專利名稱：Rna干擾介導(dǎo)的丙型肝炎病毒的抑制的制作方法
本申請是于2006年8月25日提交的美國專利申請?zhí)?1/510,872的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?1/510,872是于2005年12月19日提交的美國專利申請?zhí)?1/311,826的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?1/311,826是于2004年9月15日提交的美國專利申請?zhí)?0/942,560的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?0/942,560是于2003年9月16日提交的美國專利申請?zhí)?0/667,271的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?0/667,271是于2003年2月20日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US03/05043的部分繼續(xù)申請，所述國際專利申請?zhí)朠CT/US03/05043是于2002年3月26日提交的McSwiggenPCT/US02/09187的部分繼續(xù)申請并且要求于2002年8月5日提交的McSwiggen USSN 60/401,104的利益。本申請還是于2006年8月17日提交的美國專利申請?zhí)朤BD的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)朤BD是于2005年12月8日提交的美國專利申請?zhí)?1/299,254的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?1/299,254是于2005年9月23日提交的美國專利申請?zhí)?1/234,730的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?1/234,730是于2005年8月17日提交的美國專利申請?zhí)?1/205,646的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?1/205,646是于2005年4月4日提交的美國專利申請?zhí)?1/098,303的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?1/098,303是于2004年8月20日提交的美國專利申請?zhí)?0/923,536的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?0/923,536是于2004年5月24日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US04/16390的部分繼續(xù)申請，所述國際專利申請?zhí)朠CT/US04/16390是于2004年4月16日提交的美國專利申請?zhí)?0/826,966的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?0/826,966是于2004年1月14日提交的美國專利申請?zhí)?0/757,803的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?0/757,803是于2003年11月24日提交的美國專利申請?zhí)?0/720,448的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?0/720,448是于2003年10月23日提交的美國專利申請?zhí)?0/693,059的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?0/693,059是于2003年5月23日提交的美國專利申請?zhí)?0/444,853的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?0/444,853是于2003年2月20日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US03/05346的部分繼續(xù)申請和于2003年2月20日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US03/05028的部分繼續(xù)申請，所述2個國際專利申請要求下述美國臨時(shí)申請的利益于2002年2月20日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/358,580、于2002年3月11日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/363,124、于2002年6月6日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/386,782、于2002年8月29日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/406,784、于2002年9月5日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/408,378、于2002年9月9日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/409,293、和于2003年1月15日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/440,129。本申請還是于2004年4月30日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US04/13456的部分繼續(xù)申請，所述國際專利申請?zhí)朠CT/US04/13456是于2004年2月13日提交的美國專利申請?zhí)?0/780,447的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?0/780,447是于2003年4月30日提交的美國專利申請?zhí)?0/427,160的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?0/427,160是于2002年5月17日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US02/15876的部分繼續(xù)申請，所述國際專利申請?zhí)朠CT/US02/15876要求下述美國臨時(shí)申請的利益于2001年5月18日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/292,217、于2002年3月6日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/362,016、于2001年7月20日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/306,883、和于2001年8月13日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/311,865。本申請還是于2003年12月3日提交的美國專利申請?zhí)?0/727,780的部分繼續(xù)申請。本申請還是于2005年2月9日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US05/04270的部分繼續(xù)申請，所述國際專利申請?zhí)朠CT/US05/04270要求于2004年2月10日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/543,480的利益。本申請還是于2006年2月14日提交的美國專利申請?zhí)?1/353,630的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請?zhí)?1/353,630要求下述美國臨時(shí)專利申請的利益于2005年2月14日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/652,787、于2005年5月6日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531、于2005年7月29日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946、和于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024。本申請要求所有列出的申請的利益，所述所有列出的申請包括附圖整體引入本文作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及用于研究、診斷和治療響應(yīng)丙型肝炎病毒(HCV)基因表達(dá)和/或活性調(diào)節(jié)的性狀、疾病和狀況的化合物、組合物和方法。本發(fā)明還指向涉及性狀、疾病和狀況的化合物、組合物和方法，所述性狀、疾病和狀況響應(yīng)丙型肝炎病毒(HCV)基因表達(dá)途徑或其他細(xì)胞過程中涉及的基因表達(dá)和/或活性的調(diào)節(jié)，所述基因介導(dǎo)此類性狀、疾病和狀況的維持或發(fā)展。具體而言，本發(fā)明涉及能夠介導(dǎo)或介導(dǎo)針對丙型肝炎病毒(HCV)基因表達(dá)的RNA干擾(RNAi)的雙鏈核酸分子，包括小核酸分子，例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、和短發(fā)夾RNA(shRNA)分子，包括此種小核酸分子的混合物和此種小核酸分子的脂質(zhì)納米顆粒(nanoparticle)(LNP)制劑。本發(fā)明還涉及小核酸分子，例如siNA，siRNA，和可以抑制內(nèi)源RNA分子功能，例如內(nèi)源微小RNA(miRNA)(例如，miRNA抑制劑)或內(nèi)源短干擾RNA(siRNA)(例如siRNA抑制劑)，或可以抑制RISC功能(例如，RISC抑制劑)的其他分子，以通過干擾此種內(nèi)源RNAs或與此種內(nèi)源RNAs相關(guān)的蛋白質(zhì)(例如，RISC)的調(diào)節(jié)功能來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，包括此種小核酸分子的混合物和此種小核酸分子的脂質(zhì)納米顆粒(LNP)制劑。此種小核酸分子在例如提供預(yù)防、抑制或減少HCV感染、肝衰竭、肝細(xì)胞癌、肝硬化和/或與受試者或生物中的HCV感染相關(guān)的其他疾病狀態(tài)的組合物中是有用的。

背景技術(shù)：
下文是關(guān)于RNAi的相關(guān)技術(shù)的討論。該討論僅為了理解下述本發(fā)明而提供。該概述并非下文描述的任何工作是請求保護(hù)的本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。
RNA干擾指動物中由短干擾RNAs(siRNAs)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程(Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Fire等人，1998，Nature，391，806；Hamilton等人，1999，Science，286，950-951；Lin等人，1999，Nature，402，128-129；Sharp，1999，Genes&Dev.，13139-141；和Strauss，1999，Science，286，886)。植物中的相應(yīng)過程(Heifetz等人，國際PCT公開號WO 99/61631)通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNA沉默，并且在真菌中也稱為壓抑。轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程被認(rèn)為是用于阻止外來基因表達(dá)的進(jìn)化上保守的細(xì)胞防御機(jī)制，并且通常由不同的植物區(qū)系和門共享(Fire等人，1999，TrendsGenet.，15，358)。使免于外來基因表達(dá)的此種保護(hù)可能響應(yīng)雙鏈RNAs(dsRNAs)的產(chǎn)生而經(jīng)由細(xì)胞應(yīng)答發(fā)展出來，所述雙鏈RNAs衍生自病毒感染或轉(zhuǎn)座子元件隨機(jī)整合到宿主基因組內(nèi)，所述細(xì)胞應(yīng)答特異性破壞同源單鏈RNA或病毒基因組RNA。細(xì)胞中dsRNA的存在通過仍需充分表征的機(jī)制觸發(fā)RNAi應(yīng)答。這種機(jī)制似乎不同于涉及雙鏈RNA特異性核糖核酸酶的其他已知機(jī)制，例如起因于dsRNA介導(dǎo)的蛋白激酶PKR激活和通過核糖核酸酶L導(dǎo)致mRNA的非特異性切割的2′，5′-寡腺苷酸合成酶的干擾素應(yīng)答(參見例如美國專利號6,107,094；5,898,031；Clemens等人，1997，J.Interferon & Cytokine Res.，17，503-524；Adah等人，2001，Curr.Med.Chem.，8，1189)。
細(xì)胞中長dsRNAs的存在刺激稱為切酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性(Bass，2000，Cell，101，235；Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Hammond等人，2000，Nature，404，293)。切酶涉及dsRNA加工成稱為短干擾RNAs(siRNAs)的dsRNA短片段(Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Bass，2000，Cell，101，235；Berstein等人，2001，Nature，409，363)。衍生自切酶活性的短干擾RNAs一般為長度約21個-約23個核苷酸并且包含約19個堿基對雙鏈體(Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Elbashir等人，2001，GenesDev.，15，188)。切酶已牽涉于來自保守結(jié)構(gòu)的前體RNA的21-和22-核苷酸小時(shí)序RNAs(stRNAs)的切割，所述小時(shí)序RNAs牽涉于翻譯控制(Hutvagner等人，2001，Science，293，834)。RNAi應(yīng)答還以通常稱為RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物(RISC)的內(nèi)切核酸酶復(fù)合物為特征，所述復(fù)合物介導(dǎo)具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的序列的單鏈RNA切割。靶RNA的切割發(fā)生于與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域中部。(Elbashir等人，2001，Genes Dev.，15，188)。
RNAi已在多種系統(tǒng)中進(jìn)行研究。Fire等人，1998，Nature，391，806首先在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中觀察到RNAi。Bahramian和Zarbl，1999，Molecular and Cellular Biology，19，274-283以及Wianny和Goetz，1999，Nature Cell Biol，2，70描述了在哺乳動物系統(tǒng)中由dsRNA介導(dǎo)的RNAi。Hammond等人，2000，Nature，404，293描述了在用dsRNA轉(zhuǎn)染的果蠅(Drosophila)細(xì)胞中的RNAi。Elbashir等人，2001，Nature，411，494和Tuschl等人，國際PCT公開號WO 01/75164描述了通過在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中引入合成的21-核苷酸RNAs的雙鏈體誘導(dǎo)的RNAi，所述哺乳動物細(xì)胞包括人胚腎和HeLa細(xì)胞。果蠅胚胎溶解產(chǎn)物中的近期工作(Elbashir等人，2001，EMBO J.，20，6877和Tuschl等人，國際PCT公開號WO 01/75164)已揭示了關(guān)于siRNA長度、結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、和介導(dǎo)有效RNAi活性所必需的序列的某些要求。這些研究已顯示21-核苷酸siRNA雙鏈體在包含3′-末端二核苷酸突出端時(shí)是最有活性的。此外，用2′-脫氧(2′-H)或2′-O-甲基核苷酸完全置換1條或2條siRNA鏈取消了RNAi活性，而用2′-脫氧核苷酸(2′-H)置換3′-末端siRNA突出端核苷酸顯示是耐受的。siRNA雙鏈體中心處的單個錯配序列也顯示取消了RNAi活性。此外，這些研究還指出靶RNA中切割位點(diǎn)的位置由siRNA引導(dǎo)序列的5′-末端而不是引導(dǎo)序列的3′-末端限定(Elbashir等人，2001，EMBO J.，20，6877)。其他研究已指出siRNA雙鏈體的靶互補(bǔ)鏈上的5′-磷酸是siRNA活性所需的，并且ATP用于維持siRNA上的5′-磷酸部分(Nykanen等人，2001，Cell，107，309)。
研究已顯示用脫氧核糖核苷酸替換具有2-核苷酸的3′-突出端的21-聚體siRNA雙鏈體的3′末端核苷酸突出端區(qū)段對RNAi活性沒有不利作用。用脫氧核糖核苷酸替換siRNA每個末端上的最高達(dá)4個核苷酸已報(bào)道是良好耐受的，而使用脫氧核糖核苷酸的完全置換導(dǎo)致無RNAi活性(Elbashir等人，2001，EMBO J.，20，6877和Tuschl等人，國際PCT公開號WO 01/75164)。此外，Elbashir等人，同上，同樣報(bào)道使用2’-O-甲基核苷酸的siRNA置換完全取消了RNAi活性。Li等人，國際PCT公開號WO 00/44914和Beach等人，國際PCT公開號WO 01/68836預(yù)先提出siRNA可以包括對磷酸-糖主鏈或核苷的修飾，以包括至少一個氮或硫雜原子，然而，無一申請假定此種修飾到何種程度在siRNA分子中將是耐受的，也沒有提供此種經(jīng)修飾的siRNA的任何進(jìn)一步指導(dǎo)或例子。Kreutzer等人，加拿大專利申請?zhí)?,359,180也描述了用于在dsRNA構(gòu)建體中使用的某些化學(xué)修飾，以抵抗雙鏈RNA依賴性蛋白激酶PKR的激活，特別是2′-氨基或2′-O-甲基核苷酸，和包含2′-O或4′-C亞甲橋的核苷酸。然而，Kreutzer等人類似地未能提供關(guān)于這些修飾至何種程度在dsRNA分子中將是耐受的例子或指導(dǎo)。
Parrish等人，2000，Molecular Cell，6，1077-1087使用長(＞25nt)siRNA轉(zhuǎn)錄物測試了靶向秀麗隱桿線蟲中的unc-22基因的某些化學(xué)修飾。該作者描述了通過用T7和T3RNA聚合酶摻入硫代硫酸核苷酸類似物將硫代磷酸殘基引入這些siRNA轉(zhuǎn)錄物內(nèi)，并且觀察到具有2個硫代磷酸酯修飾的堿基的RNAs作為RNAi也具有有效性中的相當(dāng)大減少。此外，Parrish等人報(bào)道超過2個殘基的硫代磷酸酯修飾使RNAs在體外非常不穩(wěn)定，從而使得干擾活性無法被測定。同前在1081處。該作者還測試了在長siRNA轉(zhuǎn)錄物中的核苷酸糖的2′-位置處的某些修飾，并且發(fā)現(xiàn)用脫氧核苷酸置換核糖核苷酸產(chǎn)生干擾活性中的相當(dāng)大減少，特別是在尿苷至胸苷和/或胞苷至脫氧胞苷置換的情況下。同前。此外，該作者測試了某些堿基修飾，包括在siRNA的有義和反義鏈中，用4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶置換尿嘧啶，和用肌苷置換鳥苷。盡管4-硫尿嘧啶和5-溴尿嘧啶置換似乎是耐受的，Parrish報(bào)道肌苷當(dāng)摻入任一鏈中時(shí)產(chǎn)生干擾活性中的相當(dāng)大減少。Parrish還報(bào)道在反義鏈中5-碘尿嘧啶和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶的摻入同樣導(dǎo)致RNAi活性中的相當(dāng)大減少。
較長dsRNA的使用已得到描述。例如，Beach等人，國際PCT公開號WO 01/68836描述了使用內(nèi)源衍生的dsRNA用于減弱基因表達(dá)的具體方法。Tuschl等人，國際PCT公開號WO 01/75164描述了果蠅體外RNAi系統(tǒng)和特定siRNA分子用于某些功能基因組和某些治療應(yīng)用的用途；盡管由于激活干擾素應(yīng)答的危險(xiǎn)，Tuschl，2001，Chem.Biochem.，2，239-245不確定RNAi可以用于治愈遺傳疾病或病毒感染。Li等人，國際PCT公開號WO 00/44914描述了特定長度(141bp-488bp)的酶促合成或載體表達(dá)的dsRNAs用于減弱某些靶基因表達(dá)的用途。Zernicka-Goetz等人，國際PCT公開號WO 01/36646描述了使用某一長(550bp-714bp)、酶促合成或載體表達(dá)的dsRNA分子用于抑制哺乳動物細(xì)胞中的特定基因表達(dá)的某些方法。Fire等人，國際PCT公開號WO 99/32619描述了用于將某一長dsRNA分子引入細(xì)胞內(nèi)用于抑制線蟲中的基因表達(dá)的具體方法。Plaetinck等人，國際PCT公開號WO00/01846描述了關(guān)于使用特定長度的dsRNA分子鑒定細(xì)胞中負(fù)責(zé)賦予特定表型的特定基因的某些方法。Mello等人，國際PCT公開號WO01/29058描述了涉及dsRNA介導(dǎo)的RNAi的特定基因的鑒定。Pachuck等人，國際PCT公開號WO 00/63364描述了某一長(至少200個核苷酸)dsRNA構(gòu)建體。Deschamps Depaillette等人，國際PCT公開號WO99/07409描述了由與某些抗病毒劑組合的特定dsRNA分子組成的具體組合物。Waterhouse等人，國際PCT公開號99/53050和1998，PNAS，95，13959-13964描述了使用某些dsRNAs用于減少核酸在植物細(xì)胞中的表型表達(dá)的某些方法。Driscoll等人，國際PCT公開號WO 01/49844描述了用于促進(jìn)靶向的生物中的基因沉默的特定DNA表達(dá)構(gòu)建體。
其他人已報(bào)道了各種RNAi和基因沉默系統(tǒng)。例如，Parrish等人，2000，Molecular Cell，6，1077-1087描述了靶向秀麗隱桿線蟲的unc-22基因的特定化學(xué)修飾的dsRNA構(gòu)建體。Grossniklaus，國際PCT公開號WO 01/38551描述了使用某些dsRNAs用于調(diào)節(jié)植物中的polycomb基因表達(dá)的某些方法。Churikov等人，國際PCT公開號WO 01/42443描述了使用某些dsRNAs用于修飾生物的遺傳特征的某些方法。Cogoni等人，國際PCT公開號WO 01/53475描述了用于分離鏈孢霉屬(Neurospora)沉默基因的某些方法及其用途。Reed等人，國際PCT公開號WO01/68836描述了用于植物中的基因沉默的某些方法。Honer等人，國際PCT公開號WO 01/70944描述了使用某些dsRNAs使用轉(zhuǎn)基因線蟲作為帕金森氏病模型的藥物篩選的某些方法。Deak等人，國際PCT公開號WO 01/72774描述了可能涉及果蠅中的RNAi的某些果蠅衍生的基因產(chǎn)物。Arndt等人，國際PCT公開號WO 01/92513描述了通過使用增強(qiáng)RNAi的因子用于介導(dǎo)基因抑制的某些方法。Tuschl等人，國際PCT公開號WO 02/44321描述了某些合成的siRNA構(gòu)建體。Pachuk等人，國際PCT公開號WO 00/63364和Satishchandran等人，國際PCT公開號WO 01/04313描述了使用某一長(超過250bp)、載體表達(dá)的dsRNAs用于抑制某些多核苷酸序列功能的某些方法和組合物。Echeverri等人，國際PCT公開號WO 02/38805描述了經(jīng)由RNAi鑒定的某些秀麗隱桿線蟲基因。Kreutzer等人，國際PCT公開號WO 02/055692、WO 02/055693和EP 1144623 B1描述了使用dsRNA用于抑制基因表達(dá)的某些方法。Graham等人，國際PCT公開號WO 99/49029和WO 01/70949以及AU4037501描述了某些載體表達(dá)的siRNA分子。Fire等人，US 6,506,559描述了使用介導(dǎo)RNAi的某一長dsRNA(299bp-1033bp)構(gòu)建體用于抑制體外基因表達(dá)的某些方法。Martinez等人，2002，Cell，110，563-574描述了介導(dǎo)HeLa細(xì)胞中的RNA干擾的某些單鏈siRNA構(gòu)建體，包括某些5′-磷酸化的單鏈siRNAs。Harborth等人，2003，Antisense & NucleicAcid Drug Development，13，83-105描述了某些化學(xué)上和結(jié)構(gòu)上修飾的siRNA分子。Chiu和Rana，2003，RNA，9，1034-1048描述了某些化學(xué)上和結(jié)構(gòu)上修飾的siRNA分子。Woolf等人，國際PCT公開號WO03/064626和WO 03/064625描述了某些化學(xué)修飾的dsRNA構(gòu)建體。Hornung等人，2005，Nature Medicine，11，263-270描述了通過短干擾RNA在漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞中經(jīng)由TLR7的IFN-α的序列特異性有效誘導(dǎo)。Judge等人，2005，Nature Biotechnology，在線公開2005年3月20日描述了通過合成的siRNA的哺乳動物先天性免疫應(yīng)答的序列依賴性刺激。Yuki等人，國際PCT公開號WO 05/049821和WO 04/048566描述了用于設(shè)計(jì)具有最優(yōu)化活性的短干擾RNA序列和某些短干擾RNA序列的某些方法。Saigo等人，美國專利申請公開號US20040539332描述了設(shè)計(jì)寡或多核苷酸序列包括短干擾RNA序列用于達(dá)到RNA干擾的某些方法。Tei等人，國際PCT公開號WO 03/044188描述了用于抑制靶基因表達(dá)的某些方法，所述方法包括用包含DNA和RNA的雙鏈多核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織或個別生物，所述雙鏈多核苷酸具有與靶基因的至少部分核苷酸序列基本上等同的核苷酸序列。
Mattick，2005，Science，309，1527-1528；Claverie，2005，Science，309，1529-1530；Sethupathy等人，2006，RNA，12，192-197；和Czech，2006 NEJM，354，111194-1195；Hutvagner等人，US 20050227256，和Tuschl等人，US 20050182005全都描述了可以經(jīng)由立體阻斷抑制miRNA功能的反義分子并且全部整體引入本文作為參考。
McCaffrey等人，2002，Nature，418，38-39描述了小鼠中靶向嵌合HCV NS5B蛋白質(zhì)/螢光素酶轉(zhuǎn)錄物的某些siRNA構(gòu)建體的用途。
Randall等人，2003，PNAS USA，100，235-240描述了靶向Huh 7肝癌細(xì)胞系中的HCV RNA的某些siRNA構(gòu)建體。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及使用短干擾核酸(siNA)分子通過RNA干擾(RNAi)用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的化合物、組合物和方法，所述基因例如與HCV感染、肝衰竭、肝細(xì)胞癌、肝硬化和/或與HCV感染相關(guān)的其他疾病狀態(tài)的發(fā)展或維持相關(guān)的那些基因。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用小核酸分子通過RNA干擾(RNAi)用于調(diào)節(jié)HCV基因表達(dá)途徑和/或活性中涉及的一種或多種基因的表達(dá)和活性的化合物、組合物和方法。特別地，本發(fā)明的特征在于用于調(diào)節(jié)HCV基因表達(dá)和/或感染途徑中涉及的HCV基因和/或其他基因(例如，細(xì)胞或宿主基因)表達(dá)的小核酸分子，例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、和短發(fā)夾RNA(shRNA)分子和方法。
本發(fā)明還涉及小核酸分子，例如siNA、siRNA和可以抑制內(nèi)源RNA分子功能，例如內(nèi)源微小RNA(miRNA)(例如，miRNA抑制劑)或內(nèi)源短干擾RNA(siRNA)(例如siRNA抑制劑)，或可以抑制RISC功能(例如，RISC抑制劑)的其他分子，以通過干擾此種內(nèi)源RNAs或與此種內(nèi)源RNAs相關(guān)的蛋白質(zhì)(例如，RISC)的調(diào)節(jié)功能來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。此種分子在本文中統(tǒng)稱為RNAi抑制劑。
本發(fā)明的siNA或RNAi抑制劑可以是未修飾或化學(xué)修飾的。本發(fā)明的siNA或RNAi抑制劑可以是化學(xué)合成的、由載體表達(dá)的或酶促合成的。本發(fā)明的特征還在于通過RNA干擾(RNAi)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中的靶基因表達(dá)或活性的各種化學(xué)修飾的合成短干擾核酸(siNA)分子。本發(fā)明的特征還在于各種化學(xué)修飾的合成短核酸(siNA)分子，其能夠通過與miRNA、siRNA或RISC相互作用且因此下調(diào)或抑制細(xì)胞或生物中的RNA干擾(RNAi)、翻譯抑制、或轉(zhuǎn)錄沉默調(diào)節(jié)細(xì)胞中的RNAi活性?；瘜W(xué)修飾的siNA和/或RNAi抑制劑的使用通過增加的對于體內(nèi)核酸酶降解的抗性和/或通過改善的細(xì)胞攝取改善天然siNA分子和/或RNAi抑制劑的各種性質(zhì)。此外，與早期公開的研究相反，具有多重化學(xué)修飾的本發(fā)明的siNA分子，包括完全修飾的siRNA保留其RNAi活性。因此，申請人在本文中教導(dǎo)了在天然siRNA活性上保留或改善的化學(xué)修飾的siRNA(在本文中一般稱為siNA)。本發(fā)明的siNA分子提供了用于多種治療、預(yù)防、獸醫(yī)、診斷、靶確認(rèn)、基因組發(fā)現(xiàn)、基因工程和藥物基因組學(xué)(pharmacogenomic)應(yīng)用的有用試劑和方法。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于一種或多種siNA分子和/或RNAi抑制劑，和方法，其獨(dú)立或組合調(diào)節(jié)HCV和HCV相關(guān)的宿主靶基因的表達(dá)，所述基因編碼蛋白質(zhì)，例如與HCV感染、肝衰竭、肝細(xì)胞癌和肝硬化的維持或發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如編碼包含通過表I中顯示的GenBank登記號提及的那些序列的序列的基因，在本文中一般稱為HCV。本發(fā)明的各種方面和實(shí)施方案的下述描述關(guān)于示例性丙型肝炎病毒(HCV)基因，在本文中一般稱為HCV而提供。然而，此種提及僅意欲是示例性的，并且本發(fā)明的各種方面和實(shí)施方案也涉及表達(dá)可替代的HCV基因的其他基因，例如突變HCV基因、HCV基因的剪接變體、和編碼HCV不同品系的基因、以及關(guān)于HCV的細(xì)胞靶，例如在本文中描述以及在本文和下述專利中通過GenBank登記號提及的那些PCT/US03/05028、美國臨時(shí)申請公開號60/363,124或USSN 10/923,536，所述所有專利都引入本文作為參考，在本文中一般稱為“靶”序列。各種方面和實(shí)施方案也涉及HCV途徑中涉及的其他基因，包括編碼HCV感染、肝衰竭、肝細(xì)胞癌和肝硬化的維持和/或發(fā)展中涉及的細(xì)胞蛋白質(zhì)的基因，或表達(dá)與HCV感染有關(guān)的其他蛋白質(zhì)如HCV生活周期中利用的細(xì)胞蛋白質(zhì)的其他基因。此種另外的基因可以使用本文描述的用于HCV的方法就靶位點(diǎn)進(jìn)行分析。因此，其他基因的抑制和此種抑制的作用可以如本文所描述的進(jìn)行。換言之，如本文在下文中定義和在所述實(shí)施方案中描述的，術(shù)語“靶”和“靶基因”意欲包含與HCV感染發(fā)展和/或維持相關(guān)的基因，例如編碼HCV多肽的基因，包括HCV不同品系的多肽、調(diào)節(jié)多核苷酸(例如，miRNA和siRNAs)、突變HCV基因、和HCV基因的剪接變體、以及基因表達(dá)、復(fù)制和/或HCV活性的HCV途徑中涉及的細(xì)胞基因。同樣地，如本文在下文中定義和在所述實(shí)施方案中描述的，術(shù)語“靶”意欲包含HCV病毒基因產(chǎn)物和HCV感染中涉及的細(xì)胞基因產(chǎn)物，例如本文描述的那些。因此，本文關(guān)于術(shù)語“靶”描述的實(shí)施方案中的每一個都可應(yīng)用于由術(shù)語“HCV”包含的所有病毒、細(xì)胞和病毒蛋白質(zhì)、肽、多肽和/或多核苷酸分子，如那個術(shù)語在本文中定義的。總之，此種基因靶在本文中一般也稱為“靶”序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含靶向不同多核苷酸靶的本發(fā)明的2種或更多不同siNA分子和/或RNAi抑制劑的組合物，例如靶向不同多核苷酸靶的HCV RNA的不同區(qū)域(例如，siNA、雙鏈體形成siNA、或多功能siNA或其任何組合)，例如靶RNA或DNA的不同區(qū)域(例如，如本文提供的2種不同靶位點(diǎn)或靶或途徑靶的任何組合)或編碼和非編碼靶。此種siNA分子庫可以提供增加的療效。本文的2個不同的靶位點(diǎn))，不同的病毒品系(例如，HCV品系、或HIV和HCV、HCV和HBV等)，或不同的病毒和細(xì)胞靶(例如HCV靶和細(xì)胞靶)。此種siNA分子庫可以預(yù)防或克服病毒抵抗力或以其他方式提供增加的療效。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于對HCV負(fù)鏈具有RNAi特異性的siNA分子，例如Genbank登記號HPCK1S1，丙型肝炎病毒(品系HCV-1b，克隆HCV-K1-S1))，全基因組；Genbank登記號D50483，9410nt。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于本發(fā)明的2種或更多不同siNA分子的庫(例如，siNA、雙鏈體形成siNA、或多功能siNA或其任何組合)，所述siNA分子對不同的HCV多核苷酸靶具有特異性，例如靶HCV RNA或DNA的不同區(qū)域(例如，本文的2個不同靶位點(diǎn)或靶或宿主/途徑靶的任何組合)或編碼和非編碼靶，其中所述庫包含靶向約2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多不同靶的siNA分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于一種或多種siNA分子和方法，其獨(dú)立或組合調(diào)節(jié)代表關(guān)于HCV感染的細(xì)胞靶的基因的表達(dá)，所述細(xì)胞靶例如細(xì)胞受體、細(xì)胞表面分子、細(xì)胞酶、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和/或細(xì)胞因子、第二信使、和細(xì)胞輔助分子，包括但不限于，La抗原(參見例如Costa-Mattioli等人，2004，Mol Cell Biol.，24，6861-70，例如，Genbank登記號NM_003142)；FAS(例如Genbank登記號NM_000043)或FAS配體(例如，Genbank登記號NM_000639)；干擾素調(diào)節(jié)因子(IRFs；例如，Genbank登記號AF082503.1)；細(xì)胞PKR蛋白激酶(例如，Genbank登記號XM_002661.7)；人真核起始因子2B(elF2Bγ；例如，Genbank登記號AF256223，和/或elF2γ；例如，Genbank登記號NM_006874.1)；人DEAD Box蛋白質(zhì)(DDX3；例如，Genbank登記號XM_018021.2)；和與HCV 3′-UTR的聚尿苷酸片結(jié)合的細(xì)胞蛋白質(zhì)，例如多嘧啶片結(jié)合蛋白(例如，Genbank登記號NM_031991.1和XM_042972.3)。此種細(xì)胞靶在本文中一般也稱為HCV靶，和具體地稱為“宿主靶”。
由于關(guān)于HCV基因組的高序列變異性的可能性，用于廣泛治療應(yīng)用的siNA分子的選擇可能涉及HCV基因組的保守區(qū)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及靶向HCV基因組的保守區(qū)或在不同靶中保守的區(qū)域的siNA分子和/或RNAi抑制劑。HCV基因組的保守區(qū)的例子包括但不限于，5′-非編碼區(qū)(NCR，也稱為5′-非翻譯區(qū)，UTR)、核心蛋白編碼區(qū)的5′-末端、和3′-NCR。HCV基因組RNA包含5′-NCR中的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，其介導(dǎo)不依賴5′-帽結(jié)構(gòu)的翻譯(Wang等人，1993，J.Virol.，67，3338-44)。HCV RNA基因組的全長序列在臨床上分離的亞型中是異源的，其中存在至少15種(Simmonds，1995，Hepatology，21，570-583)，然而，HCV的5′-NCR序列在所有已知亞型中是高度保守的，最可能保持共有的IRES機(jī)制(Okamoto等人，1991，J.GeneralVirol.，72，2697-2704)。因此，通過靶向保守區(qū)例如5′NCR序列，siNA分子可以被設(shè)計(jì)為靶向HCV的不同分離物。被設(shè)計(jì)為靶向各種HCV分離物的保守區(qū)的siNA分子和/或RNAi抑制劑使得能夠有效抑制不同患者群體中的HCV復(fù)制，且確保siNA分子針對HCV準(zhǔn)種的有效性，所述HCV準(zhǔn)種由于HCV基因組的非保守區(qū)中的突變而進(jìn)化。如所述的，通過將siNA分子設(shè)計(jì)為與HCV的保守核苷酸序列(例如，預(yù)期存在于各種HCV分離物的RNA中的序列)相互作用，單個siNA分子可以針對HCV的所有分離物被靶向。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于雙鏈核酸分子，例如siNA分子，其中一條鏈包含與靶核酸分子中的預(yù)定核苷酸序列或其部分具有互補(bǔ)性的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，預(yù)定核苷酸序列是本文描述的核苷酸靶序列。在另一個實(shí)施方案中，預(yù)定核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的靶序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于下調(diào)靶基因表達(dá)或指導(dǎo)靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子包含約15個-約28個堿基對。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于指導(dǎo)靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子包含約15個-約28個堿基對。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由RNA干擾(RNAi)指導(dǎo)靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述雙鏈siNA分子包含第一條鏈和第二條鏈，siNA分子的每條鏈長度為約18個-約28個(例如，約18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個或28個)核苷酸，siNA分子的第一條鏈包含與靶RNA具有足夠互補(bǔ)性的核苷酸序列以用于siNA分子經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)靶RNA的切割，且所述siNA分子的第二條鏈包含與第一條鏈互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個具體實(shí)施方案中，例如，siNA分子的每條鏈長度為約18個-約27個核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由RNA干擾(RNAi)指導(dǎo)靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述雙鏈siNA分子包含第一條鏈和第二條鏈，siNA分子的每條鏈長度為約18個-約23個(例如，約18個、19個、20個、21個、22個或23個)核苷酸，siNA分子的第一條鏈包含與靶RNA具有足夠互補(bǔ)性的核苷酸序列以用于siNA分子經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)靶RNA的切割，且所述siNA分子的第二條鏈包含與第一條鏈互補(bǔ)的核苷酸序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由RNA干擾(RNAi)指導(dǎo)靶RNA切割的化學(xué)合成的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子的每條鏈長度為約18個-約28個核苷酸；且siNA分子的一條鏈包含與靶RNA具有足夠互補(bǔ)性的核苷酸序列以用于siNA分子經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)靶RNA的切割。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由RNA干擾(RNAi)指導(dǎo)靶RNA切割的化學(xué)合成的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子的每條鏈長度為約18個-約23個核苷酸；且siNA分子的一條鏈包含與靶RNA具有足夠互補(bǔ)性的核苷酸序列以用于siNA分子經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)靶RNA的切割。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于下調(diào)靶基因表達(dá)或指導(dǎo)靶RNA切割的siNA分子，例如，其中所述靶基因或RNA包含蛋白質(zhì)編碼序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于下調(diào)靶基因表達(dá)或指導(dǎo)靶RNA切割的siNA分子，例如，其中所述靶基因或RNA包含非編碼序列或涉及靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件(例如，非編碼RNA、miRNA、stRNA等)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA用于抑制靶基因或靶基因家族(例如，不同HCV品系)的表達(dá)，其中所述基因或基因家族序列共享序列同源性。此種同源序列可以如本領(lǐng)域已知的進(jìn)行鑒定，例如使用序列比對。siNA分子可以被設(shè)計(jì)為靶向此種同源序列，例如使用完全互補(bǔ)的序列或通過摻入非規(guī)范堿基對，例如錯配和/或擺動堿基對，這可以提供另外的靶序列。在其中錯配被鑒定的情況下，非規(guī)范堿基對(例如，錯配和/或擺動堿基)可以用于產(chǎn)生靶向超過一種基因序列的siNA分子。在非限制性例子中，非規(guī)范堿基對例如UU和CC堿基對用于產(chǎn)生siNA分子，其能夠靶向共享序列同源性的不同多核苷酸靶的序列。照這樣，使用本發(fā)明的siNA的一個優(yōu)點(diǎn)是單一siNA可以被設(shè)計(jì)為包括與核苷酸序列互補(bǔ)的核酸序列，所述核苷酸序列在同源基因之間是保守的。在這種方法中，單一siNA可以用于抑制超過一種基因的表達(dá)而不是使用超過一種siNA分子靶向不同基因。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有針對靶RNA(例如，編碼或非編碼RNA)的RNAi活性的siNA分子，其中所述siNA分子包含與任何RNA序列互補(bǔ)的序列，例如具有如表I、PCT/US03/05028、美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/363,124或USSN 10/923536中所示中所示GenBank登記號的那些序列，所述所有專利都引入本文作為參考。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有針對靶RNA的RNAi活性的siNA分子，其中所述siNA分子包含與具有變體編碼序列的RNA互補(bǔ)的序列，例如與本文描述的或本領(lǐng)域以其他方式已知的疾病、性狀、病癥和/或狀況的維持和/或發(fā)展相關(guān)的本領(lǐng)域已知的其他突變基因。如表III和IV中所示或本文其他地方描述的化學(xué)修飾可以應(yīng)用于本發(fā)明的任何siNA構(gòu)建體。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包括這樣的核苷酸序列，其可以與HCV靶基因的核苷酸序列相互作用且從而介導(dǎo)HCV靶基因表達(dá)的沉默，例如，其中siNA通過細(xì)胞過程介導(dǎo)HCV靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，所述細(xì)胞過程介導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或HCV靶基因的甲基化模式且阻止HCV靶基因的轉(zhuǎn)錄。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子用于下調(diào)或抑制起于單元型多態(tài)性的蛋白質(zhì)的表達(dá)，所述單元型多態(tài)性與受試者或生物中的性狀、疾病或狀況相關(guān)。基因、蛋白質(zhì)或RNA水平的分析可以用于鑒定具有此種多態(tài)性的受試者或處于發(fā)展本文描述的性狀、狀況或疾病的危險(xiǎn)中的那些受試者。這些受試者順應(yīng)這樣的治療，例如用本發(fā)明的siNA分子和在治療與靶基因表達(dá)相關(guān)的疾病中有用的任何其他組合物的治療。照這樣，蛋白質(zhì)或RNA水平的分析可以用于確定受試者治療中的治療類型和療程。蛋白質(zhì)或RNA水平的監(jiān)控可以用于預(yù)測治療結(jié)果和測定化合物和組合物的效力，所述化合物和組合物調(diào)節(jié)與性狀、病癥、狀況或疾病相關(guān)的某些蛋白質(zhì)的水平和/或活性。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，siNA分子包含反義鏈，所述反義鏈包含與編碼HCV靶蛋白的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列。siNA進(jìn)一步包含有義鏈，其中所述有義鏈包含HCV靶基因的核苷酸序列或其部分。
在另一個實(shí)施方案中，siNA分子包含反義區(qū)，所述反義區(qū)包含與編碼HCV靶蛋白的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列。siNA進(jìn)一步包含有義區(qū)，其中所述有義區(qū)包含HCV靶基因的核苷酸序列或其部分。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含核苷酸序列的siNA分子，例如在siNA分子的反義區(qū)中與HCV靶基因的核苷酸序列或序列的部分互補(bǔ)的核苷酸序列。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含區(qū)域的siNA分子，例如與包含HCV靶基因序列的序列或其部分互補(bǔ)的siNA構(gòu)建體的反義區(qū)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的有義區(qū)或有義鏈與siNA分子的反義區(qū)或反義鏈的那個部分互補(bǔ)，所述部分與HCV靶多核苷酸序列互補(bǔ)。
在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含序列的siNA分子，例如siNA構(gòu)建體的反義序列，與包含由PCT/US03/05028、美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/363,124和/或USSN 10/923,536中所示Genbank登記號表示的序列的序列或序列部分互補(bǔ)，所述所有專利都引入本文作為參考。表III和IV以及本文其他地方描述的化學(xué)修飾可以應(yīng)用于本發(fā)明的任何siNA構(gòu)建體。表IV中描述的LNP制劑可以應(yīng)用于本文的任何siNA分子或siNA分子組合。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，siNA分子包含具有約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸的反義鏈，其中所述反義鏈與HCV靶RNA序列或其部分互補(bǔ)，并且其中所述siNA進(jìn)一步包含具有約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸的有義鏈，并且其中所述有義鏈和所述反義鏈?zhǔn)瞧渲忻織l鏈中的至少約15個核苷酸與另一條鏈互補(bǔ)的不同核苷酸序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子(例如，雙鏈核酸分子)包含與靶RNA序列或其部分互補(bǔ)的具有約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸的反義(引導(dǎo))鏈。在一個實(shí)施方案中，靶RNA序列的至少15個核苷酸(例如，15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個核苷酸)與本發(fā)明的siNA分子的反義(引導(dǎo))鏈互補(bǔ)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子(例如，雙鏈核酸分子)包含具有約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸的有義(過客)鏈，其包含靶RNA的序列或其部分。在一個實(shí)施方案中，靶RNA序列的至少15個核苷酸(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸包含本發(fā)明的siNA分子的有義(過客)鏈。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含具有約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸的反義區(qū)，其中所述反義區(qū)與靶DNA序列互補(bǔ)，并且其中所述siNA進(jìn)一步包含包含具有約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸的有義區(qū)，其中所述有義區(qū)和所述反義區(qū)包含在其中有義區(qū)包含與反義區(qū)互補(bǔ)的至少約15個核苷酸的線性分子中。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子具有調(diào)節(jié)由HCV基因編碼的RNA表達(dá)的RNAi活性。因?yàn)镠CV基因可以彼此共享一定程度的序列同源性，所以通過選擇在不同的HCV靶中共享或可替代地對特定HCV靶獨(dú)特的序列，siNA分子可以被設(shè)計(jì)為靶向一類HCV基因(例如，一類不同的HCV品系)或可替代地特定HCV基因(例如，逃避突變體、抗性株、或其他多肽變體)。因此，在一個實(shí)施方案中，siNA分子可以被設(shè)計(jì)為靶向在幾種HCV基因變體中具有同源性的HCV RNA序列的保守區(qū)，以便用一種siNA分子靶向一類HCV基因。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子調(diào)節(jié)受試者或生物中的一種或多種HCV品系的表達(dá)。在另一個實(shí)施方案中，由于siNA分子介導(dǎo)RNAi活性所需的高度特異性，siNA分子可以被設(shè)計(jì)為靶向?qū)μ囟℉CV RNA序列(例如，單個HCV品系或HCV單核苷酸多態(tài)性(SNP))獨(dú)特的序列。
