專利名稱：：佐劑配制的包含細胞因子誘導劑的流感疫苗的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于用佐劑配制疫苗來提供保護以抵御流感病毒感染的領域。
背景技術：
：目前常規(guī)使用的流感疫苗一般不含佐劑。參考文獻1的第17和18章詳細描述了這些疫苗。它們基于活病毒或滅活的病毒，滅活疫苗可以基于完整的病毒、"裂解(split)"病毒或純化的表面抗原(包括血凝素和神經(jīng)氨酸酶)。血凝素(HA)是滅活流感疫苗中的主要免疫原，參考HA水平標準化疫苗劑量，疫苗通常含有約15嗎HA/毒株。流感爆發(fā)期需要大量流感疫苗，但難以增加疫苗供應從而滿足如此巨大的需求。因此，除了生產(chǎn)更多疫苗抗原，有人提出可以使用較低含量的抗原/毒株，同時使用佐劑來彌補減少的抗原劑量。還有人提出在流行間期采用相同的方案，從而例如能覆蓋更多人群而無需提高生產(chǎn)水平。有人提出可將鋁鹽佐劑用于流感疫苗(例如，見參考文獻2-5)。利用MF59水包油乳液也已見報道[6]，希龍疫苗公司(ChironVaccines)的商品化FLUADTM產(chǎn)品中也用了該乳液。本發(fā)明的目的是提供佐劑配制的其它改進流感疫苗(對于流行期和流行間期使用)和它們的制備方法。
發(fā)明內(nèi)容現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)雖然水包油乳液是流感疫苗的優(yōu)良佐劑，但仍可通過額外加入一種或多種其它免疫刺激劑來提高它們的效率。所述其它試劑不僅增加血凝滴度或抗-血凝素ELISA滴度(二者衡量免疫應答的數(shù)量)，其還起到提高應答質(zhì)量的作用。具體地說，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)所述其它試劑能改善流感疫苗引發(fā)的細胞因子應答，例如干擾素-Y應答，改善水平遠勝于只使用佐劑或該試劑時所見的。已知細胞因子應答涉及宿主抵御流感(病毒)感染的防御早期和決定階段[7]。因此，本發(fā)明提供包含(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐劑；和(iii)細胞因子誘導劑的免疫原性組合物。本發(fā)明還提供制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括混合(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐劑；和(iii)細胞因子誘導劑的步驟。本發(fā)明提供裝有以下組分的試劑盒(i)包含流感病毒抗原的第一試劑盒組分；和(ii)包含水包油乳液佐劑的第二試劑盒組分，其中(a)所述第一組分和所述第二組分包含細胞因子誘導劑，或(b)所述試劑盒裝有包含細胞因子誘導劑的第三試劑盒組分。水包浙教縱淑已發(fā)現(xiàn)水包油乳液特別適用于佐劑配制的流感病毒疫苗中。已知各種這樣的乳液，它們通常包含至少一種油和至少一種表面活性劑，其中一種或多種油和一種或多種表面活性劑是生物可降解(可代謝)和生物相容的。乳液中的油滴通常直徑低于5pm，甚至可具有亞微米直徑，用微流化儀可實現(xiàn)這些小尺寸，從而能提供穩(wěn)定的乳液。優(yōu)選尺寸小于220nm的油滴，因為能對它們進行過濾滅菌。本發(fā)明可使用諸如動物來源(例如魚)或植物來源的油。植物油來源包括堅果、種子和谷物。堅果油的例子是最常購得的花生油、大豆油、椰油和橄欖油。例如，可利用從霍霍巴豆(jojobabean)獲得的霍霍巴油。種子油包括紅花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油是最易購得的，但其它谷物如小麥、燕麥、黑麥、大米、畫眉草(teff)、黑小麥等的油也可利用。通過水解、分離和酯化合適的堅果和種子油起始物質(zhì)可制備種子油中天然不存在的甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。哺乳動物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可用于實施本發(fā)明。本領域熟知從動物來源獲得純油所需的分離、純化、皂化和其它方法。大多數(shù)魚含有不難回收的可代謝油。例如，本發(fā)明可用的幾種魚油的例子是鱈魚肝油、鯊魚肝油和鯨油，如鯨蠟?？梢?-碳異戊二烯單位通過生物化學方法合成許多支鏈油，這些支鏈油通常稱為類萜。鯊魚肝油含有稱為角鯊烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四己烯(tetracosahexaene))的支鏈不飽和類蔽，這是本發(fā)明特別優(yōu)選的。角鯊垸是角鯊烯的飽和類似物，其也是優(yōu)選的油。包含角鯊烯和角鯊烷的魚油不難從商業(yè)來源購得，或可通過本領域已知的方法獲得。其它優(yōu)選的油是生育酚(參見下文)?？衫糜偷幕旌衔??？筛鶕?jù)表面活性劑的"HLB"(親水/親油平衡)將其分類。優(yōu)選的本發(fā)明表面活性劑的HLB至少為10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16。本發(fā)明可用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80;環(huán)氧乙垸(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，以DOWFAXTM為商品名出售，例如線形EO/PO嵌段共聚物；重復的乙氧基(氧-l,2-乙二基)基團數(shù)目可能不同的辛苯聚醇，其中特別感興趣的是辛苯聚醇-9(曲通X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA誦630/NP-40);磷脂，例如磷脂酰聚膽堿(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，例如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為Brij表面活性劑)，例如三乙烯乙二醇單月桂基醚(triethyleneglycolmonolaurylether)(Brij30);聚氧乙烯-9-月桂基醚；和失水山梨糖醇酯(通常稱為SPAN),例如失水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和失水山梨糖醇單月桂酸酯。優(yōu)選非離子型表面活性劑。乳液中所含的優(yōu)選表面活性劑是吐溫80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100?？衫帽砻婊钚詣┑幕旌衔?，例如吐溫80/司盤85混合物。聚氧乙烯失水山梨糖醇酯，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇，例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合物也適用。另一有用的混合物包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性劑的優(yōu)選用量(重量％)是聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(例如，吐溫80)0.01-1%，特別是約0.1%;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X-lOO或曲通系列的其它洗滌劑)0.001-0.1%，特別是0.005-0.02%;聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)0.1-20%，優(yōu)選0.1-10%，特別是0.1-1%或約0.5%。本發(fā)明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于角鯊烯、吐溫80和司盤85的亞微米乳液。以體積計，所述乳液的組成可以是約5%角鯊烯，約0.5%聚山梨醇酯80和約0.5%司盤85。以重量計，這些比例可以是4.3%角鯊烯，0.5%聚山梨醇酯80和0.48%司盤85。該佐劑稱為"MF59"[8-10]，如參考文獻11的第10章和參考文獻12的第12章所詳述的。MF59乳液優(yōu)選包含檸檬酸離子，例如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。角鯊烯、生育酚和吐溫80的乳液。該乳液可包含磷酸緩沖鹽水。其還可包含司盤85(例如，1%)和/或卵磷脂。這些乳液可具有2-10%角鯊烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐溫80，角鯊烯:生育酚的重量比優(yōu)選《1，因為這能提供更穩(wěn)定的乳液。角鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5:2?？蓪⑼聹?0溶解于PBS中獲得2%的溶液，然后將90ml該溶液與(5gDL-a-生育酚和5ml角鯊烯)的混合物混合，隨后微流化該混合物來制備這樣一種乳液。得到的乳液可具有亞微米油滴，例如平均直徑在100-250nm之間，優(yōu)選約180nm。角鯊烯、生育酚和曲通洗滌劑(例如，曲通X-100)的乳液。該乳液還可包含3d-MPL(見下文)。該乳液可包含磷酸緩沖液。含有聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、曲通洗滌劑(例如，曲通X-100)和生育酚(例如，a-生育酚琥珀酸酯)的乳液。該乳液所包含的這三種組分的質(zhì)量比約為75:11:IO(例如，750pg/ml聚山梨醇酯80，110pg/ml曲通X-100和100嗎/mla-生育酚琥珀酸酯)，這些濃度應包括這些組分與抗原的任何比例。該乳液還可包含角鯊烯。該乳液還可包含3d-MPL(見下文)。水相可含有磷酸緩沖液。角鯊垸、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401("PluronicTML121")的乳液。可以用磷酸緩沖鹽水，pH7.4配制該乳液。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，已與用"SAF-I"佐劑(0.05-1%Thr-MDP、5%角鯊烯烷、2.5%PluronicL121和0.2%聚山梨醇酯80)配制的蘇氨酰-MDP聯(lián)用[13]。也可不與Thr-MDP聯(lián)用，例如用"AF"佐劑(5。/。角鯊烷、1.25。/oPluronicL121和0.2%聚山梨醇酯80)配制[14]。優(yōu)選微流體化。乳液可具有0.5-50%的油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非離子表面活性劑。如參考文獻15所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴大小。不可代謝的油(例如，輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(例如，卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液?？砂砑觿鏠uilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂偶聯(lián)物(例如，參考文獻16所述的GPI-0100,)、二甲基二(十八垸基)溴化銨和/或N，N-二(十八垸基)-N,N-二(2-羥乙基)丙二胺。