針筒上通常未附加針頭，但可與針筒一起提供單獨的針頭以供裝配和使用。優(yōu)選安全針頭。通常為1英寸23號、1英寸25號和5/8英寸25號針頭?？稍卺樛采咸峁┛蓜冸x的印有內容物批號和有效期的標簽以方便保存。針筒內的活塞優(yōu)選有限位件以防止活塞在抽吸過程中意外被拉出。針筒可具有乳膠橡皮帽和/或柱塞。一次性針筒裝有單劑量疫苗。針筒通常會具有針帽以在附加針頭之前密封針尖，且該針帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果針筒和針頭是獨立包裝的，則優(yōu)選為針頭配備丁基橡膠護罩。優(yōu)選灰色丁基橡膠。優(yōu)選的針筒是以商品名"Tip-Lok"TM銷售的針筒。當采用玻璃容器(例如，針筒或藥瓶)時，優(yōu)選采用由硼硅玻璃而非鈉鈣玻璃制成的容器。將組合物裝入容器后將該容器裝箱以供銷售，例如裝入紙板箱，箱上還將標示疫苗的細節(jié)，例如其商品名、疫苗中抗原的組成(例如，'乙肝重組體，等)、容器規(guī)格(例如，'一次性預裝Tip-Lok針筒，或'10x0.5ml單劑量藥瓶，)、其劑量(例如，'各含一個0.5ml劑量')、警告(例如，'僅供兒科使用')、有效期、適應癥(例如'有效免疫抵抗所有已知亞型造成的乙肝病毒(HBV)感染，可用于腎功能不全(包括血透析前(pre-haemodialysis)和血透析)的患者，患者年齡15歲以上，，等等)、專利號，等等。每箱可含有一個以上包裝的疫苗，例如5個或10個包裝的疫苗(尤其對于藥瓶而言)。如果疫苗是含在針筒內的，則包裝上應顯示針筒的圖片。疫苗可包裝在一起(例如裝入同一箱子)并夾入包含疫苗細節(jié)的單頁，如給藥說明、疫苗內抗原的細節(jié)等。說明還可包括警告，例如將腎上腺素溶液放在方便獲得的地方以應對接種后發(fā)生的過敏反應等。包裝好的疫苗優(yōu)選儲存于2-8'C。不應冷凍。制造過程中疫苗可以全液體形式提供(即所有抗原性組分都在水性溶液或懸浮液中)，或者可制備其中一些組分為液體形式而其他組分為凍干形式的疫苗。因此，可在使用時將以下兩種組分混合在一起而臨時制備最終的疫苗(a)包含水性抗原的第一組分；和(b)包含凍干抗原的第二組分。這兩種組分優(yōu)選存在于獨立容器內(例如藥瓶和/或針筒)，同時，本發(fā)明提供了含有組分(a)和(b)的試劑盒。這種形式對于含有偶聯(lián)物組分，尤其是Hib和/或腦膜炎球菌和/或肺炎球菌偶聯(lián)物的疫苗尤其有用，因為這些組分在凍干形式下可能更加穩(wěn)定。因此，可將偶聯(lián)物凍干再用于本發(fā)明。凍干之前也可加入其他組分，例如穩(wěn)定劑。優(yōu)選的穩(wěn)定劑包括乳糖、蔗糖和甘露醇，以及它們的混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物，等等。因此，最終的疫苗可含有乳糖和/或蔗糖。采用蔗糖/甘露醇混合物能加速干燥過程。因此，本發(fā)明提供了制備兩容器組合疫苗的方法，該方法包括以下步驟-如上所述制備水性組合疫苗，但其中所述一種或多種抗原不包括偶聯(lián)的莢膜糖抗原；-將所述組合疫苗包裝在第一容器內(例如針筒)；-制備凍干形式的偶聯(lián)的莢膜糖抗原；-將所述凍干的抗原包裝在第二容器內(例如藥瓶)；和-將所述第一容器和第二容器一起包裝在試劑盒內。然后可將所述試劑盒分發(fā)給醫(yī)師。D、T、P和HBsAg組分優(yōu)選為液體形式。賴^微微赫膽本發(fā)明組合物適合給予人類患者，且本發(fā)明提供了提升患者免疫應答的方法，該方法包括將本發(fā)明組合物給予患者的步驟。本發(fā)明還提供了本發(fā)明組合物在藥物中的用途。本發(fā)明還提供了(i)從重組酵母細胞純化的HBsAg，其中所述純化過程包括在存在非離子型表面活性劑時破壞酵母細胞，和(ii)一種或多種非-HBV抗原，在制造給予患者的藥物中的應用。本發(fā)明的免疫原性組合物優(yōu)選是疫苗，該疫苗至少用于預防和/或治療乙肝病毒感染。