在一個實(shí)施方案中，充當(dāng)RNA干擾基因沉默應(yīng)答介質(zhì)的本發(fā)明的核酸分子是雙鏈核酸分子。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子由包含寡核苷酸之間的約15個-約30個堿基對的雙鏈體核酸分子組成，所述寡核苷酸包含約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸。在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含具有約1個-約3個(例如，約1個、2個或3個)核苷酸的突出端的雙鏈體核酸分子，例如具有約19個堿基對和3′-末端單核苷酸、二核苷酸、或三核苷酸突出端的約21-核苷酸雙鏈體。在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含具有平端的雙鏈體核酸分子，其中2個末端是平頭的，或可替代地其中末端之一是平頭的。
在一個實(shí)施方案中，雙鏈核酸(例如，siNA)分子包含核苷酸或非核苷酸突出端。“突出端”意指在雙鏈核酸分子的2條鏈之間不是堿基配對的核苷酸序列的末端部分(參見例如圖6)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子在雙鏈核酸分子的1條或2條鏈的3′-末端處可以包含核苷酸或非核苷酸突出端。例如，本發(fā)明的雙鏈核酸分子在雙鏈核酸分子的引導(dǎo)鏈或反義鏈/區(qū)的3′-末端、過客鏈或有義鏈/區(qū)的3′-末端、或引導(dǎo)鏈或反義鏈/區(qū)和過客鏈或有義鏈/區(qū)處可以包含核苷酸或非核苷酸突出端。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸(siNA)分子的核苷酸突出端部分包含2′-O-甲基、2′-脫氧、2′-脫氧-2′-氟、2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖(2′-deoxy-2′-fluoroarabino)(FANA)、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、通用堿基、無環(huán)或5-C-甲基核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸(siNA)分子的非核苷酸突出端部分包含甘油基、脫堿基或反向的脫氧脫堿基非核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的雙鏈核酸(例如，siNA)分子的突出端部分的核苷酸對應(yīng)于包含siNA分子的HCV靶多核苷酸序列的核苷酸。因此，在此種實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的siNA分子的突出端部分的核苷酸包含基于HCV靶多核苷酸序列的序列，其中包含本發(fā)明的siNA分子的引導(dǎo)鏈或反義鏈/區(qū)的突出端部分的核苷酸可以與HCV靶多核苷酸序列中的核苷酸互補(bǔ)，且包含本發(fā)明的siNA分子的過客鏈或有義鏈/區(qū)的突出端部分的核苷酸可以包含HCV靶多核苷酸序列中的核苷酸。此種核苷酸突出端包含可起因于天然dsRNA切酶加工成siRNA的序列。
在一個實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的雙鏈核酸(例如，siNA)分子的突出端部分的核苷酸與HCV靶多核苷酸序列互補(bǔ)，并且任選如本文所描述的進(jìn)行化學(xué)修飾。照這樣，在一個實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的siNA分子的引導(dǎo)鏈或反義鏈/區(qū)的突出端部分的核苷酸可以與HCV靶多核苷酸序列中的核苷酸互補(bǔ)，即與siNA分子的引導(dǎo)鏈或反義鏈/區(qū)中的突出端核苷酸的核苷酸位置互補(bǔ)的HCV靶多核苷酸序列中的那些核苷酸位置。在另一個實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的siNA分子的過客鏈或有義鏈/區(qū)的突出端部分的核苷酸可以包含HCV靶多核苷酸序列中的核苷酸，即對應(yīng)于siNA分子的過客鏈或有義鏈/區(qū)中的突出端核苷酸的相同核苷酸位置的HCV靶多核苷酸序列中的那些核苷酸位置。在一個實(shí)施方案中，突出端包含與HCV靶多核苷酸序列的部分互補(bǔ)的2個核苷酸(例如，3′-GA；3′-GU；3′-GG；3′GC；3′-CA；3′-CU；3′-CG；3′CC；3′-UA；3′-UU；3′-UG；3′UC；3′-AA；3′-AU；3′-AG；3′-AC；3′-TA；3′-TU；3′-TG；3′-TC；3′-AT；3′-UT；3′-GT；3′-CT)突出端。在一個實(shí)施方案中，突出端包含不與HCV靶多核苷酸序列的部分互補(bǔ)的2個核苷酸(例如，3′-GA；3′-GU；3′-GG；3′GC；3′-CA；3′-CU；3′-CG；3′CC；3′-UA；3′-UU；3′-UG；3′UC；3′-AA；3′-AU；3′-AG；3′-AC；3′-TA；3′-TU；3′-TG；3′-TC；3′-AT；3′-UT；3′-GT；3′-CT)突出端。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的突出端核苷酸是2′-O-甲基核苷酸、2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖和/或2′-脫氧-2′-氟核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的突出端核苷酸在突出端核苷酸是嘌呤核苷酸的情況下是2′-O-甲基核苷酸，和/或在突出端核苷酸是嘧啶核苷酸的情況下是2′-脫氧-2′-氟核苷酸或2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的突出端中的嘌呤核苷酸(存在時(shí))是2′-O-甲基核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的突出端中的嘧啶核苷酸(存在時(shí))是2′-脫氧-2′-氟或2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的雙鏈核酸(例如siNA)分子的突出端部分的核苷酸不與HCV靶多核苷酸序列互補(bǔ)并且任選如本文所描述的進(jìn)行化學(xué)修飾。在一個實(shí)施方案中，突出端包含不與HCV靶多核苷酸序列的部分互補(bǔ)的3′-UU突出端。在另一個實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的siNA分子的突出端部分的核苷酸是2′-O-甲基核苷酸、2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖和/或2′-脫氧-2′-氟核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子(例如siNA)包含2或3核苷酸突出端，其中突出端中的核苷酸是相同或不同的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子(例如siNA)包含2或3核苷酸突出端，其中突出端中的核苷酸是相同或不同的，且其中突出端中的一個或多個核苷酸在堿基、糖和/或磷酸主鏈處進(jìn)行化學(xué)修飾。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于對HCV靶核酸分子具有特異性的一個或多個化學(xué)修飾的siNA構(gòu)建體，例如DNA、或編碼蛋白質(zhì)的RNA或與HCV靶基因表達(dá)相關(guān)的非編碼RNA。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于對核酸分子具有特異性的基于RNA的siNA分子(例如，包含2′-OH核苷酸的siNA)，其包括本文描述的一個或多個化學(xué)修飾。此種化學(xué)修飾的非限制性例子包括但不限于，硫代磷酸酯核苷酸間鍵、2′-脫氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脫氧-2′-氟核糖核苷酸、4-硫代核糖核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(參見例如于2004年11月5日提交的USSN 10/981,966，引入本文作為參考)、“通用堿基”核苷酸、“無環(huán)”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖(FANA，參見例如Dowler等人，2006，Nucleic Acids Research，34，1669-1675)和末端甘油基和/或反向的脫氧脫堿基殘基摻入。當(dāng)在各種siNA構(gòu)建體(例如，基于RNA的siNA構(gòu)建體)中使用時(shí)，這些化學(xué)修飾顯示保持細(xì)胞中的RNAi活性，而同時(shí)急劇增加這些化合物的血清穩(wěn)定性。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子在siNA分子的內(nèi)部位置處包含本文描述的化學(xué)修飾(例如，2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脫氧-2′-氟核糖核苷酸、4′-硫代核糖核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸，LNA)?！皟?nèi)部位置”意指siNA雙鏈體的堿基配對位置。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含經(jīng)修飾的核苷酸，同時(shí)維持介導(dǎo)RNAi的能力。經(jīng)修飾的核苷酸可以用于改善體外或體內(nèi)特征，例如穩(wěn)定性、活性、毒性、免疫應(yīng)答和/或生物利用率。例如，本發(fā)明的siNA分子可以包含作為siNA分子中存在的核苷酸總數(shù)目的百分比的經(jīng)修飾的核苷酸。照這樣，本發(fā)明的siNA分子一般可以包含約5％-約100％經(jīng)修飾的核苷酸(例如，約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％經(jīng)修飾的核苷酸)。例如，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子中約5％-約100％(例如，約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％經(jīng)修飾的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸糖修飾，例如2′-糖修飾，例如2′-O-甲基核苷酸、2′-脫氧-2′-氟核苷酸、2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-甲氧基乙基核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸或2′-脫氧核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子中約5％-約100％(例如，約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％經(jīng)修飾的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸堿基修飾，例如肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮(pyridin-4-one)、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，胸腺嘧啶核苷)、5-鹵尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)或丙炔修飾。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子中約5％-約100％(例如，約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％經(jīng)修飾的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸主鏈修飾，例如具有本文的式I的主鏈修飾。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子中約5％-約100％(例如，約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％經(jīng)修飾的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸糖、堿基、或主鏈修飾或其任何組合(例如，核酸糖、堿基、主鏈或本文的非核苷酸修飾的任何組合)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含至少約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％經(jīng)修飾的核苷酸。給定siNA分子中存在的經(jīng)修飾的核苷酸的實(shí)際百分比將依賴siNA中存在的核苷酸總數(shù)目。如果siNA分子是單鏈的，那么百分比修飾可以基于單鏈siNA分子中存在的核苷酸總數(shù)目。同樣地，如果siNA分子是雙鏈的，那么修飾百分比可以基于有義鏈、反義鏈、或有義和反義鏈中存在的核苷酸總數(shù)目。
本發(fā)明的siNA分子可以包含在siNA分子內(nèi)的各種位置處經(jīng)修飾的核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈siNA分子包含在siNA雙鏈體內(nèi)的內(nèi)部堿基配對位置處經(jīng)修飾的核苷酸。例如，內(nèi)部位置可以包含來自21核苷酸siNA雙鏈體的有義或反義鏈或區(qū)的5′-末端的約3個-約19個核苷酸的位置，所述21核苷酸siNA雙鏈體具有19個堿基對和2核苷酸的3′-突出端。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈siNA分子包含在siNA分子的非堿基配對或突出端區(qū)域處經(jīng)修飾的核苷酸?！胺菈A基配對”意指核苷酸在siNA分子的有義鏈或有義區(qū)和反義鏈或反義區(qū)之間不是堿基配對的。突出端核苷酸可以與相應(yīng)的HCV靶多核苷酸序列互補(bǔ)或堿基配對(參見例如圖6C)。例如，突出端位置可以包含來自21核苷酸siNA雙鏈體的有義或反義鏈或區(qū)的5′-末端的約20個-約21個核苷酸的位置，所述21核苷酸siNA雙鏈體具有19個堿基對和2核苷酸3′-突出端。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈siNA分子包含在siNA分子的末端位置處經(jīng)修飾的核苷酸。例如，此種末端區(qū)域包括siNA分子的有義和/或反義鏈或區(qū)的3′-位置、5′-位置、或3′和5′-位置。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈siNA分子包含在堿基配對或內(nèi)部位置、非堿基配對或突出端區(qū)域、和/或末端區(qū)域、或其任何組合處經(jīng)修飾的核苷酸。
本發(fā)明的一個方面的特征在于下調(diào)HCV靶基因表達(dá)或指導(dǎo)HCV靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子包含一個或多個化學(xué)修飾且雙鏈siNA的每條鏈長度為約21個核苷酸。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子不包含任何核糖核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子包含一個或多個核糖核苷酸。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子的每條鏈獨(dú)立地包含約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸，其中每條鏈包含與另一條鏈的核苷酸互補(bǔ)的約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子的一條鏈包含與HCV靶基因的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且雙鏈siNA分子的第二條鏈包含基本上類似于HCV靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于下調(diào)HCV靶基因表達(dá)或指導(dǎo)HCV靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包含反義區(qū)，其中所述反義區(qū)包含與HCV靶基因的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，和有義區(qū)，其中所述有義區(qū)包含基本上類似于靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，反義區(qū)和有義區(qū)獨(dú)立地包含約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸，其中所述反義區(qū)包含與有義區(qū)的核苷酸互補(bǔ)的約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于下調(diào)HCV靶基因表達(dá)或指導(dǎo)HCV靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包含有義區(qū)和反義區(qū)，其中所述反義區(qū)包含與由HCV靶基因編碼的RNA的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且所述有義區(qū)包含與反義區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含平端，即不包括任何突出端核苷酸的末端。例如，包含本文描述的修飾(例如，包含具有式I-VII的核苷酸或包含“Stab 00”-“Stab 36”或“Stab 3F”-“Stab 36F”(表IV)或其任何組合的siNA構(gòu)建體)和/或本文描述的任何長度的siNA分子可以包含平端或無突出端核苷酸的末端。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的任何siNA分子可以包含一個或多個平端，即當(dāng)平端不具有任何突出端核苷酸時(shí)。在一個實(shí)施方案中，平端的siNA分子具有等于siNA分子的每條鏈中存在的核苷酸數(shù)目的許多堿基對。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子包含一個平端，例如其中反義鏈的5′-末端和有義鏈的3′-末端不具有任何突出端核苷酸。在另一個例子中，siNA分子包含一個平端，例如其中反義鏈的3′-末端和有義鏈的5′-末端不具有任何突出端核苷酸。在另一個例子中，siNA分子包含2個平端，例如其中反義鏈的3′-末端和有義鏈的5′-末端以及反義鏈的5′-末端和有義鏈的3′-末端不具有任何突出端核苷酸。平端的siNA分子可以包含例如約15個-約30個核苷酸(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個核苷酸)。平端的siNA分子中存在的其他核苷酸可以包含例如，錯配、凸起、環(huán)或擺動堿基對，以調(diào)節(jié)siNA分子介導(dǎo)RNA干擾的活性。
“平端”意指無突出端核苷酸的雙鏈siNA分子的對稱末端或末端。雙鏈siNA分子的2條鏈在末端處不含突出端核苷酸彼此比對。例如，平端的siNA構(gòu)建體包含在siNA分子的有義和反義區(qū)之間互補(bǔ)的末端核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于下調(diào)HCV靶基因表達(dá)或指導(dǎo)HCV靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子由2個分開的寡核苷酸片段進(jìn)行裝配，其中一個片段包含有義區(qū)且第二個片段包含siNA分子的反義區(qū)。有義區(qū)可以經(jīng)由接頭分子例如多核苷酸接頭或非核苷酸接頭與反義區(qū)進(jìn)行連接。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子(例如siNA)分子包含在維持或增強(qiáng)RNAi活性的位置處的核糖核苷酸。在一個實(shí)施方案中，核糖核苷酸存在于siNA分子的有義鏈或有義區(qū)中，其通過允許經(jīng)由RISC內(nèi)的酶切割有義鏈或有義區(qū)可以提供RNAi活性(例如，存在于過客鏈、有義鏈、或有義區(qū)切割位置處的核糖核苷酸，例如19堿基對雙鏈體的過客鏈的位置9，其通過AGO2酶在RISC中進(jìn)行切割，參見例如Matranga等人，2005，Cell，1231-114和Rand等人，2005，Cell，123621-629)。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子的引導(dǎo)鏈或引導(dǎo)區(qū)(也稱為反義鏈或反義區(qū))的5′-末端處的一個或多個(例如1個、2個、3個、4個或5個)核苷酸是核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子(例如siNA)分子包含在過客鏈或過客區(qū)(也稱為有義鏈或有義區(qū))內(nèi)的位置處的一個或多個核糖核苷酸，其允許通過RISC復(fù)合物中的酶切割過客鏈或過客區(qū)(例如存在于過客鏈的位置例如19堿基對雙鏈體的過客鏈的位置9處的核糖核苷酸通過AGO2酶在RISC中進(jìn)行切割，參見例如Matranga等人，2005，Cell，1231-114和Rand等人，2005，Cell，123621-629)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含可以相同或不同的至少2個、3個、4個、5個或更多化學(xué)修飾。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含至少2個、3個、4個、5個或更多不同的化學(xué)修飾。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子是雙鏈短干擾核酸(siNA)，其中所述雙鏈核酸分子包含約15個-約30個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)堿基對，且其中所述siNA分子的每條鏈中的一個或多個(例如，至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸位置包含化學(xué)修飾。在另一個實(shí)施方案中，siNA包含至少2個、3個、4個、5個或更多不同的化學(xué)修飾。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于下調(diào)HCV靶基因表達(dá)或指導(dǎo)HCV靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子包含約15個-約30個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)堿基對，且其中所述siNA分子的每條鏈包含一個或多個化學(xué)修飾。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子的每條鏈包含至少2個(例如，2個、3個、4個、5個或更多)不同的化學(xué)修飾，例如不同的核苷酸糖、堿基或主鏈修飾。在另一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子的一條鏈包含與HCV靶基因的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且雙鏈siNA分子的第二條鏈包含基本上類似于HCV靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在另一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子的一條鏈包含與HCV靶基因的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且雙鏈siNA分子的第二條鏈包含基本上類似于HCV靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子的每條鏈包含約15個-約30個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸，且每條鏈包含與另一條鏈的核苷酸互補(bǔ)的至少約15個-約30個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸。HCV靶基因可以包含例如，在本文中提及或引入本文作為參考的序列。HCV基因可以包含例如在本文中通過Genbank登記號提及的序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈siNA分子的每條鏈包含不同模式的化學(xué)修飾，例如本文的任何“Stab 00”-“Stab 36”或“Stab 3F”-“Stab36F”(表IV)修飾模式或其任何組合。具有各種修飾模式的此種siNA分子的有義和反義鏈的非限制性例子顯示于表III以及圖4和5中。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子不包含核糖核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含一個或多個核糖核苷酸(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多核糖核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含反義區(qū)，所述反義區(qū)包含與HCV靶基因的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且siNA進(jìn)一步包含有義區(qū)，所述有義區(qū)包含基本上類似于HCV靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在另一個實(shí)施方案中，反義區(qū)和有義區(qū)各自包含約15個-約30個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸，且反義區(qū)包含與有義區(qū)的核苷酸互補(bǔ)的至少約15個-約30個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子的每條鏈包含至少2個(例如，2個、3個、4個、5個或更多)不同的化學(xué)修飾，例如不同的核苷酸糖、堿基或主鏈修飾。HCV靶基因可以包含例如在本文中提及或引入本文作為參考的序列。在另一個實(shí)施方案中，siNA是雙鏈核酸分子，其中siNA分子的2條鏈各自獨(dú)立地包含約15個-約40個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、23個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個或40個)核苷酸，且其中siNA分子的一條鏈包含與HCV靶基因的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的至少約15個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個或更多)核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含有義區(qū)和反義區(qū)，其中所述反義區(qū)包含與由HCV靶基因編碼的RNA的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且所述有義區(qū)包含與反義區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，siNA分子由2個分開的寡核苷酸片段進(jìn)行裝配，其中一個片段包含有義區(qū)且第二個片段包含siNA分子的反義區(qū)。在另一個實(shí)施方案中，有義區(qū)可以經(jīng)由接頭分子與反義區(qū)進(jìn)行連接。在另一個實(shí)施方案中，有義區(qū)經(jīng)由接頭分子例如核苷酸或非核苷酸接頭與反義區(qū)進(jìn)行連接。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子的每條鏈包含至少2個(例如，2個、3個、4個、5個或更多)不同的化學(xué)修飾，例如不同的核苷酸糖、堿基或主鏈修飾。HCV靶基因可以包含例如在本文中提及或引入本文作為參考的序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含一個或多個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多)2′-脫氧-2′-氟嘧啶修飾(例如，其中siNA的一個或多個或所有嘧啶(例如，U或C)位置被2′-脫氧-2′-氟核苷酸修飾)。在一個實(shí)施方案中，2′-脫氧-2′-氟嘧啶修飾存在于有義鏈中。在一個實(shí)施方案中，2′-脫氧-2′-氟嘧啶修飾存在于反義鏈中。在一個實(shí)施方案中，2′-脫氧-2′-氟嘧啶修飾存在于siNA分子的有義鏈和反義鏈中。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含一個或多個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多)2′-O-甲基嘌呤修飾(例如，其中siNA的一個或多個或所有嘌呤(例如，A或G)位置被2′-O-甲基核苷酸修飾)。在一個實(shí)施方案中，2′-O-甲基嘌呤修飾存在于有義鏈中。在一個實(shí)施方案中，2′-O-甲基嘌呤修飾存在于反義鏈中。在一個實(shí)施方案中，2′-O-甲基嘌呤修飾存在于siNA分子的有義鏈和反義鏈中。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含一個或多個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多)2′-脫氧嘌呤修飾(例如，其中siNA的一個或多個或所有嘌呤(例如，A或G)位置被2′-脫氧核苷酸修飾)。在一個實(shí)施方案中，2′-脫氧嘌呤修飾存在于有義鏈中。在一個實(shí)施方案中，2′-脫氧嘌呤修飾存在于反義鏈中。在一個實(shí)施方案中，2′-脫氧嘌呤修飾存在于siNA分子的有義鏈和反義鏈中。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于下調(diào)HCV靶基因表達(dá)或指導(dǎo)HCV靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包含有義區(qū)和反義區(qū)，其中所述反義區(qū)包含與由HCV靶基因編碼的RNA的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且所述有義區(qū)包含與反義區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列，且其中所述siNA分子具有一個或多個經(jīng)修飾的嘧啶和/或嘌呤核苷酸。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子的每條鏈包含至少2個(例如，2個、3個、4個、5個或更多)不同的化學(xué)修飾，例如不同的核苷酸糖、堿基或主鏈修飾。在一個實(shí)施方案中，有義區(qū)中的嘧啶核苷酸是2′-O-甲基嘧啶核苷酸或2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有義區(qū)中存在的嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，有義區(qū)中的嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有義區(qū)中存在的嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，有義區(qū)中的嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有義區(qū)中存在的嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸。在一個實(shí)施方案中，反義區(qū)中的嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且反義區(qū)中存在的嘌呤核苷酸是2′-O-甲基或2′-脫氧嘌呤核苷酸。在上述siNA分子中的任何一種的另一個實(shí)施方案中，有義鏈的非互補(bǔ)區(qū)(例如，突出端區(qū)域)中存在的任何核苷酸是2′-脫氧核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于下調(diào)HCV靶基因表達(dá)或指導(dǎo)HCV靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子由2個分開的寡核苷酸片段進(jìn)行裝配，其中一個片段包含有義區(qū)且第二個片段包含siNA分子的反義區(qū)，且其中包含有義區(qū)的片段包括在片段的5′-末端、3′-末端或5′-末端和3′-末端處的末端帽部分。在一個實(shí)施方案中，末端帽部分是反向的脫氧脫堿基部分或甘油基部分。在一個實(shí)施方案中，siNA分子的2個片段各自獨(dú)立地包含約15個-約30個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子的2個片段各自獨(dú)立地包含約15個-約40個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、23個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個或40個)核苷酸。在非限制性例子中，siNA分子的2個片段各自包含約21個核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含至少一個經(jīng)修飾的核苷酸的siNA分子，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸、2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、或本文和USSN 10/981,966中描述的任何其他經(jīng)修飾的核苷/核苷酸，所述USSN 10/981,966于2004年11月5日提交，引入本文作為參考。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含至少2個(例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)經(jīng)修飾的核苷酸的siNA分子，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸選自2′-脫氧-2′-氟核苷酸、2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、或本文和USSN 10/981,966中描述的任何其他經(jīng)修飾的核苷/核苷酸，所述USSN 10/981,966于2004年11月5日提交，引入本文作為參考。經(jīng)修飾的核苷酸/核苷可以是相同或不同的。siNA可以是例如長度約15個-約40個核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代嘧啶核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中經(jīng)修飾的核苷酸包括至少一個2′-脫氧-2′-氟胞苷或2′-脫氧-2′-氟尿苷核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，siNA中經(jīng)修飾的核苷酸包括至少一個2′-脫氧-2′-氟胞苷和至少一個2′-脫氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有尿苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有胞苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟胞苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有腺苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟腺苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有鳥苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟鳥苷核苷酸。siNA可以進(jìn)一步包含至少一個經(jīng)修飾的核苷酸間鍵，例如硫代磷酸酯鍵。在一個實(shí)施方案中，2′-脫氧-2′-氟核苷酸存在于siNA中特異性選擇的對經(jīng)由核糖核酸酶的切割敏感的位置處，例如具有嘧啶核苷酸的位置。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于增加siNA分子針對經(jīng)由核糖核酸酶的切割的穩(wěn)定性的方法，所述方法包括將至少一種經(jīng)修飾的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中經(jīng)修飾的核苷酸包括至少一個2′-脫氧-2′-氟胞苷或2′-脫氧-2′-氟尿苷核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，siNA中經(jīng)修飾的核苷酸包括至少一個2′-脫氧-2′-氟胞苷和至少一個2′-脫氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有尿苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有胞苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟胞苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有腺苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟腺苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有鳥苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟鳥苷核苷酸。siNA可以進(jìn)一步包含至少一個經(jīng)修飾的核苷酸間鍵，例如硫代磷酸酯鍵。在一個實(shí)施方案中，2′-脫氧-2′-氟核苷酸存在于siNA中特異性選擇的對經(jīng)由核糖核酸酶的切割敏感的位置處，例如具有嘧啶核苷酸的位置。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于增加siNA分子針對經(jīng)由核糖核酸酶的切割的穩(wěn)定性的方法，所述方法包括將至少一種經(jīng)修飾的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸是2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖嘧啶核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中經(jīng)修飾的核苷酸包括至少一個2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖胞苷或2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，siNA中經(jīng)修飾的核苷酸包括至少一個2′-氟胞苷和至少一個2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有尿苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有胞苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖胞苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有腺苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖腺苷核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA中存在的所有鳥苷核苷酸是2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖鳥苷核苷酸。siNA可以進(jìn)一步包含至少一個經(jīng)修飾的核苷酸間鍵，例如硫代磷酸酯鍵。在一個實(shí)施方案中，2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸存在于siNA中特異性選擇的對經(jīng)由核糖核酸酶的切割敏感的位置處，例如具有嘧啶核苷酸的位置。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于下調(diào)HCV靶基因表達(dá)或指導(dǎo)HCV靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包含有義區(qū)和反義區(qū)，其中所述反義區(qū)包含與由HCV靶基因編碼的RNA的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且所述有義區(qū)包含與反義區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列，且其中所述反義區(qū)中存在的嘌呤核苷酸包含2′-脫氧-嘌呤核苷酸。在一個可替代的實(shí)施方案中，反義區(qū)中存在的嘌呤核苷酸包含2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在上述實(shí)施方案的任何一個中，反義區(qū)可以包含在反義區(qū)的3′末端處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵?？商娲?，在上述實(shí)施方案的任何一個中，反義區(qū)可以包含在反義區(qū)的3′末端處的甘油基修飾。在上述siNA分子中的任何一種的另一個實(shí)施方案中，有義鏈的非互補(bǔ)區(qū)(例如，突出端區(qū)域)中存在的任何核苷酸是2′-脫氧核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的反義區(qū)包含與內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物的部分互補(bǔ)的序列，所述內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物具有對受試者或生物中的特定疾病或性狀相關(guān)的等位基因獨(dú)特的序列，例如包含與疾病或性狀特異性等位基因相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的序列。照這樣，本發(fā)明的siNA分子的反義區(qū)可以包含與對特定等位基因獨(dú)特的序列互補(bǔ)的序列，以提供介導(dǎo)針對疾病、狀況或性狀相關(guān)的等位基因的選擇性RNAi中的特異性。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于下調(diào)HCV靶基因表達(dá)或指導(dǎo)HCV靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子由2個分開的寡核苷酸片段進(jìn)行裝配，其中一個片段包含有義區(qū)且第二個片段包含siNA分子的反義區(qū)。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子的每條鏈長度為約21個核苷酸，其中siNA分子的每個片段的約19個核苷酸與siNA分子的另一個片段的互補(bǔ)核苷酸堿基配對，其中siNA分子的每個片段的至少2個3′末端核苷酸與siNA分子的另一個片段的核苷酸不是堿基配對的。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子是雙鏈核酸分子，其中每條鏈長度為約19個核苷酸，且其中siNA分子的每個片段的核苷酸與siNA分子的另一個片段的互補(bǔ)核苷酸堿基配對，以形成至少約15個(例如，15個、16個、17個、18個或19個)堿基對，其中所述siNA分子的1個或2個末端是平端。在一個實(shí)施方案中，siNA分子的每個片段的2個3′末端核苷酸各自是2′-脫氧-嘧啶核苷酸，例如2′-脫氧-胸苷。在一個實(shí)施方案中，siNA分子的每個片段的2個3′末端核苷酸各自是2′-O-甲基嘧啶核苷酸，例如2′-O-甲基尿苷、胞苷或胸苷。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子的每個片段的所有核苷酸與siNA分子的另一個片段的互補(bǔ)核苷酸堿基配對。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子是具有有義區(qū)和反義區(qū)的約19個-約25個堿基對的雙鏈核酸分子，其中所述反義區(qū)的約19個核苷酸與由HCV靶基因編碼的RNA的核苷酸序列或其部分堿基配對。在另一個實(shí)施方案中，反義區(qū)的約21個核苷酸與由HCV靶基因編碼的RNA的核苷酸序列或其部分堿基配對。在上述實(shí)施方案的任何一個中，包含所述反義區(qū)的片段的5′-末端可以任選包括磷酸基。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于抑制HCV靶RNA序列表達(dá)的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子不包含任何核糖核苷酸，且其中所述雙鏈siNA分子的每條鏈為約15個-約30個核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA分子長度為21個核苷酸。包含非核糖核苷酸的siNA構(gòu)建體的例子是有義/反義化學(xué)的任何組合的表IV中所示的穩(wěn)定化學(xué)的組合，例如Stab 7/8、Stab 7/11、Stab 8/8、Stab 18/8、Stab18/11、Stab 12/13、Stab 7/13、Stab 18/13、Stab 7/19、Stab 8/19、Stab 18/19、Stab 7/20、Stab 8/20、Stab 18/20、Stab 7/32、Stab 8/32或Stab 18/32(例如，具有Stab 7、8、11、12、13、14、15、17、18、19、20或32有義或反義鏈或其任何組合的任何siNA)。在本文中，數(shù)字Stab化學(xué)可以包括如表IV中所示化學(xué)的2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab7/8和Stab 7F/8F等。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)HCV靶RNA切割的化學(xué)合成的雙鏈RNA分子，其中所述RNA分子的每條鏈長度為約15個-約30個核苷酸；RNA分子的一條鏈包含與HCV靶RNA具有足夠互補(bǔ)性的核苷酸序列以用于RNA分子經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)HCV靶RNA切割；且其中所述RNA分子的至少一條鏈任選包含本文描述的一個或多個化學(xué)修飾的核苷酸，例如但不限于，脫氧核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、2′-脫氧-2′-氟核苷酸、2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-甲氧基乙基核苷酸、4′-硫代核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸等或其任何組合。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的HCV靶RNA包含編碼蛋白質(zhì)的序列，例如編碼HCV或HCV途徑/宿主蛋白質(zhì)的HCV或HCV途徑/宿主RNA。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶RNA包含非編碼RNA序列(例如，miRNA、snRNA、siRNA等)，參見例如Mattick，2005，Science，309，1527-1528；Claverie，2005，Science，309，1529-1530；Sethupathy等人，2006，RNA，12，192-197；和Czech，2006 NEJM，354，111194-1195。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含本發(fā)明的siNA分子的藥物。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含本發(fā)明的siNA分子的活性成分。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于雙鏈短干擾核酸(siNA)分子抑制、下調(diào)或減少HCV靶基因表達(dá)的用途，其中所述siNA分子包含一個或多個化學(xué)修飾，且雙鏈siNA的每條鏈的長度獨(dú)立地為約15個-約30個或更多(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個或更多)核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子是包含一個或多個化學(xué)修飾的雙鏈核酸分子，其中所述siNA分子的2個片段各自獨(dú)立地包含約15個-約40個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、23個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個或40個)核苷酸，且其中一條鏈包含與由HCV靶編碼RNA的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的至少15個核苷酸。在一個非限制性的例子中，siNA分子的2個片段各自包含約21個核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子是包含一個或多個化學(xué)修飾的雙鏈核酸分子，其中每條鏈長度為約21個核苷酸，且其中siNA分子的每個片段的約19個核苷酸與siNA分子的另一個片段的互補(bǔ)核苷酸堿基配對，其中siNA分子的每個片段的至少2個3′末端核苷酸與siNA分子的另一個片段的核苷酸不是堿基配對的。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子是包含一個或多個化學(xué)修飾的雙鏈核酸分子，其中每條鏈長度為約19個核苷酸，且其中siNA分子的每個片段的核苷酸與siNA分子的另一個片段的互補(bǔ)核苷酸堿基配對，以形成至少約15個(例如，15個、16個、17個、18個或19個)堿基對，其中所述siNA分子的1個或2個末端是平端。在一個實(shí)施方案中，siNA分子的每個片段的2個3′末端核苷酸各自是2′-脫氧-嘧啶核苷酸，例如2′-脫氧-胸苷。在一個實(shí)施方案中，siNA分子的每個片段的2個3′末端核苷酸是2′-O-甲基嘧啶核苷酸，例如2′-O-甲基尿苷、胞苷或胸苷。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子的每個片段的所有核苷酸與siNA分子的另一個片段的互補(bǔ)核苷酸堿基配對。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子是具有有義區(qū)和反義區(qū)且包含一個或多個化學(xué)修飾的約19個-約25個堿基對的雙鏈核酸分子，其中所述反義區(qū)的約19個核苷酸與由HCV靶基因編碼的RNA的核苷酸序列或其部分堿基配對。在另一個實(shí)施方案中，反義區(qū)的約21個核苷酸與由HCV靶基因編碼的RNA的核苷酸序列或其部分堿基配對。在上述實(shí)施方案的任何一個中，包含所述反義區(qū)的片段的5′-末端可以任選包括磷酸基。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于抑制、下調(diào)或減少HCV靶基因表達(dá)的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子的用途，其中所述雙鏈siNA分子的一條鏈?zhǔn)欠戳x鏈，所述反義鏈包含與HCV靶RNA的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，另一條鏈?zhǔn)怯辛x鏈，所述有義鏈包含與反義鏈的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，每條鏈具有至少2個(例如，2個、3個、4個、5個或更多)化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾可以是相同或不同的，例如核苷酸、糖、堿基或主鏈修飾。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子中存在的大多數(shù)嘧啶核苷酸包含糖修飾。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子中存在的大多數(shù)嘌呤核苷酸包含糖修飾。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于抑制、下調(diào)或減少HCV靶基因表達(dá)的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述雙鏈siNA分子的一條鏈?zhǔn)欠戳x鏈，所述反義鏈包含與HCV靶RNA的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，其中另一條鏈?zhǔn)怯辛x鏈，所述有義鏈包含與反義鏈的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，每條鏈具有至少2個(例如，2個、3個、4個、5個或更多)化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾可以是相同或不同的，例如核苷酸、糖、堿基或主鏈修飾。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子中存在的大多數(shù)嘧啶核苷酸包含糖修飾。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子中存在的大多數(shù)嘌呤核苷酸包含糖修飾。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于在于抑制、下調(diào)或減少HCV靶基因表達(dá)的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述雙鏈siNA分子的一條鏈?zhǔn)欠戳x鏈，所述反義鏈包含與編碼蛋白質(zhì)的HCV靶RNA的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，另一條鏈?zhǔn)怯辛x鏈，所述有義鏈包含與反義鏈的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且其中雙鏈siNA分子中存在的大多數(shù)嘧啶核苷酸包含糖修飾。在一個實(shí)施方案中，siNA分子的每條鏈包含約15個-約30個或更多(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個或更多)核苷酸，其中每條鏈包含與另一條鏈的核苷酸互補(bǔ)的至少約15個核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA分子由2個寡核苷酸片段進(jìn)行裝配，其中一個片段包含siNA分子的反義鏈的核苷酸序列，且第二個片段包含siNA分子的有義區(qū)的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，有義鏈經(jīng)由接頭分子例如多核苷酸接頭或非核苷酸接頭與反義鏈進(jìn)行連接。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，有義鏈中存在的嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有義區(qū)中存在的嘌呤核苷酸是2′-脫氧-嘌呤核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，有義鏈中存在的嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有義區(qū)中存在的嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在另外一個實(shí)施方案中，反義鏈中存在的嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且反義鏈中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-脫氧-嘌呤核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，反義鏈包含一個或多個2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸和一個或多個2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，反義鏈中存在的嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且反義鏈中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，有義鏈包含3′-末端和5′-末端，其中末端帽部分(例如，反向的脫氧脫堿基部分或反向的脫氧核苷酸部分例如反向的胸苷)存在于有義鏈的5′-末端、3′-末端、或5′和3′末端處。在另一個實(shí)施方案中，反義鏈在反義鏈的3′末端處包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在另一個實(shí)施方案中，反義鏈包含在3′末端處的甘油基修飾。在另一個實(shí)施方案中，反義鏈的5′-末端任選包含磷酸基。