其中皂苷(例如，QuilA或QS21)和固醇(例如，膽固醇)結合成螺旋狀膠束的乳液[17]。包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[18]。包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[18]。這些乳液優(yōu)選在遞送之時與抗原臨時混合。因此，在包裝或分發(fā)的疫苗中，佐劑和抗原通常分開存放，最后在使用時即時配制。抗原一般存在水性形式，從而最終可通過混合兩種液體來制備疫苗。用于混合的兩種液體的體積比可以不同(例如，在5:1和1'.5之間)，但通常是約l:l?？乖妥魟┗旌虾?，血凝素抗原通常維持在水溶液中，但其自身可能分配在油/水界面附近。進入乳液的油相的血凝素通常極少(如果有的話)。如果組合物包含生育酚，a、(3、y、S、s或；生育酚均可用，但優(yōu)選a-生育酚。生育酚可采取幾種形式，例如不同的鹽和/或異構體。鹽包括有機鹽，例如琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等等。D-a-生育酚和DL-a-生育酚均可用。老年患者(例如，60歲或更大)所用的疫苗中優(yōu)選包含生育酚，因為據(jù)報道維生素E在該患者組中對免疫應答有正面影響[19]。它們還具有抗氧化特性，從而有助于穩(wěn)定溶液[21]。優(yōu)選的oc-生育酚是DL-a-生育酚，該生育酚的優(yōu)選鹽是琥珀酸鹽?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)琥珀酸鹽在體內(nèi)能與TNF-相關的配體協(xié)作。此外，已知a-生育酚琥珀酸鹽與流感疫苗相容，是替代汞化合物的有用防腐劑[88]。^^應齒^誘導浙本發(fā)明組合物可包含細胞因子誘導劑，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該試劑與水包油乳液混合能得到出乎意料有效的免疫原性組合物，對T細胞應答有協(xié)同作用。有報道說，就耐受流感病毒抗原性漂移而言，T細胞應答優(yōu)于抗體應答。此外，T細胞效應機理可能是老年患者中疫苗誘導抵御嚴重疾病的保護作用的重要決定因素[22]，還可能通過更強的干擾素-Y應答來降低對流感的年齡相關易感性[23]。給予患者時，本發(fā)明組合物中所包含的細胞因子誘導劑能引發(fā)免疫系統(tǒng)釋放細胞因子，包括干擾素和白介素。優(yōu)選的細胞因子誘導劑能引發(fā)以下一種或多種細胞因子的釋放干擾素-Y;白介素-l;白介素-2;白介素-12;TNF-Ct;TNF-p;和GM-CSF。優(yōu)選的細胞因子誘導劑引發(fā)與Th-l型免疫應答有關的細胞因子釋放，例如干擾素-Y、TNF-a、白介素-2。優(yōu)選刺激干擾素-Y和白介素-2。因此，接受本發(fā)明組合物使得患者的T細胞在用流感抗原刺激時能以抗原特異性方式釋放所需細胞因子。例如，從他們的血液純化的T細胞在體外接觸流感病毒血凝素時會釋放Y-干擾素。本領域已知檢測外周血單核的細胞(PBMC)中這種應答的方法，包括ELISA、ELISPOT、流式細胞術和實時PCR。例如，參考文獻24報道了一項研究，該項研究監(jiān)測了針對破傷風類毒素的抗原特異性T細胞介導免疫應答，特別是Y-干擾素應答，發(fā)現(xiàn)ELISPOT是區(qū)分抗原特異性TT誘導應答與自發(fā)應答的最靈敏方法，但采用流式細胞術檢測胞質(zhì)內(nèi)細胞因子是檢測再刺激作用(re-stimulatingeffect)的最有效方法。合適的細胞因子誘導劑包括但不限于免疫刺激性寡核苷酸，例如含CpG基序的寡核苷酸(含有通過磷酯鍵與鳥嘌呤連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)，或雙鏈RNA，或含回文序列的寡核苷酸或含聚(dG)序列的寡核苷酸。*3-0-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A("3dMPL"，也稱為"MPLTM")[25-28]。咪唑并喹啉化合物，例如咪喹莫特("R837")[29、30]、瑞喹莫德("R-848")[31]和它們的類似物；和它們的鹽(例如，鹽酸鹽)。免疫刺激性咪唑并喹啉的其它細節(jié)見參考文獻32-36?？s氨基硫脲化合物，例如參考文獻37披露的那些。參考文獻37還描述了配制、制造和篩選活性化合物的方法?？s氨基硫脲在刺激人外周血單核的細胞產(chǎn)生細胞因子如TNF-a方面特別有效。色胺酮化合物，例如參考文獻38披露的那些。參考文獻38還描述了配制、制造和篩選活性化合物的方法。縮氨基硫脲在剌激人外周血單核的細胞產(chǎn)生細胞因子如TNF-a方面特別有效。核苷類似物，例如(a)艾沙托拉濱(Isatorabine)(ANA-245;7-硫雜-8-氧代鳥苷)及其前藥<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)參考文獻39-41所述的化合物；(f)下式所示化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>Rj和R2各自獨立為H、鹵素、-NRaRb、-OH、Q.6烷氧基、取代的垸氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、(:6_1()芳基、取代的(:6.1()芳基、Cl6院基或取代的Cl6院基；R3不存在，或是H、C1-6烷基、取代的C1-6院基,C6-10芳基、取代的C6-16芳基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；R4和R5各自獨立為H、鹵素、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、-C(0)-Rd、C1-6烷基、取代的C1-6烷基，或結合在一起形成5元環(huán)，如R4-5:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>在^所示鍵處實現(xiàn)結合。Xj和X2各自獨立為N、C、O或S;Rs是H、鹵素、-OH、Cl6院基、(:2.6烯基、<:2.6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-0-Rc、-0-((:1.6垸基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd;R9是H、C^烷基、取代的Cl6院基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基或R9a，其中R9a是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>在^所示鍵處實現(xiàn)結合。R,o和R各自獨立為H、鹵素、d.6垸氧基、取代的Cl6垸氧基、-NRaRb或-OH;Ra和Rb各自獨立為H、Cl6院基、取代的Cl6院基、-C(0)Rd、C6_10芳基；Rc各自獨立為H、磷酸酯基、二磷酸酯基、三磷酸酯基、Cl6院基或取代的Cl6院基；Rd各自獨立為H、鹵素、Cw烷基、取代的C,-6垸基、CL6垸氧基、取代的CL6垸氧基、-NH2、-NH(d.6垸基)、-NH(取代的Cl6院基)、-N(d.6垸基)2、^(取代的(:1.6垸基)2、C6.h)芳基或雜環(huán)基；Re各自獨立為H、C"6垸基、取代的CL6垸基、^.1()芳基、取代的Q.u)芳基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；Rf各自獨立地為H、Cl6院基、取代的CL6烷基、-C(0)Rd、磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基；n各自獨立為0、1、2或3;p各自獨立為0、l或2;或者(g)(a)-(f)中任一項的藥學上可接受的鹽，(a)-(f)中任一項的互變異構體，或該互變異構體的藥學上可接受的鹽。羅唑利賓(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧代鳥苷)[42]。參考文獻43披露的化合物，包括?；哙夯衔?、吲哚二酮(Indoledione)化合物、四氫異喹啉(THIQ)化合物、苯并環(huán)二酮(Benzocyclodione)化合物、氨基氮雜乙烯基(Aminoazavinyl)化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(Aminobenzimidazolequinolinone)(ABIQ)化合物[44、45]、羥鄰苯二甲酰胺(Hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、異嗯唑化合物、固醇化合物、喹唑酮(Quinazilinone)化合物、吡咯化合物[46]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶(Pyrazalopyrimidine)化合物和氮茚(Benzazole)化合物[47]。polyoxidonium聚合物[48、49]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。參考文獻50披露的化合物。式i、n或m所示化合物，或它們的鹽如參考文獻51所述，如'ER803058'、'ER803732'、'ER804053'、'ER804058'、'ER804059'、'ER804442'、'ER804680'、'ER804764'、'ER804057'(結構如下所示)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>或ER803022(結構如下所示)氨基垸基氨基葡糖苷磷酸鹽衍生物，如RC-529[52、53]。參考文獻54報道了RC-529在CD4+T細胞中刺激細胞因子應答的能力。磷腈，例如參考文獻55和56中描述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈]("PCPP"，poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])。含有連接于含磷酸無環(huán)主鏈的脂質(zhì)的化合物，例如TLR4拮抗劑E5564[57、58]:小分子免疫增強劑(SMIP)，例如N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-乙基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-戊基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；l-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪哇并[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙基乙酸酯；4-氨基-l-(2-甲基丙基)-l,3-二氫-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c:喹啉-2,4-二胺；l-H-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基)-2-甲基丙-2-醇;l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑并[4,5-c〗喹啉-l-基]-2-甲基丙-2-醇；N4，N4-二芐基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺。本發(fā)明所用的細胞因子誘導劑可以是Toll樣受體(TLR)的調(diào)節(jié)劑和/或激動劑。例如，它們可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8禾口/或TLR9蛋白中的一種或多種的激動劑。優(yōu)選的誘導劑是TLR7的激動劑(例如，咪唑并喹啉類)和/或TLR9的激動劑(例如，CpG寡核苷酸)。這些誘導劑可用于活化先天免疫途徑?？稍诮M合物制備期間的各階段加入細胞因子誘導劑。例如，可將其加入抗原組合物中，然后將該混合物加入水包油乳液中?；蛘撸蓪⑵浼尤胨腿橐褐?，在這種情況中可以先將誘導劑加入乳液組分中再乳化，或可先乳化再加入乳液中。類似地，誘導劑可以在乳液滴內(nèi)凝聚。最終組合物內(nèi)細胞因子誘導劑的定位和分布取決于其親水/親脂特性，例如誘導劑可位于水相中、油相中和/或油-水界面處?？蓪⒓毎蜃诱T導劑與不同的藥物，例如抗原(如CRM197)偶聯(lián)。參考文獻59概述了小分子偶聯(lián)技術?；蛘?，佐劑可以與其它藥物非共價結合，例如借助疏水性或離心性相互作用。兩種優(yōu)選的細胞因子誘導劑是(a)免疫刺激性寡核苷酸和(b)3dMPL。被微絲微辦免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或(除了dsRNA)單鏈。參考文獻60、61和62披露了可能的類似取代，例如用2'-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻63-68進一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[69]。CpG序列可特異性誘導Th1免疫應答，例如CpG-AODN(寡聚脫氧核苷酸)，或更特異地誘導B細胞應答，例如CpG-BODN。參考文獻70-72討論了CpG-A和CpG-BODN。CpG優(yōu)選CpG-AODN。優(yōu)選將CpG寡核苷酸構建為5'端易于為受體識別。任選將兩條CpG寡核苷酸序列在它們的3'端相連以形成"免疫聚體"(immunomer)。參見，例如參考文獻69和73-75。有用的CpG佐劑是CpG7909，其也稱為ProMuneTM(格雷藥物有限公司(ColeyPharmaceuticalGroup，Inc.))。除使用CpG序列以外，還可使用TpG序列[76]。這些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可以富含嘧啶。例如，其可包含多個連續(xù)的胸苷核苷酸(例如，參考文獻76所述的TTTT)，和/或其核苷酸組成可含有>25%的胸苷(例如，>35%、>40%、>50%、>60%、>80%，等等)。例如，其可包含多個連續(xù)的胞嘧啶核苷酸(例如，參考文獻76所述的CCCC)，和/或其核苷酸組成可含有>25%的胞嘧啶(例如，>35%、>40%、>50%、>60%、>80%，等等)。這些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸通常包含至少20個核苷酸。它們可包含少于100個核苷酸。3dMPL3dMPL(也稱為3脫-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A或3-0-脫?；?4'-單磷酰基脂質(zhì)A)是單磷?；|(zhì)A中還原端葡糖胺的3位被脫?；淖魟?。3dMPL從明尼蘇達沙門菌(Salmonellaminnesota)的無庚糖突變體(heptoselessmutant)制備，其在化學上類似于脂質(zhì)A但缺乏酸不穩(wěn)定的磷?；蛪A不穩(wěn)定的酰基。它活化<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>單核細胞/巨噬細胞譜系的細胞，刺激幾種細胞因子釋放，包括IL-1、IL-12、TNF-ot和GM-GSF(還可見參考文獻54)。參考文獻77最先描述了3dMPL的制備。3dMPL可采取?；潭炔煌南嚓P分子混合物的形式(例如，具有長度可能不同的3、4、5或6條?；?。兩個葡糖胺(也稱為2-脫氧-2-氨基-葡萄糖)單糖的2-位碳(S卩，2和2'位)被N-?；?，3'位也被0-?；Ｅc碳2相連的基團如式-NH-CO-CH2-CRiRi所示。與碳2，相連的基團如式-NH-CO-CH2-CR21^所示。與碳3'相連的基團如式-0-CO-CH2-CII所示。代表性的結構是基團R1、R2和R3各自獨立為-(CH2)n-CH3。n值優(yōu)選在8-16之間，更優(yōu)選在9-12之間，最優(yōu)選10?；鶊FR1,R2'和R3'各自獨立為(a)-H;(b)~OH;或(c)-O-CO-R4，其中R4是-H或-(CH2)m-CH3，其中m值優(yōu)選在8-16之間，更優(yōu)選10、12或14。在2位，m優(yōu)選14。在2'位，m優(yōu)選10。在3'位，m優(yōu)選12。因此基團R"、R2'和W優(yōu)選十二垸酸、十四垸酸和十六烷酸的-O-酰基。當R、R"和W均是-H時，3d-MPL只有3條?；?2、2'和3'位上各有一條)。當R1,W和W中只有兩個是-H時，3d-MPL可具有4條酰基鏈。當R1R"和W中只有一個是-H時，3d-MPL可具有5條酰基鏈。當R1，R"和W中無一是-H時，3d-MPL可具有6條酰基鏈。本發(fā)明所用3d-MPL佐劑可以是具有3-6條酰基鏈的這些形式的混合物，但優(yōu)選混合物中包含具有6條?；湹?d-MPL，特別是要確保以重量計6?；溞问街辽僬伎?d-MPL的10%，例如^20%、230°/。、^40%、250%或更高。發(fā)現(xiàn)具有6條?；湹?d-MPL是最有活性的佐劑形式。因此，本發(fā)明組合物包含的3dMPL最優(yōu)選形式是當采用混合物形式的3dMPL時，提及本發(fā)明組合物中3dMPL的用量或濃度指該混合物中混合的3dMPL諸種類。在水性條件下，3dMPL可形成大小不同，例如直徑<150nm或>500nm的膠束凝聚物或顆粒。本發(fā)明可使用任一種或二者，通過常規(guī)試驗可選擇較佳的顆粒。較小的顆粒因其較佳的活性而優(yōu)選用于本發(fā)明(例如，足夠小從而能得到3dMPL的透明水性混懸液)[78]。優(yōu)選顆粒的平均直徑小于220nm，更優(yōu)選小于200nm或小于150nm或小于120nm，平均直徑甚至可以小于100nm。然而，在大多數(shù)情況中，平均直徑不會小于50nm。這些顆粒足夠小，從而適于過濾滅菌?？赏ㄟ^動態(tài)光散射的常規(guī)技術評估顆粒直徑，該技術能揭示平均顆粒直徑。當說到顆粒的直徑為xnm時，顆粒分布一般在該平均值附近，但以數(shù)量計至少50%(例如，260%、$70%、280%、290%或更多)的顆粒的直徑在x土+25。/。范圍內(nèi)。最好基本上所有3dMPL位于乳液的水相中。疫苗中3dMPL的常見用量是10-100ng/劑，例如約25pg或約50pg。可單獨使用3dMPL，或與一種或多種其它化合物聯(lián)用。例如，已知可聯(lián)用3dMPL與QS21皂苷[79](包含在乳液中[80])、磷酸鋁[81]或氫氧化鋁[82]。流麟就嚴本發(fā)明組合物包含流感病毒抗原。通?？蓮牧鞲胁《绢w粒制備抗原，或者可在重組宿主(例如，在利用桿狀病毒載體的昆蟲細胞)中表達諸如血凝素等抗原并以純化形式使用[83、84]。然而，抗原一般來自病毒顆粒?？乖刹捎没畈《?，或者更優(yōu)選滅活病毒的形式。滅活病毒的化學方法包括用有效量的一種或多種以下試劑處理洗滌劑、甲醛、福爾馬林、P-丙內(nèi)酯或紫外光。滅活的其它化學方法包括用亞甲基藍、補骨脂素、羧基富勒烯(C60)或它們?nèi)魏蔚慕M合處理。本領域知道滅活病毒的其它方法，例如二元乙胺(binaryethylamine)、乙?；蚁﹣啺坊騳射線。INFLEXAL產(chǎn)品是完整的病毒顆粒滅活疫苗。如果使用滅活病毒，疫苗可包含完整的病毒顆粒、裂解病毒顆?；蚣兓谋砻婵乖?包含血凝素，通常還包含神經(jīng)氨酸酶)?？赏ㄟ^各種方法從含病毒的液體收集病毒顆粒。例如，純化方法可包括利用線性蔗糖梯度溶液的區(qū)帶離心，所述蔗糖溶液含有洗滌劑以使病毒顆粒破裂。任選稀釋后，可通過滲濾純化抗原。用洗滌劑(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、磷酸三-N-丁酯、曲通X-IOO、曲通NIOI、溴化十六垸基三甲銨，等等)處理病毒顆粒，包括"吐溫-醚"裂解方法來產(chǎn)生亞病毒顆粒制品，從而獲得了裂解病毒顆粒。本領域熟知裂解流感病毒的方法，例如參見參考文獻85-卯等。通常利用破裂濃度(disruptingconcentration)的裂解劑(splittingagent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎來進行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白質(zhì)完全或部分溶解，改變了病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子和離子性(例如，陽離子)表面活性劑，例如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜堿、甜菜堿、聚氧乙烯烷基醚、N,N-二垸基-葡糖酰胺(Glucamides)、?？他湼?Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季銨化合物、十二烷基肌氨酸鈉、CTAB(溴化十六烷基三甲銨)、磷酸三-N-丁酯、塞太弗倫(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基銨鹽、脂轉(zhuǎn)染試劑、脂轉(zhuǎn)染胺、DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性劑，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法利用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續(xù)作用，裂解可發(fā)生在最初的病毒顆粒純化期間(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)?？蓪⒘呀獾牟《绢w粒有用地重懸在磷酸鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONE和FLUSHIELDTM產(chǎn)品是裂解疫苗(splitvaccine)。純化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常還包含神經(jīng)氨酸酶。本領域熟知制備純化形式的這些蛋白質(zhì)的方法。FLUVIRINTM、AGRIPPAL和INFLUVACTM產(chǎn)品是亞單位疫苗。流感抗原還可以病毒體形式存在[91]。流感病毒可以是減毒的。流感病毒可以是溫度靈敏的。流感病毒可以是冷適應的。這三種可能性特別適用于活病毒。用于疫苗中的流感病毒毒株每季不同。