已經接受本發(fā)明組合物的患者的血清抗-HBsAgGM效價優(yōu)選^500mIU/ml，所述值在第一次免疫接種6周后測得。更優(yōu)選，當12個月后測量時，所述效價》500mlU/ml。為發(fā)揮充分功效，典型的兒童初次免疫方案可包括給予一次以上的劑量。例如，可在以下時間給予劑量第0和6個月(0時刻為第一次給藥的時間)；第0、1、2和6個月；第O天、第21天，然后在6-12個月之間給予第三次劑量；第2、4和6個月；第3、4和5個月；第6、10和14周；或第O、1、2、6和12個月。組合物還可用作加強劑量，例如對兒童而言在其兩歲時使用。本發(fā)明組合物可通過肌內注射給予，例如注射到手臂或腿中。按照本發(fā)明制造的疫苗可與單獨的肺炎球菌偶聯(lián)疫苗，如PrevnarTM同時給予患者。由于本發(fā)明組合物包含鋁基佐劑，儲藏過程中組分可能會沉淀。因此在給予患者之前需要振蕩組合物。經過振蕩的組合物將是混濁的白色懸浮液。汰遂艦艱具體的本發(fā)明的多價免疫原性組合物包括含有HBsAg、D、T、Pa和IPV的五價組合物。該疫苗為水性形式。同時含有氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑。HBsAg被吸附于磷酸鋁。D、T和Pa被吸附于氫氧化鋁。每毫升中含約50Lf白喉類毒素；約20Lf破傷風類毒素；約50嗎PT;約50嗎FHA;約16嗎黏附素；約20嗎HBsAg;約80DU1型脊髓灰質炎病毒；約16DU2型脊髓灰質炎病毒；約64DU3型脊髓灰質炎病毒。劑量約0.5ml。可裝在預裝針筒中。含HBsAg、D、T、Pa和IPV的五價組合物。該疫苗為水性形式。同時含有氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑。HBsAg被吸附于磷酸鋁。D、T和Pa被吸附于24氫氧化鋁。每毫升中含至少60IU白喉類毒素；至少80IU破傷風類毒素；約50嗎PT;約50嗎FHA;約16嗎黏附素；約20嗎HBsAg;約80DU1型脊髓灰質炎病毒；約16DU2型脊髓灰質炎病毒；約64DU3型脊髓灰質炎病毒。劑量約0.5ml?？裳b在預裝針筒中。含HBsAg、D、T和Pw的四價組合物。該組分為水性形式。同時含有氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑。HBsAg被吸附于磷酸鋁。D和T被吸附于氫氧化鋁。該組合物包含硫柳汞，但優(yōu)選不含2-苯氧乙醇。每毫升中含至少60IU白喉類毒素；至少120IU破傷風類毒素；至少8IUPw;約20嗎HBsAg。劑量約0.5ml。含HBsAg、D、T、Pw和Hib-T偶聯(lián)物的五價組合物。HBsAg、D、T和Pw組分為水性形式；Hib-T被凍干。同時含有氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑。D和T被吸附于氫氧化鋁。HBsAg和Hib-T被吸附于磷酸鋁。凍干的Hib-T包含乳糖。水性組分中可含有硫柳汞。每毫升中含至少60IU白喉類毒素；至少120IU破傷風類毒素(加上作為Hib-T載體的5-25嗎破傷風類毒素);至少8IUPw;約20嗎HBsAg;約5嗎Hib-T(以糖類計)。劑量約0.5ml。含HBsAg、D、T、Pw以及Hib-T偶聯(lián)物、MenA偶聯(lián)物和MenC偶聯(lián)物這三種偶聯(lián)物的七價組合物。HBsAg、D、T和Pw組分為水性形式；三種偶聯(lián)物被凍干。同時含有氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑。D和T被吸附于氫氧化鋁。HBsAg被吸附于磷酸鋁。凍干組分中可包含乳糖和/或蔗糖。水性組分可包含硫柳汞。每毫升中可能含至少60IU白喉類毒素；至少120IU破傷風類毒素(加上作為Hib-T載體的5-25嗎破傷風類毒素)；至少8IUPw;約20嗎HBsAg;約5嗎各種偶聯(lián)物(以糖類計)。