在抑制HCV靶基因表達(dá)的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子的上述實(shí)施方案的任何一個中，其中所述雙鏈siNA分子中存在的大多數(shù)嘧啶核苷酸包含糖修飾，siNA分子的2條鏈各自可以包含約15個-約30個或更多(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個或更多)核苷酸。在一個實(shí)施方案中，siNA分子的每條鏈的約15個-約30個或更多(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個或更多)核苷酸與siNA分子的另一條鏈的互補(bǔ)核苷酸堿基配對。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子的每條鏈的約15個-約30個或更多(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個或更多)核苷酸與siNA分子的另一條鏈的互補(bǔ)核苷酸堿基配對，其中siNA分子的每條鏈的至少2個3′末端核苷酸與siNA分子的另一條鏈的核苷酸不是堿基配對的。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子的每個片段的2個3′末端核苷酸各自是2′-脫氧-嘧啶，例如2′-脫氧-胸苷。在一個實(shí)施方案中，siNA分子的每條鏈與siNA分子的另一條鏈的互補(bǔ)核苷酸堿基配對。在一個實(shí)施方案中，反義鏈的15個-約30個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸與HCV靶RNA的核苷酸序列或其部分堿基配對。在一個實(shí)施方案中，反義鏈的18個-約25個(例如約18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個)核苷酸與HCV靶RNA的核苷酸序列或其部分堿基配對。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于抑制HCV靶基因表達(dá)的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述雙鏈siNA分子的一條鏈?zhǔn)欠戳x鏈，所述反義鏈包含與HCV靶RNA的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，另一條鏈?zhǔn)怯辛x鏈，所述有義鏈包含與反義鏈的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，每條鏈具有至少2個(例如，2個、3個、4個、5個或更多)不同的化學(xué)修飾，例如核苷酸糖、堿基或主鏈修飾。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子中存在的大多數(shù)嘧啶核苷酸包含糖修飾。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子中存在的大多數(shù)嘌呤核苷酸包含糖修飾。在一個實(shí)施方案中，反義鏈的5′-末端任選包括磷酸基。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于抑制HCV靶基因表達(dá)的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述雙鏈siNA分子的一條鏈?zhǔn)欠戳x鏈，所述反義鏈包含與HCV靶RNA的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，另一條鏈?zhǔn)怯辛x鏈，所述有義鏈包含與反義鏈的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且其中雙鏈siNA分子中存在的大多數(shù)嘧啶核苷酸包含糖修飾，且其中反義鏈的核苷酸序列或其部分與HCV靶RNA的非翻譯區(qū)的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于抑制HCV靶基因表達(dá)的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述雙鏈siNA分子的一條鏈?zhǔn)欠戳x鏈，所述反義鏈包含與HCV靶RNA的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，其中另一條鏈?zhǔn)怯辛x鏈，所述有義鏈包含與反義鏈的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中雙鏈siNA分子中存在的大多數(shù)嘧啶核苷酸包含糖修飾，且其中反義鏈的核苷酸序列與HCV靶RNA的核苷酸序列或存在于HCV靶RNA中的其部分互補(bǔ)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中包含本發(fā)明的siNA分子的組合物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的本發(fā)明的2種或更多不同的siNA分子(例如，靶向HCV靶RNA的不同區(qū)域的siNA分子或靶向HCV RNA和細(xì)胞靶的siNA分子)。
在非限制性例子中，將化學(xué)修飾的核苷酸引入核酸分子內(nèi)提供了克服外源遞送的天然RNA分子固有的體內(nèi)穩(wěn)定性和生物利用率的潛在局限性中的有力工具。例如，化學(xué)修飾的核酸分子的使用可以使得對于給定療效較低劑量的特定核酸分子成為可能，因?yàn)榛瘜W(xué)修飾的核酸分子在血清中傾向于具有較長的半衰期。此外，通過HCV靶向特定細(xì)胞或組織和/或改善核酸分子的細(xì)胞攝取，某些化學(xué)修飾可以改善核酸分子的生物利用率。因此，即使與天然核酸分子相比較，例如，當(dāng)與全RNA核酸分子相比較時(shí)，化學(xué)修飾的核酸分子的活性減少，由于分子改善的穩(wěn)定性和/或遞送，經(jīng)修飾的核酸分子的總體活性也可以大于天然分子的那種。與天然未修飾的siNA不同，化學(xué)修飾的siNA也可以使在人中激活干擾素活性或免疫刺激的可能性降到最低。這些性質(zhì)因此對天然siRNA或最低限度修飾的siRNA在各種體外和體內(nèi)背景中介導(dǎo)RNAi的能力，包括研究和治療應(yīng)用中的用途加以改進(jìn)。申請人在本文中描述了與相應(yīng)的未修飾或最低限度修飾的siNA分子相比較，具有改善的RNAi活性的化學(xué)修飾的siNA分子。本文公開的化學(xué)修飾的siNA基序提供了維持基本上類似于未修飾的或最低限度修飾的活性siNA的RNAi活性(參見例如Elbashir等人，2001，EMBO J.，206877-6888)，同時(shí)提供適合于在治療應(yīng)用中使用的核酸酶抗性和藥物代謝動力學(xué)(pharmacoketic)性質(zhì)的能力。
在本文描述的siNA分子的任何一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的反義區(qū)可以包含在所述反義區(qū)3′-末端處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在本文描述的siNA分子的任何一個實(shí)施方案中，反義區(qū)可以包含在所述反義區(qū)的5′-末端處的約1個-約5個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在本文描述的siNA分子的任何一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的3′-末端核苷酸突出端可以包含在核酸糖、堿基或主鏈處進(jìn)行化學(xué)修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。在本文描述的siNA分子的任何一個實(shí)施方案中，3′-末端核苷酸突出端可以包含一個或多個通用堿基核糖核苷酸。在本文描述的siNA分子的任何一個實(shí)施方案中，3′-末端核苷酸突出端可以包含一個或多個無環(huán)核苷酸。
本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了以允許核酸分子表達(dá)的方式包含核酸序列的表達(dá)載體，所述核酸序列編碼本發(fā)明的至少一種siNA分子。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案提供了包含此種表達(dá)載體的哺乳動物細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞可以是人細(xì)胞。表達(dá)載體的siNA分子可以包含有義區(qū)和反義區(qū)。反義區(qū)可以包含與編碼HCV靶的RNA或DNA序列互補(bǔ)的序列，且有義區(qū)可以包含與反義區(qū)互補(bǔ)的序列。siNA分子可以包含具有互補(bǔ)的有義和反義區(qū)的2條不同的鏈。siNA分子可以包含具有互補(bǔ)的有義和反義區(qū)的單鏈。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于能夠在細(xì)胞或重構(gòu)的體外系統(tǒng)內(nèi)介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述化學(xué)修飾包含一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)核苷酸，所述核苷酸包含具有式I的主鏈修飾的核苷酸間鍵
其中每個R1和R2獨(dú)立地是任何核苷酸、非核苷酸、或多核苷酸，其可以是天然存在的或化學(xué)修飾的，并且其可以包括在siNA分子的結(jié)構(gòu)中或充當(dāng)與siNA分子附著的點(diǎn)，每個X和Y獨(dú)立地是O、S、N、烷基或取代烷基，每個Z和W獨(dú)立地是O、S、N、烷基、取代烷基、O-烷基、S-烷基、烷芳基、芳烷基或乙酰基，且其中W、X、Y和Z任選地不全是O。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的主鏈修飾包含膦酰乙酸酯和/或硫代膦酰乙酸酯核苷酸間鍵(參見例如Sheehan等人，2003，NucleicAcids Research，31，4109-4118)。
具有式I，例如其中任何Z、W、X和/或Y獨(dú)立地包含硫原子的化學(xué)修飾的核苷酸間鍵，可以存在于siNA雙鏈體的1條或2條寡核苷酸鏈中，例如有義鏈、反義鏈或2條鏈中。本發(fā)明的siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端處具有式I的一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)化學(xué)修飾的核苷酸間鍵。例如，本發(fā)明的示例性siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈的5′-末端處具有式I的約1個-約5個或更多(例如，約1個、2個、3個、4個、5個或更多)化學(xué)修飾的核苷酸間鍵。在另一個非限制性例子中，本發(fā)明的示例性siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈中含有具有式I的化學(xué)修飾的核苷酸間鍵的一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)嘧啶核苷酸。在另外一個非限制性例子中，本發(fā)明的示例性siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈中含有具有式I的化學(xué)修飾的核苷酸間鍵的一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)嘌呤核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，具有式I的一個或多個核苷酸間鍵的本發(fā)明的siNA分子也包含具有式I-VII中任何一個的化學(xué)修飾的核苷酸或非核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于能夠在細(xì)胞或重構(gòu)的體外系統(tǒng)內(nèi)介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述化學(xué)修飾包含一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)具有式II的核苷酸或非核苷酸
其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11和R12各自獨(dú)立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-鏈烯基、S-鏈烯基、N-鏈烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨?；NH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨?；?、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基(polyalklylamino)、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一個的基團(tuán)，其中任何一個可以包括在siNA分子的結(jié)構(gòu)中或充當(dāng)與siNA分子附著的點(diǎn)；R9是O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2，且B是核苷(nucleosidic)堿基例如腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶、2-氨基腺苷、5-甲基胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、或與靶RNA互補(bǔ)或非互補(bǔ)的任何其他非天然存在的堿基，或非核苷堿基例如苯基、萘基、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、水粉蕈素、羥基吡啶、吡啶酮、或可以與靶RNA互補(bǔ)或非互補(bǔ)的任何其他非天然存在的通用堿基。在一個實(shí)施方案中，R3和/或R7包含綴合物部分和接頭(例如，如本文所描述或本領(lǐng)域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接頭)。綴合物部分的非限制性例子包括關(guān)于細(xì)胞受體的配體，例如衍生自天然存在的蛋白質(zhì)配體的肽；蛋白質(zhì)定位序列，包括細(xì)胞ZIP編碼序列；抗體；核酸適體；維生素和其他輔因子，例如葉酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；膽固醇；類固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亞精胺。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的具有式II的核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的具有式II的核苷酸是2′-O-甲基核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的具有式II的核苷酸是2′-脫氧核苷酸。
式II的化學(xué)修飾的核苷酸或非核苷酸可以存在于siNA雙鏈體的1條或2條寡核苷酸鏈中，例如有義鏈、反義鏈或2條鏈中。本發(fā)明的siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端處的式II的一個或多個化學(xué)修飾的核苷酸或非核苷酸。例如，本發(fā)明的示例性siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈的5′-末端處的式II的約1個-約5個或更多(例如，約1個、2個、3個、4個、5個或更多)化學(xué)修飾的核苷酸或非核苷酸。在另一個非限制性例子中，本發(fā)明的示例性siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈的3′-末端處的式II的約1個-約5個或更多(例如，約1個、2個、3個、4個、5個或更多)化學(xué)修飾的核苷酸或非核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于能夠在細(xì)胞或重構(gòu)的體外系統(tǒng)內(nèi)介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述化學(xué)修飾包含一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)具有式III的核苷酸或非核苷酸
其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11和R12各自獨(dú)立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-鏈烯基、S-鏈烯基、N-鏈烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨?；?、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一個的基團(tuán)，其中任何一個可以包括在siNA分子的結(jié)構(gòu)中或充當(dāng)與siNA分子附著的點(diǎn)；R9是O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2，且B是核苷堿基例如腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶、2-氨基腺苷、5-甲基胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、或可以利用的與靶RNA互補(bǔ)或非互補(bǔ)的任何其他非天然存在的堿基，或非核苷堿基例如苯基、萘基、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、水粉蕈素、羥基吡啶、吡啶酮、或可以與靶RNA互補(bǔ)或非互補(bǔ)的任何其他非天然存在的通用堿基。在一個實(shí)施方案中，R3和/或R7包含綴合物部分和接頭(例如，如本文所描述或本領(lǐng)域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接頭)。綴合物部分的非限制性例子包括關(guān)于細(xì)胞受體的配體，例如衍生自天然存在的蛋白質(zhì)配體的肽；蛋白質(zhì)定位序列，包括細(xì)胞ZIP編碼序列；抗體；核酸適體；維生素和其他輔因子，例如葉酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；膽固醇；類固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亞精胺。
式III的化學(xué)修飾的核苷酸或非核苷酸可以存在于siNA雙鏈體的1條或2條寡核苷酸鏈中，例如有義鏈、反義鏈或2條鏈中。本發(fā)明的siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端處的式III的一個或多個化學(xué)修飾的核苷酸或非核苷酸。例如，本發(fā)明的示例性siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈的5′-末端處的式III的約1個-約5個或更多(例如，約1個、2個、3個、4個、5個或更多)化學(xué)修飾的核苷酸或非核苷酸。在另一個非限制性例子中，本發(fā)明的示例性siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈的3′-末端處的式III的約1個-約5個或更多(例如，約1個、2個、3個、4個、5個或更多)化學(xué)修飾的核苷酸或非核苷酸。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含具有式II或III的核苷酸，其中具有式II或III的核苷酸是反向構(gòu)型。例如，具有式II或III的核苷酸以3′-3′、3′-2′、2′-3′或5′-5′的構(gòu)型例如在1條或2條siNA鏈的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端處與siNA構(gòu)建體進(jìn)行連接。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于能夠在細(xì)胞或重構(gòu)的體外系統(tǒng)內(nèi)介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述化學(xué)修飾包含具有式IV的5′-末端磷酸基
其中每個X和Y獨(dú)立地是O、S、N、烷基、取代烷基或烷基鹵；其中每個Z和W獨(dú)立地是O、S、N、烷基、取代烷基、O-烷基、S-烷基、烷芳基、芳烷基、烷基鹵或乙酰基；且其中W、X、Y和Z任選地不全是O且Y充當(dāng)與siNA分子附著的點(diǎn)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于在HCV靶互補(bǔ)鏈上帶有具有式IV的5′-末端磷酸基的siNA分子，例如與HCV靶RNA互補(bǔ)的鏈，其中所述siNA分子包含全RNA siNA分子。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于在HCV靶互補(bǔ)鏈上帶有具有式IV的5′-末端磷酸基的siNA分子，其中所述siNA分子還包含在1條或2條鏈的3′-末端上具有約1個-約4個(例如，約1個、2個、3個或4個)脫氧核糖核苷酸的約1個-約3個(例如，約1個、2個或3個)核苷酸3′-末端核苷酸突出端。在另一個實(shí)施方案中，具有式IV的5′-末端磷酸基存在于本發(fā)明的siNA分子的HCV靶互補(bǔ)鏈上，例如帶有具有式I-VII中任何一個的化學(xué)修飾的siNA分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于能夠在細(xì)胞或重構(gòu)的體外系統(tǒng)內(nèi)介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述化學(xué)修飾包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。例如，在非限制性例子中，本發(fā)明的特征在于在1條siNA鏈中具有約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)。在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于在2條siNA鏈中獨(dú)立地具有約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)。硫代磷酸酯核苷酸間鍵可以存在于siNA雙鏈體的1條或2條寡核苷酸鏈中，例如有義鏈、反義鏈或2條鏈中。本發(fā)明的siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。例如，本發(fā)明的示例性siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈的5′-末端處約1個-約5個或更多(例如，約1個、2個、3個、4個、5個或更多)連續(xù)的硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在另一個非限制性例子中，本發(fā)明的示例性siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈中的一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)嘧啶硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在另外一個非限制性例子中，本發(fā)明的示例性siNA分子可以包含在有義鏈、反義鏈或2條鏈中的一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)嘌呤硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
雙鏈siNA分子的每條鏈可以具有一個或多個化學(xué)修飾，從而使得每條鏈包含不同模式的化學(xué)修飾。本文提供了可以產(chǎn)生不同修飾模式的修飾方案的幾個非限制性例子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于siNA分子，其中有義鏈包含一個或多個，例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵，和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基和/或約一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)通用堿基修飾的核苷酸，和任選地在有義鏈的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子；且其中反義鏈包含約1個-約10個或更多，具體地約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵，和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)通用堿基修飾的核苷酸，和任選地在反義鏈的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子。在另一個實(shí)施方案中，有義和/或反義siNA鏈的一個或多個，例如約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多嘧啶核苷酸由2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或2′-脫氧-2′-氟核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，包括或不包括存在于相同或不同鏈中的一個或多個，例如約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵和/或3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于siNA分子，其中有義鏈包含約1個-約5個，具體地約1個、2個、3個、4個或5個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個或更多)2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個或更多)通用堿基修飾的核苷酸，和任選地在有義鏈的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子；且其中反義鏈包含約1個-約5個或更多，具體地約1個、2個、3個、4個、5個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵，和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)通用堿基修飾的核苷酸，和任選地在反義鏈的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子。在另一個實(shí)施方案中，有義和/或反義siNA鏈的一個或多個，例如約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多嘧啶核苷酸由2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或2′-脫氧-2′-氟核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，包括或不包括存在于相同或不同鏈中的約1個-約5個或更多，例如約1個、2個、3個、4個、5個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵和/或3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于siNA分子，其中反義鏈包含一個或多個，例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵，和/或約一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)通用堿基修飾的核苷酸，和任選地在有義鏈的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子；且其中反義鏈包含約1個-約10個或更多，具體地約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵，和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)通用堿基修飾的核苷酸，和任選地在反義鏈的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子。在另一個實(shí)施方案中，有義和/或反義siNA鏈的一個或多個，例如約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多嘧啶核苷酸由2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或2′-脫氧-2′-氟核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，包括或不包括存在于相同或不同鏈中的一個或多個，例如約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵和/或3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于siNA分子，其中反義鏈包含約1個-約5個或更多，具體地約1個、2個、3個、4個、5個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵，和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)通用堿基修飾的核苷酸，和任選地在有義鏈的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子；且其中反義鏈包含約1個-約5個或更多，具體地約1個、2個、3個、4個、5個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵，和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)通用堿基修飾的核苷酸，和任選地在反義鏈的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子。在另一個實(shí)施方案中，有義和/或反義siNA鏈的一個或多個，例如約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多嘧啶核苷酸由2′-脫氧、2′-O-甲基、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或2′-脫氧-2′-氟核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，包括或不包括存在于相同或不同鏈中的約1個-約5個，例如約1個、2個、3個、4個、5個或更多硫代磷酸酯核苷酸間鍵和/或3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處的末端帽分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于在siNA分子的每條鏈中具有約1個-約5個或更多(具體地約1個、2個、3個、4個、5個或更多)硫代磷酸酯核苷酸間鍵的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含2′-5′核苷酸間鍵的siNA分子。一個或多個2′-5′核苷酸間鍵可以在1條或2條siNA序列鏈的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端處。此外，一個或多個2′-5′核苷酸間鍵可以存在于1條或2條siNA序列鏈的各種其他位置處，例如，包括siNA分子的1條或2條鏈中的嘧啶核苷酸的每個核苷酸間鍵的約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多可以包括2′-5′核苷酸間鍵，或包括siNA分子的1條或2條鏈中的嘌呤核苷酸的每個核苷酸間鍵的約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多可以包括2′-5′核苷酸間鍵。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的化學(xué)修飾的siNA分子包含具有2條鏈的雙鏈體，其中的1條或2條鏈可以是化學(xué)修飾的，其中每條鏈的長度單獨(dú)地是約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸，其中所述雙鏈體具有約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)堿基對，且其中所述化學(xué)修飾包含具有式I-VII中任何一個的結(jié)構(gòu)。例如，本發(fā)明的示例性化學(xué)修飾的siNA分子包含具有2條鏈的雙鏈體，其中的1條或2條鏈可以是由具有式I-VII中任何一個或其任何組合的化學(xué)修飾進(jìn)行化學(xué)修飾，其中每條鏈由約21個核苷酸組成，各自具有2-核苷酸3′-末端核苷酸突出端，且其中所述雙鏈體具有約19個堿基對。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含單鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中所述siNA長度為約36個-約70個(例如，約36個、40個、45個、50個、55個、60個、65個或70個)核苷酸，具有約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)堿基對，且其中所述siNA可以包括包含具有式I-VII中任何一個或其任何組合的結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾。例如，本發(fā)明的示例性化學(xué)修飾的siNA分子包含具有約42個-約50個(例如，約42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個或50個)核苷酸的線性寡核苷酸，其由具有式I-VII中任何一個或其任何組合的化學(xué)修飾進(jìn)行化學(xué)修飾，其中所述線性寡核苷酸形成具有約19個-約21個(例如，19個、20個或21個)堿基對和2-核苷酸3′-末端核苷酸突出端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的線性發(fā)夾siNA分子包含莖環(huán)基序，其中所述siNA分子的環(huán)部分是生物可降解的。例如，本發(fā)明的線性發(fā)夾siNA分子被這樣設(shè)計(jì)，從而使得siNA分子的環(huán)部分在體內(nèi)降解可以產(chǎn)生具有3′-末端突出端的雙鏈siNA分子，例如包含約2個核苷酸的3′-末端核苷酸突出端。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中所述siNA長度為約25個-約50個(例如，約25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個或50個)核苷酸，具有約3個-約25個(例如，約3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個)堿基對，且其中所述siNA可以包括一個或多個化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾包含具有式I-VII中任何一個或其任何組合的結(jié)構(gòu)。例如，本發(fā)明的示例性化學(xué)修飾的siNA分子包含具有約25個-約35個(例如，約25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個或35個)核苷酸的線性寡核苷酸，其由具有式I-VII中任何一個或其任何組合的一個或多個化學(xué)修飾進(jìn)行化學(xué)修飾，其中所述線性寡核苷酸形成具有約3個-約25個(例如，3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個)堿基對和可以如本文所描述的進(jìn)行化學(xué)修飾的5′-末端磷酸基(例如具有式IV的5′-末端磷酸基)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的線性發(fā)夾siNA分子包含莖環(huán)基序，其中所述siNA分子的環(huán)部分是生物可降解的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的線性發(fā)夾siNA分子包含含有非核苷酸接頭的環(huán)部分。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含不對稱的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中所述siNA分子長度為約25個-約50個(例如，約25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個或50個)核苷酸，具有約3個-約25個(例如，約3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個)堿基對，且其中所述siNA可以包括一個或多個化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾包含具有式I-VII中任何一個或其任何組合的結(jié)構(gòu)。例如，本發(fā)明的示例性化學(xué)修飾的siNA分子包含具有約25個-約35個(例如，約25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個或35個)核苷酸的線性寡核苷酸，其由具有式I-VII中任何一個或其任何組合的一個或多個化學(xué)修飾進(jìn)行化學(xué)修飾，其中所述線性寡核苷酸形成具有約3個-約25個(例如，約3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個)堿基對和可以如本文所描述的進(jìn)行化學(xué)修飾的5′-末端磷酸基(例如具有式IV的5′-末端磷酸基)的不對稱的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的不對稱的發(fā)夾siNA分子包含莖環(huán)基序，其中所述siNA分子的環(huán)部分是生物可降解的。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的不對稱的發(fā)夾siNA分子包含含有非核苷酸接頭的環(huán)部分。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含具有分開的多核苷酸鏈的不對稱的雙鏈結(jié)構(gòu)，所述多核苷酸鏈包含有義和反義區(qū)，其中所述反義區(qū)長度為約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸，其中所述有義區(qū)長度為約3個-約25個(例如，約3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個)核苷酸，其中所述有義區(qū)和反義區(qū)具有至少3個互補(bǔ)核苷酸，且其中所述siNA可以包括一個或多個化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾包含具有式I-VII中任何一個或其任何組合的結(jié)構(gòu)。例如，本發(fā)明的示例性化學(xué)修飾的siNA分子包含具有分開的多核苷酸鏈的不對稱的雙鏈結(jié)構(gòu)，所述多核苷酸鏈包含有義和反義區(qū)，其中所述反義區(qū)長度為約18個-約23個(例如，約18個、19個、20個、21個、22個或23個)核苷酸，且其中所述有義區(qū)長度為約3個-約15個(例如，約3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個)核苷酸，其中所述有義區(qū)反義區(qū)具有至少3個互補(bǔ)核苷酸，且其中所述siNA可以包括一個或多個化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾包含具有式I-VII中任何一個或其任何組合的結(jié)構(gòu)。在另一個實(shí)施方案中，不對稱的雙鏈siNA分子還可以具有可如本文所描述的進(jìn)行化學(xué)修飾的5′-末端磷酸基(例如具有式IV的5′-末端磷酸基)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含環(huán)狀核酸分子，其中所述siNA長度為約38個-約70個(例如，約38個、40個、45個、50個、55個、60個、65個或70個)核苷酸，具有約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)堿基對，且其中所述siNA可以包括化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾包含具有式I-VII中任何一個或其任何組合的結(jié)構(gòu)。例如，本發(fā)明的示例性化學(xué)修飾的siNA分子包含具有約42個-約50個(例如，約42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個或50個)核苷酸的環(huán)狀寡核苷酸，其由具有式I-VII中任何一個或其任何組合的化學(xué)修飾進(jìn)行化學(xué)修飾，其中所述環(huán)狀寡核苷酸形成具有約19個堿基對和2個環(huán)的啞鈴形結(jié)構(gòu)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的環(huán)狀siNA分子包含2個環(huán)基序，其中所述siNA分子的1個或2個環(huán)部分是生物可降解的。例如，本發(fā)明的環(huán)狀siNA分子被這樣設(shè)計(jì)，從而使得siNA分子的環(huán)部分在體內(nèi)降解可以產(chǎn)生具有3′-末端突出端的雙鏈siNA分子，例如包含約2個核苷酸的3′-末端核苷酸突出端。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含至少一個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)脫堿基部分，例如具有式V的化合物
其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-鏈烯基、S-鏈烯基、N-鏈烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨?；?、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一個的基團(tuán)，其中任何一個可以包括在siNA分子的結(jié)構(gòu)中或充當(dāng)與siNA分子附著的點(diǎn)；R9是O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2。在一個實(shí)施方案中，R3和/或R7包含綴合物部分和接頭(例如，如本文所描述或本領(lǐng)域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接頭)。綴合物部分的非限制性例子包括關(guān)于細(xì)胞受體的配體，例如衍生自天然存在的蛋白質(zhì)配體的肽；蛋白質(zhì)定位序列，包括細(xì)胞ZIP編碼序列；抗體；核酸適體；維生素和其他輔因子，例如葉酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；膽固醇；類固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亞精胺。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含至少一個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)反向的脫堿基部分，例如具有式VI的化合物