在目前的流行間期，疫苗通常包含兩種甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一種乙型流感毒株，一般是三價疫苗。本發(fā)明還可利用流行毒株(即，對疫苗受者和普通人群而言免疫原初的毒株)的病毒，例如H2、H5、H7或H9亞型毒株(特別是甲型流感病毒)，流行毒株的流感疫苗可以是單價疫苗，或者可以添加了流行毒株的普通三價疫苗為基礎。然而，取決于季節(jié)和疫苗中抗原的性質(zhì)，本發(fā)明可起保護作用以抵御以下一種或多種甲型流感病毒HA亞型Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16。本發(fā)明可起保護作用以抵御一種或多種甲型流感病毒NA亞型Nl、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9?？捎杏玫匕谶@些組合物中的其它毒株是耐受抗病毒治療的毒株(例如，耐受奧塞米韋[92]和/或扎那米韋)的毒株，包括耐藥性流行毒株[93]。本發(fā)明佐劑配制的組合物特別適用于免疫接種以抵御流行毒株。能導致流行病爆發(fā)的流感毒株的特征在于(a)與目前流行的人毒株中的血凝素相比，其含有新的血凝素，即，未在人群中出現(xiàn)超過10年的毒株(例如，H2)，或者以前根本未在人群中見到的毒株(例如，通常只在鳥群中發(fā)現(xiàn)的H5、H6或H9)，從而使得人群對該毒株的血凝素而言在免疫學上是原初的；(b)其能在人群中水平轉(zhuǎn)移；和(c)其對人具有致病性。對于免疫接種抵御流行性流感，優(yōu)選具有H5血凝素類型的毒株，例如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，及任何其它可能出現(xiàn)的流行毒株。在H5亞型內(nèi)，病毒可能屬于HA進化枝1、HA進化枝r、HA進化枝2或HA進化枝3[94]，其中進化枝l和3特別相關。本發(fā)明組合物可包含一種或多種(例如，1、2、3、4或更多種)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。如果疫苗包含多種流感毒株，通常分別培養(yǎng)不同的毒株，收集病毒后混合來制備抗原。因此，本發(fā)明方法可包括混合多種流感毒株的抗原的步驟。流感病毒可以是重配毒株，可通過反向遺傳學技術獲得。反向遺傳學技術[例如，95-99]能利用質(zhì)粒在體外制備含所需基因組區(qū)段的流感病毒。該技術通常涉及表達(a)例如能從polI啟動子編碼所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如能從polII啟動子編碼病毒蛋白質(zhì)的DNA分子，從而使得在細胞中表達兩種類型的DNA能裝配完整的感染性病毒顆粒。DNA優(yōu)選能提供所有病毒RNA和蛋白質(zhì)，但也可能利用輔助病毒提供所述RNA和蛋白質(zhì)中的一些。優(yōu)選質(zhì)粒方法，從而能用不同質(zhì)粒產(chǎn)生各病毒RNA[100-102]，這些方法還包括利用質(zhì)粒來表達所有病毒蛋白質(zhì)或其中一些(例如，只是PB1、PB2、PA和NP蛋白質(zhì))，一些方法利用了12種質(zhì)粒。為減少所需的質(zhì)粒數(shù)，最近的方法[103]在同一質(zhì)粒上組合了多個RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒(對于病毒RNA合成)(例如，編碼l、2、3、4、5、6、7或所有8個甲型流感vRNA區(qū)段的序列)，在另一質(zhì)粒上組合了含RNA聚合酶II啟動子的多個蛋白質(zhì)編碼區(qū)(例如，編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8個甲型流感mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列)。參考文獻103所述方法的優(yōu)選方面包括(a)單獨質(zhì)粒上的PB1、PB2和PAmRNA編碼區(qū)；和(b)單獨質(zhì)粒上的所有8個vRNA編碼區(qū)段。包含一個質(zhì)粒上的NA和HA區(qū)段和另一質(zhì)粒上的6個其它區(qū)段也是有利的。除了用poll啟動子編碼病毒RNA區(qū)段，還可能用細菌噬菌體聚合酶啟動子[104]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的啟動子。由于poll啟動子的種類特異性，細菌噬菌體聚合酶啟動子對于許多細胞類型(例如，MDCK)更方便，雖然還必須用編碼外源性聚合酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。其它技術可能采用雙重poll和polll啟動子來同時編碼一個模板的病毒RNA和可表達的mRNA[105、106]。因此，甲型流感病毒可包含A/PR/8/34病毒的一個或多個RNA區(qū)段(通常是A/PR/8/34的6個區(qū)段，其中HA和N區(qū)段來自疫苗毒株，即6:2重配株)，特別是用卵培養(yǎng)病毒時。還可包含用于生產(chǎn)疫苗制備用重配病毒的A/WSN/33病毒或任何其它病毒毒株的一個或多個RNA區(qū)段。通常，本發(fā)明保護抵御能人向人傳播的毒株，因此毒株的基因組一般包含源自哺乳動物(例如人)流感病毒的至少一個RNA區(qū)段。其可包含源自禽流感病毒的NS區(qū)段。可用卵(通常是SPF卵)或細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)用作抗原來源的病毒。目前培養(yǎng)流感病毒的標準方法利用含胚的雞蛋以及從雞蛋內(nèi)含物(尿囊液)中純化病毒。然而，近年來用動物細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)病毒，出于速度和患者變態(tài)反應的原因，優(yōu)選該培養(yǎng)方法。如果采用雞蛋培養(yǎng)病毒，則可將病毒與一種或多種氨基酸一起引入雞蛋的尿囊液中[89]。細胞物質(zhì)通常是哺乳動物細胞系。合適的哺乳動物細胞來源包括但不限于倉鼠、牛、靈長類(包括人和猴)和犬細胞?？衫酶鞣N細胞類型，例如腎細胞、成纖維細胞、視網(wǎng)膜細胞、肺細胞等。合適的倉鼠細胞的例子是名為BHK21或HKCC的細胞系。合適的猴細胞是，例如非洲綠猴細胞，例如Vero細胞系中的腎細胞。合適的犬細胞是，例如MDCK細胞系中的腎細胞。因此，合適的細胞系包括但不限于MDCK;CHO;293T;BHK;Vero;MRC-5;PER.C6;WI-38;等等。用于培養(yǎng)流感病毒的優(yōu)選哺乳動物細胞系包括源自馬-達二氏犬腎的MDCK細胞[107-110];源自非洲綠猴(Cwcop"/zecwaeA/o;w)腎臟的Vero細胞[l11-113];或源自人胚胎成視網(wǎng)膜細胞的PER.C6細胞[114]。這些細胞系可廣泛購自，例如美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)[115]、寇里爾細胞保藏中心(CoriellCellRepositories)[l16]或歐洲細胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供目錄號為CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587的各種不同Vero細胞，目錄號為CCL-34的MDCK細胞。PER.C6可以保藏號96022940購自ECACC。作為哺乳動物細胞系的次選替代，可用禽細胞系培養(yǎng)病毒[例如，參考文獻117-119]，包括源自鴨(例如，鴨視網(wǎng)膜)或母雞，例如雞胚胎成纖維細胞(CEF)的細胞系，等等。例子包括禽胚胎干細胞[117、120]，包括源自雞胚胎干細胞的EBx細胞系、EB45、EB14和EB14-074[121]。培養(yǎng)流感病毒的最優(yōu)選細胞系是MDCK細胞系。原始MDCK細胞系可以CCL-34購自ATCC，但也可使用該細胞系的衍生物。例如，參考文獻107披露了適應于在懸浮培養(yǎng)基中生長的MDCK細胞系("MDCK33016"，以DSMACC2219保藏)。類似地，參考文獻122披露了生長在無血清培養(yǎng)懸液中的MDCK衍生細胞系("B-702"，以FERMBP-7449保藏)。參考文獻123披露了非致瘤性MDCK細胞，包括"MDCK-S"(ATCCPTA-6500)、"MDCK-SF101"(ATCCPTA-6501)、"MDCK-SF102"(ATCCPTA-6502)和"MDCK-SF103"(PTA-6503)。參考文獻124披露了對感染高度敏感的MDCK細胞系，包括"MDCK.5F1"細胞(ATCCCRL-12042)?？墒褂萌魏芜@些MDCK細胞系。如果利用哺乳動物細胞系培養(yǎng)病毒，則組合物優(yōu)選不含卵蛋白質(zhì)(例如，卵白蛋白和卵類黏蛋白)和雞DNA，從而能降低變應原性。如果用細胞系培養(yǎng)病毒，則生長培養(yǎng)基以及用于啟動培養(yǎng)的病毒接種物優(yōu)選不含(即，經(jīng)測試得到污染的陰性結果)單純皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸病毒、多瘤病毒、雙RNA病毒、環(huán)病毒和/或細小病毒[125]。特別優(yōu)選不含單純皰疹病毒。如果用細胞系培養(yǎng)病毒，則每劑組合物優(yōu)選含有少于10ng(優(yōu)選少于1ng，更優(yōu)選少于100pg)的殘留宿主細胞DNA，雖然可以存在痕量的宿主細胞DNA?？傊?，本發(fā)明組合物中的宿主細胞DNA不能長于100bp?，F(xiàn)在，檢測殘留的宿主細胞DNA是生物制品的常規(guī)要求，屬于技術人員的普通能力。用于檢測DNA的試驗通常是確認試驗[126、127]。可利用數(shù)學和可定量的術語描述確認試驗的性能特征，已鑒定了其可能的誤差來源。已在總體上檢驗了該試驗的諸如準確度、精密度、特異性等特征。一旦校驗(例如，用已知標準量的宿主細胞DNA)及檢驗好某試驗，可常規(guī)進行定量DNA檢測?？刹捎萌N主要的DNA定量技術雜交方法，例如Sourthern印跡或槽印跡[128];免疫測定方法，例如ThresholdTM系統(tǒng)[129];和定量PCR[130]。技術人員熟知這些方法，雖然各方法的精確特征取決于所研究的宿主細胞，例如雜交探針的選擇，擴增用引物和/或探針的選擇，等等。分子裝置公司(MolecularDevices)的Threshold系統(tǒng)是用于皮克水平總DNA的定量試驗，其已用于監(jiān)測生物藥品中的污染DNA水平[129]。典型的試驗包括在生物素化的ssDNA結合蛋白、脲酶偶聯(lián)的抗-ssDNA抗體和DNA之間非序列特異性地形成反應復合物。所有試驗組分均裝入購自生產(chǎn)商的完整的總DNA測定試劑盒(TotalDNAAssayKit)中。各種商品化生產(chǎn)商提供檢測殘留宿主細胞DNA的定量PCR試驗，例如AppTecTM實驗室服務公司(LaboratoryServices)、BioRelianceTM、亞瑟技術公司(AltheaTechnologies),等等。檢測人病毒疫苗中宿主細胞DNA污染的化學發(fā)光雜交試驗和總DNAThresholdTM系統(tǒng)的比較見參考文獻131。可釆用標準純化方法，例如層析等在疫苗制備期間除去污染性DNA。