劑量約0.5ml。這些組合物本身可用作疫苗或作為進一步疫苗的組分。例如，本發(fā)明提供了一種六價組合物，其包含上述五價HBsAg-D-T-Pa-IPV組合物加上凍干的Hib-T偶聯(lián)物。所述凍干的Hib-T優(yōu)選不吸附于鋁鹽。本發(fā)明還提供了一種七價組合物，其包含上述五價HBsAg-D-T-Pa-IPV組合物加上凍干的Hib-T和MenC偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了一種八價組合物，其包含上述五價HBsAg-D-T-Pa-IPV組合物加上凍干的Hib-T、MenC和MenY偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了一種五價組合物，其包含上述四價HBsAg-D-T-Pw組合物加上凍干的Hib-T偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了一種七價組合物，其包含上述四價HBsAg-D-T-Pw組合物加上凍干的Hib-T偶聯(lián)物、MenA偶聯(lián)物和MenC偶聯(lián)物的混合物。使用時可用含有HBsAg的水性材料重建凍干材料以得到最終的疫苗，且凍干組分和水性組分優(yōu)選一起包裝在試劑盒中，如上所述。具體的本發(fā)明方法包括那些包括以下步驟的方法按照本發(fā)明純化HBsAg;將HBsAg吸附于磷酸鋁佐劑；獲得不含硫柳汞、帶有氫氧化鋁佐劑的二價D-T混合物；獲得PT、FHA和黏附素作為Pa組分；獲得EPV抗原，將l、2和3型合并在一起，優(yōu)選不含鋁鹽佐劑；以任何順序組合D-T、Pa、IPV和HBsAg，以得到最終的七價組合物；任選包裝在針筒內。按照本發(fā)明純化HBsAg;將HBsAg吸附于磷酸鋁佐劑；獲得不含2-苯氧乙醇、含硫柳汞、帶有氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑的三價D-T-Pw混合物；將D-T-Pw與HBsAg組合以得到最終的四價組合物；任選包裝在針筒內；任選與凍干的偶聯(lián)物組分如Hib-T、MenA、MenC組合包裝。按照本發(fā)明純化HBsAg;將HBsAg吸附于磷酸鋁佐劑；獲得不含2-苯氧乙醇、含硫柳汞、帶有氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑的三價D-T-Pw混合物；獲得凍干的Hib-T偶聯(lián)物；將D-T-Pw和HBsAg組合以得到水性四價組分；將水性四價組分包裝在玻璃瓶內；將凍干的Hib-T和/或MenC和/或MenY包裝在玻璃瓶內；將兩個瓶子一起裝在單個試劑盒內以供重建得到五價組合疫苗。所述玻璃瓶可以是I型玻璃并配有丁基橡膠塞。按照本發(fā)明純化HBsAg;將HBsAg吸附于磷酸鋁佐劑；獲得不含2-苯氧乙醇、含硫柳汞、帶有氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑的三價D-T-Pw混合物；獲得IPV抗原，將l、2和3型合并在一起，優(yōu)選不含鋁鹽佐劑；以任何順序合并D-T-Pw、IPV和HBsAg以得到最終的五價組合物；任選包裝在針筒內；任選與凍干的偶聯(lián)物組分如Hib-T、MenA、MenC組合包裝。其他組分可在任何階段加入，例如氯化鈉、佐劑、防腐劑，等等。例如，這些方法可用于制備上述疫苗。可在幾乎相同時間進行不同的方法步驟，或者可單獨進行?？稍谙嗤恢没虿煌恢?，甚至在不同國家進行方法步驟，例如可在與凍干Hib-T不同的位置進行HBsAg的純化。微激纖條A偶聯(lián)的糖抗原包含載體蛋白，其中的糖是直接或通過接頭共價連接的。偶聯(lián)技術的一般信息可在參考文獻45中找到。已知可將各種蛋白質用作載體，優(yōu)選的載體蛋白是細菌毒素或類毒素，如白喉類毒素或破傷風類毒素。