其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11、R12和R13各自獨(dú)立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-鏈烯基、S-鏈烯基、N-鏈烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨?；NH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一個的基團(tuán)，其中任何一個可以包括在siNA分子的結(jié)構(gòu)中或充當(dāng)與siNA分子附著的點(diǎn)；R9是O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2，且R2、R3、R8或R13充當(dāng)與本發(fā)明的siNA分子附著的點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，R3和/或R7包含綴合物部分和接頭(例如，如本文所描述或本領(lǐng)域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接頭)。綴合物部分的非限制性例子包括關(guān)于細(xì)胞受體的配體，例如衍生自天然存在的蛋白質(zhì)配體的肽；蛋白質(zhì)定位序列，包括細(xì)胞ZIP編碼序列；抗體；核酸適體；維生素和其他輔因子，例如葉酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；膽固醇；類固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亞精胺。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含至少一個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)取代的聚烷基部分，例如具有式VII的化合物
其中每個n獨(dú)立地是1-12的整數(shù)，R1、R2和R3各自獨(dú)立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-鏈烯基、S-鏈烯基、N-鏈烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨?；NH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨?；?、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一個的基團(tuán)，其中任何一個可以包括在siNA分子的結(jié)構(gòu)中或充當(dāng)與siNA分子附著的點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，R3和/或R1包含綴合物部分和接頭(例如，如本文所描述或本領(lǐng)域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接頭)。綴合物部分的非限制性例子包括關(guān)于細(xì)胞受體的配體，例如衍生自天然存在的蛋白質(zhì)配體的肽；蛋白質(zhì)定位序列，包括細(xì)胞ZIP編碼序列；抗體；核酸適體；維生素和其他輔因子，例如葉酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；膽固醇；類固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亞精胺。
“ZIP編碼”序列意指涉及細(xì)胞拓?fù)?topogenic)信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)的任何肽或蛋白質(zhì)序列(參見例如Ray等人，2004，Science，306(1501)1505)。
雙鏈siNA分子內(nèi)的每個核苷酸可以獨(dú)立地具有包含式I-VIII中任何一個的結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的一個或多個核苷酸位置包含具有式I-VII中任何一個的結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾或本文的任何其他修飾。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的每個核苷酸位置包含具有式I-VII中任何一個的結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾或本文的任何其他修飾。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈siNA分子的1條或2條鏈的一個或多個核苷酸位置包含具有式I-VII中任何一個的結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾或本文的任何其他修飾。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈siNA分子的1條或2條鏈的每個核苷酸位置包含具有式I-VII中任何一個的結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾或本文的任何其他修飾。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有式VII的化合物，其中R1和R2是羥基(OH)，n＝1，且R3包含O且是與本發(fā)明的雙鏈siNA分子的1條或2條鏈的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端或者與本發(fā)明的單鏈siNA分子附著的點(diǎn)。這種修飾在本文中稱為“甘油基”(例如，

圖10中的修飾6)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的化學(xué)修飾的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII中任何一個的部分)在本發(fā)明的siNA分子的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端處。例如，化學(xué)修飾的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可以存在于siNA分子的反義鏈、有義鏈、或反義和有義鏈的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，化學(xué)修飾的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可以存在于本發(fā)明的雙鏈siNA分子的有義鏈的5′-末端和3′-末端以及反義鏈的3′-末端處。在一個實(shí)施方案中，化學(xué)修飾的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可以存在于本發(fā)明雙鏈siNA分子的有義鏈的5′-末端和3′-末端以及反義鏈的3′-末端的末端位置處。在一個實(shí)施方案中，化學(xué)修飾的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可以存在于本發(fā)明雙鏈siNA分子的有義鏈的5′-末端和3′-末端以及反義鏈的3′-末端的2個末端位置處。在一個實(shí)施方案中，化學(xué)修飾的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可以存在于本發(fā)明雙鏈siNA分子的有義鏈的5′-末端和3′-末端以及反義鏈的3′-末端的倒數(shù)第二位置處。此外，具有式VII的部分可以存在于如本文所描述的發(fā)夾siNA分子的3′-末端或5′-末端處。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含具有式V或VI的脫堿基殘基，其中具有式VI或VI的所述脫堿基殘基以3′-3′、3′-2′、2′-3′或5′-5′的構(gòu)型例如在1條或2條siNA鏈的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端處與siNA構(gòu)建體進(jìn)行連接。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含例如在siNA分子的5′-末端、3′-末端、5′和3′-末端、或其任何組合處的一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)鎖定核酸(LNA)核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含例如在siNA分子的5′-末端、3′-末端、5′和3′-末端、或其任何組合處的一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)4′-硫代核苷酸。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含例如在siNA分子的5′-末端、3′-末端、5′和3′-末端、或其任何組合處的一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)無環(huán)核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子包含有義鏈或有義區(qū)，其具有一個或多個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)、2′-脫氧-2′-氟、2′-脫氧、FANA、或脫堿基化學(xué)修飾或其任何組合。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子包含反義鏈或反義區(qū)，其具有一個或多個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)、2′-脫氧-2′-氟、2′-脫氧、FANA、或脫堿基化學(xué)修飾或其任何組合。
本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子包含有義鏈或有義區(qū)和反義鏈或反義區(qū)，其各自具有一個或多個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)、2′-脫氧-2′-氟、2′-脫氧、FANA、或脫堿基化學(xué)修飾或其任何組合。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含有義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述有義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含有義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述有義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是FANA嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是FANA嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是FANA嘧啶核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含反義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述反義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含有義區(qū)和反義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述有義區(qū)和反義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含有義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述有義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含反義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述反義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含有義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述有義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸)，且所述有義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含有義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述有義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述有義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸)，其中包含存在于所述有義區(qū)中的3′-末端核苷酸突出端的任何核苷酸是2′-脫氧核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含有義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述有義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述有義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含有義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述有義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述有義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，且其中包含存在于所述有義區(qū)中的3′-末端核苷酸突出端的任何核苷酸是2′-脫氧核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含反義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述反義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述反義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含反義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述反義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，其中所述反義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，且其中包含存在于所述反義區(qū)中的3′-末端核苷酸突出端的任何核苷酸是2′-脫氧核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含反義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述反義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述反義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含反義區(qū)的本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述反義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述反義區(qū)中存在的任何(例如，一個或多個或所有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于能夠在細(xì)胞或重構(gòu)的體外系統(tǒng)內(nèi)介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子，其包含有義區(qū)，其中所述有義區(qū)中存在的一個或多個嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且所述有義區(qū)中存在的一個或多個嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸)，和反義區(qū)，其中所述反義區(qū)中存在的一個或多個嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且所述反義區(qū)中存在的一個或多個嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。有義區(qū)和/或反義區(qū)可以具有末端帽修飾，例如本文描述或圖10中顯示的任何修飾，其任選存在于有義和/或反義序列的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端處。有義和/或反義區(qū)可以任選進(jìn)一步包含具有約1個-約4個(例如，約1個、2個、3個或4個)2′-脫氧核苷酸的3′-末端核苷酸突出端。突出端核苷酸可以進(jìn)一步包含一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個或更多)硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯和/或硫代膦酰乙酸酯核苷酸間鍵。這些化學(xué)修飾的siNAs的非限制性例子顯示于本文的圖4和5以及表III中。在這些描述的實(shí)施方案的任何一個中，有義區(qū)中存在的嘌呤核苷酸可替代地是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多個嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，且反義區(qū)中存在的一個或多個嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。同樣地，在這些實(shí)施方案的任何一個中，有義區(qū)中存在的一個或多個嘌呤核苷酸可替代地是嘌呤核糖核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是嘌呤核糖核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是嘌呤核糖核苷酸)，且反義區(qū)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。此外，在這些實(shí)施方案的任何一個中，有義區(qū)中存在和/或反義區(qū)中存在的一個或多個嘌呤核苷酸可替代地選自2′-脫氧核苷酸、鎖定核酸(LNA)核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、4′-硫代核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、和2′-O-甲基核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸選自2′-脫氧核苷酸、鎖定核酸(LNA)核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、4′-硫代核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、和2′-O-甲基核苷酸，或可替代地多個(即超過一個)嘌呤核苷酸選自2′-脫氧核苷酸、鎖定核酸(LNA)核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、4′-硫代核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、和2′-O-甲基核苷酸)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子中，優(yōu)選地在本發(fā)明的siNA分子的反義鏈中，但也任選在有義和/或反義和有義鏈中存在的任何經(jīng)修飾的核苷酸，包含具有與天然存在的核糖核苷酸類似的性質(zhì)或特征的經(jīng)修飾的核苷酸。例如，本發(fā)明的特征在于包括具有Northern構(gòu)型(例如，Northern假旋轉(zhuǎn)環(huán)(pseudorotation cycle)，參見例如Saenger，Principles of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag編輯，1984)的經(jīng)修飾的核苷酸的siNA分子，所述Northern構(gòu)型也稱為“核糖樣(ribo-like)”或“A型螺旋”構(gòu)型。照這樣，本發(fā)明的siNA分子中，優(yōu)選地在本發(fā)明的siNA分子的反義鏈中，但也任選在有義和/或反義和有義鏈中存在的化學(xué)修飾的核苷酸，對核酸酶降解有抗性同時(shí)維持介導(dǎo)RNAi的能力。具有northern構(gòu)型的核苷酸的非限制性例子包括鎖定核酸(LNA)核苷酸(例如，2′-O-，4′-C-亞甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)；2′-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸；2′-甲基-硫代-乙基，2′-脫氧-2′-氟核苷酸，2′-脫氧-2′-氯核苷酸，2′-疊氮核苷酸，2′-O-三氟甲基核苷酸，2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸，2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸，4′-硫代核苷酸、和2′-O-甲基核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈siNA分子的有義鏈包含末端帽部分，(參見例如圖10)例如在有義鏈的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端處的反向脫氧脫堿基部分。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于能夠在細(xì)胞或重構(gòu)的體外系統(tǒng)內(nèi)介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的化學(xué)修飾的短干擾核酸分子(siNA)，其中所述化學(xué)修飾包含與化學(xué)修飾的siNA分子共價(jià)附著的綴合物。由本發(fā)明預(yù)期的綴合物的非限制性例子包括在Vargeese等人，USSN10/427,160中描述的綴合物和配體，所述USSN 10/427,160于2003年4月30日提交，包括附圖整體引入本文作為參考。在另一個實(shí)施方案中，綴合物經(jīng)由生物可降解的接頭與化學(xué)修飾的siNA分子共價(jià)附著。在一個實(shí)施方案中，綴合物分子在化學(xué)修飾的siNA分子的有義鏈、反義鏈、或2條鏈的3′-末端處進(jìn)行附著。在另一個實(shí)施方案中，綴合物分子在化學(xué)修飾的siNA分子的有義鏈、反義鏈、或2條鏈的5′-末端處進(jìn)行附著。在另外一個實(shí)施方案中，綴合物分子在化學(xué)修飾的siNA分子的有義鏈、反義鏈、或2條鏈的3′-末端和5′-末端或其任何組合處進(jìn)行附著。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物分子包含促進(jìn)化學(xué)修飾的siNA分子遞送到生物系統(tǒng)例如細(xì)胞內(nèi)的分子。在另一個實(shí)施方案中，與化學(xué)修飾的siNA分子附著的綴合物分子是關(guān)于細(xì)胞受體的配體，例如衍生自天然存在的蛋白質(zhì)配體的肽；蛋白質(zhì)定位序列，包括細(xì)胞ZIP編碼序列；抗體；核酸適體；維生素和其他輔因子，例如葉酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；膽固醇；類固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亞精胺。由本發(fā)明預(yù)期的可以與化學(xué)修飾的siNA分子附著的具體綴合物分子的例子在Vargeese等人，美國系列號10/201,394中得到描述，所述美國系列號10/201,394于2002年7月22日提交，引入本文作為參考。本發(fā)明的siNA分子使用的綴合物類型和綴合程度可以就改善的藥物代謝動力學(xué)概況、生物利用率和/或siNA構(gòu)建體的穩(wěn)定性同時(shí)維持siNA介導(dǎo)RNAi活性的能力進(jìn)行評估。照這樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以篩選用各種綴合物進(jìn)行修飾的siNA構(gòu)建體，以確定siNA綴合物復(fù)合物是否具有改善的性質(zhì)同時(shí)維持介導(dǎo)RNAi的能力，例如在如本領(lǐng)域一般已知的動物模型中。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于本發(fā)明的短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA進(jìn)一步包含使siNA的有義區(qū)與siNA的反義區(qū)連接的核苷酸、非核苷酸、或混合的核苷酸/非核苷酸接頭。在一個實(shí)施方案中，核苷酸、非核苷酸、或混合的核苷酸/非核苷酸接頭用于例如使綴合物部分與siNA附著。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸接頭可以是長度≥2個核苷酸的接頭，例如長度約3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，核苷酸接頭可以是核酸適體。如本文所使用的，“適體”或“核酸適體”意指與HCV靶分子特異性結(jié)合的核酸分子，其中所述核酸分子具有包含在其天然背景中由HCV靶分子識別的序列的序列。可替代地，適體可以是與HCV靶分子結(jié)合的核酸分子，其中所述HCV靶分子不與核酸天然結(jié)合。HCV靶分子可以是任何目的分子。例如，適體可以用于與蛋白質(zhì)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而阻止天然存在的配體與蛋白質(zhì)的相互作用。這是非限制性例子，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到使用本領(lǐng)域一般已知的技術(shù)可以容易地產(chǎn)生其他實(shí)施方案。(參見，例如，Gold等人，1995，Annu.Rev.Biochem.，64，763；Brody和Gold，2000，J.Biotechnol.，74，5；Sun，2000，Curr.Opin.Mol.Ther.，2，100；Kusser，2000，J.Biotechnol.，74，27；Hermann和Patel，2000，Science，287，820；和Jayasena，1999，Clinical Chemistry，45，1628.) 在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的非核苷酸接頭包含脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質(zhì)、聚烴、或其他聚合化合物(例如聚乙二醇，例如具有2個-100個乙二醇單位的那些)。具體例子包括由下述參考文獻(xiàn)描述的那些Seela和Kaiser，Nucleic AcidsRes.1990，186353和Nucleic Acids Res.1987，153113；Cload和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.1991，1136324；Richardson和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.1991，1135109；Ma等人，Nucleic Acids Res.1993，212585和Biochemistry 1993，321751；Durand等人，Nucleic AcidsRes.1990，186353；McCurdy等人，Nucleosides & Nucleotides 1991，10287；Jschke等人，Tetrahedron Lett.1993，34301；Ono等人，Biochemistry 1991，309914；Arnold等人，國際公開號WO 89/02439；Usman等人，國際公開號WO 95/06731；Dudycz等人，國際公開號WO95/11910以及Ferentz和Verdine，J.Am.Chem.Soc.1991，1134000，全部引入本文作為參考。“非核苷酸”進(jìn)一步意指任何基團(tuán)或化合物，其可以摻入核酸鏈內(nèi)代替一個或多個核苷酸單位，包括糖和/或磷酸置換，且允許siNA分子保留RNAi活性或RNAi抑制以保留其抑制活性?；鶊F(tuán)或化合物可以是脫堿基的，因?yàn)樗话ǔ９J(rèn)的核苷酸堿基，例如腺苷、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，例如在糖的C1位置處。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于能夠在細(xì)胞或重構(gòu)的體外系統(tǒng)內(nèi)介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的短干擾核酸(siNA)分子，其中由2個分開的寡核苷酸裝配的siNA分子的1條或2條鏈不包含任何核糖核苷酸(例如，siNA分子的1條或2條鏈?zhǔn)?00％化學(xué)修飾的)。例如，siNA分子可以由單個寡核苷酸裝配，其中所述siNA的有義和反義區(qū)包含分開的寡核苷酸，其不具有寡核苷酸中存在的任何核糖核苷酸(例如，具有2′-OH基團(tuán)的核苷酸)。在另一個例子中，siNA分子可以由單個寡核苷酸裝配，其中siNA的有義和反義區(qū)通過如本文所描述的核苷酸或非核苷酸接頭進(jìn)行連接或環(huán)化，其中所述寡核苷酸不具有寡核苷酸中存在的任何核糖核苷酸(例如，具有2′-OH基團(tuán)的核苷酸)。申請人已驚訝地發(fā)現(xiàn)siNA分子內(nèi)核糖核苷酸(例如，具有2′-羥基的核苷酸)的存在并非支持RNAi活性所需或必需的。照這樣，在一個實(shí)施方案中，siNA內(nèi)的所有位置可以包括化學(xué)修飾的核苷酸和/或非核苷酸，例如具有式I、II、III、IV、V、VI或VII或其任何組合的核苷酸和或非核苷酸，其程度至siNA分子支持細(xì)胞中的RNAi活性的能力被維持。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子是在細(xì)胞或重構(gòu)的體外系統(tǒng)中介導(dǎo)RNAi活性的單鏈siNA分子，其包含與HCV靶核酸序列具有互補(bǔ)性的單鏈多核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈siNA分子包含5′-末端磷酸基。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈siNA分子包含5′-末端磷酸基和3′-末端磷酸基(例如，2′，3′-環(huán)磷酸)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈siNA分子包含約15個-約30個(例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸。在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈siNA分子包含一個或多個本文描述的化學(xué)修飾的核苷酸或非核苷酸。例如，siNA分子內(nèi)的所有位置可以包括化學(xué)修飾的核苷酸，例如具有式I-VII中的任何一個或其任何組合的核苷酸，其程度至siNA分子支持細(xì)胞中的RNAi活性的能力被維持。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子是在細(xì)胞或重構(gòu)的體外系統(tǒng)中介導(dǎo)RNAi活性或可替代地調(diào)節(jié)RNAi活性的單鏈siNA分子，其包含與HCV靶核酸序列具有互補(bǔ)性的單鏈多核苷酸，其中所述siNA中存在的一個或多個嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多個嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述反義區(qū)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多個嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，和末端帽修飾，例如本文描述或圖10中顯示的任何修飾，其任選存在于反義序列的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端處。siNA任選進(jìn)一步包含在siNA分子的3′-末端處的約1個-約4個或更多(例如，約1個、2個、3個、4個或更多)末端2′-脫氧核苷酸，其中所述末端核苷酸可以進(jìn)一步包含一個或多個(例如，1個、2個、3個、4個或更多)硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯和/或硫代膦酰乙酸酯核苷酸間鍵，且其中所述siNA任選進(jìn)一步包含末端磷酸基，例如5′-末端磷酸基。在這些實(shí)施方案的任何一個中，反義區(qū)中存在的任何嘌呤核苷酸可替代地是2′-脫氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸，或可替代地多個嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸)。同樣，在這些實(shí)施方案的任何一個中，siNA中存在的任何嘌呤核苷酸(即，有義和/或反義區(qū)中存在的嘌呤核苷酸)可以可替代地是鎖定核酸(LNA)核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是LNA核苷酸，或可替代地多個嘌呤核苷酸是LNA核苷酸)。同樣，在這些實(shí)施方案的任何一個中，siNA中存在的任何嘌呤核苷酸可替代地是2′-甲氧基乙基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-甲氧基乙基嘌呤核苷酸，或可替代地多個嘌呤核苷酸是2′-甲氧基乙基嘌呤核苷酸)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈siNA分子中存在的任何經(jīng)修飾的核苷酸包含具有與天然存在的核糖核苷酸類似的性質(zhì)或特征的經(jīng)修飾的核苷酸。例如，本發(fā)明的特征在于包括具有Northern構(gòu)型(例如，Northern假旋轉(zhuǎn)環(huán)，參見例如Saenger，Principles of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag編輯，1984)的經(jīng)修飾的核苷酸的siNA分子。照這樣，本發(fā)明的單鏈siNA分子中存在的化學(xué)修飾的核苷酸優(yōu)選對核酸酶降解有抗性同時(shí)維持介導(dǎo)RNAi的能力。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子包含具有2個或更多(例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)修飾或其任何組合的有義鏈或有義區(qū)。在另一個實(shí)施方案中，2′-O-烷基修飾在siNA的有義鏈或有義區(qū)中的交替位置處，例如位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20等。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子包含具有2個或更多(例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)修飾或其任何組合的反義鏈或反義區(qū)。在另一個實(shí)施方案中，2′-O-烷基修飾在siNA的反義鏈或反義區(qū)中的交替位置處，例如位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20等。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子包含有義鏈或有義區(qū)和反義鏈或反義區(qū)，其各自具有2個或更多(例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)、2′-脫氧-2′-氟、2′-脫氧、或脫堿基化學(xué)修飾或其任何組合。在另一個實(shí)施方案中，2′-O-烷基修飾在siNA的有義鏈或有義區(qū)中的交替位置處，例如位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20等。在另一個實(shí)施方案中，2′-O-烷基修飾在siNA的反義鏈或反義區(qū)中的交替位置處，例如位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20等。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含在siNA分子的1條或多條鏈或一個或多個區(qū)域內(nèi)的交替位置處的化學(xué)修飾的核苷酸或非核苷酸(例如，具有式I-VII中的任何一個，例如2′-脫氧、2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸)。例如，此種化學(xué)修飾可以在基于RNA的siNA分子每隔一個的位置處引入，起始于來自siNA的3′-末端或5′-末端的第一個或第二個核苷酸。在非限制性例子中，在其中siNA的每條鏈長度為21個核苷酸的本發(fā)明的雙鏈siNA分子的特征在于其中每條鏈的位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21是化學(xué)修飾的(例如，由具有式I-VII中的任何一個的化合物，例如2′-脫氧、2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸)。在另一個非限制性例子中，在其中siNA的每條鏈長度為21個核苷酸的本發(fā)明的雙鏈siNA分子的特征在于其中每條鏈的位置2、4、6、8、10、12、14、16、18和20是化學(xué)修飾的(例如，由具有式I-VII中的任何一個的化合物，例如2′-脫氧、2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸)。在一個實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子的一條鏈包含在位置2、4、6、8、10、12、14、16、18和20處的化學(xué)修飾，和在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21處的化學(xué)修飾。此種siNA分子可以進(jìn)一步包含如本文所描述的末端帽部分和/或主鏈修飾。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含下述特征如果嘌呤核苷酸存在于siNA分子的反義鏈或反義區(qū)(也稱為引導(dǎo)序列或引導(dǎo)鏈)的5′-末端處(例如，來自5′-末端的末端核苷酸位置1、2、3、4、5或6中的任何一個處)，那么此種嘌呤核苷酸是核糖核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，嘌呤核糖核苷酸當(dāng)存在時(shí)與siNA分子的有義鏈或有義區(qū)(也稱為過客鏈)的核苷酸堿基配對。此種嘌呤核糖核苷酸可以存在于另外包含經(jīng)修飾的核苷酸的siNA穩(wěn)定化基序中。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含下述特征如果嘧啶核苷酸存在于siNA分子的反義鏈或反義區(qū)(也稱為引導(dǎo)序列或引導(dǎo)鏈)的5′-末端處(例如，來自5′-末端的末端核苷酸位置1、2、3、4、5或6中的任何一個處)，那么此種嘧啶核苷酸是核糖核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，嘧啶核糖核苷酸當(dāng)存在時(shí)與siNA分子的有義鏈或有義區(qū)(也稱為過客鏈)的核苷酸堿基配對。此種嘧啶核糖核苷酸可以存在于另外包含經(jīng)修飾的核苷酸的siNA穩(wěn)定化基序中。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含下述特征如果嘧啶核苷酸存在于siNA分子的反義鏈或反義區(qū)(也稱為引導(dǎo)序列或引導(dǎo)鏈)的5′-末端處(例如，來自5′-末端的末端核苷酸位置1、2、3、4、5或6中的任何一個處)，那么此種嘧啶核苷酸是經(jīng)修飾的核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的嘧啶核糖核苷酸當(dāng)存在時(shí)與siNA分子的有義鏈或有義區(qū)(也稱為過客鏈)的核苷酸堿基配對。經(jīng)修飾的嘧啶核苷酸的非限制性例子包括具有式I-VII中的任何一個的那些，例如2′-脫氧、2′-脫氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SI的雙鏈核酸分子B——NX3———(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——[N]X5-5′ SI 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表其中存在時(shí)的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2′-O-甲基核苷酸、2′-脫氧核糖核苷酸、或2′-脫氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的組合； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2′-脫氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脫氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的組合；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SII的雙鏈核酸分子B——NX3———(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——[N]X5-5′ SII 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表其中存在時(shí)的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是核糖核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SIII的雙鏈核酸分子B——NX3———(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——[N]X5-5′ SIII 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表其中存在時(shí)的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SIV的雙鏈核酸分子B——NX3———(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——[N]X5-5′SIV 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表其中存在時(shí)的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是脫氧核糖核苷酸；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SV的雙鏈核酸分子B——NX3———(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——[N]X5-5′ SV 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表其中存在時(shí)的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖樣構(gòu)型(例如，Northern或A型螺旋構(gòu)型)的核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖樣構(gòu)型(例如，Northern或A型螺旋構(gòu)型)的核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SVI的雙鏈核酸分子B——NX3———(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——[N]X5-5′ SVI 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表包含使得反義鏈(下部鏈)的5′-末端比有義鏈(上部鏈)的5′-末端更不熱穩(wěn)定的序列的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2′-O-甲基核苷酸、2′-脫氧核糖核苷酸、或2′-脫氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的組合； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2′-脫氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脫氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的組合；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SVII的雙鏈核酸分子B——NX3——(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——-5′ SVII 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表非堿基配對或突出端核苷酸； X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，NX3與NX4互補(bǔ)，且任何(N)核苷酸是2′-O-甲基和/或2′-脫氧-2′-氟核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SVIII的雙鏈核酸分子
其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表包含使得反義鏈(下部鏈)的5′-末端比有義鏈(上部鏈)的5′-末端更不熱穩(wěn)定的序列的核苷酸位置；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約15的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；X6是約1-約4的整數(shù)；X7是約9-約15的整數(shù)；NX7、NX6和NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2′-O-甲基核苷酸、2′-脫氧核糖核苷酸、或2′-脫氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的組合； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸除[N]核苷酸外是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸除[N]核苷酸外獨(dú)立地是2′-脫氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脫氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的組合；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SIX的雙鏈核酸分子B——NX3———(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——[N]X5-5′ SIX 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2′-O-甲基核苷酸、2′-脫氧核糖核苷酸、或2′-脫氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的組合； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2′-脫氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脫氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的組合；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SX的雙鏈核酸分子B——NX3———(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——[N]X5-5′ SX 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是核糖核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SXI的雙鏈核酸分子B——NX3———(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——[N]X5-5′ SXI 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SXII的雙鏈核酸分子B——NX3———(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——[N]X5-5′SXII 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是脫氧糖核苷酸；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SXIII的雙鏈核酸分子B——NX3———(N)X2 B-3′ B(N)X1——NX4——[N]X5-5′ SXIII 其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約30的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖樣構(gòu)型(例如，Northern或A型螺旋構(gòu)型)的核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖樣構(gòu)型(例如，Northern或A型螺旋構(gòu)型)的核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有結(jié)構(gòu)SXIV的雙鏈核酸分子