通過核酸酶處理，例如用DNA酶可促進除去殘留的宿主細胞DNA。參考文獻132和133披露了降低宿主細胞DNA污染的便利方法，其涉及兩步處理，首先可在病毒培養(yǎng)期間使用DNA酶(例如，Benzonase)，然后可在病毒顆粒破裂期間使用陽離子洗滌劑(例如，CTAB)。用烷化劑，例如P-丙內(nèi)酯處理也可用于除去宿主細胞DNA,該方法還可優(yōu)選用于滅活病毒顆粒[134]。優(yōu)選在每15pg血凝素中含有〈10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主細胞DNA的疫苗，例如每0.25ml體積含有〈10ng(例如，<1ng、〈100pg)宿主細胞DNA的疫苗。更優(yōu)選在每50pg血凝素中含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主細胞DNA的疫苗，例如每0.5ml體積含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主細胞DNA的疫苗。優(yōu)選任何殘留宿主細胞DNA的平均長度短于500bp，例如短于400bp、短于300bp、短于200bp、短于100bp，等等。對于用細胞系，例如MDCK細胞培養(yǎng)，可用懸液培養(yǎng)[107、135、136]或貼壁培養(yǎng)的細胞來培養(yǎng)病毒。用于懸液培養(yǎng)的一種合適的MDCK細胞系是MDCK33016(保藏號為DSMACC2219)?；蛘撸刹捎梦⑤d體培養(yǎng)。優(yōu)選用無血清的培養(yǎng)基和/或無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)支持流感病毒復制的細胞系。本發(fā)明將其中不含人或動物來源的血清添加劑的培養(yǎng)基稱為無血清培養(yǎng)基。無蛋白質(zhì)應理解為表示發(fā)生細胞增殖的培養(yǎng)基中不含蛋白質(zhì)、生長因子、其它蛋白質(zhì)添加劑和非血清蛋白質(zhì)，但可包含病毒生長所需的蛋白質(zhì)，例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在這種培養(yǎng)基中生長的細胞自身可天然含有蛋白質(zhì)。支持流感病毒復制的細胞系優(yōu)選在37'C以下生長[137](例如，30-36°C，或約3(TC、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C)，例如在病毒復制期間。在培養(yǎng)的細胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步驟給培養(yǎng)的細胞接種待培養(yǎng)的毒株，將受感染的細胞培養(yǎng)病毒繁殖所需的時間，例如通過病毒滴度或抗原表達測定的(如，接種后24-168小時)，收集繁殖的病毒。以病毒和細胞之比為1:500-1:1,優(yōu)選1:100-1:5，更優(yōu)選1:50-1:10(通過PFU或TCIDso檢測)接種培養(yǎng)的細胞。可將病毒加入細胞懸液中，或施加于細胞單層，病毒于25-40°C，優(yōu)選28-37T:，在細胞上吸附至少60分鐘，但通常少于300分鐘，優(yōu)選在90-240分鐘之間?？赏ㄟ^凍融或酶促作用除去感染的細胞培養(yǎng)物(例如，單層)，從而增加了收集的培養(yǎng)上清液中的病毒含量。然后使收集的液體滅活或冷凍保存。以約0.0001-10，優(yōu)選0.002-5，更優(yōu)選0.001-2的感染復數(shù)("m.o.i.")感染培養(yǎng)的細胞。更優(yōu)選以約O.Ol的m.o丄感染細胞。感染后30-60小時收集感染的細胞。優(yōu)選在感染后34-48小時收集細胞。更優(yōu)選在感染后38-40小時收集細胞。通常在細胞培養(yǎng)期間加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以釋放病毒，可在培養(yǎng)期間的任何合適階段加入蛋白酶。血凝素(HA)是滅活流感疫苗中的主要免疫原，參考HA水平使疫苗劑量標準化，一般通過單向輻射狀免疫擴散(SRID)試驗檢測。疫苗通常含有約15pgHA/毒株，雖然在例如兒童，或流行情況下可使用較低的劑量。與較高劑量(例如，3X或9X劑量[138、139])—樣，已使用了部分劑量，例如V2(即，7.5pgHA/毒株)、V4和Vs[4、5]。因此，疫苗可包含0.1-150iigHA/流感毒株，優(yōu)選0.1-50jig，例如0.1-20^g、0.1-15^g、0.1-10pg、0.1-7.5|ig、0.5-5^g，等等。具體的劑量包括，例如約45、約30、約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約1.9、約1.5，等等。與本發(fā)明一樣，當疫苗中存在佐劑時，這些較低的劑量最有用。對于活疫苗，通過中值組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5o)而不是HA含量來檢測給藥，每種毒株的TCID5o—般在106-108之間(優(yōu)選1065-1075)。本發(fā)明所用的HA可以是病毒中發(fā)現(xiàn)的天然HA，或者可經(jīng)修飾。例如，己知可修飾HA以除去致使病毒在禽類中高度致病的決定簇(例如，圍繞HA1和HA2之間的切割位點的超堿性區(qū)域(hyper-basicregion)),否則這些決定簇可阻止病毒在卵中生長。本發(fā)明的組合物可包含洗滌劑，例如聚氧乙烯失水失水山梨糖醇酯表面活性齊IJ(稱為"吐溫")，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六垸基三甲銨(CTAB)，或脫氧膽酸鈉，特別是對于裂解疫苗或表面抗原疫苗?？梢灾淮嬖诤哿康南礈靹?。因此，疫苗中所含的辛苯聚醇-10、a-生育酚半琥珀酸酯(a-tocopherylhydrogensuccinate)和聚山梨醇酯80各自低于1mg/ml。其它痕量的殘留組分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。滅活但非全細胞的疫苗(例如，裂解病毒疫苗或純化的表面抗原疫苗)可包含基質(zhì)蛋白，從而受益于位于該抗原內(nèi)的其它T細胞表位。因此，包含血凝素和神經(jīng)氨酸酶的非全細胞疫苗(特別是裂解疫苗)還可包含Ml和/或M2基質(zhì)蛋白。如果存在基質(zhì)蛋白，優(yōu)選包含可檢測水平的M1基質(zhì)蛋白。還可存在核蛋白。藥激邀會激本發(fā)明組合物是藥學上可接受的。它們通常包含除抗原、佐劑和細胞因子誘導劑以外的組分，例如，它們通常包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。對這些組分的充分討論見參考文獻140。組合物可包含一種或多種防腐劑，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。然而，這些疫苗優(yōu)選基本上不含(S卩，少于5pg/ml)汞物質(zhì)，例如不含硫柳汞[88、141]。更優(yōu)選不含汞的疫苗。特別優(yōu)選不含防腐劑的疫苗。優(yōu)選包含生理鹽，例如鈉鹽以控制張力。優(yōu)選1-20mg/ml之間的氯化鈉(NaCl)?？纱嬖诘钠渌}包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、脫水磷酸氫二鈉(disodiumphosphatedehydrate)、氯化鎂、氯化鈣等。組合物的重量克分子滲透濃度通常在200mOsm/kg-400mOsm/kg之間，優(yōu)選240-360mOsm/kg之間，更優(yōu)選處于290-310mOsm/kg范圍內(nèi)。以前有報道說重量克分子滲透濃度對疫苗接種所致的疼痛沒有影響[142]，但最好將重量克分子滲透濃度維持在該范圍內(nèi)。組合物可包含一種或多種緩沖液。典型的緩沖液包括磷酸緩沖液；Tris緩沖液；硼酸緩沖液；琥珀酸緩沖液；組氨酸緩沖液；或擰檬酸緩沖液。所含的緩沖液范圍一般是5-20mM。組合物的pH通常在5.0-8.1之間，更常見在6.0-8.0之間，例如6.5禾B7.5之間，或7.0-7.8之間。因此，本發(fā)明方法可包括先調(diào)節(jié)散裝疫苗的pH再包裝的步驟。組合物優(yōu)選無菌。組合物優(yōu)選無熱原，例如每劑量含有<1EU(內(nèi)毒素單位，標準量度)，優(yōu)選每劑量〈0.1EU。組合物優(yōu)選無谷蛋白。組合物可包含一次免疫的物質(zhì)，或可包含多次免疫的物質(zhì)(即，"多劑量"試劑盒)。在多劑量配置中，優(yōu)選包含防腐劑。除了在多劑量組合物中包含防腐劑以外，還可將組合物置于裝有用于轉(zhuǎn)移物質(zhì)的無菌適配器的容器中。一般給予的疫苗劑量體積是約0.5ml，雖然可將半劑量(即，約0.25ml)給予兒童。通?；旌辖M合物中的抗原、佐劑和細胞因子誘導劑。組合物和試劑盒優(yōu)選保存在2'C-8'C之間。不應冷凍它們。最好避免有光直射。本發(fā)灘試微如上所述，可以在遞送時臨時制備本發(fā)明組合物。因此，本發(fā)明提供裝有即時混合的各組分的試劑盒。所述試劑盒將水包油乳液和抗原分別保存待用。細胞因子誘導劑可以包含在這兩種試劑盒組分之一中，或者可以是第三試劑盒組分的一部分。試劑盒內(nèi)的諸組分彼此物理分離，可采用各種方法實現(xiàn)這種分離。例如，諸組分可處于單獨的容器，例如小瓶中。然后可取出一個小瓶的內(nèi)含物并將其加入另一小瓶，或者分別取出兩小瓶的內(nèi)含物并在第三容器中混合而混合兩小瓶的內(nèi)含物。在優(yōu)選的配置中，試劑盒諸組分之一存于注射器中，其它組分存于容器，例如小瓶中?？衫米⑸淦?例如，裝有針頭)將其內(nèi)含物注入第二容器中進行混合，然后將混合物抽入該注射器中。隨后將該注射器中的混合內(nèi)含物給予患者，通常利用新的無菌針頭。將一種組分包裝在注射器中無需利用另一注射器來給予患者。在另一優(yōu)選配置中，將兩種試劑盒組分分別保存在同一注射器，例如雙室注射器中，如參考文獻143-150等所披露的。使用該注射器(例如，給予患者期間)之時即混合了該兩室中的內(nèi)含物。該配置在使用時無需單獨的混合步驟。試劑盒各組分的內(nèi)含物通常均可處于水性形式。在一些配置中，某組分(一般是抗原組分而不是乳液組分)處于干燥形式(例如，凍干的形式)，另一組分處于水性形式?？梢曰旌纤鰞煞N組分以再活化干組分，從而獲得給予患者的水性組合物。凍干組分通常保存于小瓶而不是注射器內(nèi)。干燥的組分可以包含穩(wěn)定劑，例如乳糖、蔗糖或甘露醇以及它們的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一種可能的配置將水性乳液組分存于預填充注射器中，而將凍干抗原組分存于小瓶中。包紫遂會激或試微遂分本發(fā)明組合物(或試劑盒組分)的合適容器包括小瓶、注射器(例如，一次性注射器)、鼻噴霧器等。這些容器應無菌。如果將組合物/組分存于小瓶中，所述小瓶優(yōu)選由玻璃或塑料材料制成。優(yōu)選先將小瓶滅菌再加入組合物。為避免患者對乳膠過敏的問題，優(yōu)選用無乳膠的塞子密封小瓶，所有包裝材料最好均不含乳膠。小瓶可裝有單劑量疫苗，或可裝有多劑量("多劑量"小瓶)，例如IO份劑量。優(yōu)選用無色玻璃制成小瓶。