其他合適的載體蛋白包括，但不限于，白喉毒素的CRM197突變體[75-77]、腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[78]、合成肽[79、80]、熱激蛋白[81,82]、百日咳蛋白[83，84]、細胞因子[85]、淋巴因子[85]、激素[85]、生長因子[85]、含有各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細胞表位的人造蛋白[86]如N19[87]、流感嗜血桿菌的D蛋白[88,89]、肺炎球菌表面蛋白PspA[90]、肺炎球菌溶血素[91]、鐵攝取蛋白[92]、艱難梭菌(Cj驕c/fe)的毒素A或B[94]等等。糖類優(yōu)選通過-NH2基連接于載體，例如載體蛋白賴氨酸殘基或精氨酸殘基側鏈中的-NH2基。也可以連接于-SH基(例如在半胱氨酸側鏈中)。偶聯(lián)物中糖:蛋白質的比例(w/w)在l:5(即蛋白質過量)和5:1(即糖類過量)之間是優(yōu)選的。組合物可包含小量游離載體。不考慮任何作為單獨抗原的載體，未偶聯(lián)載體優(yōu)選不超過組合物中所有載體蛋白總量的5%，其含量更優(yōu)選小于2重量％。組合物中也可包含一種以上類型的載體蛋白，例如以降低載體抑制風險。用于腦膜炎奈瑟氏球菌偶聯(lián)物的載體蛋白可以是流感嗜血桿菌的D蛋白。這種蛋白質詳細描述于參考文獻參考文獻95和96，將其用作偶聯(lián)物中的載體蛋白描述于參考文獻97。術語"D蛋白"包括天然的全長蛋白質的片段，如參考文獻97所述，還包括含有全長D蛋白或這些片段的融合蛋白(例如，流感病毒NS1蛋白的片段和D蛋白的片段的融合物)。當這些片段與T-非依賴性糖類抗原偶聯(lián)時保留了將其轉變成T-依賴性抗原的能力。典型的片段至少將包括D蛋白N-端的1/3。該蛋白質可在大腸桿菌中方便地表達[96]，且這種重組材料優(yōu)選用于本發(fā)明[97]。凝遂術語"含有"包括"包含"以及"由...組成"，例如"含有"X的組合物可僅由X組成或可包含其它的物質，例如X+Y。術語"基本上，，不排除"完全"，例如"基本上不含"Y的組合物可完全不含Y。"基本上"可視需要從本發(fā)明定義中省去。與數(shù)值x相關的術語"約"表示，例如x±10%。除非另有說明，包括混合兩種或多種組分的步驟的方法對于特定混合順序沒有任何要求。因此可以任何順序混合組分。當有三種組分時則可將兩種組分相互組合，然后將該組合物與第三種組分合并，等等。當將抗原描述為被"吸附"到佐劑時，優(yōu)選至少50%(以重量計)的抗原被吸附，例如50%、60%、70%、80%、卯％、95%、98%或更多被吸附。優(yōu)選白喉類毒素和破傷風類毒素都被全部吸附，即在上清液中檢測不到。也優(yōu)選將HBsAg全部吸附。白喉類毒素的量可表達為國際單位(IU)。例如，NIBSC提供的'吸附的白喉類毒素的第三國際標準1999'(DiphtheriaToxoidAdsorbedThirdInternationalStandard1999)[98，99]含有160IU/安瓿。除了IU系統(tǒng)，'Lf，單位("絮凝化單位"或"臨界絮凝化劑量")被定義為與1國際單位抗毒素混合產生最佳絮凝化混合物的類毒素的量[100]。例如，NIBSC提供的'簡易白喉類毒素'(DiphtheriaToxoid,Plain)[101]，其含有300LF/安瓿，并還提供了'用于絮凝試驗的白喉類毒素的第一國際參考試劑，(The1stInternationalReferenceReagentForDiphtheriaToxoidForFlocculationTest)[102]，其含有卯0LF/安瓿。破傷風類毒素的量可表達為國際單位(IU)。例如，NIBSC提供的'吸附的破傷風類毒素的第三國際標準2000，(TetanusToxoidAdsorbedThirdInternationalStandard2000)[103，104]含有469IU/安瓿。