其中每個N獨(dú)立地是可以是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸；每個B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修飾或化學(xué)修飾的非堿基配對或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2獨(dú)立地是約0-約4的整數(shù)；X3是約9-約15的整數(shù)；X4是約11-約30的整數(shù)，前提是X4和X5的和為17-36；X5是約1-約6的整數(shù)；X6是約1-約4的整數(shù)；X7是約9-約15的整數(shù)；NX7、NX6和NX3與NX4和NX5互補(bǔ)，且 (a)反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反義鏈(下部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2′-O-甲基核苷酸、2′-脫氧核糖核苷酸、或2′-脫氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的組合； (b)有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘧啶核苷酸除[N]核苷酸外是2′-脫氧-2′-氟核苷酸；有義鏈(上部鏈)中存在的任何嘌呤核苷酸除[N]核苷酸外獨(dú)立地是2′-脫氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脫氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的組合；和 (c)任何(N)核苷酸任選是2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟或脫氧核糖核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含在核酸分子的反義鏈或反義區(qū)的5′-末端處的末端磷酸基。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含X5＝1、2或3；X1和X2各自＝1或2；X3＝12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和X4＝15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含X5＝1；X1和X2各自＝2；X3＝19，和X4＝18。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含X5＝2；X1和X2各自＝2；X3＝19，和X4＝17。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含X5＝3；X1和X2各自＝2；X3＝19，和X4＝16。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含在有義鏈或有義區(qū)的3′和5′-末端處的B。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含在反義鏈或反義區(qū)的3′-末端處的B。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含在有義鏈或有義區(qū)的3′和5′-末端處的B以及在反義鏈或反義區(qū)的3′-末端處的B。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子進(jìn)一步包含在核酸分子的有義鏈、反義鏈、或有義鏈和反義鏈的3′末端上的第一個末端(N)處的一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。例如，雙鏈核酸分子可以包含具有含硫代磷酸酯核苷酸間鍵的突出端核苷酸位置的X1和/或X2＝2，例如(NsN)其中“s”指示硫代磷酸酯。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含是2′-O-甲基核苷酸的(N)核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含是2′-脫氧核苷酸的(N)核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含在反義鏈(下部鏈)中的(N)核苷酸，其與靶多核苷酸序列(例如，HCV靶和/或HCV途徑/宿主靶序列)中的核苷酸互補(bǔ)，所述靶多核苷酸序列中的核苷酸與反義(下部)鏈的N和[N]核苷酸具有互補(bǔ)性。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含在有義鏈(上部鏈)中的(N)核苷酸，其包含靶多核苷酸序列(例如，HCV靶和/或HCV途徑/宿主靶序列)的約15個-約30個核苷酸的鄰接核苷酸序列。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含在有義鏈(上部鏈)中的(N)核苷酸，其包含對應(yīng)與反義(下部)鏈具有互補(bǔ)性的靶多核苷酸序列(例如，HCV靶和/或HCV途徑/宿主靶序列)的核苷酸序列，從而使得有義鏈的鄰接(N)和N核苷酸序列包含靶核酸序列(例如，HCV靶和/或HCV途徑/宿主靶序列)的核苷酸序列。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SVIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含僅在雙鏈核酸分子的有義(上部)鏈的5′-末端處的B。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXII、SXIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子進(jìn)一步包含在反義(下部)鏈的5′-末端處非配對的末端核苷酸。非配對的核苷酸不與有義(上部)鏈互補(bǔ)。在一個實(shí)施方案中，非配對的末端核苷酸與靶多核苷酸序列互補(bǔ)，所述靶多核苷酸序列與反義(下部)鏈的N和[N]核苷酸具有互補(bǔ)性。在另一個實(shí)施方案中，非配對的末端核苷酸不與靶多核苷酸序列互補(bǔ)，所述靶多核苷酸序列與反義(下部)鏈的N和[N]核苷酸具有互補(bǔ)性。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SVIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含X6＝1和X3＝10。
在一個實(shí)施方案中，具有結(jié)構(gòu)SVIII或SXIV中的任何一個的雙鏈核酸分子包含X6＝2和X3＝9。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含配制為表VI中所示的任何制劑的siNA分子或雙鏈核酸分子或RNAi抑制劑的組合物，例如LNP-051；LNP-053；LNP-054；LNP-069；LNP-073；LNP-077；LNP-080；LNP-082；LNP-083；LNP-060；LNP-061；LNP-086；LNP-097；LNP-098；LNP-099；LNP-100；LNP-101；LNP-102；LNP-103；或LNP-104(參見表VI)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含各自具有彼此互補(bǔ)的第一條鏈和第二條鏈的第一種雙鏈核酸和第二種雙鏈核酸分子的組合物，其中所述第一種雙鏈核酸分子的第二條鏈包含與第一種靶序列互補(bǔ)的序列，且所述第二種雙鏈核酸分子的第二條鏈包含與第二種靶或途徑靶序列互補(bǔ)的序列。在一個實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)和聚乙二醇-綴合物。在一個實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、聚乙二醇-綴合物和膽固醇。在一個實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含聚乙二醇-綴合物、膽固醇和表面活性劑。在一個實(shí)施方案中，陽離子脂質(zhì)選自CLinDMA、pCLinDMA、eCLinDMA、DMOBA和DMLBA。在一個實(shí)施方案中，中性脂質(zhì)選自DSPC、DOBA和膽固醇。在一個實(shí)施方案中，聚乙二醇-綴合物選自PEG-二肉豆蔻酰甘油和PEG-膽固醇。在一個實(shí)施方案中，PEG是2KPEG。在一個實(shí)施方案中，表面活性劑選自棕櫚醇、十八烷醇、油醇和亞油醇(linoleyl alcohol)。在一個實(shí)施方案中，陽離子脂質(zhì)是CLinDMA，中性脂質(zhì)是DSPC，聚乙二醇綴合物是2KPEG-DMG，膽固醇是膽固醇，且表面活性劑是亞油醇。在一個實(shí)施方案中，CLinDMA、DSPC、2KPEG-DMG、膽固醇和亞油醇分別以43∶38∶10∶2∶7的摩爾比存在。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含各自具有彼此互補(bǔ)的第一條鏈和第二條鏈的第一種雙鏈核酸和第二種雙鏈核酸分子的組合物，其中所述第一種雙鏈核酸分子的第二條鏈包含與具有SEQ ID NO1444的HCV序列互補(bǔ)的序列，且所述第二種雙鏈核酸分子的第二條鏈包含與具有SEQ ID NO1417的HCV序列互補(bǔ)的序列。在一個實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)和聚乙二醇-綴合物。在一個實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、聚乙二醇-綴合物和膽固醇。在一個實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含聚乙二醇-綴合物、膽固醇和表面活性劑。在一個實(shí)施方案中，陽離子脂質(zhì)選自CLinDMA、pCLinDMA、eCLinDMA、DMOBA和DMLBA。在一個實(shí)施方案中，中性脂質(zhì)選自DSPC、DOBA和膽固醇。在一個實(shí)施方案中，聚乙二醇-綴合物選自PEG-二肉豆蔻酰甘油和PEG-膽固醇。在一個實(shí)施方案中，PEG是2KPEG。在一個實(shí)施方案中，表面活性劑選自棕櫚醇、十八烷醇、油醇和亞油醇。在一個實(shí)施方案中，陽離子脂質(zhì)是CLinDMA，中性脂質(zhì)是DSPC，聚乙二醇綴合物是2KPEG-DMG，膽固醇是膽固醇，且表面活性劑是亞油醇。在一個實(shí)施方案中，CLinDMA、DSPC、2KPEG-DMG、膽固醇和亞油醇分別以43∶38∶10∶2∶7的摩爾比存在。在一個實(shí)施方案中，第一種雙鏈核酸分子的第一條鏈和第二條鏈分別包含SEQ IDNOs1796和2010，且第二種雙鏈核酸分子的第一條鏈和第二條鏈分別包含SEQ ID NOs1677和2011。在一個實(shí)施方案中，第一種雙鏈核酸分子的第一條鏈和第二條鏈分別包含SEQ ID NOs1796和2012，且第二種雙鏈核酸分子的第一條鏈和第二條鏈分別包含SEQ ID NOs1677和2013。在一個實(shí)施方案中，第一種雙鏈核酸分子的第一條鏈和第二條鏈分別包含SEQ ID NOs1796和2102，且第二種雙鏈核酸分子的第一條鏈和第二條鏈分別包含SEQ ID NOs1677和2103。
在本文的任何一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子經(jīng)由RNA干擾或RNA干擾的抑制調(diào)節(jié)一種或多種靶的表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，RNA干擾是RISC介導(dǎo)的靶的切割(例如，siRNA介導(dǎo)的RNA干擾)。在一個實(shí)施方案中，RNA干擾是靶的翻譯抑制(例如，miRNA介導(dǎo)的RNA干擾)。在一個實(shí)施方案中，RNA干擾是靶的轉(zhuǎn)錄抑制(例如，siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默)。在一個實(shí)施方案中，RNA干擾在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生。在一個實(shí)施方案中，RNA干擾在核中發(fā)生。
在本文的任何一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子經(jīng)由內(nèi)源靶RNA例如內(nèi)源mRNA、siRNA、miRNA的抑制，或可替代地通過RISC的抑制調(diào)節(jié)一種或多種靶的表達(dá)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于通過miRNA抑制、siRNA抑制、或RISC抑制調(diào)節(jié)一種或多種基因靶的表達(dá)的一種或多種RNAi抑制劑。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNAi抑制劑是如本文所描述的siNA分子，其具有與一種或多種靶miRNA或siRNA分子互補(bǔ)的一條或多條鏈。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNAi抑制劑是與靶miRNA或siRNA分子或其部分互補(bǔ)的反義分子。本發(fā)明的反義RNAi抑制劑可以具有長度為約10個-約40個核苷酸的長度(例如長度為10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個或40個核苷酸)。本發(fā)明的反義RNAi抑制劑可以包含如本文所描述的一個或多個經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸(參見例如具有本文的式I-VII中任何一個或其任何組合的分子)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義RNAi抑制劑可以包含一個或多個或所有2′-O-甲基核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義RNAi抑制劑可以包含一個或多個或所有2′-脫氧-2′-氟核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義RNAi抑制劑可以包含一個或多個或所有2′-O-甲氧基-乙基(也稱為2′-甲氧基乙氧基或MOE)核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義RNAi抑制劑可以包含一個或多個或所有硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義RNAi抑制劑可以包含在反義RNAi抑制劑的3′-末端、5′-末端、或5′和3′末端處的末端帽部分。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNAi抑制劑是對于RISC具有結(jié)合親和力的核酸適體，例如可調(diào)節(jié)的適體(參見例如An等人，2006，RNA，12710-716)。本發(fā)明的適體RNAi抑制劑可以具有長度為約10個-約50個核苷酸的長度(例如長度為10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個或50個核苷酸)。本發(fā)明的適體RNAi抑制劑可以包含如本文所描述的一個或多個經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸(參見例如具有本文的式I-VII中任何一個或其任何組合的分子)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的適體RNAi抑制劑可以包含一個或多個或所有2′-O-甲基核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的適體RNAi抑制劑可以包含一個或多個或所有2′-脫氧-2′-氟核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的適體RNAi抑制劑可以包含一個或多個或所有2′-O-甲氧基-乙基(也稱為2′-甲氧基乙氧基或MOE)核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的適體RNAi抑制劑可以包含一個或多個或所有硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的適體RNAi抑制劑可以包含在適體RNAi抑制劑的3′-末端、5′-末端、或5′和3′末端處的末端帽部分。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾或未修飾的，其中所述siNA鏈之一包含與HCV靶基因的RNA互補(bǔ)的序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入細(xì)胞內(nèi)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾或未修飾的，其中所述siNA鏈之一包含與HCV靶基因的RNA互補(bǔ)的序列，且其中所述siNA的有義鏈序列包含與HCV靶RNA的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入細(xì)胞內(nèi)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的超過一種HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾或未修飾的，其中所述siNA鏈之一包含與HCV靶基因的RNA互補(bǔ)的序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入細(xì)胞內(nèi)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的2種或更多HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的一種或多種siNA分子，其可以是化學(xué)修飾或未修飾的，其中所述siNA鏈包含與HCV靶基因的RNA互補(bǔ)的序列，且其中所述siNA的有義鏈序列包含與HCV靶RNAs的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入細(xì)胞內(nèi)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的超過一種HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾或未修飾的，其中所述siNA鏈包含與HCV靶基因的RNA互補(bǔ)的序列，且其中所述siNA的有義鏈序列包含與HCV靶RNAs的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入細(xì)胞內(nèi)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾或未修飾的，其中所述siNA鏈之一包含與靶基因的RNA互補(bǔ)的序列，其中所述siNA的有義鏈序列包含與靶RNA的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞中的靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入細(xì)胞內(nèi)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子用作先體外后體內(nèi)應(yīng)用中的試劑。例如，為了療效將siNA試劑引入移植到受試者內(nèi)的組織或細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞和/或組織可以得自隨后接受外植體的生物或受試者，或可以得自移植前的另一種生物或受試者。siNA分子可以用于調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織中的一種或多種基因的表達(dá)，從而使得細(xì)胞或組織獲得所需表型或當(dāng)體內(nèi)移植時(shí)能夠執(zhí)行功能。在一個實(shí)施方案中，從患者中提取某些靶細(xì)胞(例如肝細(xì)胞)。在適合于經(jīng)由這些細(xì)胞攝取siNAs的條件下(例如，使用遞送試劑例如陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體等，或使用技術(shù)例如電穿孔以促進(jìn)siNAs遞送到細(xì)胞內(nèi))，使這些提取的細(xì)胞與靶向細(xì)胞內(nèi)的特定核苷酸序列的siNAs接觸。隨后將細(xì)胞再引回到相同患者或其他患者內(nèi)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)組織外植體(例如，肝或如可以從一個生物移植給另一個或移植回器官、組織或細(xì)胞從中獲得的相同生物的任何其他器官、組織或細(xì)胞)中的靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA鏈之一包含與靶基因的RNA互補(bǔ)的序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)組織外植體中的靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入得自特定生物的組織外植體的細(xì)胞內(nèi)。在另一個實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)那種生物中的靶基因表達(dá)的條件下，將組織外植體引回到組織從中獲得的生物內(nèi)或另一個生物內(nèi)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)組織外植體(例如，肝或如可以從一個生物移植給另一個或移植回器官、組織或細(xì)胞從中獲得的相同生物的任何其他器官、組織或細(xì)胞)中的靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA鏈之一包含與靶基因的RNA互補(bǔ)的序列，且其中所述siNA的有義鏈序列包含與靶RNA的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)組織外植體中的靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入得自特定生物的組織外植體的細(xì)胞內(nèi)。在另一個實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)那種生物中的靶基因表達(dá)的條件下，將組織外植體引回到組織從中獲得的生物內(nèi)或另一個生物內(nèi)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)組織外植體(例如，肝或如可以從一個生物移植給另一個或移植回器官、組織或細(xì)胞從中獲得的相同生物的任何其他器官、組織或細(xì)胞)中的超過一種靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA鏈之一包含與靶基因的RNA互補(bǔ)的序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)組織外植體中的靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入得自特定生物的組織外植體的細(xì)胞內(nèi)。在另一個實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)那種生物中的靶基因表達(dá)的條件下，將組織外植體引回到組織從中獲得的生物或另一個生物內(nèi)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)受試者或生物中的靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA鏈之一包含與靶基因的RNA互補(bǔ)的序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)受試者或生物中的靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入受試者或生物內(nèi)。靶蛋白或RNA的水平可以使用本領(lǐng)域眾所周知的各種方法進(jìn)行測定。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)受試者或生物中的超過一種靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA鏈之一包含與靶基因的RNA互補(bǔ)的序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)受試者或生物中的靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入受試者或生物內(nèi)。靶蛋白或RNA的水平可以如本領(lǐng)域已知的進(jìn)行測定。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于調(diào)節(jié)細(xì)胞(例如，肝細(xì)胞)內(nèi)的靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA包含與靶基因的RNA具有互補(bǔ)性的單鏈序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞中的靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入細(xì)胞內(nèi)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于調(diào)節(jié)細(xì)胞(例如，肝細(xì)胞)內(nèi)的超過一種HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA包含與HCV靶基因的RNA具有互補(bǔ)性的單鏈序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，使細(xì)胞在體外或體內(nèi)與siNA分子接觸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)組織外植體((例如，肝或如可以從一個生物移植給另一個或移植回器官、組織或細(xì)胞從中獲得的相同生物的任何其他器官、組織或細(xì)胞)中的HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA包含與HCV靶基因的RNA具有互補(bǔ)性的單鏈序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)組織外植體中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，使得自特定受試者或生物的組織外植體的細(xì)胞與siNA分子接觸。在另一個實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)那種受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，將組織外植體引回到組織從中獲得的受試者或生物內(nèi)或另一個受試者或生物內(nèi)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)組織外植體(例如，肝或如可以從一個生物移植給另一個或移植回器官、組織或細(xì)胞從中獲得的相同生物的任何其他器官、組織或細(xì)胞)中的超過一種HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA包含與HCV靶基因的RNA具有互補(bǔ)性的單鏈序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)組織外植體中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入得自特定受試者或生物的組織外植體的細(xì)胞內(nèi)。在另一個實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)那種受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，將組織外植體引回到組織從中獲得的受試者或生物內(nèi)或另一個受試者或生物內(nèi)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA包含與HCV靶基因的RNA具有互補(bǔ)性的單鏈序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入受試者或生物內(nèi)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)受試者或生物中的超過一種HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA包含與HCV靶基因的RNA具有互補(bǔ)性的單鏈序列；和(b)在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入受試者或生物內(nèi)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防與受試者或生物中的基因表達(dá)或活性相關(guān)的疾病、病癥、性狀或狀況的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)受試者或生物中的靶基因表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸?；虮磉_(dá)的減少和因此各自蛋白質(zhì)/RNA水平中的減少在某種程度上減輕了疾病、病癥、性狀或狀況的癥狀。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者或生物中的HCV感染的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，由此可以達(dá)到HCV感染的治療或預(yù)防。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞例如肝細(xì)胞和組織的局部施用，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞的全身施用(例如經(jīng)由siNA的靜脈內(nèi)或皮下施用)使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，所述組織或細(xì)胞例如涉及受試者或生物中的HCV感染的維持或發(fā)展的組織或細(xì)胞。本發(fā)明的siNA分子可以如本文描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的進(jìn)行配制或綴合，以靶向受試者或生物中的合適組織或細(xì)胞。siNA分子可以與本領(lǐng)域已知的其他治療性處理和方式組合，用于治療或預(yù)防受試者或生物中的HCV感染。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者或生物中的肝衰竭或狀況的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，由此可以達(dá)到肝衰竭或狀況的治療或預(yù)防。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞例如涉及肝衰竭的肝細(xì)胞和組織的局部施用，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞的全身施用(例如經(jīng)由siNA的靜脈內(nèi)或皮下施用)使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，所述組織或細(xì)胞例如涉及受試者或生物中的肝衰竭或狀況的維持或發(fā)展的組織或細(xì)胞。本發(fā)明的siNA分子可以如本文描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的進(jìn)行配制或綴合，以靶向受試者或生物中的合適組織或細(xì)胞。siNA分子可以與本領(lǐng)域已知的其他治療性處理和方式組合，用于治療或預(yù)防受試者或生物中的肝衰竭、性狀、病癥或狀況。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者或生物中的肝細(xì)胞癌的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，由此可以達(dá)到肝細(xì)胞癌的治療或預(yù)防。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞例如涉及肝細(xì)胞癌的肝細(xì)胞和組織的局部施用，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞的全身施用(例如經(jīng)由siNA的靜脈內(nèi)或皮下施用)使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，所述組織或細(xì)胞例如涉及受試者或生物中的肝細(xì)胞癌的維持或發(fā)展的組織或細(xì)胞。本發(fā)明的siNA分子可以如本文描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的進(jìn)行配制或綴合，以靶向受試者或生物中的合適組織或細(xì)胞。siNA分子可以與本領(lǐng)域已知的其他治療性處理和方式組合，用于治療或預(yù)防受試者或生物中的肝細(xì)胞癌。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者或生物中的肝硬化、病癥、性狀或狀況的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，由此可以達(dá)到肝硬化、病癥、性狀或狀況的治療或預(yù)防。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞例如涉及肝硬化、病癥、性狀或狀況的細(xì)胞和組織的局部施用，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞的全身施用(例如經(jīng)由siNA的靜脈內(nèi)或皮下施用)使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，所述組織或細(xì)胞例如涉及受試者或生物中的肝硬化、病癥、性狀或狀況的維持或發(fā)展的組織或細(xì)胞。本發(fā)明的siNA分子可以如本文描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的進(jìn)行配制或綴合，以靶向受試者或生物中的合適組織或細(xì)胞。siNA分子可以與本領(lǐng)域已知的其他治療性處理和方式組合，用于治療或預(yù)防受試者或生物中的肝硬化、病癥、性狀或狀況。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者或生物中的HCV感染的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)受試者或生物中的HCV基因表達(dá)的抑制劑表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者或生物中的肝衰竭的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)受試者或生物中的HCV基因表達(dá)的抑制劑表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者或生物中的肝細(xì)胞癌的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)受試者或生物中的HCV基因表達(dá)的抑制劑表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者或生物中的肝硬化的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)受試者或生物中的HCV基因表達(dá)的抑制劑表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與本發(fā)明的siNA分子組合的PEG干擾素；其中PEG干擾素和siNA分子在這樣的條件下施用，與未用PEG干擾素和siNA分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與本發(fā)明的siNA分子組合的病毒唑；其中病毒唑和siNA在這樣的條件下施用，與未用病毒唑和siNA分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子或雙鏈核酸分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與本發(fā)明的siNA分子組合的PEG干擾素和病毒唑；其中PEG干擾素和病毒唑以及siNA分子在這樣的條件下施用，與未用PEG干擾素和病毒唑以及siNA分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子或雙鏈核酸分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與化學(xué)合成的雙鏈核酸分子組合的PEG干擾素；其中(a)雙鏈核酸分子包含有義鏈和反義鏈；(b)雙鏈核酸分子的每條鏈長度為15個-28個核苷酸；(c)有義鏈的至少15個核苷酸與反義鏈互補(bǔ)；(d)雙鏈核酸分子的反義鏈與丙型肝炎病毒(HCV)HCV靶RNA具有互補(bǔ)性；且其中PEG干擾素和雙鏈核酸分子在這樣的條件下施用，與未用PEG干擾素和雙鏈核酸分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子或雙鏈核酸分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與化學(xué)合成的雙鏈核酸分子組合的病毒唑；其中(a)雙鏈核酸分子包含有義鏈和反義鏈；(b)雙鏈核酸分子的每條鏈長度為15個-28個核苷酸；(c)有義鏈的至少15個核苷酸與反義鏈互補(bǔ)；(d)雙鏈核酸分子的反義鏈與丙型肝炎病毒(HCV)HCV靶RNA具有互補(bǔ)性；且其中病毒唑和雙鏈核酸分子在這樣的條件下施用，與未用病毒唑和雙鏈核酸分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子或雙鏈核酸分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與化學(xué)合成的雙鏈核酸分子組合的PEG干擾素和病毒唑；其中(a)雙鏈核酸分子包含有義鏈和反義鏈；(b)雙鏈核酸分子的每條鏈長度為15個-28個核苷酸；(c)有義鏈的至少15個核苷酸與反義鏈互補(bǔ)；(d)雙鏈核酸分子的反義鏈與丙型肝炎病毒(HCV)HCV靶RNA具有互補(bǔ)性；且其中PEG干擾素和病毒唑以及雙鏈核酸分子在這樣的條件下施用，與未用PEG干擾素和病毒唑以及雙鏈核酸分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子或雙鏈核酸分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與化學(xué)合成的雙鏈核酸分子組合的PEG干擾素；其中(a)雙鏈核酸分子包含有義鏈和反義鏈；(b)雙鏈核酸分子的每條鏈長度為15個-28個核苷酸；(c)有義鏈的至少15個核苷酸與反義鏈互補(bǔ)；(d)雙鏈核酸分子的反義鏈與丙型肝炎病毒(HCV)HCV靶RNA具有互補(bǔ)性；(e)雙鏈核酸分子的每條鏈的至少20％內(nèi)部核苷酸是具有化學(xué)修飾的經(jīng)修飾的核苷；和(f)至少2個化學(xué)修飾彼此不同，且其中PEG干擾素和雙鏈核酸分子在這樣的條件下施用，與未用PEG干擾素和雙鏈核酸分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子或雙鏈核酸分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與化學(xué)合成的雙鏈核酸分子組合的病毒唑；其中(a)雙鏈核酸分子包含有義鏈和反義鏈；(b)雙鏈核酸分子的每條鏈長度為15個-28個核苷酸；(c)有義鏈的至少15個核苷酸與反義鏈互補(bǔ)；(d)雙鏈核酸分子的反義鏈與丙型肝炎病毒(HCV)HCV靶RNA具有互補(bǔ)性；(e)雙鏈核酸分子的每條鏈的至少20％內(nèi)部核苷酸是具有化學(xué)修飾的經(jīng)修飾的核苷；和(f)至少2個化學(xué)修飾彼此不同，且其中病毒唑和雙鏈核酸分子在這樣的條件下施用，與未用病毒唑和雙鏈核酸分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子或雙鏈核酸分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與化學(xué)合成的雙鏈核酸分子組合的PEG干擾素和病毒唑；其中(a)雙鏈核酸分子包含有義鏈和反義鏈；(b)雙鏈核酸分子的每條鏈長度為15個-28個核苷酸；(c)有義鏈的至少15個核苷酸與反義鏈互補(bǔ)；(d)雙鏈核酸分子的反義鏈與丙型肝炎病毒(HCV)HCV靶RNA具有互補(bǔ)性；(e)雙鏈核酸分子的每條鏈的至少20％內(nèi)部核苷酸是具有化學(xué)修飾的經(jīng)修飾的核苷；和(f)至少2個化學(xué)修飾彼此不同，且其中PEG干擾素和病毒唑以及雙鏈核酸分子在這樣的條件下施用，與未用PEG干擾素和病毒唑以及雙鏈核酸分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子或雙鏈核酸分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與化學(xué)合成的雙鏈核酸分子組合的PEG干擾素；其中(a)雙鏈核酸分子包含有義鏈和反義鏈；(b)雙鏈核酸分子的每條鏈長度為15個-28個核苷酸；(c)有義鏈的至少15個核苷酸與反義鏈互補(bǔ)；(d)雙鏈核酸分子的反義鏈與丙型肝炎病毒(HCV)HCV靶RNA具有互補(bǔ)性；(e)雙鏈核酸分子的每條鏈的至少20％內(nèi)部核苷酸是具有糖修飾的經(jīng)修飾的核苷；和(f)至少2個糖修飾彼此不同，且其中PEG干擾素和雙鏈核酸分子在這樣的條件下施用，與未用PEG干擾素和雙鏈核酸分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子或雙鏈核酸分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與化學(xué)合成的雙鏈核酸分子組合的病毒唑；其中(a)雙鏈核酸分子包含有義鏈和反義鏈；(b)雙鏈核酸分子的每條鏈長度為15個-28個核苷酸；(c)有義鏈的至少15個核苷酸與反義鏈互補(bǔ)；(d)雙鏈核酸分子的反義鏈與丙型肝炎病毒(HCV)HCV靶RNA具有互補(bǔ)性；(e)雙鏈核酸分子的每條鏈的至少20％內(nèi)部核苷酸是具有糖修飾的經(jīng)修飾的核苷；和(f)至少2個糖修飾彼此不同，且其中病毒唑和雙鏈核酸分子在這樣的條件下施用，與未用病毒唑和雙鏈核酸分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子或雙鏈核酸分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括給受試者施用與化學(xué)合成的雙鏈核酸分子組合的PEG干擾素和病毒唑；其中(a)雙鏈核酸分子包含有義鏈和反義鏈；(b)雙鏈核酸分子的每條鏈長度為15個-28個核苷酸；(c)有義鏈的至少15個核苷酸與反義鏈互補(bǔ)；(d)雙鏈核酸分子的反義鏈與丙型肝炎病毒(HCV)HCV靶RNA具有互補(bǔ)性；(e)雙鏈核酸分子的每條鏈的至少20％內(nèi)部核苷酸是具有糖修飾的經(jīng)修飾的核苷；和(f)至少2個糖修飾彼此不同，且其中PEG干擾素和病毒唑以及雙鏈核酸分子在這樣的條件下施用，與未用PEG干擾素和病毒唑以及雙鏈核酸分子治療的受試者比較，所述條件適合于減少或抑制受試者中的丙型肝炎病毒(HCV)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子或雙鏈核酸分子配制為下述專利中描述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531和于2005年7月29日提交的相關(guān)的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者或生物中的神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病、病癥、性狀或狀況的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，由此可以達(dá)到神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病、病癥、性狀或狀況的治療或預(yù)防。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞例如涉及神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病、病癥、性狀或狀況的細(xì)胞和組織的局部施用，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞的全身施用(例如經(jīng)由siNA的靜脈內(nèi)或皮下施用)使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，所述組織或細(xì)胞例如涉及受試者或生物中的神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病、病癥、性狀或狀況的維持或發(fā)展的組織或細(xì)胞。本發(fā)明的siNA分子可以如本文描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的進(jìn)行配制或綴合，以靶向受試者或生物中的合適組織或細(xì)胞。siNA分子可以與本領(lǐng)域已知的其他治療性處理和方式組合，用于治療或預(yù)防受試者或生物中的神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病、病癥、性狀或狀況。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者或生物中的代謝疾病、病癥、性狀或狀況的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，由此可以達(dá)到代謝疾病、病癥、性狀或狀況的治療或預(yù)防。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞例如涉及代謝疾病、病癥、性狀或狀況的細(xì)胞和組織的局部施用，使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由給相關(guān)組織或細(xì)胞的全身施用(例如經(jīng)由siNA的靜脈內(nèi)或皮下施用)使受試者或生物與本發(fā)明的siNA分子接觸，所述組織或細(xì)胞例如涉及受試者或生物中的代謝疾病、病癥、性狀或狀況的維持或發(fā)展的組織或細(xì)胞。本發(fā)明的siNA分子可以如本文描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的進(jìn)行配制或綴合，以靶向受試者或生物中的合適組織或細(xì)胞。siNA分子可以與本領(lǐng)域已知的其他治療性處理和方式組合，用于治療或預(yù)防受試者或生物中的代謝疾病、病癥、性狀或狀況。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的PEG干擾素和本發(fā)明的一種或多種雙鏈核酸分子或siNA分子的組合物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的PEG干擾素、病毒唑、Vertex VX-950、Actilon(CPG 10101)和/或艾沙托立賓(Isatoribine)(TLR-7激動劑)和本發(fā)明的一種或多種雙鏈核酸分子或siNA分子的組合物。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療方法的特征在于與一種或多種其他治療方式組合施用本發(fā)明的雙鏈核酸分子，所述其他治療方式包括干擾素(例如，干擾素-α，或PEG干擾素例如佩樂能(PEG-Intron)、利巴韋林(Rebetol)、Rebetron或長效干擾素α-2a(Pegasys))、病毒唑、Vertex VX-950、Actilon(CPG 10101)或艾沙托立賓(TLR-7激動劑)。在另一個實(shí)施方案中，此種組合療法可以在本文的任何一個實(shí)施方案中利用。
在本發(fā)明的任何一種治療方法中，siNA可以作為療程給受試者施用，例如以各種時(shí)間間隔施用，例如在療程期間每天一次，在療程期間每2天一次，在療程期間每3天一次，在療程期間每4天一次，在療程期間每5天一次，在療程期間每6天一次，在療程期間每周一次，在療程期間每隔一周一次，在療程期間每月一次等。在一個實(shí)施方案中，療程是每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周1次。在一個實(shí)施方案中，療程為約1-約52周或更長(例如，無限期)。在一個實(shí)施方案中，療程為約1-約48個月或更長(例如，無限期)。
在一個實(shí)施方案中，療程涉及初始療程，例如對于固定時(shí)間間隔(例如1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更多)每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周1次，隨后為維持療程，例如對于另外的固定時(shí)間間隔(例如1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更多)每4、6、8、10、15、20、25、30、35、40或更多周1次。
在本發(fā)明的任何一種治療方法中，siNA可以如本文所描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的全身性地給受試者施用，單獨(dú)作為單一療法或與本文描述的或本領(lǐng)域已知的另外療法組合。全身施用可以包括例如，如本領(lǐng)域一般已知的肺(吸入、噴霧法等)靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、導(dǎo)管插入、鼻咽、經(jīng)皮和/或經(jīng)口/胃腸施用。
在一個實(shí)施方案中，在本發(fā)明的任何一種治療或預(yù)防方法中，siNA可以如本文描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的局部地施用于受試者或施用于局部組織，單獨(dú)作為單一療法或與本領(lǐng)域已知的另外療法組合。局部施用可以包括例如，如本領(lǐng)域一般已知的吸入、噴霧法、導(dǎo)管插入、植入、直接注射、皮膚/經(jīng)皮應(yīng)用、支架、滴耳劑/滴眼劑、或門靜脈施用于相關(guān)組織，或任何其他局部施用技術(shù)、方法或操作。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)受試者或生物中的超過一種HCV靶基因表達(dá)的方法，其包括在適合于調(diào)節(jié)(例如，抑制)受試者或生物中的HCV靶基因表達(dá)的條件下，使受試者或生物與本發(fā)明的一種或多種siNA分子接觸。
本發(fā)明的siNA分子可以被設(shè)計(jì)為經(jīng)由多種核酸分子的RNAi靶向下調(diào)或抑制靶基因表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子用于靶向?qū)?yīng)于靶基因的各種DNA，例如經(jīng)由異染色質(zhì)基因沉默或轉(zhuǎn)錄抑制。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子用于靶向?qū)?yīng)于靶基因的各種RNAs，例如經(jīng)由RNA靶切割或翻譯抑制。此種RNAs的非限制性例子包括信使RNA(mRNA)、非編碼RNA(ncRNA)或調(diào)節(jié)元件(參見例如Mattick，2005，Science，309，1527-1528和Claverie，2005，Science，309，1529-1530)，其包括miRNA和其他小RNAs、一種或多種靶基因的可變RNA剪接變體、一種或多種靶基因的轉(zhuǎn)錄后修飾的RNA、一種或多種靶基因的前mRNA、和/或RNA模板。如果可變剪接產(chǎn)生通過使用合適的外顯子加以區(qū)分的轉(zhuǎn)錄物家族，那么本發(fā)明可以用于抑制通過合適的外顯子的基因表達(dá)，以特異性抑制或區(qū)分基因家族成員的功能。例如，包含可變剪接的跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可以以膜結(jié)合和分泌形式進(jìn)行表達(dá)。使用本發(fā)明靶向包含跨膜結(jié)構(gòu)域的外顯子可以用于確定與蛋白質(zhì)的分泌形式成對比的膜結(jié)合的藥物靶向的功能結(jié)果。涉及靶向這些RNA分子的本發(fā)明應(yīng)用的非限制性例子包括治療藥物應(yīng)用、化妝品應(yīng)用、獸醫(yī)應(yīng)用、藥物發(fā)現(xiàn)應(yīng)用、分子診斷和基因功能應(yīng)用、和基因作圖，例如用本發(fā)明的siNA分子使用單核苷酸多態(tài)性作圖。此種應(yīng)用可以使用已知的基因序列或來自可從表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)獲得的部分序列來實(shí)現(xiàn)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子用于靶向?qū)?yīng)于一種或多種基因家族如HCV家族基因(例如，所有已知的HCV品系、相關(guān)HCV品系組、或趨異HCV品系組)的保守序列。照這樣，靶向多重HCV靶的siNA分子可以提供增加的療效。此外，siNA可以用于在多種應(yīng)用中表征基因功能的途徑。例如，本發(fā)明可以用于抑制途徑中的一種或多種靶基因的活性，以在基因功能分析、mRNA功能分析或翻譯分析中確定未表征的一種或多種基因的功能。本發(fā)明可以用于確定通向藥物開發(fā)的涉及各種疾病和狀況的潛在靶基因途徑。本發(fā)明可以用于了解涉及例如增生性疾病、病癥和狀況的基因表達(dá)的途徑。