小瓶可裝有蓋子(例如，Luer鎖扣)，從而可將預填充的注射器插入蓋子中，將注射器的內(nèi)含物推入小瓶中(例如，重建其中的凍干材料)，再將小瓶的內(nèi)含物抽回注射器中。將注射器從小瓶中取出后，裝上針頭，將組合物給予患者。優(yōu)選使蓋子位于封口或覆蓋物內(nèi)，從而要先除去封口或覆蓋物再接觸蓋子。小瓶可具有蓋子，從而能無菌取出其內(nèi)含物，特別是對于多劑量小瓶。如果要將某組分包裝入注射器，注射器可裝有針頭。如果未裝針頭，可隨注射器提供單獨的針頭用于裝配和使用。這種針頭可以是有鞘的。優(yōu)選安全針頭。常見的是1英寸23號、1英寸25號和5/8英寸25號針頭。注射器可裝有可剝離標簽，其上打印了批號、流感季節(jié)和內(nèi)含物的有效期，從而有助于記錄保管。注射器的柱塞優(yōu)選具有塞子，從而能防止柱塞在抽吸期間意外掉出。注射器可裝有乳膠橡膠蓋子和/或柱塞。一次性注射器可含有單劑量疫苗。在裝上針頭之前，注射器一般裝有針帽以密封頂端，所述針帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭分開包裝，則優(yōu)選給針頭裝有丁基橡膠罩。優(yōu)選的注射器是以"Tip-Lok"TM為商品名投入市場的那些。可給容器做上顯示半劑量體積的標記，例如以有助于遞送給兒童。例如，含有0.5ml劑量的注射器可具有顯示0.25ml體積的標記。如果使用玻璃容器(例如，注射器或小瓶)，則優(yōu)選使用硼硅酸玻璃而不是鈉鈣玻璃制成的容器?？呻S試劑盒或組合物裝有(例如，裝在同一盒子中)插頁，該插頁包括疫苗的細節(jié)，例如給藥的使用說明書，疫苗中抗原的細節(jié)等。使用說明書還可包括警告，例如準備腎上腺素溶液以防疫苗接種后的過敏反應，等等。潛伊方法微纖鄉(xiāng)本發(fā)明組合物適合給予人患者，本發(fā)明提供在患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應答的方法，包括將本發(fā)明組合物給予患者的步驟。本發(fā)明還提供試劑盒，或者用作藥物的本發(fā)明組合物。本發(fā)明還提供(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐劑；和(iii)細胞因子誘導劑在制備用于在患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應答的藥物中的應用。這些方法和應用產(chǎn)生的免疫應答通常包括抗體應答，優(yōu)選保護性抗體應答。本領域熟知評估流感病毒疫苗接種后的抗體應答、中和能力和保護作用的方法。人類研究證明針對人流感病毒血凝素的抗體滴度與保護作用有關(血清樣品血凝反應-抑制滴度約30-40時，對同源病毒感染的保護作用約為50%)[151]。一般通過血凝反應抑制、微量中和、單輻射免疫擴散(SRID)和/或單向輻射狀溶血(SRH)檢測抗體應答。本領域熟知這些試驗技術?？梢愿鞣N方法給予本發(fā)明組合物。最優(yōu)選的免疫途徑是肌肉內(nèi)注射(例如，注射入手臂或腿中)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)[152-154]、口服[155]、真皮內(nèi)[156，157]、透皮、經(jīng)皮[158]等。本發(fā)明制備的疫苗可用于治療兒童和成年人。流感疫苗目前推薦用于兒科和成年人免疫接種，年齡自6個月起。因此，患者可以小于l歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲、或至少55歲。接受疫苗的患者優(yōu)選老年人(例如，$50歲，260歲，優(yōu)選265歲)，年輕人(例如，$5歲)，住院患者，衛(wèi)生保健人員、軍隊和軍事人員，懷孕的婦女，慢性病、免疫缺陷患者，在接受疫苗前7天中服用抗病毒化合物(例如，奧塞米韋或扎那米韋化合物；例如磷酸奧塞米韋，參見下文)的患者，和出國的人。然而，這些疫苗不僅適用于這些團體，還可應用于更廣泛的人群中。對于流行毒株，優(yōu)選給予所有的年齡組。本發(fā)明的優(yōu)選組合物滿足效力的CPMP標準的1、2或3條。在成年人(18-60歲)中，這些標準是(1)^70%血清保護作用；(2)240%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT增加22.5-倍。在老年人(>60歲)中，這些標準是(1)^60%血清保護作用；(2)230%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT增加2L倍。這些標準依據(jù)至少50位患者的標簽公開研究(openlabelstudy)。治療可以是單劑量用藥法或多劑量用藥法。多劑量可以用于初次免疫接種程序表和/或加強免疫接種程序表中。在多劑量用藥法中，可通過相同或不同的途徑給予各種劑量，例如胃腸外致敏和粘膜加強，粘膜致敏和胃腸外加強，等等。給予多次劑量(通常是兩劑量)在免疫原初患者，例如對于以前從未接受流感疫苗的人，或?qū)τ诮臃N抵御新HA亞型的疫苗而言(例如在流行病爆發(fā)期間)特別有用。多劑量通?？砷g隔至少一周(例如，約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約10周、約12周、約16周，等等)給予。可將本發(fā)明疫苗與其它疫苗基本上同時C例如，可在醫(yī)療保健專家或疫苗接種中心的同一次用藥咨詢或就診期間)給予患者，例如與以下疫苗基本上同時麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破傷風疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯(lián)的乙型流感嗜血桿菌疫苗、滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)物疫苗(例如，四價A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞體病毒疫苗、肺炎球菌偶聯(lián)物疫苗，等等。與肺炎球菌疫苗和/或腦膜炎球菌疫苗基本上同時給予在老年患者中特別有用。類似地，可將本發(fā)明疫苗與抗病毒化合物，特別是有效抵御疫流感毒的抗病毒化合物(例如，奧塞米韋和/或扎那米韋)基本上同時(例如，可在醫(yī)療保健專家的同一次用藥咨詢或就診期間)給予患者。這些抗病毒(化合物)包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑，例如(3R,4R,5S)-4-乙?；被?5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-環(huán)己烯-l-羧酸或5-(乙?；被?-4-[(氨基亞氨基甲基)-氨基]-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-D-丙三基-D-半乳糖壬(galactonon)-2-烯酸(enonicacid)，包括它們的酯(例如乙酯)和它們的鹽(例如磷酸鹽)。優(yōu)選的抗病毒化合物是(3尺,411,58)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-環(huán)己烯-l-羧酸、乙酯、磷酸酯(1:1)，也稱為磷酸奧塞米韋(TAMIFLIJtm)。撒迷術語"含有"包括"包含"以及"由...組成"，例如"含有"X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。詞語"基本上"不排除"完全"，例如"基本上無"Y的組合物可完全無Y。該詞語"基本上"可視需要從本發(fā)明定義中省去。與數(shù)值x有關的術語"約"表示，例如x士100/0。除非有專門表述，包括混合兩種或多種組分的步驟的某方法不要求任何具體混合順序。因此，可以任何順序混合諸組分。如果有三種組分，則可先將兩種組分彼此混合，再將該混合物與第三種組分混合，等等。如果利用動物(特別是牛)材料培養(yǎng)細胞，這些材料應從不含可傳染海綿樣腦病(TSE)，特別是不含牛海綿樣腦病(BSE)的來源獲得?？傮w上，優(yōu)選在完全不含動物來源的材料中培養(yǎng)細胞。如果將化合物作為組合物的一部分給予身體，或可用合適的前藥替代該化合物。如果將細胞物質(zhì)用于重配或反向遺傳學方法，優(yōu)選批準用于人疫苗生產(chǎn)的細胞物質(zhì)，例如歐洲藥典概述章節(jié)5.2.3中的。附圖簡述圖1-3顯示了用不同組合物免疫的小鼠的LoglO血清抗體滴度(ELISA)。箭頭顯示了包含MF59乳液的組合物。從左向右，各柱形分為單用四種佐劑(i)到(iv);四種CpG組合；四種R-848組合；四種ER-57組合；包含添加劑的對照；和單用兩種組分(a)和(b)。因此，最左側的箭頭顯示了單用MF59的結果。圖4顯示了用HA刺激時獲得抗原特異性細胞因子應答的CD4+T細胞百分比(每對的左柱)和，干擾素陽性的百分比(每對的右柱)。各組在X-軸上與圖1-3相同。圖5顯示了IgG抗H3N2毒株的GMT(AU/ml)。各對中左柱顯示了IgGl;右柱顯示了IgG2a。圖6顯示了接受雞蛋培養(yǎng)的三價抗原的小鼠中的血清抗-HAELISA應答(2劑量后)。進行的實驗分別是不含佐劑，含MF59和/或CpG7909。類似地，圖7顯示了同一小鼠中的抗-HAHI應答。圖8顯示了通過ELISA評估的抗-H3N2IgGl和IgG2a比例。圖9顯示了細胞因子陽性細胞數(shù)量，以總CD4+細胞M表示。顯示了兩只獨立小鼠的應答。用不含佐劑或用佐劑(l)、(2)或(3)配制的裂解疫苗"A"或"B"免疫小鼠。本發(fā)明實施方式在MDCK細胞上分別培養(yǎng)流感病毒毒株WyomingH3N2(A)、New-CaledoniaH1N1(A)和Jiangsu(B)。制備三價表面糖蛋白疫苗，用其在第0天和第28天以兩種劑量(O.l和1pgHA/毒株)免疫免疫原初的Balb/C小鼠。在第42天采集小鼠的血液并用該血進行各種試驗HI滴度；通過ELISA測得的抗-HA應答；和以抗原特異性方式釋放細胞因子的CD4+T細胞水平，包括單獨檢測釋放Y-干擾素的那些細胞水平。對于IgGl或IgG2a，專門檢測IgG應答。用于免疫的組合物(除了陰性對照)包含以下之一(i)MF59乳液，以1:1的體積比與抗原溶液混合；(ii)氫氧化鋁，以lmg/ml使用并包含5mM組氨酸緩沖液；(iii)磷酸鈣，以1mg/ml使用并包含5mM組氨酸緩沖液；或(iv)由聚(丙交酯-共-乙交酯)50:50共聚組合物形成的微粒，內(nèi)部粘度0.4("PLG")，含吸附的抗原。此外(再次除了陰性對照)，組合物包含以下組分之一(a)具有硫代磷酸酯主鏈的免疫刺激性CpGODN;或(b)R-848。分別檢驗了這六種組分，只有MF59乳液在兩種劑量均始終提高了針對所有三種毒株的HI滴度。對于H1N1毒株，滴度比無佐劑對照高10倍以上。對于H3N2毒株，(滴度)增加在抗原劑量較低時>5倍，而在劑量較高時>10倍。對于乙型流感病毒毒株，(滴度)增加在抗原劑量較低時>3倍，而在劑量較高時>5倍。再看各組合，對于乙型流感病毒，使用O.lpg抗原時，只有兩種組合在第42天使HI滴度增加超過3倍(與無佐劑的對照疫苗相比)，這兩種組合是基于MF59的組合。對于H1N1毒株，除CpG/PLG組合以外的所有含CpG的組合使HI滴度增加至少5倍，當使用MF59/CpG組合時增加超過10倍。其它基于MF59的組合顯示增加>5倍。對于H3N2毒株，再次是所有含CpG的組合(除CpG/PLG組合以外，其使滴度增加>3倍)使HI滴度增加至少5倍。