除了IU系統(tǒng)，'Lf'單位("絮凝化單位"或"臨界絮凝化劑量")被定義為與1國際單位抗毒素混合產生最佳絮凝化混合物的類毒素的量[100]。例如，NIBSC提供了'用于絮凝試驗的破傷風類毒素的第一國際參考試齊廿，(The1stInternationalReferenceReagentforTetanuxToxoidForFlocculationTest)[105]，其含有1000LF/安瓿。wP抗原的量可表達為國際單位(IU)。例如，NIBSC提供的'百日咳疫苗的第三國際標準，(ThirdInternationalStandardForPertussisVaccine)[106]含有46IU/安瓿。其含有46IU/安瓿。各安瓿含有2.0ml等分水溶液的凍干殘余物，該水溶液含有10升用8升M/15Sorensen緩沖液pH7.0稀釋的細菌懸浮液(根據(jù)美國不透明度標準等于180不透明單位)。除了IU系統(tǒng)，還可使用'OU，單位("不透明單位")(例如，4OU約為1IU)。偶聯(lián)物的量通常用糖的質量表示(即偶聯(lián)物(載體+糖)的劑量作為整體將高于標識劑量)以避免由于載體選擇造成的偏差。當采用動物(尤其是牛)材料來培養(yǎng)細胞時，它們應獲自未患遺傳性海綿狀腦病(TSE)且尤其未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源。附圖簡述圖1是參考文獻3和4中圖2的拷貝，所述文獻聲稱，該圖顯示了"基于吸附方法的抗原性和免疫力，其中，樣品1是將疫苗各組分組合之后加入過量氫氧化鋁凝膠得到的樣品，樣品2是在組合之前加入相同濃度凝膠的樣品"。圖1A和1B分別顯示了樣品1和2的相對抗原性。圖1C和1D分別顯示了針對樣品1和2各抗原的相對抗體形成水平。圖2顯示了組合物中HBsAg穩(wěn)定性的western印跡結果。在圖2A中，各泳道為(1)Laemmli樣品緩沖液(LSB);(2)MW標記；(3-5)l嗎三種單獨的對照HBsAg制品；(6-8)三種單獨的五價產品的上清液；(9-10)LSB。在圖2B和2C中，各泳道為(l)MW標記；(2-4)lng三種單獨的對照HBsAg制品；(5-7)三種單獨的五價產品的上清液，在2-8"儲存2周；(8-10)三種單獨的五價產品的上清液，在36-38t:儲存2周。在圖2D中，各泳道為(l)MW標記；(2)對照HBsAg;(3-5)三種單獨的五價產品的上清液。圖3顯示了五價組合物的pH隨時間的變化情況。圖4顯示了八價組合物中HBsAg穩(wěn)定性的western印跡結果。在圖4A和4B中泳道1含有MW標記；泳道2含有l(wèi)pg/mlHBsAg對照；泳道3含有八價組合物上清液。在圖4B中泳道4含有LSB;泳道5含有與泳道2相同的對照；泳道6含有DOC/TCA提取物。實施本發(fā)明的方式朋"g游表這贈眾制備了編碼HBsAg[107,108]的多形漢遜酵母(//,/0/;;/^77^)宿主。在300升發(fā)酵罐內準備100升培養(yǎng)基并與酵母一起培育。發(fā)酵可持續(xù)到細胞濃度達到100克/升。此時，由于宿主是甲基缺陷型的(methyl叩tr叩hic)故加入甲醇，并停止發(fā)酵。最終培養(yǎng)物的體積為160-170升。通過離心從培養(yǎng)基中收獲細胞。不同于參考文獻3和4中所述的在純化之后在HBsAg中加入非離子型表面活性劑，表面活性劑是在蛋白質純化期間使用的。具體地說，收獲的酵母細胞是懸浮于含0.1-0.2%聚山梨醇酯20和10mMEDTA的磷酸鹽緩沖液的。將懸浮液冷卻并采用高壓液體勻漿器破壞細胞。然后通過離心澄清勻漿的細胞懸浮液。在懸浮液中加入NaCl，然后緩慢加入聚乙二醇至濃度為3-5%以進行沉淀。將溶液攪拌5分鐘，之后靜置30分鐘并離心10分鐘。再在懸浮液中緩慢加入PEG至8-10%，攪拌并靜置2小時。將該溶液離心IO分鐘。在此懸浮液中加入熱解法二氧化硅至濃度為1-2%。將該溶液攪拌12小時，離心，并將沉淀完全溶于含脫氧膽酸鈉的硼砂緩沖液。