此外，siNA可以用于在多種應(yīng)用中表征基因功能的途徑。例如，本發(fā)明可以用于抑制途徑中的一種或多種靶基因的活性，以在基因功能分析、mRNA功能分析或翻譯分析中確定未表征的一種或多種基因的功能。本發(fā)明可以用于確定通向藥物開發(fā)的涉及各種疾病和狀況的潛在靶基因途徑。本發(fā)明可以用于了解涉及例如聽力喪失、耳聾、耳鳴、運(yùn)動或平衡失調(diào)、以及與受試者或生物中的靶基因表達(dá)或活性相關(guān)的任何其他疾病、性狀和狀況的進(jìn)展和/或維持的基因表達(dá)的途徑。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或多種siNA分子和/或方法用于下調(diào)編碼通過Genbank登記提及的RNA的一種或多種基因的表達(dá)，例如編碼通過Genbank登記號在本文中提及的一種或多種RNA序列的靶基因，例如表I中顯示的Genbank登記號或者PCT/US03/05028、美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/363,124或USSN 10/923,536中顯示的Genbank登記號，所述所有專利引入本文作為參考。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于這樣的方法，其包括(a)產(chǎn)生具有預(yù)定復(fù)雜性的siNA構(gòu)建體文庫；和(b)在適合于測定靶RNA序列內(nèi)的RNAi靶位點(diǎn)的條件下，測定上文(a)的siNA構(gòu)建體。在一個實(shí)施方案中，(a)的siNA分子具有固定長度的鏈，例如長度為約23個核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，(a)的siNA分子具有不同長度，例如具有長度為約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸的鏈。在一個實(shí)施方案中，該測定可以包含如本文所描述的重構(gòu)的體外siNA測定。在另一個實(shí)施方案中，該測定可以包括在其中表達(dá)靶RNA的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。在另一個實(shí)施方案中，就可檢測的切割水平分析靶RNA的片段，例如通過凝膠電泳、RNA印跡分析或RNA酶保護(hù)測定，以確定靶RNA序列內(nèi)最合適的一個或多個靶位點(diǎn)。靶RNA序列可以如本領(lǐng)域已知的獲得，例如對于體外系統(tǒng)通過克隆和/或轉(zhuǎn)錄，和在體內(nèi)系統(tǒng)中通過細(xì)胞表達(dá)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于這樣的方法，其包括(a)產(chǎn)生具有預(yù)定復(fù)雜性例如4N的siNA構(gòu)建體的隨機(jī)文庫，其中N代表在每條siNA構(gòu)建體鏈中堿基配對的核苷酸的數(shù)目(例如，對于具有含19個堿基對的21核苷酸有義和反義鏈的siNA構(gòu)建體，復(fù)雜性將是419)；和(b)在適合于測定靶RNA序列內(nèi)的RNAi靶位點(diǎn)的條件下，測定上文(a)的siNA構(gòu)建體。在另一個實(shí)施方案中，(a)的siNA分子具有固定長度的鏈，例如長度為約23個核苷酸。在另外一個實(shí)施方案中，(a)的siNA分子具有不同長度，例如具有長度為約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸的鏈。在一個實(shí)施方案中，該測定可以包含如本文實(shí)施例6中所描述的重構(gòu)的體外siNA測定。在另一個實(shí)施方案中，該測定可以包括在其中表達(dá)靶RNA的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。在另一個實(shí)施方案中，就可檢測的切割水平分析靶RNA的片段，例如通過凝膠電泳、RNA印跡分析或RNA酶保護(hù)測定，以確定靶RNA序列內(nèi)最合適的一個或多個靶位點(diǎn)。靶RNA序列可以如本領(lǐng)域已知的獲得，例如對于體外系統(tǒng)通過克隆和/或轉(zhuǎn)錄，和在體內(nèi)系統(tǒng)中通過細(xì)胞表達(dá)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于這樣的方法，其包括(a)分析由靶基因編碼的RNA靶的序列；(b)合成與(a)的RNA的一個或多個區(qū)域具有序列互補(bǔ)性的一個或多個siNA分子組；和(c)在適合于測定靶RNA序列內(nèi)的RNAi靶的條件下，測定(b)的siNA分子。在一個實(shí)施方案中，(b)的siNA分子具有固定長度的鏈，例如長度為約23個核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，(b)的siNA分子具有不同長度，例如具有長度為約15個-約30個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)核苷酸的鏈。在一個實(shí)施方案中，該測定可以包含如本文所描述的重構(gòu)的體外siNA測定。在另一個實(shí)施方案中，該測定可以包括在其中表達(dá)靶RNA的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。就可檢測的切割水平分析靶RNA的片段，例如通過凝膠電泳、RNA印跡分析或RNA酶保護(hù)測定，以確定靶RNA序列內(nèi)最合適的一個或多個靶位點(diǎn)。靶RNA序列可以如本領(lǐng)域已知的獲得，例如對于體外系統(tǒng)通過克隆和/或轉(zhuǎn)錄，和在體內(nèi)系統(tǒng)中通過表達(dá)。
“靶位點(diǎn)”意指靶RNA內(nèi)對于由siNA構(gòu)建體介導(dǎo)的切割“被靶向”的序列，所述siNA構(gòu)建體在其反義區(qū)內(nèi)包含與靶序列互補(bǔ)的序列。
“可檢測的切割水平”意指靶RNA的切割(和切割產(chǎn)物RNAs的形成)至足以區(qū)分超過由靶RNA隨機(jī)降解產(chǎn)生的RNAs背景的切割產(chǎn)物的程度。對于大多數(shù)檢測方法，來自1-5％靶RNA的切割產(chǎn)物的產(chǎn)生足以檢測超過背景。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的本發(fā)明siNA分子的組合物，所述本發(fā)明siNA分子可以是化學(xué)修飾的。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的本發(fā)明siNA分子的藥物組合物，所述本發(fā)明siNA分子可以是化學(xué)修飾的，靶向一種或多種基因。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于診斷受試者中的疾病、性狀或狀況的方法，其包括在適合于診斷受試者中的疾病、性狀或狀況的條件下，給受試者施用本發(fā)明的組合物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于治療或預(yù)防受試者中的疾病、性狀或狀況，例如聽力喪失、耳聾、耳鳴和/或運(yùn)動和平衡失調(diào)的方法，其包括在適合于治療或預(yù)防受試者中的疾病、性狀或狀況的條件下，給受試者施用單獨(dú)或與一種或多種其他治療化合物結(jié)合的本發(fā)明的組合物。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于確認(rèn)靶基因靶的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA鏈之一包括與靶基因的RNA互補(bǔ)的序列；(b)在適合于調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織、受試者或生物中的靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入細(xì)胞、組織、受試者或生物內(nèi)；和(c)通過測定細(xì)胞、組織、受試者或生物中的任何表型改變來確定基因的功能。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于確認(rèn)靶的方法，其包括(a)合成本發(fā)明的siNA分子，其可以是化學(xué)修飾的，其中所述siNA鏈之一包括與靶基因的RNA互補(bǔ)的序列；(b)在適合于調(diào)節(jié)生物系統(tǒng)中的靶基因表達(dá)的條件下，將siNA分子引入生物系統(tǒng)內(nèi)；和(c)通過測定生物系統(tǒng)中的任何表型改變來確定基因的功能。
“生物系統(tǒng)”意指來自生物源的純化或未純化形式的材料，所述生物源包括但不限于人或動物，其中所述系統(tǒng)包括對RNAi活性所需的組分。術(shù)語“生物系統(tǒng)”包括例如，細(xì)胞、組織、受試者或生物、或其提取物。術(shù)語生物系統(tǒng)還包括可以在體外背景中使用的重構(gòu)的RNAi系統(tǒng)。
“表型改變”意指響應(yīng)與本發(fā)明的核酸分子接觸或用本發(fā)明的核酸分子(例如，siNA)治療發(fā)生的關(guān)于細(xì)胞的任何可檢測改變。此種可檢測的改變包括但不限于，如可以通過本領(lǐng)域已知的方法測定的形狀、大小、增殖、運(yùn)動性、蛋白質(zhì)表達(dá)或RNA表達(dá)中的改變或者其他物理或化學(xué)變化?？蓹z測的改變還可以包括報(bào)道基因/分子的表達(dá)，例如綠色熒光蛋白(GFP)或用于鑒定表達(dá)的蛋白質(zhì)的各種標(biāo)記或可以被測定的任何其他細(xì)胞組分。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含本發(fā)明的siNA分子的試劑盒，所述本發(fā)明的siNA分子可以是化學(xué)修飾的，所述試劑盒可以用于調(diào)節(jié)生物系統(tǒng)包括例如細(xì)胞、組織、受試者或生物中的靶基因表達(dá)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含本發(fā)明的超過一種siNA分子的試劑盒，所述本發(fā)明的siNA分子可以是化學(xué)修飾的，所述試劑盒可以用于調(diào)節(jié)生物系統(tǒng)包括例如細(xì)胞、組織、受試者或生物中的超過一種靶基因的表達(dá)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含本發(fā)明的一種或多種siNA分子的細(xì)胞，所述本發(fā)明的siNA分子可以是化學(xué)修飾的。在另一個實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的siNA分子的細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。在另外一個實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的siNA分子的細(xì)胞是人細(xì)胞。
在一個實(shí)施方案中，可以是化學(xué)修飾的本發(fā)明的siNA分子的合成包括(a)合成siNA分子的2條互補(bǔ)鏈；(b)在適合于獲得雙鏈siNA分子的條件下，使2條互補(bǔ)鏈一起退火。在另一個實(shí)施方案中，siNA分子的2條互補(bǔ)鏈的合成是通過固相寡核苷酸合成。在另外一個實(shí)施方案中，siNA分子的2條互補(bǔ)鏈的合成是通過固相串聯(lián)寡核苷酸合成。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于合成siNA雙鏈體分子的方法，其包括(a)合成siNA分子的第一條寡核苷酸序列鏈，其中所述第一條寡核苷酸序列鏈包含可切割的接頭分子，其可以用作支架用于合成siNA的第二條寡核苷酸序列鏈；(b)在第一條寡核苷酸序列鏈的支架上合成siNA的第二條寡核苷酸序列鏈，其中所述第二條寡核苷酸序列鏈進(jìn)一步包含可以用于純化siNA雙鏈體的化學(xué)部分；(c)在適合于2條siNA寡核苷酸鏈雜交且形成穩(wěn)定的雙鏈體的條件下，切割(a)的接頭分子；和(d)利用第二條寡核苷酸序列鏈的化學(xué)部分純化siNA雙鏈體。在一個實(shí)施方案中，上文(c)中的接頭分子的切割在寡核苷酸的脫保護(hù)期間發(fā)生，例如在使用烷基胺堿例如甲胺的水解條件下。在一個實(shí)施方案中，合成方法包括在固體支持體例如可控孔度玻璃(CPG)或聚苯乙烯上的固相合成，其中(a)的第一種序列在可切割接頭例如琥珀酰接頭上使用固體支持體作為支架來合成。用作支架用于合成第二條鏈的(a)中的可切割接頭可以包含與固體支持體衍生的接頭相似的反應(yīng)性，從而使得固體支持體衍生的接頭和(a)的可切割接頭的切割伴隨發(fā)生。在另一個實(shí)施方案中，可以用于分離附著的寡核苷酸序列的(b)的化學(xué)部分包含三苯甲基，例如二甲氧三苯甲基，其可以在如本文所描述的三苯甲基依賴性(trityl-on)合成策略中使用。在另外一個實(shí)施方案中，化學(xué)部分例如二甲氧三苯甲基在純化期間例如使用酸性條件去除。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，用于siNA合成的方法是溶液相合成或混合相合成，其中siNA雙鏈體的2條鏈?zhǔn)褂门c第一種序列附著的可切割接頭串聯(lián)合成，所述可切割接頭充當(dāng)支架用于合成第二種序列。在適合于分開的siNA序列鏈雜交的條件下切割接頭導(dǎo)致雙鏈siNA分子的形成。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于合成siNA雙鏈體分子的方法，其包括(a)合成siNA分子的一條寡核苷酸序列鏈，其中所述序列包含可切割的接頭分子，其可以用作支架用于合成另一條寡核苷酸序列；(b)在(a)的支架上合成與第一條序列鏈具有互補(bǔ)性的第二條寡核苷酸序列，其中所述第二條序列包含雙鏈siNA分子的另一條鏈，且其中所述第二條序列進(jìn)一步包含可以用于分離附著的寡核苷酸序列的化學(xué)部分；(c)在適合于分離包含由可切割接頭連接的2條siNA寡核苷酸鏈的全長序列的條件下，和在適合于2條siNA寡核苷酸鏈雜交且形成穩(wěn)定的雙鏈體的條件下，利用第二條寡核苷酸序列鏈的化學(xué)部分純化(b)的產(chǎn)物。在一個實(shí)施方案中，上文(c)中的接頭分子的切割在寡核苷酸的脫保護(hù)期間發(fā)生，例如在水解條件下。在另一個實(shí)施方案中，上文(c)中的接頭分子的切割在寡核苷酸的脫保護(hù)后發(fā)生。在另一個實(shí)施方案中，合成方法包括在固體支持體例如可控孔度玻璃(CPG)或聚苯乙烯上的固相合成，其中(a)的第一種序列在可切割接頭例如琥珀酰接頭上使用固體支持體作為支架來合成。用作支架用于合成第二條鏈的(a)中的可切割接頭可以包含與固體支持體衍生的接頭相似的反應(yīng)性或不同的反應(yīng)性，從而使得固體支持體衍生的接頭和(a)的可切割接頭的切割伴隨或順次發(fā)生。在一個實(shí)施方案中，可以用于分離附著的寡核苷酸序列的(b)的化學(xué)部分包含三苯甲基，例如二甲氧三苯甲基。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于在單一合成法中制備雙鏈siNA分子的方法，其包括(a)合成具有第一種和第二種序列的寡核苷酸，其中第一種序列與第二種序列互補(bǔ)，且第一種寡核苷酸序列經(jīng)由可切割接頭與第二種序列連接，且其中末端5′-保護(hù)基團(tuán)例如5′-O-二甲氧三苯甲基(5′-O-DMT)保持在具有第二種序列的寡核苷酸上；(b)使寡核苷酸脫保護(hù)，由此脫保護(hù)導(dǎo)致使2種寡核苷酸序列連接的接頭的切割；和(c)在適合于分離雙鏈siNA分子的條件下，例如使用如本文所描述的三苯甲基依賴性合成策略，純化(b)的產(chǎn)物。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的合成方法包括Scaringe等人，美國專利號5,889,136；6,008,400；和6,111,086的教導(dǎo)，所述專利整體引入本文作為參考。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于介導(dǎo)針對靶多核苷酸(例如，RNA或DNA靶)的RNAi的siNA構(gòu)建體，其中所述siNA構(gòu)建體包含增加siNA構(gòu)建體的核酸酶抗性的一種或多種化學(xué)修飾，例如具有式I-VII中任何一個或其任何組合的一種或多種化學(xué)修飾。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有增加的核酸酶抗性的siNA分子的方法，其包括(a)將具有I-VII中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離具有增加的核酸酶抗性的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有改善的毒理學(xué)概況(例如，具有減弱的或無免疫刺激性質(zhì))的siNA分子的方法，其包括(a)將具有I-VII(例如，表IV中提及的siNA基序)中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離具有改善的毒理學(xué)概況的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有改善的毒理學(xué)概況(例如，具有減弱的或無免疫刺激性質(zhì))的siNA制劑的方法，其包括(a)產(chǎn)生包含本發(fā)明的siNA分子和如本文所描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的遞送媒介物或遞送顆粒的siNA制劑，和(b)在適合于分離具有改善的毒理學(xué)概況的siNA制劑的條件下，測定步驟(a)的siNA制劑。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生在細(xì)胞、受試者或生物中不刺激干擾素應(yīng)答(例如，無干擾素應(yīng)答或減弱的干擾素應(yīng)答)的siNA分子的方法，其包括(a)將具有I-VII(例如，表IV中提及的siNA基序)中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離不刺激干擾素應(yīng)答的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生在細(xì)胞、受試者或生物中不刺激干擾素應(yīng)答(例如，無干擾素應(yīng)答或減弱的干擾素應(yīng)答)的siNA制劑的方法，其包括(a)產(chǎn)生包含本發(fā)明的siNA分子和如本文所描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的遞送媒介物或遞送顆粒的siNA制劑，和(b)在適合于分離不刺激干擾素應(yīng)答的siNA制劑的條件下，測定步驟(a)的siNA制劑。在一個實(shí)施方案中，干擾素包括干擾素α。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生在細(xì)胞、受試者或生物中不刺激炎癥或促炎細(xì)胞因子應(yīng)答(例如，無細(xì)胞因子應(yīng)答或減弱的細(xì)胞因子應(yīng)答)的siNA分子的方法，其包括(a)將具有I-VII(例如，表IV中提及的siNA基序)中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離不刺激細(xì)胞因子應(yīng)答的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞因子包含白細(xì)胞介素例如白細(xì)胞介素-6(IL-6)和/或腫瘤壞死α(TNF-α)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生在細(xì)胞、受試者或生物中不刺激炎癥或促炎細(xì)胞因子應(yīng)答(例如，無細(xì)胞因子應(yīng)答或減弱的細(xì)胞因子應(yīng)答)的siNA制劑的方法，其包括(a)產(chǎn)生包含本發(fā)明的siNA分子和如本文所描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的遞送媒介物或遞送顆粒的siNA制劑，和(b)在適合于分離不刺激細(xì)胞因子應(yīng)答的siNA制劑的條件下，測定步驟(a)的siNA制劑。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞因子包含白細(xì)胞介素例如白細(xì)胞介素-6(IL-6)和/或腫瘤壞死α(TNF-α)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生在細(xì)胞、受試者或生物中不刺激Toll樣受體(TLR)應(yīng)答(例如，無TLR應(yīng)答或減弱的TLR應(yīng)答)的siNA分子的方法，其包括(a)將具有I-VII(例如，表IV中提及的siNA基序)中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離不刺激TLR應(yīng)答的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。在一個實(shí)施方案中，TLR包含TLR3、TLR7、TLR8和/或TLR9。
在一個實(shí)施方案中，與沒有化學(xué)修飾或具有較少的化學(xué)修飾的相應(yīng)siNA分子相比較，本發(fā)明的化學(xué)修飾的siNA分子具有改善的毒理學(xué)概況。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生在細(xì)胞、受試者或生物中不刺激Toll樣受體(TLR)應(yīng)答(例如，無TLR應(yīng)答或減弱的TLR應(yīng)答)的siNA制劑的方法，其包括(a)產(chǎn)生包含本發(fā)明的siNA分子和如本文所描述的或如本領(lǐng)域其他方面已知的遞送媒介物或遞送顆粒的siNA制劑，和(b)在適合于分離不刺激TLR應(yīng)答的siNA制劑的條件下，測定步驟(a)的siNA制劑。在一個實(shí)施方案中，TLR包含TLR3、TLR7、TLR8和/或TLR9。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由RNA干擾(RNAi)指導(dǎo)靶RNA切割的化學(xué)合成的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中(a)所述siNA分子的每條鏈長度為約18個-約38個核苷酸；(b)所述siNA分子的一條鏈包含與所述靶RNA具有足夠互補(bǔ)性的核苷酸序列，用于siNA分子經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)靶RNA切割；和(c)其中所述siNA分子內(nèi)的核苷酸位置進(jìn)行化學(xué)修飾，以將siNA分子的免疫刺激性質(zhì)減少至低于相應(yīng)的未修飾的siNA分子那種的水平。與未修飾或最低限度修飾的siNA相比較，此種siNA分子被說成具有改善的毒理學(xué)概況。
“改善的毒理學(xué)概況”意指與未修飾或未配制的siNA、或具有較少的修飾或在給予改善的毒理學(xué)方面較不有效的修飾的siNA分子相比較，化學(xué)修飾或配制的siNA構(gòu)建體在細(xì)胞、受試者或生物中顯示出減少的毒性。此種siNA分子也被視為具有“改善的RNAi活性”。在非限制性例子中，與未修飾或未配制的siNA、或具有較少的修飾或在給予改善的毒理學(xué)方面較不有效的修飾的siNA分子相比較，具有改善的毒理學(xué)概況的siNA分子和制劑與細(xì)胞、受試者或生物中減少的免疫刺激性質(zhì)相關(guān)，例如減少的、降低的或減弱的免疫刺激應(yīng)答。此種改善的毒理學(xué)概況的特征在于取消的或減少的免疫刺激，例如減少或取消干擾素(例如干擾素α)、炎性細(xì)胞因子(例如白細(xì)胞介素例如IL-6和/或TNF-α)和/或toll樣受體(例如，TLR-3、TLR-7、TLR-8和/或TLR-9)的誘導(dǎo)。在一個實(shí)施方案中，具有改善的毒理學(xué)概況的siNA分子或制劑不包含核糖核苷酸。在一個實(shí)施方案中，具有改善的毒理學(xué)概況的siNA分子或制劑包含少于5個核糖核苷酸(例如，1個、2個、3個或4個核糖核苷酸)。在一個實(shí)施方案中，具有改善的毒理學(xué)概況的siNA分子或制劑包含Stab 7、Stab 8、Stab 11、Stab 12、Stab 13、Stab 16、Stab 17、Stab 18、Stab 19、Stab 20、Stab 23、Stab 24、Stab 25、Stab 26、Stab 27、Stab 28、Stab 29、Stab 30、Stab 31、Stab 32、Stab 33、Stab 34、Stab 35、Stab 36或其任何組合(參見表IV)。在本文中，數(shù)字Stab化學(xué)包括表IV中所示化學(xué)的2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。在一個實(shí)施方案中，具有改善的毒理學(xué)概況的siNA分子或制劑包含本發(fā)明的siNA分子和如美國專利申請公開號20030077829中所述的制劑，所述專利包括附圖整體引入本文作為參考。
在一個實(shí)施方案中，與給定siNA分子相關(guān)的免疫刺激應(yīng)答的水平可以如本文所描述的或如本領(lǐng)域其他方面已知的進(jìn)行測量，例如通過在測定中測定PKR/干擾素應(yīng)答、增殖、B細(xì)胞激活和/或細(xì)胞因子生產(chǎn)水平，以定量特定siNA分子的免疫刺激應(yīng)答(參見，例如，Leifer等人，2003，J Immunother.26，313-9；和美國專利號5,968,909，整體引入作為參考)。在一個實(shí)施方案中，與未修飾或最低限度修飾的siNA分子相比較，減少的免疫刺激應(yīng)答為約10％-約100％，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％減少的免疫刺激應(yīng)答。在一個實(shí)施方案中，與siNA分子相關(guān)的免疫刺激應(yīng)答可以通過化學(xué)修飾的程度進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，可以選擇在siNA分子中具有約10％-約100％(例如，約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)修飾的核苷酸位置的siNA分子，以具有如本文所描述的相應(yīng)程度的免疫刺激性質(zhì)。
在一個實(shí)施方案中，就最優(yōu)化的RNAi活性選擇減少的免疫刺激應(yīng)答的程度。例如，對治療病毒感染保留某一程度的免疫刺激可以是優(yōu)選的，其中對于最大的抗病毒活性，免疫刺激中小于100％的減少可以是優(yōu)選的(例如，免疫刺激中約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的減少)，而關(guān)于具有最小免疫刺激性質(zhì)的siNA分子抑制內(nèi)源基因靶的表達(dá)可以是優(yōu)選的，以防止非特異性毒性或脫靶(off-target)效應(yīng)(例如免疫刺激中約90％-約100％的減少)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由RNA干擾(RNAi)指導(dǎo)靶RNA切割的化學(xué)合成的雙鏈siNA分子，其中(a)所述siNA分子的每條鏈長度為約18個-約38個核苷酸；(b)所述siNA分子的一條鏈包含與所述靶RNA具有足夠互補(bǔ)性的核苷酸序列，用于siNA分子經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)靶RNA切割；和(c)其中所述siNA分子的一個或多個核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，以將siNA分子的免疫刺激性質(zhì)減少至低于相應(yīng)的未修飾的siNA分子那種的水平。在一個實(shí)施方案中，每條鏈包含與另一條鏈的核苷酸互補(bǔ)的至少約18個核苷酸。
在另一個實(shí)施方案中，包含經(jīng)修飾的核苷酸以減少siNA分子的免疫刺激性質(zhì)的siNA分子包含反義區(qū)，所述反義區(qū)具有與靶基因的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且進(jìn)一步包含有義區(qū)，其中所述有義區(qū)包含與所述靶基因的核苷酸序列或其部分基本上類似的核苷酸序列。在其的一個實(shí)施方案中，反義區(qū)和有義區(qū)包含約18個-約38個核苷酸，其中所述反義區(qū)包含與有義區(qū)的核苷酸互補(bǔ)的至少約18個核苷酸。在其的一個實(shí)施方案中，有義區(qū)中的嘧啶核苷酸是2′-O-甲基嘧啶核苷酸。在其的另一個實(shí)施方案中，有義區(qū)中的嘌呤核苷酸是2′-脫氧嘌呤核苷酸。在其的另外一個實(shí)施方案中，有義區(qū)中存在的嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸。在其的另一個實(shí)施方案中，所述反義區(qū)中的嘧啶核苷酸是2′-脫氧-2′-氟嘧啶核苷酸。在其的另外一個實(shí)施方案中，所述反義區(qū)中的嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在其的另外一個實(shí)施方案中，所述反義區(qū)中存在的嘌呤核苷酸包含2′-脫氧嘌呤核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，反義區(qū)包含在所述反義區(qū)的3′末端處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在另一個實(shí)施方案中，反義區(qū)包含在所述反義區(qū)的3′末端處的甘油基修飾。
在其他實(shí)施方案中，包含經(jīng)修飾的核苷酸以減少siNA分子的免疫刺激性質(zhì)的siNA分子可以包含本文描述的siNA分子的任何結(jié)構(gòu)特征。在其他實(shí)施方案中，包含經(jīng)修飾的核苷酸以減少siNA分子的免疫刺激性質(zhì)的siNA分子可以包含本文描述的siNA分子的任何化學(xué)修飾。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生化學(xué)合成的雙鏈siNA分子的方法，所述雙鏈siNA分子具有化學(xué)修飾的核苷酸以減少siNA分子的免疫刺激性質(zhì)，其包括(a)在siNA分子中引入一個或多個經(jīng)修飾的核苷酸，和(b)在這樣的條件下測定步驟(a)的siNA分子，與具有未修飾的核苷酸的相應(yīng)siNA分子相比較，所述條件適合于分離具有減少的免疫刺激性質(zhì)的siNA分子。siNA分子的每條鏈長度為約18個-約38個核苷酸。siNA分子的一條鏈包含與靶RNA具有足夠互補(bǔ)性的核苷酸序列，用于siNA分子經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)靶RNA切割。在一個實(shí)施方案中，減少的免疫刺激性質(zhì)包含響應(yīng)于引入細(xì)胞、組織或生物中的siNA，炎性或促炎細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素(IL-6)或腫瘤壞死α(TNF-α)取消的或減少的誘導(dǎo)。在另一個實(shí)施方案中，減少的免疫刺激性質(zhì)包含響應(yīng)于引入細(xì)胞、組織或生物中的siNA，Toll樣受體(TLRs)例如TLR3、TLR7、TLR8或TLR9取消的或減少的誘導(dǎo)。在另一個實(shí)施方案中，減少的免疫刺激性質(zhì)包含響應(yīng)于引入細(xì)胞、組織或生物中的siNA，干擾素例如干擾素α取消的或減少的誘導(dǎo)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于介導(dǎo)針對靶多核苷酸的RNAi的siNA構(gòu)建體，其中所述siNA構(gòu)建體包含本文描述的一個或多個化學(xué)修飾，其調(diào)節(jié)siNA構(gòu)建體的有義和反義鏈之間的結(jié)合親和力。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生在siNA分子的有義和反義鏈之間具有增加的結(jié)合親和力的siNA分子的方法，其包括(a)將具有式I-VII中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離在siNA分子的有義和反義鏈之間具有增加的結(jié)合親和力的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于介導(dǎo)針對靶多核苷酸的RNAi的siNA構(gòu)建體，其中所述siNA構(gòu)建體包含本文描述的一個或多個化學(xué)修飾，其調(diào)節(jié)siNA構(gòu)建體的反義鏈和細(xì)胞內(nèi)的互補(bǔ)靶RNA序列之間的結(jié)合親和力。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于介導(dǎo)針對靶多核苷酸的RNAi的siNA構(gòu)建體，其中所述siNA構(gòu)建體包含本文描述的一個或多個化學(xué)修飾，其調(diào)節(jié)siNA構(gòu)建體的反義鏈和細(xì)胞內(nèi)的互補(bǔ)靶DNA序列之間的結(jié)合親和力。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生在siNA分子的反義鏈和互補(bǔ)靶RNA序列之間具有增加的結(jié)合親和力的siNA分子的方法，其包括(a)將具有式I-VII中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離在siNA分子的反義鏈和互補(bǔ)靶RNA序列之間具有增加的結(jié)合親和力的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生在siNA分子的反義鏈和互補(bǔ)靶DNA序列之間具有增加的結(jié)合親和力的siNA分子的方法，其包括(a)將具有式I-VII中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離在siNA分子的反義鏈和互補(bǔ)靶DNA序列之間具有增加的結(jié)合親和力的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于介導(dǎo)針對靶多核苷酸的RNAi的siNA構(gòu)建體，其中所述siNA構(gòu)建體包含本文描述的一個或多個化學(xué)修飾，其調(diào)節(jié)能夠產(chǎn)生另外的內(nèi)源siNA分子的細(xì)胞聚合酶的聚合酶活性，所述內(nèi)源siNA分子與化學(xué)修飾的siNA構(gòu)建體具有序列同源性。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生能夠介導(dǎo)細(xì)胞聚合酶增加的聚合酶活性的siNA分子的方法，所述細(xì)胞聚合酶能夠產(chǎn)生與化學(xué)修飾的siNA分子具有序列同源性的另外的內(nèi)源siNA分子，所述方法包括(a)將具有式I-VII中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離能夠介導(dǎo)細(xì)胞聚合酶增加的聚合酶活性的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子，所述細(xì)胞聚合酶能夠產(chǎn)生與化學(xué)修飾的siNA分子具有序列同源性的另外的內(nèi)源siNA分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于介導(dǎo)針對細(xì)胞中靶多核苷酸的RNAi的化學(xué)修飾的siNA構(gòu)建體，其中所述化學(xué)修飾不以降低經(jīng)由此種siNA構(gòu)建體介導(dǎo)的RNAi的功效的方式顯著影響siNA與靶RNA分子、DNA分子和/或蛋白質(zhì)或?qū)τ赗NAi所必需的其他因子的相互作用。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有針對多核苷酸靶改善的RNAi特異性的siNA分子的方法，其包括(a)將具有式I-VII中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離具有改善的RNAi特異性的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。在一個實(shí)施方案中，改善的特異性包含與未修飾的siNA分子相比較具有減少的脫靶效應(yīng)。例如，在本發(fā)明的siNA分子的有義鏈或區(qū)的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端處引入末端帽部分可以指導(dǎo)siNA具有改善的特異性，其通過阻止有義鏈或有義區(qū)充當(dāng)用于針對相應(yīng)靶的RNAi活性的模板實(shí)現(xiàn)，所述相應(yīng)靶與有義鏈或有義區(qū)具有互補(bǔ)性。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有針對靶多核苷酸改善的RNAi活性的siNA分子的方法，其包括(a)將具有式I-VII中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離具有改善的RNAi活性的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。
在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有針對靶RNA改善的RNAi活性的siNA分子的方法，其包括(a)將具有式I-VII中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離具有針對靶RNA改善的RNAi活性的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。
在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有針對靶DNA改善的RNAi活性的siNA分子的方法，其包括(a)將具有式I-VII中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離具有針對靶DNA改善的RNAi活性的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于介導(dǎo)針對靶多核苷酸的RNAi的siNA構(gòu)建體，其中所述siNA構(gòu)建體包含本文描述的一個或多個化學(xué)修飾，其調(diào)節(jié)siNA構(gòu)建體例如siNA的膽固醇綴合物的細(xì)胞攝取。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有改善的細(xì)胞攝取的針對靶多核苷酸的siNA分子的方法，其包括(a)將具有式I-VII中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離具有改善的細(xì)胞攝取的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于介導(dǎo)針對靶多核苷酸的RNAi的siNA構(gòu)建體，其中所述siNA構(gòu)建體包含本文描述的一個或多個化學(xué)修飾，其增加siNA構(gòu)建體的生物利用率，例如通過附著改善siNA構(gòu)建體的藥物代謝動力學(xué)的聚合綴合物例如聚乙二醇或等價(jià)綴合物，或通過附著在體內(nèi)靶向特定組織類型或細(xì)胞類型的綴合物。此種綴合物的非限制性例子在引入本文作為參考的Vargeese等人，美國系列號10/201,394中得到描述。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有改善的生物利用率的本發(fā)明siNA分子的方法，其包括(a)將綴合物引入siNA分子的結(jié)構(gòu)內(nèi)，和(b)在適合于分離具有改善的生物利用率的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。此種綴合物可以包括關(guān)于細(xì)胞受體的配體，例如衍生自天然存在的蛋白質(zhì)配體的肽；蛋白質(zhì)定位序列，包括細(xì)胞ZIP編碼序列；抗體；核酸適體；維生素和其他輔因子，例如葉酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；膽固醇；膽固醇衍生物，聚胺，例如精胺或亞精胺；等。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包括與靶RNA序列或其部分互補(bǔ)的第一種核苷酸序列，和與所述第一種序列具有互補(bǔ)性的第二種序列，其中所述第二種序列以不能再充當(dāng)引導(dǎo)序列用于有效介導(dǎo)RNA干擾和/或由促進(jìn)RNAi的細(xì)胞蛋白質(zhì)識別的方式進(jìn)行化學(xué)修飾。在一個實(shí)施方案中，siNA的第一種核苷酸序列如本文所描述的進(jìn)行化學(xué)修飾。在一個實(shí)施方案中，siNA的第一種核苷酸序列未修飾(例如，是全RNA)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包括與靶RNA序列或其部分互補(bǔ)的第一種核苷酸序列，和與所述第一種序列具有互補(bǔ)性的第二種序列，其中所述第二種序列以阻止其進(jìn)入RNAi途徑作為引導(dǎo)序列或作為與靶核酸(例如，RNA)序列互補(bǔ)的序列的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)或修飾。在一個實(shí)施方案中，siNA的第一種核苷酸序列如本文所描述的進(jìn)行化學(xué)修飾。在一個實(shí)施方案中，siNA的第一種核苷酸序列未修飾(例如，是全RNA)。此種設(shè)計(jì)或修飾預(yù)期增強(qiáng)siNA的活性和/或改善本發(fā)明的siNA分子的特異性。這些修飾還預(yù)期使任何脫靶效應(yīng)和/或相關(guān)毒性降到最低。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包括與靶RNA序列或其部分互補(bǔ)的第一種核苷酸序列，和與所述第一種序列具有互補(bǔ)性的第二種序列，其中所述第二種序列不能充當(dāng)引導(dǎo)序列用于介導(dǎo)RNA干擾。在一個實(shí)施方案中，siNA的第一種核苷酸序列如本文所描述的進(jìn)行化學(xué)修飾。在一個實(shí)施方案中，siNA的第一種核苷酸序列未修飾(例如，是全RNA)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包括與靶RNA序列或其部分互補(bǔ)的第一種核苷酸序列，和與所述第一種序列具有互補(bǔ)性的第二種序列，其中所述第二種序列沒有末端5′-羥基(5′-OH)或5′-磷酸基。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包括與靶RNA序列或其部分互補(bǔ)的第一種核苷酸序列，和與所述第一種序列具有互補(bǔ)性的第二種序列，其中所述第二種序列包含在所述第二種序列的5′-末端處的末端帽部分。在一個實(shí)施方案中，末端帽部分包含反向脫堿基、反向脫氧脫堿基、反向核苷酸部分、圖10中顯示的基團(tuán)、烷基或環(huán)烷基、雜環(huán)、或阻止其中第二種序列充當(dāng)引導(dǎo)序列或關(guān)于RNAi的模板的RNAi活性的任何其他基團(tuán)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包括與靶RNA序列或其部分互補(bǔ)的第一種核苷酸序列，和與所述第一種序列具有互補(bǔ)性的第二種序列，其中所述第二種序列包含在所述第二種序列的5′-末端和3′-末端處的末端帽部分。在一個實(shí)施方案中，每個末端帽部分個別地包含反向脫堿基、反向脫氧脫堿基、反向核苷酸部分、圖10中顯示的基團(tuán)、烷基或環(huán)烷基、雜環(huán)、或阻止其中第二種序列充當(dāng)引導(dǎo)序列或關(guān)于RNAi的模板的RNAi活性的任何其他基團(tuán)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有關(guān)于下調(diào)或抑制靶核酸(例如DNA或RNA，例如基因或其相應(yīng)的RNA)的表達(dá)改善的特異性的本發(fā)明siNA分子的方法，所述方法包括(a)將一個或多個化學(xué)修飾引入siNA分子的結(jié)構(gòu)內(nèi)，和(b)在適合于分離具有改善的特異性的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。在另一個實(shí)施方案中，用于改善特異性的化學(xué)修飾包含在siNA分子的5′-末端、3′-末端、或5′和3′-末端處的末端帽修飾。末端帽修飾可以包含例如，圖10中顯示的結(jié)構(gòu)(例如反向脫氧脫堿基部分)，或使得siNA分子的部分(例如有義鏈)不能介導(dǎo)針對脫靶核酸序列的RNA干擾的化學(xué)修飾。在非限制性例子中，siNA分子被這樣設(shè)計(jì)，從而使得只有siNA分子的反義序列可以充當(dāng)引導(dǎo)序列用于RISC介導(dǎo)的相應(yīng)靶RNA序列的降解。這可以通過經(jīng)由向有義鏈中引入化學(xué)修飾使得siNA的有義序列無活性來完成，所述化學(xué)修飾阻礙有義鏈被識別為經(jīng)由RNAi機(jī)器的引導(dǎo)序列。在一個實(shí)施方案中，此種化學(xué)修飾包含在siNA的有義鏈的5′-末端處的任何化學(xué)基團(tuán)，或用于使得有義鏈作為用于介導(dǎo)RNA干擾的引導(dǎo)序列無活性的任何其他基團(tuán)。這些修飾例如可以導(dǎo)致其中有義鏈的5′-末端不再具有游離的5′-羥基(5′-OH)或游離的5′-磷酸基(例如，磷酸、二磷酸、三磷酸、環(huán)磷酸等)的分子。此種siNA構(gòu)建體的非限制性例子在本文中得到描述，例如“Stab 9/10”、“Stab 7/8”、“Stab 7/19”、“Stab 17/22”、“Stab 23/24”、“Stab24/25”和“Stab 24/26”(例如，具有Stab 7、9、17、23或24有義鏈的任何siNA)化學(xué)及其變體(參見表IV)，其中siNA的有義鏈的5′-末端和3′-末端不包含羥基或磷酸基。在本文中，數(shù)字Stab化學(xué)包括表IV中所示化學(xué)的2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有關(guān)于下調(diào)或抑制靶核酸(例如DNA或RNA，例如基因或其相應(yīng)的RNA)的表達(dá)改善的特異性的本發(fā)明siNA分子的方法，所述方法包括將一個或多個化學(xué)修飾引入siNA分子的結(jié)構(gòu)內(nèi)，所述化學(xué)修飾阻止siNA分子的鏈或部分充當(dāng)關(guān)于RNAi活性的模板或引導(dǎo)序列。在一個實(shí)施方案中，siNA分子的無活性鏈或有義區(qū)是siNA分子的有義鏈或有義區(qū)，即siNA的鏈或區(qū)與靶核酸序列沒有互補(bǔ)性。在一個實(shí)施方案中，此種化學(xué)修飾包含在siNA的有義鏈或區(qū)的5′-末端處不包含5′-羥基(5′-OH)或5′-磷酸基的任何化學(xué)基團(tuán)，或用于使得有義鏈或有義區(qū)作為用于介導(dǎo)RNA干擾的引導(dǎo)序列無活性的任何其他基團(tuán)。此種siNA構(gòu)建體的非限制性例子在本文中得到描述，例如“Stab 9/10”、“Stab 7/8”、“Stab 7/19”、“Stab 17/22”、“Stab 23/24”、“Stab 24/25”和“Stab 24/26”(例如，具有Stab 7、9、17、23或24有義鏈的任何siNA)化學(xué)及其變體(參見表IV)，其中siNA的有義鏈的5′-末端和3′-末端不包含羥基或磷酸基。在本文中，數(shù)字Stab化學(xué)包括表IV中所示化學(xué)的2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于篩選在介導(dǎo)針對靶核酸序列的RNA干擾中有活性的siNA分子的方法，其包括(a)產(chǎn)生多個未修飾的siNA分子，(b)在適合于分離在介導(dǎo)針對靶核酸序列的RNA干擾中有活性的siNA分子的條件下，篩選步驟(a)的siNA分子，和(c)將化學(xué)修飾(例如，如本文所描述的或如本領(lǐng)域其他方面已知的化學(xué)修飾)引入(b)的活性siNA分子內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在適合于分離在介導(dǎo)針對靶核酸序列的RNA干擾中有活性的化學(xué)修飾的siNA分子的條件下，再次篩選步驟(c)的化學(xué)修飾的siNA分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于篩選在介導(dǎo)針對靶核酸序列的RNA干擾中有活性的化學(xué)修飾的siNA分子的方法，其包括(a)產(chǎn)生多個化學(xué)修飾的siNA分子(例如，如本文所描述的或如本領(lǐng)域其他方面已知的siNA分子)，和(b)在適合于分離在介導(dǎo)針對靶核酸序列的RNA干擾中有活性的化學(xué)修飾的siNA分子的條件下，篩選步驟(a)的siNA分子。
術(shù)語“配體”指任何化合物或分子，例如藥物、肽、激素或神經(jīng)遞質(zhì)，其能夠與另一種化合物例如受體直接或間接地相互作用。與配體相互作用的受體可以存在于細(xì)胞表面上，或可替代地可以是細(xì)胞間受體。配體與受體的相互作用可以導(dǎo)致生化反應(yīng)，或可以僅僅是物理相互作用或結(jié)合。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有改善的生物利用率的本發(fā)明siNA分子的方法，其包括(a)將賦形劑制劑引入siNA分子，和(b)在適合于分離具有改善的生物利用率的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。此種賦形劑包括聚合物例如環(huán)糊精、脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)、聚胺、磷脂、納米顆粒、受體、配體等。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于產(chǎn)生具有改善的生物利用率的本發(fā)明siNA分子的方法，其包括(a)將將具有式I-VII中任何一個或其任何組合的核苷酸引入siNA分子內(nèi)，和(b)在適合于分離具有改善的生物利用率的siNA分子的條件下，測定步驟(a)的siNA分子。
在另一個實(shí)施方案中，聚乙二醇(PEG)可以與本發(fā)明的siNA化合物共價(jià)附著。附著的PEG可以是任何分子量，優(yōu)選約100-約50,000道爾頓(Da)。
本發(fā)明可以單獨(dú)或作為試劑盒的組分使用，所述試劑盒具有執(zhí)行在體外或體內(nèi)將RNA引入測試樣品和/或受試者所必需的至少一種試劑。例如，試劑盒的優(yōu)選組分包括本發(fā)明的siNA分子和如本文所描述的促進(jìn)siNA引入目的細(xì)胞內(nèi)的媒介物(例如，使用脂質(zhì)和本領(lǐng)域已知的其他轉(zhuǎn)染方法，參見例如Beigelman等人，US 6,395,713)。該試劑盒可以例如在確定基因功能和/或活性，或在藥物最優(yōu)化中，和在藥物發(fā)現(xiàn)中用于靶確認(rèn)(參見例如Usman等人，USSN 60/402,996)。此種試劑盒還可以包括說明書以允許試劑盒用戶實(shí)踐本發(fā)明。