MF59/R-848和明礬/R-848組合(使滴度)增加>3倍。因此，總體上，選項(i)-(iv)中用于增加HI滴度的最佳佐劑是水包油乳液。(a)或(b)中較佳的添加劑是CpG，雖然單用CpG并未提高HI滴度。最佳組合均以水包油乳液為基礎。圖1-3顯示了15組的抗-HAELISA應答；1組無佐劑；3組含(a)和(b);4組含(i)-(iv);8組含(i)-(iv)/(a)-(b)的各組合。箭頭顯示可包含MF59水包油乳液的3種組合物。馬上可以看出基于乳液的組合物獲得最佳抗-HA應答。圖4顯示了獲得最佳T細胞應答的佐劑。再次馬上可以看出基于乳液的組合物獲得最佳應答。對于單用(a)和(b)，T細胞應答中等，當它們與MF59混合時觀察到最佳結果。用MF59/CpG組合獲得最高水平的Y-干擾素-分泌細胞，以星號表示。利用MF59/CpG組合獲得的Y-干擾素-分泌細胞數(shù)目優(yōu)于單用任一種組分。雖然單用MF59佐劑主要引發(fā)Th2-型應答，但Y-干擾素分泌增加顯示加入CpG使應答向Thl型轉(zhuǎn)變。據(jù)報道，Thl-型應答能提高異源亞型免疫力(heterosubtypicimmunity)[159]。檢測IgG型時也觀察到向Thl-型應答轉(zhuǎn)變。如圖5所示，單用MF59顯示IgGl應答(Th2)強，而IgG2a應答(Thl)低。CpG顯示IgGl和IgG2a應答弱。相反，MF59/CpG組合顯示IgG2a應答占優(yōu)勢。其它實驗利用從卵培養(yǎng)的病毒制備的純化表面糖蛋白，其中將MF59/CpG組合改進為利用不同的免疫刺激性寡核苷酸，即(c)CpG7909。如圖6-8所示，這些實驗所得的結果與以前的實驗一致。具體地說，圖6顯示向抗原中加入MF59使抗-HA血清ELISAIgG滴度急劇增加，而單獨加入CpG7909未獲得相當?shù)奶岣?。類似地，加入CpG7909未顯著地進一步提高用MF59獲得的滴度。血清HI滴度基本上觀察到相同的模式(圖7)。然而，觀察抗體應答的質(zhì)量時，加入CpG7909增加了Thl-相關同種型的相對比例(圖8)?？贵w數(shù)據(jù)與對抗原再激活(restimulation)特異性起反應的CD4T細胞的細胞因子分布良好相關。MF59再次導致Ag反應性T細胞(Ag-respondingTcell)的頻率增加。加入CpG7909并未極大增加反應性T細胞的總體百分比，但改變了這些應答細胞產(chǎn)生的細胞因子的組成。因此，包含CpG7909時，產(chǎn)生IFN-y的Ag-特異性T細胞比例較髙，而產(chǎn)生IL-5的細胞比例較低。在其它實驗中，獲得了兩種可商品化購得的無佐劑裂解病毒顆粒三價流感疫苗("SPLIT(A)"和"SPLIT(B)")，將它們用于免疫小鼠。稀釋疫苗從而獲得0.2嗎各HA的劑量。疫苗是無佐劑的，或用以下佐劑配制(1)氫氧化鋁，(2)MF59乳液，或(3)MF59乳液和免疫刺激性CpG寡核苷酸。用這些疫苗肌肉內(nèi)免疫8組雌性Balb/C小鼠，8周齡，在第O天和第28天(注射)50pl劑量。在第14天和第42天獲得血清，分析抗-HA滴度(IgG)、HI滴度和T細胞。下表I給出了第42天針對各病毒的血清IgG抗體滴度(ELISA)。表II是HI血清抗體滴度。圖9顯示了小鼠的T細胞應答。利用純化的表面糖蛋白疫苗可以看出，MF59獲得的結果優(yōu)于明礬，但向MF59中加入CpG寡核苷酸一般能獲得更好的T細胞應答。例如，向MF59"裂解(A)"中加入CpG獲得的抗原特異性T細胞比例高于單用MF59獲得的。因此，對于流感疫苗，包括表面糖蛋白疫苗和裂解疫苗，水包油乳液是優(yōu)秀的佐劑，但通過額外加入免疫刺激劑，例如CpG可以提高其引發(fā)細胞因子應答，特別是"干擾素應答的能力。水包油乳液使得針對異源變體流感毒株的中和作用提高，因而即使疫苗毒株與流行毒株不匹配，該疫苗也可誘導保護性免疫力[160]?，F(xiàn)已證明加入細胞因子誘導劑可獲得能維持良好HI滴度并增強T細胞和細胞因子應答的疫苗。HI滴度與流感病毒的血清中和作用相關，因此維持HI滴度高是有用的，特別是對于群體原初的或可逃避宿主細胞因子應答的毒株[161]。T細胞和細胞因子應答增強涉及宿主抵御流感(病毒)感染的防御早期和決定階段，因而有用[7]，其還可能通過誘導更強的干擾素-y應答來降低流感的年齡相關敏感性[23]。因此，組合水包油乳液和細胞因子誘導劑是有利的。應該知道，本發(fā)明只是借助實施例得到了描述，可以作出改進而仍維持在本發(fā)明的范圍和公司中。表/<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>參考文獻(其內(nèi)容通過引用納入本文)《疫苗》(Vaccines),(Plotkin和Orenstein編)'第4版，2004,ISBN:0-7216-9688-0.[2]US6,372,223.WO00/15251.[4JWO01/22992.Hehme等(2004)VirusRes.103(1-2):163-71.[6]Frey等(2003)Vaccine21:4234-7.[7]Hayden等.(1998)JClinInvest101(3):643陽9.〖8]WO簡4837.Podda禾口DelGiudice(2003)ExpertRevVaccines2:197-203.[10〗Podda(2001)Vaccine19:2673-2680.《疫苗設計亞單位和佐劑方法》(VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach)(Powell和Newman編)，普萊納姆出版社(PlenumPress)1995(ISBN0-306-44867-X).[12]《疫苗佐劑制備方法和研究方案》(VaccineAdjuvants:Pr印arationMethodsandResearchProtocols)(分子醫(yī)學叢書第42巻).ISBN:1-59259-083-7.O,Hagan編.Allison和Byars(1992)ResImmunol143:519-25.Hariharan等.(1995)CancerRes55:3486-9.WO95/11700.美國專利6,080,725.WO2005/097181.WO2006/113373.Han等(2005)"維生素E對老年人的免疫功能和感染性疾病的影響"(ImpactofVitaminEonImmuneFunctionandInfectiousDiseasesintheAged),"營養(yǎng)、免疫功能和健康歐洲大會"(Nutrition,ImmunefunctionsandHealthEuroConference)，巴黎，2005年6月9-10曰.Han等(2004)AnnNYAcadSci1031:96-101.[21〗US-6630161.Powers和Belshe(1993)JInfectDis167:584-92.[23]Mbawuike等(1996)CellImmunol173:64-78.[24]Tassignon等(2005)JImmunolMeth305:188-98.Johnson等(1999)JMedChem42:4640-9.Baldrick等(2002)RegulatoryToxicolPharmacol35:398-413.US4,680,338.US4,988,815.W092/15582.Stanley(2002)ClinExpDermatol27:571-577.Wu等(2004)AntiviralRes.64(2):79-83.美國專利4689338，4929624，5238944，5266575，5268376，5346905，5352784，5389640，5395937，5482936,5494916，5525612，6083505，6440992，6627640，6656938，6660735，6660747,6664260,6664264,6664265，6667312,6670372,6677347，6677348，6677349，6683088，6703402，6743920，6800624，6809203，6888000和6924293.Jones(2003)CurrOpinInvestigDrugs4:214-218.WO2004/060308.同WO2004/064759.US6,924,271.US2005/0070556.US5,658,731.US5,011,828.US6,605,617.WO02/18383.WO2004/018455.WO03/082272.FR-2859633.[50]WO2006/002422.51]WO03/011223.Evans等(2003)ExpertRevVaccines2:219-229.Andriaov等(1998)Biomaterials19:109-115.Payne等(1998)AdvDrugDeliveryReview31:185-196.Wong等(2003)JClinPharmacol43(7):735-42.US2005/0215517.WO00/60050.101]WO01/04333.102]US6649372.103]Neumann等(2005)ProcNatlAcadSciUSA102:16825-9.104]WO2006/067211.105]WO01/83794.106]Hoffmann等(2000)Virology267(2):310-7.107]WO97/37000.108]Brands等(1999)DevBiolStand98:93-100.109]Halperin等(2002)Vaccine20:1240-7.110〗Tree等(2001)Vaccine19:3444-50.Ill]Kistner(1998)Vaccine16:960-8.[112]Kistner等(1999)DevBiolStand98:101-110.Bruhl等(2000)Vaccine19:1149-58.Pau等(2001)Vaccine19:2716-21.http:〃www.atcc.org/http:〃locus,umdnj.edu/WO03/076601.WO2005/042728.WO01/85938.WO2006/108846.EP-A-1260581CWO01/64846).WO2006/071563.WO2005/113758,WO2006/027698.fLundblad(2001)BiotechnologyandAppliedBiochemistry34:195-197."工業(yè)指南生物分析方法確認"(GuidanceforIndustry:BioanalyticalMethodValidation),美國健康和人服務部食品藥品管理中心獸藥評估和研究(CDER)中心(CVM)(U.S.DepartmentofHealthandHumanServicesFoodandDrugAdministrationCenterforDrugEvaluationandResearch(CDER)CenterforVeterinaryMedicine(CVM)).2001年5月.Ji等(2002)Biotechniques.32:1162-7,il29JBriggs(1991)JParenterSciTechnol.45:7-12.[130]Lahijani等(1998)HumGeneTher.9:1173-80.[131]Lokteff等(2001)Biologicals.29:123-32.[132]EP-B-0870508.[133]US5948410.名為"殘留細胞DNA水平低的細胞衍生的病毒疫苗"(CELL-DERIVEDVIRALVACCINESWITHLOWLEVELSOFRESIDUALCELLDNA)的國際專利申請，2006年11月1日提交，要求US-60/732786的優(yōu)先權。