在水浴中振蕩100-120分鐘后將溶液離心并收集上清液。將上清液加載到已經用Tris/Cl緩沖液以200毫升/分的流速平衡過的DEAE柱上，并用含NaCl溶液的Tris/Cl緩沖液洗脫。在DEAE洗出液中加入氯化鍶至濃度最高達1.2g/mL并以40,000rpm離心該溶液。用PBS稀釋脫鹽的CsCl收集液至蛋白質濃度400嗎/ml，加入福爾馬林至濃度為0.025%，并使混合物靜置72小時。最終用PBS除去殘余的福爾馬林。由此HBsAg被純化并摻入了聚山梨醇酯20，但表面活性劑是在破裂重組細胞之前而并非是在純化抗原之后加入的。紐伴多份資艱在鋁鹽佐劑懸浮液中加入酵母表達的HBsAg、白喉類毒素、破傷風類毒素和全細胞百日咳抗原。調節(jié)混合物的pH，然后加入Hib-CRM197偶聯(lián)物，從而它不會被吸附到鋁佐劑上。該方法得到含有以下組合物的五價疫苗30<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在進一步的工作中，在加入CRM-Hib組分之后加入來自血清組C、W135和Y中每一種的單獨的腦膜炎球菌-CRM197偶聯(lián)物以得到八價疫苗<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表示疫苗穩(wěn)定性和功效的一個重要參數(shù)是Hib偶聯(lián)物的水解百分比，臨床上限為25%游離糖類(參考文獻109稱，20%不會影響臨床免疫原性)。通過HPAEC-PAD測量了五價疫苗的這一參數(shù)，HPAEC-PAD能夠以最小量的分離和純化(withminimalseparationandclean-up)直接量化皮摩爾水平的未偶聯(lián)糖類。分析針對于游離糖類的量。測定了游離糖的量并表示為占總量的百分比。結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>最多25%的游離糖是臨床上可接受的。所有的值都低于該范圍，在2-8"C儲存最多達4周時低于6.5%。在熱應激條件下(36-38'C儲存4周)觀察到較高水平，但仍舊低于25%的值，其中對第l批觀察到最大值，為11.6%。對多價Hib疫苗進行的早期工作顯示，相比在2-8'C儲存2年，在36-38'C儲存1個月使更多的CRM-Hib水解。因此可以預計，在正常儲存條件下儲存至少兩年仍有可接受的水解。還在于2-8。C儲存6個月之后對游離糖類進行了HPAEC-PAD分析。數(shù)據(jù)如下<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>因此，與儲存4周相比，儲存6個月后游離糖的百分比僅少量增加，其值仍舊遠低于25%的值。因此CRM197-Hib在這三種劑型中非常穩(wěn)定。圖3A顯示了三批五價疫苗在2-8X:儲存6個月期間pH的變化。圖3B顯示了三批產品在36-38。C儲存4周期間pH的變化。在2-8°。儲存6個月后pH是穩(wěn)定的，而在熱應激條件下，直到2周后pH才略微下降0.1個單位，而直到4周后才進一步略微下降。即便如此，所有的pH值都保持在6.0-7.0的可接受范圍內。三批五價疫苗的重量克分子滲透濃度為312-315mOsm/Kg，位于可注射疫苗重量克分子滲透濃度240-360mOsm/Kg的可接受范圍中央。為獲得組合疫苗的功效，評價抗原的功效和免疫原性是重要的。評價了五價疫苗中白喉、破傷風和百日咳抗原的功效并檢測了CRM-Hib和HBsAg的免疫原性。進行ELISA分析以評價免疫接種后特定抗體的水平。用小鼠模型和不同于測定HBV功效的免疫接種方案測量HBsAg的免疫原性。DTP功效值如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>對這三批抗原中的每一批，功效檢測結果都明顯高于可接受的下限，這些結果顯示這三批抗原有良好的功效。為評價HBsAg免疫原性，在第0天和第14天通過皮下注射給一組10只CD1小鼠接種五價疫苗(0.5ml，用鹽水1:4稀釋)。