如本文所使用的，術(shù)語“短干擾核酸”、“siNA”、“短干擾RNA”、“siRNA”、“短干擾核酸分子”、“短干擾寡核苷酸分子”或“化學(xué)修飾的短干擾核酸分子”指能夠通過介導(dǎo)RNA干擾“RNAi”或基因沉默以序列特異性方式抑制或下調(diào)基因表達(dá)或病毒復(fù)制的任何核酸分子。這些術(shù)語可以指單個核酸分子、多個此種核酸分子、或此種核酸分子庫。siNA可以是包含自互補(bǔ)的有義和反義區(qū)的雙鏈核酸分子，其中所述反義區(qū)包含與靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且有義區(qū)具有對應(yīng)于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siNA可以由2個分開的寡核苷酸裝配，其中一條鏈?zhǔn)怯辛x鏈而另一條是反義鏈，其中所述反義和有義鏈?zhǔn)亲曰パa(bǔ)的(即，每條鏈包含與另一條鏈中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；例如其中反義鏈和有義鏈形成雙鏈體或雙鏈結(jié)構(gòu)，例如其中雙鏈區(qū)為約15個-約30個，例如約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個堿基對；反義鏈包含與靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且有義鏈包含對應(yīng)于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列(例如，siNA分子的約15個-約25個或更多核苷酸與靶核酸或其部分互補(bǔ))?？商娲兀瑂iNA由單個寡核苷酸裝配，其中所述siNA的自互補(bǔ)的有義和反義區(qū)通過一種或多種基于核酸或非基于核酸的接頭進(jìn)行連接。siNA可以是具有雙鏈體、不對稱的雙鏈體、發(fā)夾或不對稱的發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)、具有自互補(bǔ)的有義和反義區(qū)的多核苷酸，其中所述反義區(qū)包含與分開的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且有義區(qū)具有對應(yīng)于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siNA可以是具有2個或更多環(huán)結(jié)構(gòu)和包含自互補(bǔ)的有義和反義區(qū)的莖的環(huán)狀單鏈多核苷酸，其中所述反義區(qū)包含與靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且有義區(qū)具有對應(yīng)于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，且其中環(huán)狀多核苷酸可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行加工以產(chǎn)生能夠介導(dǎo)RNAi的活性siNA分子。siNA還可以包含具有與靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)的核苷酸序列的單鏈多核苷酸(例如，其中此種siNA分子不需要在siNA分子內(nèi)存在對應(yīng)于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列)，其中所述單鏈多核苷酸可以進(jìn)一步包含末端磷酸基，例如5′-磷酸(參見例如Martinez等人，2002，Cell.，110，563-574和Schwarz等人，2002，Molecular Cell，10，537-568)或5’，3’-二磷酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含分開的有義和反義序列或區(qū)，其中所述有義和反義區(qū)通過如本領(lǐng)域已知的核苷酸或非核苷酸接頭分子進(jìn)行共價(jià)連接，或可替代地通過離子相互作用、氫鍵合、范德瓦爾斯(van der waals)相互作用、疏水作用和/或堆積相互作用進(jìn)行非共價(jià)連接。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含與靶基因的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子以引起靶基因表達(dá)抑制的方式與靶基因的核苷酸序列相互作用。如本文所使用的，siNA分子無需限于僅包含RNA的那些分子，而是進(jìn)一步包含化學(xué)修飾的核苷酸和非核苷酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的短干擾核酸分子缺乏含2′-羥基(2′-OH)的核苷酸。申請人在某些實(shí)施方案中描述了不需要存在具有2′-羥基的核苷酸用于介導(dǎo)RNAi的短干擾核酸，并且照這樣，本發(fā)明的短干擾核酸分子任選地不包括任何核糖核苷酸(例如，具有2′-OH基團(tuán)的核苷酸)。然而，在siNA分子內(nèi)不需要存在核糖核苷酸以支持RNAi的此種siNA分子可以具有一種或多種附著的接頭或其他附著或結(jié)合的基團(tuán)、部分、或包含一個或多個具有2′-OH基團(tuán)的核苷酸的鏈。任選地，siNA分子可以在約5、10、20、30、40或50％的核苷酸位置處包含核糖核苷酸。本發(fā)明的經(jīng)修飾的短干擾核酸分子還可以稱為短干擾經(jīng)修飾的寡核苷酸“siMON”。如本文所使用的，術(shù)語siNA意欲等價(jià)于用于描述能夠介導(dǎo)序列特異性RNAi的核酸分子的其他術(shù)語，例如短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、短干擾寡核苷酸、短干擾核酸、短干擾經(jīng)修飾的寡核苷酸、化學(xué)修飾的siRNA、轉(zhuǎn)錄后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。本發(fā)明的siNA分子的非限制性例子顯示于本文的圖4-6、以及表II和III中。此種siNA分子不同于本領(lǐng)域已知的介導(dǎo)基因表達(dá)抑制的其他核酸技術(shù)，例如核酶、反義、三鏈體形成、適體、2，5-A嵌合體或誘餌寡核苷酸。
“RNA干擾”或“RNAi”意指如本領(lǐng)域一般已知的且由短干擾核酸分子介導(dǎo)的抑制或下調(diào)細(xì)胞中的基因表達(dá)的生物過程，參見例如Zamore和Haley，2005，Science，309，1519-1524；Vaughn和Martienssen，2005，Science，309，1525-1526；Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等人，2001，Nature，411，494-498；和Kreutzer等人，國際PCT公開號WO00/44895；Zernicka-Goetz等人，國際PCT公開號WO 01/36646；Fire，國際PCT公開號WO 99/32619；Plaetinck等人，國際PCT公開號WO00/01846；Mello和Fire，國際PCT公開號WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，國際PCT公開號WO 99/07409；和Li等人，國際PCT公開號WO 00/44914；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science，297，2232-2237；Hutvagner和Zamore，2002，Science，297，2056-60；McManus等人，2002，RNA，8，842-850；Reinhart等人，2002，Gene&Dev.，16，1616-1626；和Reinhart和Bartel，2002，Science，297，1831)。此外，如本文所使用的，術(shù)語RNAi意欲等價(jià)于用于描述序列特異性RNA干擾的其他術(shù)語，例如轉(zhuǎn)錄后基因沉默、翻譯抑制、轉(zhuǎn)錄抑制或表觀遺傳學(xué)(epigenetics)。例如，本發(fā)明的siNA分子可以用于在轉(zhuǎn)錄后水平或轉(zhuǎn)錄前水平上表觀遺傳地沉默基因。在非限制性例子中，基因表達(dá)經(jīng)由本發(fā)明的siNA分子的表觀遺傳調(diào)節(jié)可以起因于siNA介導(dǎo)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾或甲基化模式以改變基因表達(dá)(參見，例如，Verdel等人，2004，Science，303，672-676；Pal-Bhadra等人，2004，Science，303，669-672；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science，297，2232-2237)。在另一個非限制性例子中，基因表達(dá)經(jīng)由本發(fā)明的siNA分子的調(diào)節(jié)可以起因于siNA經(jīng)由RISC介導(dǎo)的RNA(編碼或非編碼RNA)切割，或可替代地，如本領(lǐng)域已知的翻譯抑制。在另一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)經(jīng)由本發(fā)明的siNA分子的調(diào)節(jié)可以起因于轉(zhuǎn)錄抑制(參見例如Janowski等人，2005，Nature ChemicalBiology，1，216-222)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子是雙鏈體形成寡核苷酸“DFO”，(參見例如圖14-15以及于2003年12月3日提交的Vaish等人，USSN 10/727,780和于2004年5月24日提交的國際PCT申請?zhí)朥S04/16390)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子是多功能siNA(參見例如圖16-21以及于2004年2月10日提交的Jadhav等人，USSN 60/543,480和與2004年5月24日提交的國際PCT申請?zhí)朥S04/16390)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能siNA可以包含靶向例如靶RNA的2個或更多區(qū)域的序列(參見例如表II和III中的靶序列)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能siNA可以包含靶向HCV RNA和涉及HCV生活周期(lifecyle)的一種或多種細(xì)胞靶的序列，所述細(xì)胞靶例如細(xì)胞受體、細(xì)胞表面分子、細(xì)胞酶、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和/或細(xì)胞因子、第二信使、和細(xì)胞輔助分子包括但不限于，La抗原(參見例如Costa-Mattioli等人，2004，Mol Cell Biol.，24，6861-70，例如，Genbank登記號NM_003142)(例如，干擾素調(diào)節(jié)因子(IRFs；例如，Genbank登記號AF082503.1)；細(xì)胞PKR蛋白激酶(例如，Genbank登記號XM_002661.7)；人真核起始因子2B(elF2Bγ；例如，Genbank登記號AF256223和/或elF2γ；例如，Genbank登記號NM_006874.1)；人DEAD Box蛋白質(zhì)(DDX3；例如，Genbank登記號XM_018021.2)；和與HCV 3′-UTR的聚尿苷酸片結(jié)合的細(xì)胞蛋白質(zhì)，例如多嘧啶片結(jié)合蛋白(例如，Genbank登記號NM_031991.1和XM_042972.3)。
如本文所使用的，“不對稱發(fā)夾”意指包含反義區(qū)、可以包含核苷酸或非核苷酸的環(huán)部分、和有義區(qū)的線性siNA分子，所述有義區(qū)包含比反義區(qū)更少的核苷酸，其程度至有義區(qū)具有足夠的互補(bǔ)核苷酸以與反義區(qū)堿基配對且形成具有環(huán)的雙鏈體。例如，本發(fā)明的不對稱的發(fā)夾siNA分子可以包含具有足夠的長度以在細(xì)胞或體外系統(tǒng)中介導(dǎo)RNAi的反義區(qū)(例如約15個-約30個，或約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個核苷酸)和包含約4個-約12個(例如，約4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或12個)核苷酸的環(huán)區(qū)域、和具有與反義區(qū)互補(bǔ)的約3個-約25個(例如，約3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個)核苷酸的有義區(qū)。不對稱的發(fā)夾siNA分子還可以包含5′-末端磷酸基，其可以是化學(xué)修飾的。不對稱的發(fā)夾siNA分子的環(huán)部分可以包含如本文所描述的核苷酸、非核苷酸、接頭分子或綴合分子。
如本文所使用的，“不對稱的雙鏈體”意指具有2條分開的鏈的siNA分子，所述鏈包含有義區(qū)和反義區(qū)，其中所述有義區(qū)包含比反義區(qū)更少的核苷酸，其程度至有義區(qū)具有足夠的互補(bǔ)核苷酸以與反義區(qū)堿基配對且形成雙鏈體。例如，本發(fā)明的不對稱的雙鏈體siNA分子可以包含具有足夠的長度以在細(xì)胞或體外系統(tǒng)中介導(dǎo)RNAi的反義區(qū)(例如約15個-約30個，或約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個核苷酸)、和具有與反義區(qū)互補(bǔ)的約3個-約25個(例如，約3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個)核苷酸的有義區(qū)。
“RNAi抑制劑”意指可以在細(xì)胞或生物中下調(diào)、減少或抑制RNA干擾功能或活性的任何分子。RNAi抑制劑可以下調(diào)、減少或抑制RNAi(例如RNAi介導(dǎo)的靶多核苷酸的切割、翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄沉默)，其通過與RNAi途徑的任何組分相互作用或干擾RNAi途徑的任何組分的功能實(shí)現(xiàn)，所述組分包括蛋白質(zhì)組分例如RISC、或核酸組分例如miRNAs或siRNAs。RNAi抑制劑可以是siNA分子，反義分子，適體，或者與RISC、miRNA、或siRNA或細(xì)胞或生物中的RNAi途徑的任何其他組分相互作用、或干擾RISC、miRNA、或siRNA或細(xì)胞或生物中的RNAi途徑的任何其他組分的功能的小分子。通過抑制RNAi(例如RNAi介導(dǎo)的靶多核苷酸的切割、翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄沉默)，本發(fā)明的RNAi抑制劑可以用于調(diào)節(jié)(例如上調(diào)或下調(diào))靶基因的表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA抑制劑經(jīng)由翻譯抑制、轉(zhuǎn)錄沉默、或RISC介導(dǎo)的多核苷酸(例如，mRNA)的切割，通過干擾(例如減少或阻止)基因表達(dá)的內(nèi)源性下調(diào)或抑制用于上調(diào)基因表達(dá)。通過干擾基因表達(dá)的內(nèi)源阻遏、沉默或抑制機(jī)制，本發(fā)明的RNAi抑制劑因而可以用于上調(diào)基因表達(dá)以治療起因于功能喪失的疾病、性狀或狀況。在一個實(shí)施方案中，術(shù)語“RNAi抑制劑”用于代替本文的各種實(shí)施方案中的術(shù)語“siNA”，例如具有增加基因表達(dá)的作用用于治療功能喪失疾病、性狀和/或狀況。
如本文所使用的，“適體”或“核酸適體”意指與靶分子特異性結(jié)合的多核苷酸，其中核酸分子具有與由靶分子在其天然背景中識別的序列不同的序列。可替代地，適體可以是與靶分子結(jié)合的核酸分子，其中靶分子不與核酸天然結(jié)合。靶分子可以是任何目的分子。例如，適體可以用于與蛋白質(zhì)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而阻止天然存在的配體與蛋白質(zhì)的相互作用。這是非限制性例子，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到使用本領(lǐng)域一般已知的技術(shù)可以容易地產(chǎn)生其他實(shí)施方案，參見例如Gold等人，1995，Annu.Rev.Biochem.，64，763；Brody和Gold，2000，J.Biotechnol.，74，5；Sun，2000，Curr.Opin.Mol.Ther.，2，100；Kusser，2000，J.Biotechnol.，74，27；Hermann和Patel，2000，Science，287，820；和Jayasena，1999，Clinical Chemistry，45，1628。本發(fā)明的適體分子可以如本領(lǐng)域一般已知的或如本文描述的進(jìn)行化學(xué)修飾。
如本文所使用的，術(shù)語“反義核酸”指這樣的核酸分子，其通過RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白質(zhì)核酸；Egholm等人，1993Nature 365，566)相互作用與靶RNA結(jié)合，并且通過空間相互作用或通過RNA酶H介導(dǎo)的靶識別改變靶RNA的活性(關(guān)于綜述，參見Stein和Cheng，1993 Science 261，1004和Woolf等人，美國專利號5,849,902)。一般地，反義分子沿著反義分子的單個鄰接序列與靶序列互補(bǔ)。然而，在某些實(shí)施方案中，反義分子可以與底物結(jié)合，從而使得底物分子形成環(huán)，和/或反義分子可以結(jié)合，從而使得反義分子形成環(huán)。因此，反義分子可以與2個(或甚至更多)非鄰接的底物序列互補(bǔ)，或反義分子的2個(或甚至更多)非鄰接的序列部分可以與靶序列或2者互補(bǔ)。關(guān)于目前的反義策略的綜述，參見Schmajuk等人，1999，J.Biol.Chem.，274，21783-21789，Delihas等人，1997，Nature，15，751-753，Stein等人，1997，Antisense N.A.Drug Dev.，7，151，Crooke，2000，MethodsEnzymol.，313，3-45；Crooke，1998，Biotech.genet.Eng.Rev.，15，121-157，Crooke，1997，Ad.Pharmacol.，40，1-49。此外，由2’-MOE和如本領(lǐng)域已知的其他修飾進(jìn)行修飾的反義DNA或反義可以通過DNA-RNA相互作用用于靶向RNA，從而激活RNA酶H，所述RNA酶H消化雙鏈體中的靶RNA。反義寡核苷酸可以包含一個或多個RNA酶H激活區(qū)，其能夠激活靶RNA的RNA酶H切割。反義DNA可以經(jīng)由使用單鏈DNA表達(dá)載體或其等價(jià)物進(jìn)行化學(xué)合成或表達(dá)。本發(fā)明的反義分子可以如本領(lǐng)域一般已知的或如本文描述的進(jìn)行化學(xué)修飾。
“調(diào)節(jié)”意指基因表達(dá)、或編碼一種或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的RNA分子或等價(jià)RNA分子的水平、或一種或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的活性得到上調(diào)或下調(diào)，從而使得表達(dá)、水平或活性大于或小于在不存在調(diào)節(jié)劑的情況下觀察到的那種。例如，術(shù)語“調(diào)節(jié)”可以意指“抑制”，但措辭“調(diào)節(jié)”的用途不限于這個定義。
“抑制”、“下調(diào)”或“減少”意指基因表達(dá)、或編碼一種或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的RNA分子或等價(jià)RNA分子的水平、或一種或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的活性減少低于在不存在本發(fā)明的核酸分子(例如，siNA)的情況下觀察到的那種。在一個實(shí)施方案中，由siNA分子的抑制、下調(diào)或減少低于在無活性或減弱的分子的存在下觀察到的那種水平。在另一個實(shí)施方案中，由siNA分子的抑制、下調(diào)或減少低于在例如具有雜亂序列或具有錯配的siNA分子的存在下觀察到的那種水平。在另一個實(shí)施方案中，由本發(fā)明的核酸分子抑制、下調(diào)或減少基因表達(dá)在核酸分子的存在下大于在不存在其的情況下。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)的抑制、下調(diào)或減少與轉(zhuǎn)錄后沉默，例如RNAi介導(dǎo)的靶核酸分子(例如RNA)切割或翻譯抑制相關(guān)。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)的抑制、下調(diào)或減少與轉(zhuǎn)錄前沉默相關(guān)，例如通過DNA甲基化模式和DNA染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中的改變。
“上調(diào)”或“促進(jìn)”意指基因表達(dá)、或編碼一種或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的RNA分子或等價(jià)RNA分子的水平、或一種或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的活性增加高于在不存在本發(fā)明的核酸分子(例如，siNA)的情況下觀察到的那種。在一個實(shí)施方案中，由siNA分子上調(diào)或促進(jìn)基因表達(dá)高于在無活性或減弱的分子的存在下觀察到的那種水平。在另一個實(shí)施方案中，由siNA分子上調(diào)或促進(jìn)基因表達(dá)高于在例如具有雜亂序列或具有錯配的siNA分子的存在下觀察到的那種水平。在另一個實(shí)施方案中，由本發(fā)明的核酸分子上調(diào)或促進(jìn)基因表達(dá)在核酸分子的存在下大于在不存在其的情況下。在一個實(shí)施方案中，基因表達(dá)的上調(diào)或促進(jìn)與RNA介導(dǎo)的基因沉默抑制相關(guān)，例如RNAi介導(dǎo)的編碼或非編碼RNA靶的切割或沉默，其下調(diào)、抑制或沉默待上調(diào)的目的基因的表達(dá)?；虮磉_(dá)的下調(diào)可以例如由編碼RNA或其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)，例如通過負(fù)反饋或拮抗作用。基因表達(dá)的下調(diào)可以例如由對目的基因具有調(diào)節(jié)控制的非編碼RNA進(jìn)行誘導(dǎo)，例如經(jīng)由翻譯抑制、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、甲基化、RISC介導(dǎo)的RNA切割或翻譯抑制通過沉默基因表達(dá)。照這樣，下調(diào)、抑制或沉默目的基因的靶的抑制或下調(diào)可以用于上調(diào)或促進(jìn)目的基因朝向治療用途表達(dá)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNAi抑制劑通過抑制RNAi或基因沉默用于上調(diào)基因表達(dá)。例如，本發(fā)明的RNAi抑制劑通過上調(diào)基因表達(dá)可以用于治療功能喪失疾病和狀況，例如在其中特定基因的一個等位基因具有導(dǎo)致由突變等位基因編碼的蛋白質(zhì)功能喪失的突變(例如，移碼、錯義或無義突變)的單倍性不足情況下。在此種情況下，RNAi抑制劑可以用于上調(diào)由野生型或功能等位基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)，從而通過補(bǔ)償突變體或無效等位基因校正單倍性不足。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子用于下調(diào)功能等位基因的毒性獲得的表達(dá)，而本發(fā)明的RNAi抑制劑伴隨地用于上調(diào)野生型或功能等位基因的表達(dá)，例如在本文或本領(lǐng)域其他方面已知的疾病、性狀或狀況治療中(參見例如Rhodes等人，2004，PNAS USA，10111147-11152和Meisler等人2005，The Journalof Clinical Investigation，1152010-2017)。
“基因”、或“靶基因”或“靶DNA”意指編碼RNA的核酸，例如核酸序列，包括但不限于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因。基因或靶基因還可以編碼功能RNA(fRNA)或非編碼RNA(ncRNA)，例如小時(shí)序RNA(stRNA)、微小RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、短干擾RNA(siRNA)、核仁小RNA(snRNA)、核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)及其前體RNAs。此種非編碼RNAs可以充當(dāng)在調(diào)節(jié)涉及功能或調(diào)節(jié)性細(xì)胞過程的fRNA或ncRNA活性中siNA介導(dǎo)的RNA干擾的靶核酸分子。導(dǎo)致疾病的異常fRNA或ncRNA活性因此可以通過本發(fā)明的siNA分子進(jìn)行調(diào)節(jié)。靶向fRNA和ncRNA的siNA分子也可以用于操作或改變受試者、生物或細(xì)胞的基因型或表型，其通過干預(yù)細(xì)胞過程例如遺傳印記、轉(zhuǎn)錄、翻譯或核酸加工(例如，轉(zhuǎn)氨基作用、甲基化等)實(shí)現(xiàn)。靶基因可以是衍生自細(xì)胞、內(nèi)源基因、轉(zhuǎn)基因或外源基因的基因，所述外源基因例如在感染其后存在于細(xì)胞中的病原體例如病毒的基因。包含靶基因的細(xì)胞可以衍生自或包含在任何生物中，例如植物、動物、原生動物、病毒、細(xì)菌或真菌。植物的非限制性例子包括單子葉植物、雙子葉植物或裸子植物。動物的非限制性例子包括脊椎動物或無脊椎動物。真菌的非限制性例子包括霉菌或酵母。關(guān)于綜述，參見例如Snyder和Gerstein，2003，Science，300，258-260。
“非規(guī)范堿基對”意指任何非沃森克里克堿基對，例如錯配和/或擺動堿基對，包括翻轉(zhuǎn)錯配(flipped mismatches)、單氫鍵錯配、反式類型錯配、三堿基相互作用、和四堿基相互作用。此種非規(guī)范堿基對的非限制性例子包括但不限于，AC反Hoogsteen、AC擺動、AU反Hoogsteen、GU擺動、AA N7氨基、CC 2-羰基-氨基(H1)-N3-氨基(H2)、GA剪切、UC 4-羰基-氨基、UU亞氨基-羰基、AC反擺動、AU Hoogsteen、AU反沃森克里克、CG反沃森克里克、CG N3-氨基-氨基N3、AA N1-氨基對稱、AA N7-氨基對稱、GA N7-N1氨基-羰基、GA+羰基-氨基N7-N1、GG N1-羰基對稱、GG N3-氨基對稱、CC羰基-氨基對稱、CC N3-氨基對稱、UU 2-羰基-亞氨基對稱、UU 4-羰基-亞氨基對稱、AA氨基-N3、AAN1-氨基、AC氨基2-羰基、AC N3-氨基、AC N7-氨基、AU氨基-4-羰基、AU N1-亞氨基、AU N3-亞氨基、AU N7-亞氨基、CC羰基-氨基、GA氨基-N1、GA氨基-N7、GA羰基-氨基、GA N3-氨基、GC氨基-N3、GC羰基-氨基、GC N3-氨基、GC N7-氨基、GG氨基-N7、GG羰基-亞氨基、GG N7-氨基、GU氨基-2-羰基、GU羰基-亞氨基、GU亞氨基-2-羰基、GUN7-亞氨基、psiU亞氨基-2-羰基、UC 4-羰基-氨基、UC亞氨基-羰基、UU亞氨基-4-羰基、AC C2-H-N3、GA羰基-C2-H、UU亞氨基-4-羰基2羰基-C5-H、AC氨基(A)N3(C)-羰基、GC亞氨基氨基-羰基、Gpsi亞氨基-2-羰基氨基-2-羰基和GU亞氨基氨基-2-羰基堿基對。
如本文所使用的，“HCV”意指任何丙型肝炎病毒或具有HCV活性的HCV蛋白質(zhì)、肽或多肽，例如由表I中顯示的HCV Genbank登記號編碼的。術(shù)語HCV還指編碼具有HCV活性的任何HCV蛋白質(zhì)、肽或多肽的核酸序列。術(shù)語“HCV”還意欲包括其他HCV編碼序列，例如其他HCV同工型、突變HCV基因、HCV基因的剪接變體和HCV基因多態(tài)。在一個實(shí)施方案中，如本文所使用的，術(shù)語HCV指細(xì)胞或宿主蛋白質(zhì)或編碼此種蛋白質(zhì)或以其他方式涉及HCV感染和/或復(fù)制的多核苷酸。
如本文所使用的，“靶”意指任何靶蛋白、肽或多肽，例如由本文以及USSN 10/923,536和USSN 10/923536的Genbank登記號編碼的，所述2個專利引入本文作為參考。術(shù)語“靶”還指編碼任何靶蛋白、肽或多肽的核酸序列或靶多核苷酸序列，例如由具有本文和/或美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/363,124、USSN 10/923,536和USSN PCT/US03/05028中顯示的Genbank登記號的序列編碼的蛋白質(zhì)、肽或多肽。目的靶可以包括靶多核苷酸序列，例如靶DNA或靶RNA。術(shù)語“靶”還意欲包括其他序列，例如相異同工型、突變靶基因、靶多核苷酸的剪接變體、靶多態(tài)和非編碼(例如，ncRNA、miRNA、stRNA)或如本文所描述的其他調(diào)節(jié)多核苷酸序列。因此，在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，與靶RNA具有互補(bǔ)性的本發(fā)明的雙鏈核酸分子(例如siNA)可以用于抑制或下調(diào)miRNA或其他ncRNA活性。在一個實(shí)施方案中，miRNA或ncRNA活性的抑制可以用于下調(diào)或抑制依賴于miRNA或ncRNA活性的基因表達(dá)(例如，本文描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的基因靶)或病毒復(fù)制(例如，本文描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的病毒靶)。在另一個實(shí)施方案中，通過與miRNA或ncRNA具有互補(bǔ)性的本發(fā)明的雙鏈核酸分子(例如siNA)抑制miRNA或ncRNA活性可以用于上調(diào)或促進(jìn)靶基因表達(dá)(例如，本文描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的基因靶)，其中此種基因的表達(dá)通過miRNA或ncRNA得到下調(diào)、抑制或沉默。基因表達(dá)的此種上調(diào)可以用于治療如本領(lǐng)域一般已知的與功能喪失或單倍性不足相關(guān)的疾病和狀況。
“途徑靶”或“宿主靶”意指涉及基因表達(dá)途徑或活性或細(xì)胞或宿主蛋白質(zhì)或編碼此種蛋白質(zhì)或以其他方式涉及HCV感染和/或復(fù)制的多核苷酸的任何靶。例如，任何給定靶都可以具有相關(guān)途徑或宿主靶，其可以包括生物途徑中的上游、下游或修飾基因。這些途徑和宿主靶基因可以在本文的疾病、狀況和性狀治療中提供加性或協(xié)同效應(yīng)。
在一個實(shí)施方案中，靶是任何靶RNA或其部分。
在一個實(shí)施方案中，靶是任何靶DNA或其部分。
在一個實(shí)施方案中，靶是任何靶mRNA或其部分。
在一個實(shí)施方案中，靶是任何靶miRNA或其部分。
在一個實(shí)施方案中，靶是任何靶siRNA或其部分。
在一個實(shí)施方案中，靶是任何靶stRNA或其部分。
在一個實(shí)施方案中，靶是靶和或途徑靶或其部分。
在一個實(shí)施方案中，靶是本文和/或美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/363,124、USSN 10/923,536和/或PCT/US03/05028中描述的任何(例如，一個或多個)靶序列或其部分。在一個實(shí)施方案中，靶是表I、II或III中顯示的任何(例如，一個或多個)靶序列或其部分。在另一個實(shí)施方案中，靶是對應(yīng)于表II或表III中顯示的任何(例如，一個或多個)靶、上部鏈或下部鏈序列或其部分的siRNA、miRNA或stRNA。在另一個實(shí)施方案中，靶是對應(yīng)于任何序列(例如，一個或多個)的任何siRNA、miRNA或stRNA，所述序列對應(yīng)于本文或美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/363,124、USSN10/923,536和/或PCT/US03/05028中描述的序列。
“同源序列”意指由一個或多個多核苷酸序列例如基因、基因轉(zhuǎn)錄物和/或非編碼多核苷酸共享的核苷酸序列。例如，同源序列可以是由編碼相關(guān)但不同的蛋白質(zhì)的2個或更多基因共享的核苷酸序列，例如基因家族的不同成員，不同的蛋白質(zhì)表位、不同的蛋白質(zhì)同工型或完全趨異的基因，例如細(xì)胞因子及其相應(yīng)受體。同源序列可以是由2種或更多非編碼多核苷酸共享的核苷酸序列，例如非編碼DNA或RNA、調(diào)節(jié)序列、內(nèi)含子、和轉(zhuǎn)錄控制或調(diào)節(jié)位點(diǎn)。同源序列還可以包括由超過一種多核苷酸序列共享的保守序列區(qū)。同源性無需是完全同源性(例如，100％)，因?yàn)椴糠滞吹男蛄幸灿杀景l(fā)明預(yù)期(例如，99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％等)。
“保守序列區(qū)”意指多核苷酸中的一個或多個區(qū)域的核苷酸序列在世代之間或從一個生物系統(tǒng)、受試者或生物到另一個生物系統(tǒng)、受試者或生物沒有明顯變化。多核苷酸可以包括編碼或非編碼DNA和RNA。
“有義區(qū)”意指與siNA分子的反義區(qū)具有互補(bǔ)性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的有義區(qū)可以包含與靶核酸序列具有同源性的核酸序列。在一個實(shí)施方案中，siNA分子的有義區(qū)稱為有義鏈或過客鏈。
“反義區(qū)”意指與靶核酸序列具有互補(bǔ)性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的反義區(qū)可以任選包含與siNA分子的有義區(qū)具有互補(bǔ)性的核酸序列。在一個實(shí)施方案中，siNA分子的反義區(qū)稱為反義鏈或引導(dǎo)鏈。
“靶核酸”或“靶多核苷酸”意指其表達(dá)或活性待調(diào)節(jié)的任何核酸序列(例如，任何靶和/或途徑靶序列)。靶核酸可以是DNA或RNA。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸是靶RNA或DNA。
“互補(bǔ)性”意指核酸可以通過傳統(tǒng)沃森-克里克或如本文所描述的其他非傳統(tǒng)類型與另一種核酸序列形成一個或多個氫鍵。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子例如siNA分子，其中每條鏈長度為15個-30個核苷酸，包含雙鏈核酸分子的2條鏈之間約10％-約100％(例如，約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)的互補(bǔ)性。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子例如siNA分子，其中一條鏈?zhǔn)怯辛x鏈且另一條鏈?zhǔn)欠戳x鏈，其中每條鏈長度為15個-30個核苷酸，包含在雙鏈核酸分子的反義鏈中的核苷酸序列及其相應(yīng)的靶核酸分子例如靶RNA或靶mRNA或病毒RNA的核苷酸序列之間至少約10％-約100％(例如，至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)的互補(bǔ)性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子例如siNA分子，其中一條鏈包含稱為有義區(qū)的核苷酸序列且另一條鏈包含稱為反義區(qū)的核苷酸序列，其中每條鏈長度為15個-30個核苷酸，包含在雙鏈核酸分子的有義區(qū)和反義區(qū)之間約10％-約100％(例如，約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)的互補(bǔ)性。提及本發(fā)明的核酸分子，關(guān)于核酸分子與其互補(bǔ)序列的結(jié)合自由能足以允許核酸的相關(guān)功能得以進(jìn)行，例如RNAi活性。關(guān)于核酸分子的結(jié)合自由能的測定是本領(lǐng)域眾所周知的(參見，例如，Turner等人，1987，CSH Symp.Quant.Biol.LII pp.123-133；Frier等人，1986，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 839373-9377；Turner等人，1987，J.Am.Chem.Soc.1093783-3785)。百分比互補(bǔ)性指示可以與第二種核酸序列形成氫鍵(例如，沃森-克里克堿基配對)的核酸分子中的鄰接殘基百分比(例如與具有10個核苷酸的第二種核酸序列堿基配對的第一種寡核苷酸中總共10個核苷酸中的5個、6個、7個、8個、9個或10個核苷酸分別代表50％、60％、70％、80％、90％和100％的互補(bǔ)性)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子在siNA分子的有義鏈或有義區(qū)和反義鏈或反義區(qū)之間具有完全互補(bǔ)性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子與相應(yīng)的靶核酸分子完全互補(bǔ)?！巴耆パa(bǔ)”意指核酸序列的所有鄰接殘基將與第二種核酸序列中相同數(shù)目的鄰接殘基氫鍵合。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含與一種或多種靶核酸分子或其部分互補(bǔ)的約15個-約30個或更多(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個或更多)核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子在siNA分子的有義鏈或有義區(qū)和反義鏈或反義區(qū)之間或在siNA分子的反義鏈或反義區(qū)和相應(yīng)的靶核酸分子之間具有部分互補(bǔ)性(即，小于100％的互補(bǔ)性)。例如，部分互補(bǔ)性可以包括在siNA結(jié)構(gòu)內(nèi)的各種錯配或非堿基配對的核苷酸(例如，1個、2個、3個、4個、5個或更多錯配或非堿基配對的核苷酸)，其可以導(dǎo)致在siNA分子的有義鏈或有義區(qū)和反義鏈或反義區(qū)之間或在siNA分子的反義鏈或反義區(qū)和相應(yīng)的靶核酸分子之間產(chǎn)生的凸起、環(huán)或突出端。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子例如siNA分子在核酸分子的有義鏈或有義區(qū)和反義鏈或反義區(qū)之間具有完全互補(bǔ)性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子例如siNA分子與相應(yīng)的靶核酸分子完全互補(bǔ)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子例如siNA分子在雙鏈核酸分子的有義鏈或有義區(qū)和反義鏈或反義區(qū)之間或在核酸分子的反義鏈或反義區(qū)和相應(yīng)的靶核酸分子之間具有部分互補(bǔ)性(即，小于100％的互補(bǔ)性)。例如，部分互補(bǔ)性可以包括在雙鏈核酸分子，結(jié)構(gòu)內(nèi)的各種錯配或非堿基配對的核苷酸(例如，1個、2個、3個、4個、5個或更多錯配或非堿基配對的核苷酸，例如核苷酸凸起)，其可以導(dǎo)致在雙鏈核酸分子的有義鏈或有義區(qū)和反義鏈或反義區(qū)之間或在雙鏈核酸分子的反義鏈或反義區(qū)和相應(yīng)的靶核酸分子之間產(chǎn)生的凸起、環(huán)或突出端。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈核酸分子是微小RNA(miRNA)?！拔⑿NA”或“miRNA”意指通過mRNA切割、翻譯阻遏/抑制或異染色質(zhì)沉默調(diào)節(jié)靶信使RNAs的表達(dá)的小雙鏈RNA(參見例如Ambros，2004，Nature，431，350-355；Bartel，2004，Cell，116，281-297；Cullen，2004，Virus Research.，102，3-9；He等人，2004，Nat.Rev.Genet.，5，522-531；Ying等人，2004，Gene，342，25-28；和Sethupathy等人，2006，RNA，12192-197)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的微小RNA在miRNA分子的有義鏈或有義區(qū)和反義鏈或反義區(qū)之間或在miRNA的反義鏈或反義區(qū)和相應(yīng)的靶核酸分子之間具有部分互補(bǔ)性(即，小于100％的互補(bǔ)性)。例如，部分互補(bǔ)性可以包括在雙鏈核酸分子，結(jié)構(gòu)內(nèi)的各種錯配或非堿基配對的核苷酸(例如，1個、2個、3個、4個、5個或更多錯配或非堿基配對的核苷酸，例如核苷酸凸起)，其可以導(dǎo)致在miRNA的有義鏈或有義區(qū)和反義鏈或反義區(qū)之間或在miRNA的反義鏈或反義區(qū)和相應(yīng)的靶核酸分子之間產(chǎn)生的凸起、環(huán)或突出端。
在一個實(shí)施方案中，下調(diào)或減少靶基因表達(dá)的本發(fā)明的siNA分子如本文所描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的用于治療、預(yù)防或減少受試者或生物中HCV感染、肝衰竭、肝細(xì)胞癌或肝硬化。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的每個序列長度獨(dú)立地為約15個-約30個核苷酸，在具體實(shí)施方案中長度為約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA雙鏈體獨(dú)立地包含約15個-約30個堿基對(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子的一條或多條鏈獨(dú)立地包含與靶核酸分子互補(bǔ)的約15個-約30個核苷酸(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)。在另外一個實(shí)施方案中，包含發(fā)夾或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的siNA分子長度為約35個-約55個(例如，約35個、40個、45個、50個或55個)核苷酸、或長度為約38個-約44個(例如，約38個、39個、40個、41個、42個、43個或44個)核苷酸且包含約15個-約25個(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個)堿基對。本發(fā)明的示例性siNA分子顯示于表II和III和/或圖4-5中。
如本文所使用的，“細(xì)胞”以其通常的生物學(xué)含義使用，并且不指完整多細(xì)胞生物，例如具體地不指人。細(xì)胞可以存在于生物內(nèi)，例如鳥類、植物和哺乳動物，例如人、牛、羊、猿、猴、豬、狗和貓。細(xì)胞可以是原核的(例如，細(xì)菌細(xì)胞)或真核的(例如，哺乳動物或植物細(xì)胞)。細(xì)胞可以具有體細(xì)胞或種系起源、全能或多能、分裂或非分裂。細(xì)胞還可以衍生自或可以包含配子或胚胎、干細(xì)胞、或完全分化的細(xì)胞。細(xì)胞可以是如本領(lǐng)域一般公認(rèn)的分離的細(xì)胞、純化的細(xì)胞或基本上純化的細(xì)胞。
本發(fā)明的siNA分子可以直接添加，或可以與陽離子脂質(zhì)復(fù)合，包裝在脂質(zhì)體內(nèi)，或以其他方式遞送給靶細(xì)胞或組織。核酸或核酸復(fù)合物可以先體外后體內(nèi)、或在體內(nèi)通過局部遞送給肺局部地施用于相關(guān)組織，包括或不包括其摻入生物聚合物中。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含表II和III和/或圖4-5中顯示的序列。此種核酸分子的例子基本上由這些表和圖中限定的序列組成。此外，表IV中描述的化學(xué)修飾的構(gòu)建體和表VI中顯示的脂質(zhì)納米顆粒(LNP)制劑可以應(yīng)用于本發(fā)明的任何siNA序列或siNA序列組。
在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的一種或多種siNA分子的哺乳動物細(xì)胞。一種或多種siNA分子可以獨(dú)立地被靶向本發(fā)明的靶多核苷酸內(nèi)的相同或不同位點(diǎn)。
“RNA”意指包含至少一種核糖核苷酸殘基的分子。“核糖核苷酸”意指在β-D-呋喃核糖部分的2′位置處具有羥基的核苷酸。該術(shù)語包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA例如部分純化的RNA、基本上純的RNA、合成RNA、重組產(chǎn)生的RNA、以及通過一個或多個核苷酸的添加、缺失、置換和/或改變不同于天然存在的RNA的改變的RNA。此種改變可以包括添加非核苷酸材料，例如向siNA的一個或多個末端或內(nèi)部，例如在RNA的一個或多個核苷酸處。本發(fā)明的RNA分子中的核苷酸還可以包含非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化學(xué)合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些改變的RNAs可以稱為類似物或天然存在的RNA的類似物。
“受試者”意指其是外植細(xì)胞的供體或受體或細(xì)胞自身的生物。“受試者”還指本發(fā)明的核酸分子可以施用于其的生物。受試者可以是哺乳動物或哺乳動物細(xì)胞，包括人或人細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，受試者是嬰兒(例如，小于1個月大，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月大的受試者)。在一個實(shí)施方案中，受試者是初學(xué)走路的孩子(例如，1、2、3、4、5或6歲大)。在一個實(shí)施方案中，受試者是老人(例如，超過約65歲年齡的任何人)。
如本文所使用的，“化學(xué)修飾”意指與天然siRNA或RNA的核苷酸不同的核苷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)的任何修飾。術(shù)語“化學(xué)修飾”包含天然siRNA或RNA核苷和核苷酸由經(jīng)修飾的核苷和經(jīng)修飾的核苷酸如本文所描述的或如本領(lǐng)域其他方面已知的添加、置換或修飾。此種化學(xué)修飾的非限制性例子包括但不限于，具有本文的式I、II、III、IV、V、VI或VII中的任何一個的組合物，硫代磷酸酯核苷酸間鍵，2′-脫氧核糖核苷酸，2′-O-甲基核糖核苷酸，2′-脫氧-2′-氟核糖核苷酸，4′-硫代核糖核苷酸，2′-O-三氟甲基核苷酸，2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸，2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(參見例如于2004年11月5日提交的USSN 10/981,966，引入本文作為參考)，F(xiàn)ANA，“通用堿基”核苷酸，“無環(huán)”核苷酸，5-C-甲基核苷酸，末端甘油基和/或反向脫氧脫堿基殘基摻入，或具有本文的式I-VII中任何一個的修飾。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子(例如，dsRNA、siNA等)是被化學(xué)修飾部分修飾的(例如，約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％修飾的)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子(例如，dsRNA、siNA等)是被化學(xué)修飾完全修飾的(例如，約100％修飾的)。
如本文所使用的，術(shù)語“硫代磷酸酯”指具有式I的核苷酸間鍵，其中Z和/或W包含硫原子。因此，術(shù)語硫代磷酸酯指硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
如本文所使用的，術(shù)語“膦酰乙酸酯”指具有式I的核苷酸間鍵，其中Z和/或W包含乙酰基或保護(hù)的乙?；?。
如本文所使用的，術(shù)語“硫代膦酰乙酸酯”指具有式I的核苷酸間鍵，其中Z包含乙?；虮Ｗo(hù)的乙?；襑包含硫原子，或可替代地W包含乙酰基或保護(hù)的乙?；襔包含硫原子。
如本文所使用的，術(shù)語“通用堿基”指與每個天然DNA/RNA堿基形成堿基對的核苷酸堿基類似物，而在它們之間只有很少的區(qū)別。通用堿基的非限制性例子包括C-苯基、C-萘基和其他芳族衍生物、肌苷、吡咯氨甲酰和硝基吡咯衍生物例如如本領(lǐng)域已知的3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚(參見例如Loakes，2001，Nucleic AcidsResearch，29，2437-2447)。
如本文所使用的，術(shù)語“無環(huán)核苷酸”指具有無環(huán)核糖的任何核苷酸，例如其中核糖碳(C1、C2、C3、C4或C5)中任何一個獨(dú)立地或組合地在核苷酸中不存在。
本發(fā)明的核酸分子獨(dú)立地、或與其他藥物組合或結(jié)合可以用于預(yù)防或治療受試者或生物中本文描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的疾病、病癥、狀況和性狀。例如，siNA分子可以在適合于治療的條件下獨(dú)立地或與一種或多種藥物組合施用于受試者，或可以施用于對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其他合適的細(xì)胞。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子可以在適合于治療的條件下獨(dú)立地或與一種或多種藥物組合施用于受試者，或可以施用于對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其他合適的細(xì)胞。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，siNA分子可以與其他已知治療組合用于預(yù)防或治療受試者或生物中。例如，所描述的分子可以與一種或多種已知化合物、治療或操作組合用于預(yù)防或治療如本領(lǐng)域已知的受試者或生物中疾病、病癥、狀況和性狀。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于以允許siNA分子表達(dá)的方式包含編碼本發(fā)明的至少一種siNA分子的核酸序列的表達(dá)載體。例如，載體可以包含編碼siNA分子的2條鏈的一種或多種序列，所述siNA分子包含雙鏈體。載體還可以包含編碼單個核酸分子的一種或多種序列，所述單個核酸分子是自互補(bǔ)的且因此形成siNA分子。此種表達(dá)載體的非限制性例子在Paul等人，2002，Nature Biotechnology，19，505；Miyagishi和Taira，2002，Nature Biotechnology，19，497；Lee等人，2002，NatureBiotechnology，19，500；和Novina等人，2002，Nature Medicine，預(yù)先在線公開doi10.1038/nm725中得到描述。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包括本發(fā)明的表達(dá)載體的哺乳動物細(xì)胞，例如人細(xì)胞。