[135]WO03/023021[137]WO97/37001.Treanor等(1996)JInfectDis173:1467-70.Keitel等(1996)ClinDiagnLabImmunol3:507-10.Gennaro(2000)《雷明頓藥學科學和實踐》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy),第20版，ISBN:0683306472.Banzhoff(2000)ImmunologyLetters71:91-96.Nony等(2001)Vaccine27:3645-51.WO2005/089837.US6,692,468.WO00/07647.WO99/17820.US5,971,953.US4,060,082.EP-A-0520618.WO98/01174.Potter和Oxford(1979)BrMedBull35:69-75.Greenbaum等(2004)Vaccine22:2566-77.Zurbriggen等(2003)ExpertRevVaccines2:295-304.Piaseik(2003)JAmPharmAssoc(華盛頓，哥倫比亞特區(qū)).43:728-30.Mann等(2004)Vaccine22:2425-9.Halperin等(1979)AmJPublicHealth69:1247-50.Herbert等(1979)JInfectDis140:234-8.[158]Chen等(2003)Vaccine21:2830-6.[159]Moran等(1999)JInfectDis180:579-85.[160]Stephenson等(2005)JInfectDis191(8):1210-[161]Seo等(2002)NatMed8(9):950-4.權利要求1.一種免疫原性組合物，其包含(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐劑；和(iii)細胞因子誘導劑。2.如權利要求l所述的組合物，其特征在于，所述流感病毒抗原是滅活病毒。3.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述流感病毒抗原包含完整的病毒、裂解病毒或純化的表面抗原。4.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述流感病毒抗原來自H1、H2、H3、H5、H7或H9甲型流感病毒亞型。5.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，從用卵培養(yǎng)的流感病毒制備所述流感病毒抗原。6.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，從用細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)的流感病毒制備所述流感病毒抗原。7.如權利要求1-4中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物不含卵白蛋白、卵類黏蛋白和雞DNA。8.如權利要求6或7所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含少于10ng細胞培養(yǎng)宿主的細胞DNA。9.如權利要求6或7所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含的100個核苷酸或更長的DNA少于10ng。10.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，從具有A/PR/8/34流感病毒一個或多個RNA區(qū)段的流感病毒制備所述流感病毒抗原。11.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，從通過反向遺傳學技術獲得的流感病毒制備所述流感病毒抗原。12.如權利要求6-11中任一項所述的組合物，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)物是微載體培養(yǎng)物、貼壁培養(yǎng)物或懸浮培養(yǎng)物。13.如權利要求6-12中任一項所述的組合物，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)物不含血清。14.如權利要求6-13中任一項所述的組合物，其特征在于，從用MDCK細胞培養(yǎng)的流感病毒制備所述流感病毒抗原。15.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含0.1-20pg血凝素/病毒毒株。16.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述乳液中的一種或多種油和一種或多種表面活性劑是生物可降解和生物相容的。17.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述乳液的液滴具有亞微米直徑。18.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述乳液包含類萜。19.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述乳液包含角鯊烯。20.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述乳液包含生育酚。21.如權利要求20所述的組合物，其特征在于，所述生育酚是DL-oc-生育酚。22.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述乳液包含聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑、辛苯聚醇表面活性劑和/或失水山梨糖醇酯。23.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述細胞因子誘導劑引發(fā)干擾素-Y的釋放。24.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述細胞因子誘導劑是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9中的一種或多種的激動劑。25.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述細胞因子誘導劑選自免疫刺激性寡核苷酸；3-0-脫酰基單磷酰脂質(zhì)A(3dMPL);咪唑并喹啉化合物；和/或氨基垸基氨基葡糖苷磷酸鹽衍生物。26.如權利要求25所述的組合物，其特征在于，所述細胞因子誘導劑是3dMPL，并且以重量計，至少10%的3dMPL是六?；溞问健?7.如權利要求25或26所述的組合物，其特征在于，所述細胞因子誘導劑是3dMPL，并且所述3dMPL為直徑<150nm的顆粒形式。28.如權利要求25或26或27所述的組合物，其特征在于，所述細胞因子誘導劑是3dMPL，并且所述3dMPL位于乳液的水相中。29.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物基本上不含汞物質(zhì)。30.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含1-20mg/ml氯化鈉。31.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物的重量克分子滲透濃度在200-400mOsm/kg之間。32.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含一種或多種緩沖液。33.如權利要求32所述的組合物，其特征在于，所述一種或多種緩沖液包括磷酸緩沖液；Tris緩沖液；硼酸緩沖液；琥珀酸緩沖液；組氨酸緩沖液；或檸檬酸緩沖液。34.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物的pH在5.0-8.1之間。35.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物每劑含有<1內(nèi)毒素單位。36.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物不含谷蛋白。37.以上任一項權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含兩種甲型流感毒株和一種乙型流感毒株。38.如權利要求1-36中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物是抵御流行性流感病毒毒株的單價疫苗。39.—種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括混合以下組分的步驟(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐劑；和(iii)細胞因子誘導劑。40.—種裝有以下組分的試劑盒(i)包含流感病毒抗原的第一試劑盒組分；和(ii)包含水包油乳液佐劑的第二試劑盒組分，其中(a)所述第一組分和所述第二組分包含細胞因子誘導劑，或(b)所述試劑盒裝有包含細胞因子誘導劑的第三試劑盒組分。41.如權利要求40所述的試劑盒，其特征在于，所述第一組分和所述第二組分裝在不同容器中。42.如權利要求41所述的試劑盒，其特征在于，所述第一組分和所述第二組分裝在小瓶中。43.如權利要求41所述的試劑盒，其特征在于，所述第一組分和所述第二組分之一裝在注射器中，另一組分裝在小瓶中。44.如權利要求42或43所述的試劑盒，其特征在于，所述小瓶由玻璃或塑料材料制成。45.如權利要求42或43或44所述的試劑盒，其特征在于，用無乳膠的塞子密封所述小瓶。46.—種在患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應答的方法，所述方法包括給予患者某種藥物的步驟，其中所述藥物是如權利要求1-35中任一項所述的組合物。47.(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐劑；和(iii)細胞因子誘導劑在制備用于在患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應答的藥物中的應用。48.如權利要求46所述的方法，或如權利要求47所述的應用，其特征在于，在與肺炎球菌偶聯(lián)物疫苗基本上相同的時間將所述藥物給予患者。49.如權利要求46所述的方法，或如權利要求47所述的應用，其特征在于，在與有效抵御流感病毒的抗病毒化合物基本上相同的時間將所述藥物給予患者。全文摘要雖然水包油乳液是流感疫苗的有效佐劑，但仍可通過額外加入其它免疫刺激劑來增強細胞因子應答，例如γ-干擾素應答而提高其效力。因此，疫苗包含(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐劑；(iii)細胞因子誘導劑。文檔編號A61K39/145GK101365483SQ200680047600公開日2009年2月11日申請日期2006年11月6日優(yōu)先權日2005年11月4日發(fā)明者D·奧黑根,G·德爾古迪斯,R·拉普奧里申請人:諾華疫苗和診斷有限公司