在第21天采集小鼠血液并用(a)"Enzygnost抗-HBII"檢驗(DB公司(DadeBehring))或(b)"AusabEIA"檢驗(雅培公司(Abbott))通過ELISA評價HBsAg特異性抗體。這些ELISA檢驗具有不同模式和不同的HBsAg靈敏度。因此無法比較兩種檢測之間效價的幾何平均值。然而，在各檢測中，血清的GMT值是最佳的。結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>進行這種類型的小鼠免疫原性試驗獲得的所有GMT值都高于文獻中報道的值。兩種抗原的應答者的百分比始終較高，處于約100%的最佳水平。為評價Hib免疫原性，在第0天、第10天和第20天通過皮下注射給一組8只CD1小鼠接種五價疫苗(0.5ml，用鹽水1:4稀釋)。在第34天采集小鼠血液并通過ELISA評價Hib特異性抗體。結果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>HBsAg與鋁佐劑的吸附是疫苗免疫原性的重要因素，該參數(shù)是通過免疫印跡測量的。免疫印跡過程基本如下用D0C/TCA沉淀1ml疫苗懸浮液，用LSB使其變性，然后加載到12%丙烯酰胺SDS-PAGE上；加入1pg各批次HBsAg作為對照；山羊抗-HBsAg抗體制劑被用作第一抗體(1:1000稀釋)并4每抗-羊POD偶聯(lián)物(1:2500稀釋)用作第二抗體。五價疫苗的結果示于圖2。圖2A的泳道6-8顯示，在O時間點組合物中沒有可檢測的可溶性HBsAg，圖2B和2C的泳道5-10證實，在2-8。C或36-38°C儲存2周和4周后亦是如此。在三個不同批次中，在這些不同條件下約99%的HBsAg保持吸附在佐劑上。在2-8。C儲存6個月后再進行一次穩(wěn)定性試驗(圖2D)。三批疫苗中每一批的吸附仍約為99%。圖2所用的陽性對照含有1MgHBsAg。觀察到與S肽(24kDa)對應的單個條帶以及聚集體的特征性條帶(約45kDa)。未見Pre-S2。還用類似的方法檢測了八價疫苗的HBsAg吸附。將1ml樣品3500rpm離心10分鐘。將上清液轉移到新的試管中并用DOC/TCA沉淀。將沉淀重懸于200|il提取緩沖液，煮沸5分鐘并1300rpm離心10分鐘。將20pl該提取物和經DOC/TCA沉淀的上清液加載到12%SDS-PAGE上進行Western印跡。圖4A顯示了0時點的八價疫苗，圖4B顯示了在2-8。C儲存8個月后的該疫苗。圖4B的泳道3和6不存在任何明顯染色(明顯少于在對照泳道2和5中用lpgHBsAg觀察到的染色)說明，在該儲存期之后HBsAg吸附仍舊是穩(wěn)定的。發(fā)歸f多艦欲收集如下3種抗原性組分-三價D-T-PW組分制備的D-T-Pw組分包括吸附到氫氧化鋁佐劑上的白喉類毒素、同樣吸附到氫氧化鋁佐劑上的破傷風類毒素和以磷酸鋁作為佐劑的全細胞百日咳抗原。該組分含有硫柳汞但不含2-苯氧乙醇。-HBsAg組分從重組釀酒酵母表達并純化HBsAg。將純化的蛋白質吸附到磷酸鋁抗原上[110]。-Hib偶聯(lián)物組分從Hib毒株20752制備Hib多糖，用溴化氰活化并用己二酸酰肼間隔物衍生化后通過碳二亞胺縮合共價偶聯(lián)于破傷風類毒素，糖:載體的重量比約為1:3。該偶聯(lián)物被吸附于磷酸鋁佐劑[64]然后與乳糖一起凍干。將D-T-Pw組分與HBsAg組分混合。HBsAg水平為20嗎/ml。D水平》60IU。T水平^120IU。Pw水平》8IU。將這種白色混濁懸浮液形式的四價混合物以水性形式包裝入有丁基橡膠塞的玻璃瓶，瓶中含有1劑(0.5ml)、2劑(lml)或10劑(5ml)。也將凍干的Hib組分裝入藥瓶。每個藥瓶中的粉末量為在用每瓶1劑、2劑或10劑重建之后可達到5pg/ml(以糖類計)的量。將兩個藥瓶包裝在一個盒子中。盒子中含有1瓶各組分(單劑量或多劑量藥瓶)或IOO瓶各組分。為對患者給藥，將水性D-T-Pw-HBsAg材料吸入針筒，并注入裝有凍干偶聯(lián)物的藥瓶。在凍干材料重活化之后用新的針頭將其吸回針筒，從而得到可施用于患者的五價疫苗?？刹捎酶鞣N3-劑初免方案第2、4和6個月；第3、4和5個月；或第6、10和14周。也可在兩歲時將該疫苗用作加強劑。10劑量藥瓶中所含的材料在用一個藥瓶重建后足以免疫10名患者。先用第一針筒重建，然后用新的針筒吸出單個劑量，每個針筒一劑。在另一種(不太優(yōu)選的)安排中，將10個劑量吸入一個針筒，然后在患者之間更換針頭。應當理解的是，本發(fā)明只是用實施例的方式進行描述，只要不偏離本發(fā)明范圍和精神，可以對本發(fā)明作出修改。參考文獻(其內容通過引用納入本文)I](f座度j)(Tocc/"esXPlotkin和Orenstein編)。第四版，2004，ISBN:0-7216-9688-0。2]美國專利6616931。3JWO02/055105。4]US2004/0048336。5]if7A庸f表^"存絲,i/,^"教眾學》f7Vcw'ow'cSw//acto"te,Ogam'cC/2e附"/0^.NicoM.vanOs編，ISBN:0824799976。6]Vanlandschoot等，(2005)■/Ge"Wra/86:323-31。7]Hilleman(1993)(TZ;^^ii欲游^f^"教》(He/7油'fe5/""/"/^/;^"/￡^第17-40頁，SBN0-8247-8780-3。8]Gerin等，(1969)4:763。9]Gerin等，(1969)J腸/7:569。10]Siebke等，(1972)Jcto尸aAo/Mr'croWo/5ta"B部分80:935。II]Pillot等，(1976)JC"wM'cra編4:205。12]Duimel和Krijnen(1972)版5b"g23:249。13]Neurath等，(1974)尸A^腦71:2663。14]Charm和Wong(1975)萬Zo&c/oto/16:593。15]美國專利4，857，317。16]美國專利4,683,294。17]Houwen等，(1975)J^/wm/Mo/Me,/zocfe8:185。18]Sitrin等，(1993)ifZI皮欲游^^錄J1第83-101頁，ISBN0-8247-8780-3。19]Wampler等，(1985)iW」SLS482:6830-4。20]Chi^，(1994)」"wA^A;ac5W721:365-73。21]Agraz等，(1994)/Owww"/ogrJ672:25-33。22]Mason等，(1992)/WASL489:11745-9。23]Demi等，(1999)JWra/Mertorfs79:205-17。:24]Ibarra等，(1999)■/CAra附atogr5<SWJ/;p/735:271陽7。25]WO麵0058。26]日本專利申請JP63239234。27]美國專利4,694,074。28]EP-0341733。29]美國專利5,242,812。30]WO02/12287。31]俄國專利申請RU-2128707。32〗Hardy等，(2000)/5/o,ecA"o/77:157-67。33]Dogan等，(2000)5/o&c/oto/Prag16:435-41。34]WO03/066094。35]Rappuoli等，(1991)77S7EC//9:232-238。36]Ramsay等,(2001)丄朋c"357(9251):195-196。37]Lmdberg(1999)Facc/"e17,增刊2:S28-36。38]Buttery禾QMoxon(2000)/7Co〃P/jw'c/a"sZowd34:163-168。39]Ahmad和Chapnick(1999)/ra/ec,C7Z"M)W/力附13:113-133，vii。40]Goldblatt(1998)乂Mo/.M/cra^o/.47:563-567。:41]歐洲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