在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體包含關(guān)于與RNA分子具有互補(bǔ)性的siNA分子的序列，所述RNA分子通過Genbank登記號提及，例如本文或美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/363,124、USSN 10/923,536和/或PCT/US03/05028中描述的Genbank登記號。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體包含編碼2種或更多siNA分子的核酸序列，所述siNA分子可以是相同或不同的。
在本發(fā)明的另一個方面，與靶RNA分子相互作用且下調(diào)編碼靶RNA分子(例如在本文中通過Genbank登記號提及的靶RNA分子)的基因的siNA分子由插入到DNA或RNA載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)。重組載體可以是DNA質(zhì)?；虿《据d體。表達(dá)siNA的病毒載體可以基于但不限于下述進(jìn)行構(gòu)建腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或甲病毒。能夠表達(dá)siNA分子的重組載體可以如本文所描述的進(jìn)行遞送，且在靶細(xì)胞中持續(xù)?？商娲?，可以使用提供siNA分子的瞬時(shí)表達(dá)的病毒載體。必要時(shí)此種載體可以重復(fù)施用。一旦被表達(dá)，siNA分子就經(jīng)由RNA干擾(RNAi)結(jié)合且下調(diào)基因功能或表達(dá)。siNA表達(dá)載體的遞送可以是全身性的，例如通過靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用，通過施用于來自受試者外植(ex-planted)的靶細(xì)胞隨后重新引入受試者內(nèi)，或通過將允許引入所需靶細(xì)胞內(nèi)的任何其他方式。
“載體”意指用于遞送所需核酸的任何基于核酸和/或病毒的技術(shù)。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)由于其優(yōu)選實(shí)施方案的下列描述和由于權(quán)利要求將是顯而易見的。
附圖簡述 圖1顯示了用于合成siNA分子的方案的非限制性例子?；パa(bǔ)的siNA序列鏈，鏈1和鏈2串聯(lián)合成，且通過可切割鍵例如核苷酸琥珀酸酯或脫堿基琥珀酸酯進(jìn)行連接，所述可切割鍵可以與用于在固體支持體上的固相合成的可切割接頭相同或不同。合成可以是固相或液相，在顯示的實(shí)例中，合成是固相合成。合成這樣進(jìn)行從而使得保護(hù)基團(tuán)例如二甲氧三苯甲基在串聯(lián)寡核苷酸的末端核苷酸上保持完整。寡核苷酸切割和脫保護(hù)后，2條siNA鏈自發(fā)地雜交以形成siNA雙鏈體，其允許通過利用末端保護(hù)基團(tuán)的性質(zhì)純化雙鏈體，例如通過應(yīng)用其中僅分離具有末端保護(hù)基團(tuán)的雙鏈體/寡核苷酸的三苯甲基依賴純化法。
圖2顯示了通過本發(fā)明方法合成的純化siNA雙鏈體的MALDI-TOF質(zhì)譜。顯示的2個峰對應(yīng)于分開的siNA序列鏈的預(yù)測質(zhì)量。這個結(jié)果證實(shí)由串聯(lián)合成產(chǎn)生的siNA雙鏈體可以作為單個實(shí)體使用簡單的三甲苯基依賴純化法進(jìn)行純化。
圖3顯示了涉及RNAi的靶RNA降解的非限制性被提議的機(jī)制代表。通過依賴于RNA的RNA聚合酶(RdRP)由外來單鏈RNA產(chǎn)生的雙鏈RNA(dsRNA)激活切酶(DICER)，所述切酶依次產(chǎn)生siNA雙鏈體，所述外來單鏈RNA例如病毒、轉(zhuǎn)座子或其他外源RNA。可替代地，合成或表達(dá)的siNA可以通過合適的方法直接引入細(xì)胞內(nèi)。形成識別靶RNA的活性siNA復(fù)合物，從而導(dǎo)致通過RISC內(nèi)切核酸酶復(fù)合物降解靶RNA或?qū)е峦ㄟ^依賴于RNA的RNA聚合酶(RdRP)合成另外的RNA，其可以激活切酶且導(dǎo)致另外的siNA分子，從而擴(kuò)大RNAi應(yīng)答。
圖4A-F顯示了本發(fā)明的化學(xué)修飾的siNA構(gòu)建體的非限制性例子。在該圖中，N代表任何核苷酸(腺苷、鳥苷、胞嘧啶、尿苷或任選地胸苷，例如胸苷可以在由圓括號指定的突出端區(qū)域(N N)中被取代。顯示了關(guān)于siNA構(gòu)建體的有義和反義鏈的各種修飾。(N N)核苷酸位置可以如本文所描述的進(jìn)行化學(xué)修飾(例如，2′-O-甲基，2′-脫氧-2′-氟等)且可以衍生自或不衍生自相應(yīng)的靶核酸序列(參見例如圖6C)。此外，圖4中顯示的序列可以任選包括在來自有義鏈的5′-末端的第9位，或通過從引導(dǎo)鏈的5′-末端計(jì)數(shù)11個核苷酸位置基于引導(dǎo)鏈的5′-末端的第11位處的核糖核苷酸(參見圖6C)。
圖4A有義鏈包含21個核苷酸，其中2個末端3′-核苷酸任選是堿基配對的且其中存在的所有核苷酸都是核糖核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾。反義鏈包含21個核苷酸，任選具有3′-末端甘油基部分，其中2個末端3′-核苷酸任選與靶RNA序列互補(bǔ)，且其中存在的所有核苷酸都是核糖核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾。顯示為“s”的經(jīng)修飾的核苷酸間鍵例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他經(jīng)修飾的核苷酸間鍵，任選使反義鏈中的(N N)核苷酸連接。
圖4B有義鏈包含21個核苷酸，其中2個末端3′-核苷酸任選是堿基配對的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脫氧-2′-氟經(jīng)修飾的核苷酸，且可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-O-甲基經(jīng)修飾的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾。反義鏈包含21個核苷酸，任選具有3′-末端甘油基部分且其中2個末端3′-核苷酸任選與靶RNA序列互補(bǔ)，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脫氧-2′-氟經(jīng)修飾的核苷酸，且可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-O-甲基經(jīng)修飾的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾。顯示為“s”的經(jīng)修飾的核苷酸間鍵例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他經(jīng)修飾的核苷酸間鍵，任選使有義和反義鏈中的(N N)核苷酸連接。
圖4C有義鏈包含具有5′和3′-末端帽部分的21個核苷酸，其中2個末端3′-核苷酸任選是堿基配對的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′-O-甲基或2′脫氧-2′-氟經(jīng)修飾的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾。反義鏈包含21個核苷酸，任選具有3′-末端甘油基部分且其中2個末端3′-核苷酸任選與靶RNA序列互補(bǔ)，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脫氧-2′-氟經(jīng)修飾的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾。顯示為“s”的經(jīng)修飾的核苷酸間鍵例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他經(jīng)修飾的核苷酸間鍵，任選使反義鏈中的(N N)核苷酸連接。
圖4D有義鏈包含具有5′和3′-末端帽部分的21個核苷酸，其中2個末端3′-核苷酸任選是堿基配對的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脫氧-2′-氟經(jīng)修飾的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾，且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-脫氧核苷酸。反義鏈包含21個核苷酸，任選具有3′-末端甘油基部分且其中2個末端3′-核苷酸任選與靶RNA序列互補(bǔ)，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脫氧-2′-氟經(jīng)修飾的核苷酸且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-O-甲基經(jīng)修飾的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾。顯示為“s”的經(jīng)修飾的核苷酸間鍵例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他經(jīng)修飾的核苷酸間鍵，任選使反義鏈中的(N N)核苷酸連接。
圖4E有義鏈包含具有5′和3′-末端帽部分的21個核苷酸，其中2個末端3′-核苷酸任選是堿基配對的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脫氧-2′-氟經(jīng)修飾的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾。反義鏈包含21個核苷酸，任選具有3′-末端甘油基部分且其中2個末端3′-核苷酸任選與靶RNA序列互補(bǔ)，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脫氧-2′-氟經(jīng)修飾的核苷酸且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-O-甲基經(jīng)修飾的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾。顯示為“s”的經(jīng)修飾的核苷酸間鍵例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他經(jīng)修飾的核苷酸間鍵，任選使反義鏈中的(N N)核苷酸連接。
圖4F有義鏈包含具有5′和3′-末端帽部分的21個核苷酸，其中2個末端3′-核苷酸任選是堿基配對的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脫氧-2′-氟經(jīng)修飾的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾，且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-脫氧核苷酸。反義鏈包含21個核苷酸，任選具有3′-末端甘油基部分且其中2個末端3′-核苷酸任選與靶RNA序列互補(bǔ)，且具有1個3′-末端硫代磷酸酯核苷酸間鍵，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脫氧-2′-氟經(jīng)修飾的核苷酸且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-脫氧核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脫氧核苷酸、通用堿基、或本文描述的其他化學(xué)修飾。顯示為“s”的經(jīng)修飾的核苷酸間鍵例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他經(jīng)修飾的核苷酸間鍵，任選使反義鏈中的(N N)核苷酸連接。構(gòu)建體A-F的反義鏈包含與本發(fā)明的任何靶核酸序列互補(bǔ)的序列。此外，當(dāng)對于圖4A-F中顯示的任何構(gòu)建體在反義鏈的3′-末端處存在甘油基部分(L)時(shí)，經(jīng)修飾的核苷酸間鍵是任選的。
圖5A-F顯示了本發(fā)明的具體化學(xué)修飾的siNA序列的非限制性例子。A-F將圖4A-F中描述的化學(xué)修飾應(yīng)用于示例性HCV siNA序列。此種化學(xué)修飾可以應(yīng)用于任何HCV序列。此外，圖5中顯示的序列可以任選包括在來自有義鏈的5′-末端的第9位，或通過從引導(dǎo)鏈的5′-末端計(jì)數(shù)11個核苷酸位置基于引導(dǎo)鏈的5′-末端的第11位處的核糖核苷酸(參見圖6C)。此外，圖5中顯示的序列可以任選包括在反義鏈的5′-末端處最高達(dá)約4個位置的末端核糖核苷酸(例如，在反義鏈的5′-末端處的約1個、2個、3個或4個末端核糖核苷酸)和/或細(xì)胞靶序列。
圖6A-C顯示了本發(fā)明的不同siNA構(gòu)建體的非限制性例子。
圖6A中顯示的例子(構(gòu)建體1、2和3)具有19個代表性堿基對；然而，本發(fā)明的不同實(shí)施方案包括本文描述的任何數(shù)目的堿基對。括弧區(qū)域代表核苷酸突出端，例如，包含長度為約1個、2個、3個或4個核苷酸，優(yōu)選約2個核苷酸。構(gòu)建體1和2可以獨(dú)立地用于RNAi活性。構(gòu)建體2可以包含多核苷酸或非核苷酸接頭，其可以任選被設(shè)計(jì)為生物可降解的接頭。在一個實(shí)施方案中，構(gòu)建體2中顯示的環(huán)結(jié)構(gòu)可以包含生物可降解的接頭，其導(dǎo)致在體內(nèi)和/或體外形成構(gòu)建體1。在另一個例子中，構(gòu)建體3可以用于在相同原理下產(chǎn)生構(gòu)建體2，其中接頭用于在體內(nèi)和/或體外產(chǎn)生活性siNA構(gòu)建體2，其可以任選利用另一種生物可降解的接頭以在體內(nèi)和/或體外產(chǎn)生活性siNA構(gòu)建體1。照這樣，siNA構(gòu)建體的穩(wěn)定性和/或活性可以基于用于在體內(nèi)或體外和/或體外使用的siNA構(gòu)建體的設(shè)計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)。
圖6B中顯示的例子代表本發(fā)明的雙鏈核酸分子的不同變化，例如微小RNA，其可以包括起因于部分互補(bǔ)性的突出端、凸起、環(huán)和莖-環(huán)。具有凸起、環(huán)和莖-環(huán)的此種基序一般是miRNA的特征。凸起、環(huán)和莖-環(huán)可以起因于任何程度的部分互補(bǔ)性，例如在本發(fā)明的雙鏈核酸分子的1條或2條鏈中約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多核苷酸的錯配或凸起。
圖6C中顯示的例子代表本發(fā)明的模型雙鏈核酸分子，其包含具有2個21核苷酸序列、具有二核苷酸3′-突出端的19個堿基對雙鏈體。頂部鏈(1)代表有義鏈(過客鏈)，中間鏈(2)代表反義鏈(引導(dǎo)鏈)，和下部鏈(3)代表靶多核苷酸序列。二核苷酸突出端(NN)可以包含衍生自靶多核苷酸的序列。例如，引導(dǎo)鏈中的3′-(NN)序列可以與靶多核苷酸的5′-[NN]序列互補(bǔ)。此外，過客鏈的5′-(NN)序列可以包含與靶多核苷酸序列的5′-[NN]序列相同的序列。在其他實(shí)施方案中，突出端(NN)不衍生自靶多核苷酸序列，例如其中引導(dǎo)鏈中的3′-(NN)序列與靶多核苷酸的5′-[NN]序列不互補(bǔ)，且過客鏈的5′-(NN)序列可以包含與靶多核苷酸序列的5′-[NN]序列不同的序列。在另外的實(shí)施方案中，任何(NN)核苷酸是化學(xué)修飾的，例如如2′-O-甲基、2′-脫氧-2′-氟和/或本文的其他修飾。此外，過客鏈可以包含過客鏈的核糖核苷酸位置N。對于顯示的代表性19堿基對21聚體雙鏈體，位置N可以是在來自過客鏈的3′末端中的9個核苷酸。然而，在具有不同長度的雙鏈體中，位置N基于引導(dǎo)鏈的5′-末端進(jìn)行確定，其通過從引導(dǎo)鏈的5′-末端計(jì)數(shù)11個核苷酸位置且挑選過客鏈中相應(yīng)的堿基配對核苷酸實(shí)現(xiàn)。通過Ago2的切割在如箭標(biāo)指出的位置10和11之間發(fā)生。在另外的實(shí)施方案中，在基于引導(dǎo)鏈的5′-末端的位置10和11處存在2個核糖核苷酸，NN，其通過從引導(dǎo)鏈的5′-末端計(jì)數(shù)10和11個核苷酸位置且挑選過客鏈中相應(yīng)的堿基配對核苷酸實(shí)現(xiàn)。
圖7A-C是在產(chǎn)生用于產(chǎn)生siNA發(fā)夾構(gòu)建體的表達(dá)盒中利用的方案的圖示。
圖7A合成具有5′-限制位點(diǎn)(R1)序列隨后為具有與預(yù)定靶序列等同的序列的區(qū)域(siNA的有義區(qū))的DNA寡聚體，其中有義區(qū)包含例如長度約19個、20個、21個或22個核苷酸(N)，其隨后為限定序列(X)的環(huán)序列，所述限定序列包含例如約3個-約10個核苷酸。
圖7B合成構(gòu)建體隨后通過DNA聚合酶進(jìn)行延伸以產(chǎn)生具有自互補(bǔ)序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其將導(dǎo)致對于靶序列具有特異性和具有自互補(bǔ)的有義和反義區(qū)的siNA轉(zhuǎn)錄物。
圖7C將構(gòu)建體加熱(例如至約95℃)以使序列線性化，從而允許使用引物將互補(bǔ)的第二條DNA鏈延伸至第一條鏈的3′-限制序列。隨后將雙鏈DNA插入合適的載體內(nèi)用于在細(xì)胞中表達(dá)。構(gòu)建體可以這樣設(shè)計(jì)從而使得3′-末端核苷酸突出端起因于轉(zhuǎn)錄，例如如Paul等人，2002，NatureBiotechnology，29，505-508中描述的通過工程改造限制位點(diǎn)和/或利用聚尿苷酸終止區(qū)域。
圖8A-C是在產(chǎn)生用于產(chǎn)生雙鏈siNA構(gòu)建體的表達(dá)盒中利用的方案的圖示。
圖8A合成具有5′-限制位點(diǎn)(R1)序列隨后為具有與預(yù)定靶序列等同的序列的區(qū)域(siNA的有義區(qū))的DNA寡聚體，其中有義區(qū)包含例如長度約19個、20個、21個或22個核苷酸(N)，且其隨后為與限定序列(X)的環(huán)序列相鄰的3′-限制位點(diǎn)(R2)。
圖8B合成構(gòu)建體隨后通過DNA聚合酶進(jìn)行延伸以產(chǎn)生具有自互補(bǔ)序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
圖8C通過對R1和R2特異的限制酶加工構(gòu)建體以產(chǎn)生雙鏈DNA，隨后將所述雙鏈DNA插入合適的載體內(nèi)用于在細(xì)胞中表達(dá)。轉(zhuǎn)錄盒這樣設(shè)計(jì)從而使得U6啟動子區(qū)在dsDNA每一側(cè)的側(cè)面，其產(chǎn)生分開的siNA有義和反義鏈。可以給構(gòu)建體添加聚T終止序列以在所得到的轉(zhuǎn)錄物中產(chǎn)生U突出端。
圖9A-E是用于確定特定靶核酸序列例如信使RNA內(nèi)關(guān)于siNA介導(dǎo)的RNAi的靶位點(diǎn)的方法圖示。
圖9A合成siNA寡核苷酸庫，其中siNA構(gòu)建體的反義區(qū)在靶核酸序列中與靶位點(diǎn)具有互補(bǔ)性，且其中有義區(qū)包含與siNA的反義區(qū)互補(bǔ)的序列。
圖9B和C(圖9B)合并序列并插入載體內(nèi)，從而使得(圖9C)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致siNA表達(dá)。
圖9D基于與靶核酸序列調(diào)節(jié)有關(guān)的表型改變分選細(xì)胞。
圖9E從分選的細(xì)胞中分離siNA且測序以鑒定靶核酸序列內(nèi)的有效靶位點(diǎn)。
圖10顯示了不同穩(wěn)定化學(xué)(1-10)的非限制性例子，所述穩(wěn)定化學(xué)可以例如用于穩(wěn)定本發(fā)明的siNA序列的3′-末端，包括(1)[3-3′]-反向脫氧核糖；(2)脫氧核糖核苷酸；(3)[5′-3′]-3′-脫氧核糖核苷酸；(4)[5′-3′]-核糖核苷酸；(5)[5′-3′]-3′-O-甲基核糖核苷酸；(6)3′-甘油基；(7)[3′-5′]-3′-脫氧核糖核苷酸；(8)[3′-3′]-脫氧核糖核苷酸；(9)[5′-2′]-脫氧核糖核苷酸；和(10)[5-3′]-二脫氧核糖核苷酸。除了該圖中指出的經(jīng)修飾的和未修飾的主鏈化學(xué)外，這些化學(xué)可以與如本文所描述的不同主鏈修飾例如具有式I的主鏈修飾組合。此外，顯示的末端修飾5′顯示的2′-脫氧核苷酸可以是本文描述的另一種經(jīng)修飾的或未修飾的核苷酸或非核苷酸，例如具有式I-VII中任何一個或其任何組合的修飾。
圖11顯示了用于鑒定本發(fā)明化學(xué)修飾的siNA構(gòu)建體的策略的非限制性例子，所述siNA構(gòu)建體是核酸酶抗性的同時(shí)保留介導(dǎo)RNAi活性的能力。基于教導(dǎo)的設(shè)計(jì)參數(shù)將化學(xué)修飾引入siNA構(gòu)建體內(nèi)(例如，引入2′-修飾、堿基修飾、主鏈修飾、末端帽修飾等)。經(jīng)修飾的構(gòu)建體在合適的系統(tǒng)中進(jìn)行測試(例如，關(guān)于核酸酶抗性的人血清，顯示，或關(guān)于PK/遞送參數(shù)的動物模型)。平行地，siNA構(gòu)建體就RNAi活性例如在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)例如螢光素酶報(bào)道分子測定)中進(jìn)行測試。隨后鑒定具有特定特征同時(shí)維持RNAi活性的引導(dǎo)siNA構(gòu)建體，且其可以再一次進(jìn)行進(jìn)一步修飾和測定。相同方法可以用于鑒定具有改善的藥物代謝動力學(xué)概況、遞送和RNAi活性的siNA-綴合物分子。
圖12顯示了本發(fā)明的磷酸化siNA分子的非限制性例子，包括線性和雙鏈體構(gòu)建體及其不對稱的衍生物。
圖13顯示了本發(fā)明的化學(xué)修飾的末端磷酸基的非限制性例子。
圖14A顯示了利用在靶核酸序列中鑒定的回文和/或重復(fù)核酸序列用于設(shè)計(jì)自互補(bǔ)的DFO構(gòu)建體的方法的非限制性例子。(i)在核酸靶序列中鑒定回文或重復(fù)序列。(ii)設(shè)計(jì)與靶核酸序列和回文序列互補(bǔ)的序列。(iii)給互補(bǔ)序列的3′-末端附加互補(bǔ)序列的非回文/重復(fù)部分的反向重復(fù)序列，以產(chǎn)生包含與核酸靶互補(bǔ)的序列的自互補(bǔ)DFO分子。(iv)DFO分子可以自我裝配以形成雙鏈寡核苷酸。圖14B顯示了雙鏈體形成寡核苷酸序列的非限制性代表性例子。圖14C顯示了代表性雙鏈體形成寡核苷酸序列的自我裝配示意圖的非限制性例子。圖14D顯示了代表性雙鏈體形成寡核苷酸序列的自我裝配示意圖，隨后為與靶核酸序列的相互作用導(dǎo)致基因表達(dá)的調(diào)節(jié)的非限制性例子。
圖15顯示了利用摻入DFO構(gòu)建體內(nèi)的回文和/或重復(fù)核酸序列設(shè)計(jì)自互補(bǔ)DFO構(gòu)建體的非限制性例子，所述DFO構(gòu)建體具有與任何目的靶核酸序列互補(bǔ)的序列。這些回文/重復(fù)序列的摻入允許設(shè)計(jì)形成雙鏈體的DFO構(gòu)建體，其中每條鏈能夠例如通過RNAi介導(dǎo)靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。首先，鑒定靶序列。隨后產(chǎn)生互補(bǔ)序列，其中將核苷酸或非核苷酸修飾(顯示為X或Y)引入互補(bǔ)序列內(nèi)，產(chǎn)生人工回文(在該圖中顯示為XYXYXY)。給互補(bǔ)序列的3′-末端附加非回文/重復(fù)互補(bǔ)序列的反向重復(fù)，以產(chǎn)生包含與核酸靶互補(bǔ)的序列的自互補(bǔ)DFO。DFO可以自我裝配以形成雙鏈寡核苷酸。
圖16顯示了包含2種分開的多核苷酸序列的本發(fā)明多功能siNA分子的非限制性例子，所述多核苷酸序列各自能夠介導(dǎo)RNAi指導(dǎo)的不同靶核酸序列的切割。圖16A顯示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有與第一種靶核酸序列互補(bǔ)的第一個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域1)和與第二種靶核酸序列互補(bǔ)的第二個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域2)，其中所述第一個和第二個互補(bǔ)區(qū)域位于多功能siNA中的每種多核苷酸序列的3′-末端處。多功能siNA構(gòu)建體的每種多核苷酸序列的虛線部分具有關(guān)于siNA雙鏈體的相應(yīng)部分的互補(bǔ)性，但不具有對于靶核酸序列的互補(bǔ)性。圖16B顯示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有與第一種靶核酸序列互補(bǔ)的第一個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域1)和與第二種靶核酸序列互補(bǔ)的第二個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域2)，其中所述第一個和第二個互補(bǔ)區(qū)域位于多功能siNA中的每種多核苷酸序列的5′-末端處。多功能siNA構(gòu)建體的每種多核苷酸序列的虛線部分具有關(guān)于siNA雙鏈體的相應(yīng)部分的互補(bǔ)性，但不具有對于靶核酸序列的互補(bǔ)性。
圖17顯示了包含單一多核苷酸序列的本發(fā)明多功能siNA分子的非限制性例子，所述單一多核苷酸序列包含各自能夠介導(dǎo)RNAi指導(dǎo)的不同靶核酸序列的切割的不同區(qū)域。圖17A顯示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有與第一種靶核酸序列互補(bǔ)的第一個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域1)和與第二種靶核酸序列互補(bǔ)的第二個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域2)，其中所述第二個互補(bǔ)區(qū)域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的3′-末端處。多功能siNA構(gòu)建體的每種多核苷酸序列的虛線部分具有關(guān)于siNA雙鏈體的相應(yīng)部分的互補(bǔ)性，但不具有對于靶核酸序列的互補(bǔ)性。圖17B顯示多功能siNA分子的非限制性例子，其具有與第一種靶核酸序列互補(bǔ)的第一個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域1)和與第二種靶核酸序列互補(bǔ)的第二個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域2)，其中所述第一個互補(bǔ)區(qū)域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的5′-末端處。多功能siNA構(gòu)建體的每種多核苷酸序列的虛線部分具有關(guān)于siNA雙鏈體的相應(yīng)部分的互補(bǔ)性，但不具有對于靶核酸序列的互補(bǔ)性。在一個實(shí)施方案中，這些多功能siNA構(gòu)建體在體內(nèi)或體外進(jìn)行加工，以產(chǎn)生如圖16中所示的多功能siNA構(gòu)建體。
圖18顯示了包含2種分開的多核苷酸序列的本發(fā)明多功能siNA分子的非限制性例子，所述多核苷酸序列各自能夠介導(dǎo)RNAi指導(dǎo)的不同靶核酸序列的切割，且其中所述多功能siNA構(gòu)建體進(jìn)一步包含自互補(bǔ)的、回文或重復(fù)區(qū)域，從而使得較短的雙功能siNA構(gòu)建體成為可能，所述雙功能siNA構(gòu)建體可以介導(dǎo)針對不同靶核酸序列的RNA干擾。圖18A顯示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有與第一種靶核酸序列互補(bǔ)的第一個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域1)和與第二種靶核酸序列互補(bǔ)的第二個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域2)，其中所述第一個和第二個互補(bǔ)區(qū)域位于多功能siNA中的每種多核苷酸序列的3′-末端處，且其中所述第一個和第二個互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)一步包含自互補(bǔ)的、回文或重復(fù)區(qū)域。多功能siNA構(gòu)建體的每種多核苷酸序列的虛線部分具有關(guān)于siNA雙鏈體的相應(yīng)部分的互補(bǔ)性，但不具有對于靶核酸序列的互補(bǔ)性。圖18B顯示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有與第一種靶核酸序列互補(bǔ)的第一個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域1)和與第二種靶核酸序列互補(bǔ)的第二個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域2)，其中所述第一個和第二個互補(bǔ)區(qū)域位于多功能siNA中的每種多核苷酸序列的5′-末端處，且其中所述第一個和第二個互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)一步包含自互補(bǔ)的、回文或重復(fù)區(qū)域。多功能siNA構(gòu)建體的每種多核苷酸序列的虛線部分具有關(guān)于siNA雙鏈體的相應(yīng)部分的互補(bǔ)性，但不具有對于靶核酸序列的互補(bǔ)性。
圖19顯示了包含單一多核苷酸序列的本發(fā)明多功能siNA分子的非限制性例子，所述單一多核苷酸序列包含各自能夠介導(dǎo)RNAi指導(dǎo)的不同靶核酸序列的切割的不同區(qū)域，且其中所述多功能siNA構(gòu)建體進(jìn)一步包含自互補(bǔ)的、回文或重復(fù)區(qū)域，從而使得較短的雙功能siNA構(gòu)建體成為可能，所述雙功能siNA構(gòu)建體可以介導(dǎo)針對不同靶核酸序列的RNA干擾。圖19A顯示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有與第一種靶核酸序列互補(bǔ)的第一個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域1)和與第二種靶核酸序列互補(bǔ)的第二個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域2)，其中所述第二個互補(bǔ)區(qū)域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的3′-末端處，且其中所述第一個和第二個互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)一步包含自互補(bǔ)的、回文或重復(fù)區(qū)域。多功能siNA構(gòu)建體的每種多核苷酸序列的虛線部分具有關(guān)于siNA雙鏈體的相應(yīng)部分的互補(bǔ)性，但不具有對于靶核酸序列的互補(bǔ)性。圖19B顯示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有與第一種靶核酸序列互補(bǔ)的第一個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域1)和與第二種靶核酸序列互補(bǔ)的第二個區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域2)，其中所述第一個互補(bǔ)區(qū)域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的5′-末端處，且其中所述第一個和第二個互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)一步包含自互補(bǔ)的、回文或重復(fù)區(qū)域。多功能siNA構(gòu)建體的每種多核苷酸序列的虛線部分具有關(guān)于siNA雙鏈體的相應(yīng)部分的互補(bǔ)性，但不具有對于靶核酸序列的互補(bǔ)性。在一個實(shí)施方案中，這些多功能siNA構(gòu)建體在體內(nèi)或體外進(jìn)行加工，以產(chǎn)生如圖18中所示的多功能siNA構(gòu)建體。
圖20顯示了本發(fā)明的多功能siNA分子如何能夠靶向2種分開的靶核酸分子的非限制性例子，例如編碼不同蛋白質(zhì)的分開的RNA分子，例如細(xì)胞因子及其相應(yīng)受體、不同的病毒品系、病毒和涉及病毒感染或復(fù)制的細(xì)胞蛋白質(zhì)、或涉及共同或分歧生物途徑的不同蛋白質(zhì)，所述生物途徑牽涉于疾病進(jìn)展的維持。多功能siNA構(gòu)建體的每條鏈包含與分開的靶核酸分子具有互補(bǔ)性的區(qū)域。多功能siNA分子這樣設(shè)計(jì)，從而使得可以由RISC復(fù)合物利用siNA的每條鏈，以起始RNA干擾介導(dǎo)的其相應(yīng)靶的切割。這些設(shè)計(jì)參數(shù)可以包括siNA構(gòu)建體的每個末端的去穩(wěn)定作用(參見例如Schwarz等人，2003，Cell，115，199-208)。此種去穩(wěn)定作用可以例如通過使用如本領(lǐng)域已知的鳥苷-胞苷堿基對、交替堿基對(例如，擺動)、或在末端核苷酸位置處使化學(xué)修飾的核苷酸去穩(wěn)定來完成。
圖21顯示了本發(fā)明的多功能siNA分子如何能夠靶向相同靶核酸分子內(nèi)的2種分開的靶核酸序列的非限制性例子，例如RNA的交替編碼區(qū)、RNA的編碼和非編碼區(qū)、或RNA的可變剪接變體區(qū)域。多功能siNA構(gòu)建體的每條鏈包含與靶核酸分子的分開區(qū)域具有互補(bǔ)性的區(qū)域。多功能siNA分子這樣設(shè)計(jì)，從而使得可以由RISC復(fù)合物利用siNA的每條鏈，以起始RNA干擾介導(dǎo)的其相應(yīng)靶區(qū)域的切割。這些設(shè)計(jì)參數(shù)可以包括siNA構(gòu)建體的每個末端的去穩(wěn)定作用(參見例如Schwarz等人，2003，Cell，115，199-208)。此種去穩(wěn)定作用可以例如通過使用如本領(lǐng)域已知的鳥苷-胞苷堿基對、交替堿基對(例如，擺動)、或在末端核苷酸位置處使化學(xué)修飾的核苷酸去穩(wěn)定來完成。
圖22(A-H)顯示了本發(fā)明的束縛多功能siNA構(gòu)建體的非限制性例子。在顯示的例子中，接頭(例如，核苷酸或非核苷酸接頭)使2個siNA區(qū)域(例如，2個有義、2個反義、或可替代地有義和反義區(qū)連接在一起。對應(yīng)于第一種靶序列和第二種靶序列的分開的有義(或有義和反義)序列與多功能siNA中其對應(yīng)的有義和/或反義序列雜交。此外，各種綴合物、配體、適體、聚合物或報(bào)道分子可以與接頭區(qū)域附著，用于選擇性或改善的遞送和/或藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)。
圖23顯示了各種基于樹狀聚體的多功能siNA設(shè)計(jì)的非限制性例子。
圖24顯示了各種超分子的多功能siNA設(shè)計(jì)的非限制性例子。
圖25顯示了使用30核苷酸前體siNA構(gòu)建體的切酶激活的多功能siNA設(shè)計(jì)的非限制性例子。30堿基對雙鏈體經(jīng)由切酶從任一末端切割成22和8堿基對產(chǎn)物(8b.p.片段未顯示)。為了易于呈現(xiàn)，由切酶產(chǎn)生的突出端未顯示-但可以被補(bǔ)償。顯示了3個靶向序列。重疊的所需序列同一性由灰色框指出。要求親本30b.p.siNA的N’s的2’-OH位置的位點(diǎn)以使切酶切割成為可能，如果這在穩(wěn)定化學(xué)中進(jìn)行測試的話。應(yīng)當(dāng)指出30聚體雙鏈體經(jīng)由切酶RNA酶III的加工不產(chǎn)生精確的22+8切割，而是產(chǎn)生一系列緊密相關(guān)的產(chǎn)物(其中22+8是主要位點(diǎn))。因此，經(jīng)由切酶的加工將產(chǎn)生一系列活性siNAs。
圖26顯示了使用40核苷酸前體siNA構(gòu)建體的切酶激活的多功能siNA設(shè)計(jì)的非限制性例子。40堿基對雙鏈體經(jīng)由切酶從任一末端切割成20堿基對產(chǎn)物。為了易于呈現(xiàn)，由切酶產(chǎn)生的突出端未顯示-但可以被補(bǔ)償。顯示了4個靶向序列。具有同源性的靶序列由框包圍。這種設(shè)計(jì)形式可以延伸至較大的RNAs。如果化學(xué)穩(wěn)定的siNAs由切酶結(jié)合，那么策略上定位的核糖核苷酸鍵可以使設(shè)計(jì)者切割產(chǎn)物成為可能，其允許更廣泛的多功能設(shè)計(jì)譜。例如不限于約22-核苷酸的切酶標(biāo)準(zhǔn)的切割產(chǎn)物可以允許多功能siNA構(gòu)建體具有例如約3個-約15個核苷酸的靶序列同一性重疊。
圖27顯示了本發(fā)明的另外多功能siNA構(gòu)建體設(shè)計(jì)的非限制性例子。在一個例子中，綴合物、配體、適體、標(biāo)記或其他部分與多功能siNA的區(qū)域附著，以使得改善的遞送或藥物代謝動力學(xué)概況分析成為可能。
圖28顯示了本發(fā)明的另外多功能siNA構(gòu)建體設(shè)計(jì)的非限制性例子。在一個例子中，綴合物、配體、適體、標(biāo)記或其他部分與多功能siNA的區(qū)域附著，以使得改善的遞送或藥物代謝動力學(xué)概況分析成為可能。
圖29顯示了膽固醇連接的亞磷酰胺的非限制性例子，其可以用于合成本發(fā)明的膽固醇綴合的siNA分子。顯示了具有與siNA分子的有義鏈5′-末端連接的膽固醇部分的例子。
圖30顯示了在HCV感染的絨猴模型中靶向GBV-B的雙鏈核酸分子混合物制劑的非限制性例子。GBV-B提供了用于測試關(guān)于HCV感染的抗病毒化合物和疫苗的小動物模型。2只動物用GBV-B進(jìn)行接種，且使用3mg/kg的活性配制siNA(Sirna化合物編號33149/35180和31703/35176，制劑LNP-086；參見表III和VI)的IV處理在感染后1天開始。另外2只動物用GBV-B進(jìn)行接種，且未加處理以充當(dāng)陰性對照。監(jiān)控動物以測定GBV-B感染的治療效應(yīng)。在研究過程期間進(jìn)行抽血以測定病毒滴度。處理的動物中配制的siNA的給藥在第0天的接種后第1、3和7天時(shí)重復(fù)。如該圖中所示，與未處理的對照動物相比較，這些動物顯示在3周時(shí)間過程中的GBV-B顯著抑制。
圖31顯示了具有確立的GBV感染的動物中GBV感染抑制的非限制性例子，所述動物在感染后第28、31和35天時(shí)用活性配制siNA(Sirna化合物編號33149/38758和31703/38759，制劑LNP-086；參見表III和VI)進(jìn)行處理。與歷史上未加處理的對照相比較，這個動物在活性化合物給藥后顯示病毒滴度減少至檢測極限。
發(fā)明詳述 本發(fā)明的核酸分子的作用機(jī)制 隨后的討論討論了由短干擾RNA介導(dǎo)的RNA干擾被提議的機(jī)制，如目前已知的并且不意欲是限制性的且不是現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。申請人在本文中證實(shí)化學(xué)修飾的短干擾核酸如siRNA分子一樣具有類似或改善的介導(dǎo)RNAi的能力，且預(yù)期具有改善的體內(nèi)穩(wěn)定性和活性；因此，這個討論不意欲僅限于siRNA且可以整體應(yīng)用于siNA。“改善的介導(dǎo)RNAi的能力”或“改善的RNAi活性”意欲包括在體外和/或體內(nèi)測量的RNAi活性，其中RNAi活性是siNA介導(dǎo)RNAi的能力和本發(fā)明siNAs的穩(wěn)定性的反映。在本發(fā)明中，與包含多個核糖核苷酸的全RNA siRNA或siNA相比較，這些活性的產(chǎn)物可以在體外和/或體內(nèi)得到增加。在一些情況下，siNA分子的活性或穩(wěn)定性可以是減少的(即，小于10倍)，但siNA分子的總體活性在體外和/或體內(nèi)得到增強(qiáng)。
RNA干擾指動物中由短干擾RNAs(siRNAs)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程(Fire等人，1998，Nature，391，806)。植物中的相應(yīng)過程通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNA沉默，并且在真菌中也稱為壓抑。轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程被認(rèn)為是用于阻止外來基因表達(dá)的進(jìn)化上保守的細(xì)胞防御機(jī)制，所述細(xì)胞防御機(jī)制通常由不同的植物區(qū)系和門共享(Fire等人，1999，Trends Genet.，15，358)。使免于外來基因表達(dá)的此種保護(hù)可能響應(yīng)雙鏈RNAs(dsRNAs)的產(chǎn)生而經(jīng)由細(xì)胞應(yīng)答發(fā)展出來，所述雙鏈RNAs衍生自病毒感染或轉(zhuǎn)座子元件隨機(jī)整合到宿主基因組內(nèi)，所述細(xì)胞應(yīng)答特異性破壞同源單鏈RNA或病毒基因組RNA。細(xì)胞中dsRNA的存在通過仍需充分表征的機(jī)制觸發(fā)RNAi應(yīng)答。這種機(jī)制似乎不同于起因于dsRNA介導(dǎo)的蛋白激酶PKR激活和通過核糖核酸酶L導(dǎo)致mRNA的非特異性切割的2′，5′-寡腺苷酸合成酶的干擾素應(yīng)答。
細(xì)胞中長dsRNAs的存在刺激稱為切酶的核糖核酸酶III酶的活性。切酶涉及dsRNA加工成稱為短干擾RNAs(siRNAs)的dsRNA短片段(Berstein等人，2001，Nature，409，363)。衍生自切酶活性的短干擾RNAs一般為長度約21個-約23個核苷酸并且包含約19堿基對雙鏈體。切酶也已牽涉于來自保守結(jié)構(gòu)的前體RNA的21-和22-核苷酸小時(shí)序RNAs(stRNAs)的切割，所述小時(shí)序RNAs牽涉于翻譯控制(Hutvagner等人，2001，Science，293，834)。RNAi應(yīng)答還以通常稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的包含siRNA的內(nèi)切核酸酶復(fù)合物為特征，所述復(fù)合物介導(dǎo)具有與siRNA同源的序列的單鏈RNA切割。靶RNA的切割在與siRNA雙鏈體的引導(dǎo)序列互補(bǔ)的區(qū)域中間發(fā)生(Elbashir等人，2001，Genes Dev.，15，188)。此外，RNA干擾還可以涉及小RNA(例如，微小RNA或miRNA)介導(dǎo)的基因沉默，推測是通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)且從而阻止靶基因序列轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞機(jī)制(參見例如Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science，297，2232-2237)。照這樣，本發(fā)明的siNA分子可以用于經(jīng)由與RNA轉(zhuǎn)錄物相互作用或可替代地通過與特定基因序列相互作用來介導(dǎo)基因沉默，其中此種相互作用導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默。
RNAi已在多種系統(tǒng)中進(jìn)行研究。Fire等人，1998，Nature，391，806首先在秀麗隱桿線蟲中觀察到RNAi。Wianny和Goetz，1999，Nature CellBiol.，2，70描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介導(dǎo)的RNAi。Hammond等人，2000，Nature，404，293描述了在用dsRNA轉(zhuǎn)染的果蠅細(xì)胞中的RNAi。Elbashir等人，2001，Nature，411，494描述了在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中通過引入合成的21-核苷酸RNAs的雙鏈體誘導(dǎo)的RNAi，所述哺乳動物細(xì)胞包括人胚腎和HeLa細(xì)胞。果蠅胚胎溶解產(chǎn)物中的近期工作已揭示了關(guān)于siRNA長度、結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、和介導(dǎo)有效RNAi活性所必需的序列的某些要求。這些研究已顯示21核苷酸siRNA雙鏈體在包含2個2-核苷酸3′-末端核苷酸突出端時(shí)是最有活性的。此外，用2′-脫氧或2′-O-甲基核苷酸置換1條或2條siRNA鏈取消了RNAi活性，而用脫氧核苷酸置換3′-末端siRNA核苷酸顯示是耐受的。siRNA雙鏈體中心處的錯配序列也顯示取消了RNAi活性。此外，這些研究還指出靶RNA中切割位點(diǎn)的位置由siRNA引導(dǎo)序列的5′-末端而不是3′-末端限定(Elbashir等人，2001，EMBOJ.，20，6877)。其他研究已指出siRNA雙鏈體的靶互補(bǔ)鏈上的5′-磷酸是siRNA活性所需的，并且ATP用于維持siRNA上的5′-磷酸部分(Nykanen等人，2001，Cell，107，309)；然而，缺乏5′-磷酸的siRNA分子當(dāng)外源引入時(shí)是有活性的，從而暗示siRNA構(gòu)建體的5′-磷酸化可以在體內(nèi)發(fā)生。
本發(fā)明的雙鏈體形成寡核苷酸(DFO) 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含雙鏈體形成寡核苷酸(DFO)的siNA分子，所述DFO可以自我裝配成雙鏈寡核苷酸。本發(fā)明的雙鏈體形成寡核苷酸可以化學(xué)合成或由轉(zhuǎn)錄單位和/或載體表達(dá)。本發(fā)明的DFO分子提供用于多種治療、診斷、農(nóng)業(yè)、獸醫(yī)、靶確認(rèn)、基因組發(fā)現(xiàn)、基因工程和藥物基因組學(xué)應(yīng)用的有用試劑和方法。
申請人:在本文中證實(shí)某些寡核苷酸是基因表達(dá)的序列特異性調(diào)節(jié)的有效介質(zhì)，所述寡核苷酸為了方便起見且非限制性地在本文中稱為雙鏈體形成寡核苷酸或DFO分子。本發(fā)明的寡核苷酸與本領(lǐng)域已知的其他核酸序列(例如，siRNA、miRNA、stRNA、shRNA、反義寡核苷酸等)的不同之處在于它們代表被設(shè)計(jì)為自我裝配成雙鏈寡核苷酸的一類線性多核苷酸序列，其中雙鏈寡核苷酸中的每條鏈包含與靶核酸分子互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明的核酸分子因此可以自我裝配成功能雙鏈體，其中雙鏈體的每條鏈包含相同的多核苷酸序列且每條鏈包含與靶核酸分子互補(bǔ)的核苷酸序列。
一般地，雙鏈寡核苷酸通過2種不同的寡核苷酸序列裝配形成，其中一條鏈的寡核苷酸序列與第二條鏈的寡核苷酸序列互補(bǔ)；此種雙鏈寡核苷酸由2種分開的寡核苷酸裝配，或由在其自身上折疊以形成雙鏈結(jié)構(gòu)的單個分子裝配，所述單個分子在本領(lǐng)域中通常稱為發(fā)夾莖環(huán)結(jié)構(gòu)(例如，shRNA或短發(fā)夾RNA)。本領(lǐng)域已知的這些雙鏈寡核苷酸都具有共同特征，因?yàn)殡p鏈體的每條鏈具有不同的核苷酸序列。
不同于本領(lǐng)域已知的雙鏈核酸分子，申請人已開發(fā)了由單鏈或線性寡核苷酸開始形成雙鏈核酸分子的新的、潛在地節(jié)省成本和簡化的方法。根據(jù)本發(fā)明形成的雙鏈寡核苷酸的2條鏈具有相同的核苷酸序列并且彼此不共價(jià)連接。此種雙鏈寡核苷酸分子可以通過本領(lǐng)域已知的方法和試劑容易地進(jìn)行合成后連接，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，形成雙鏈寡核苷酸的本發(fā)明的單鏈寡核苷酸(雙鏈體形成寡核苷酸)包含第一個區(qū)域和第二個區(qū)域，其中所述第二個區(qū)域包括其是第一個區(qū)域中的核苷酸序列或其部分的反向重復(fù)的核苷酸序列，從而使得單鏈寡核苷酸自我裝配以形成雙鏈體寡核苷酸，其中雙鏈體的一條鏈的核苷酸序列與第二條鏈的核苷酸序列相同。此種雙鏈體形成寡核苷酸的非限制性例子在圖14和15中舉例說明。這些雙鏈體形成寡核苷酸(DFOs)可以任選包括某些回文或重復(fù)序列，其中此種回文或重復(fù)序列存在于DFO的第一個區(qū)域和第二個區(qū)域之間。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于雙鏈體形成寡核苷酸(DFO)分子，其中所述DFO包含雙鏈體形成自互補(bǔ)核酸序列，其具有與靶核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。DFO分子可以包含單個自互補(bǔ)序列或起因于此種自互補(bǔ)序列裝配的雙鏈體。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈體形成寡核苷酸(DFO)包含第一個區(qū)域和第二個區(qū)域，其中所述第二個區(qū)域包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含第一個區(qū)域的核苷酸序列的反向重復(fù)，從而使得DFO分子可以裝配成雙鏈寡核苷酸。此種雙鏈寡核苷酸可以充當(dāng)短干擾核酸(siNA)以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。由本發(fā)明的DFO分子形成的雙鏈寡核苷酸雙鏈體的每條鏈可以包含與靶核酸分子(例如，HCV靶RNA)中的相同核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列區(qū)域。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于可以裝配成雙鏈寡核苷酸的單鏈DFO。申請人已驚訝地發(fā)現(xiàn)具有自互補(bǔ)性的核苷酸區(qū)域的單鏈寡核苷酸可以容易地裝配成雙鏈體寡核苷酸構(gòu)建體。此種DFOs可以裝配成可以以序列特異性方式抑制基因表達(dá)的雙鏈體。本發(fā)明的DFO分子包含具有核苷酸序列的第一個區(qū)域，所述核苷酸序列與第二個區(qū)域的核苷酸序列互補(bǔ)，且其中所述第一個區(qū)域的序列與靶核酸互補(bǔ)。DFO可以形成雙鏈寡核苷酸，其中雙鏈寡核苷酸的每條鏈的部分包含與靶核酸序列互補(bǔ)的序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于雙鏈寡核苷酸，其中所述雙鏈寡核苷酸的2條鏈彼此不共價(jià)連接，且其中雙鏈寡核苷酸的每條鏈包含與靶核酸分子中的相同核苷酸序列或其部分(例如，HCV RNA靶)互補(bǔ)的核苷酸序列。在另一個實(shí)施方案中，雙鏈寡核苷酸的2條鏈共享至少約15個，優(yōu)選至少約16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸的相同核苷酸序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的DFO分子包含具有式DFO-I的結(jié)構(gòu) 5′-p-X Z X′-3′ 其中Z包含任選具有一個或多個經(jīng)修飾的核苷酸(例如具有經(jīng)修飾的堿基例如2-氨基嘌呤、2-氨基-1，6-二氫嘌呤或通用堿基的核苷酸)的回文或重復(fù)核酸序列，例如長度為偶數(shù)數(shù)目的約2個-約24個核苷酸(例如，約2個、4個、6個、8個、10個、12個、14個、16個、18個、20個或22個或24個核苷酸)，X代表例如長度約1個-約21個核苷酸(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)的核酸序列，X′包含例如長度約1個-約21個核苷酸(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)的、具有對于序列X或其部分的核苷酸序列互補(bǔ)性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的末端磷酸基，且其中序列X和Z獨(dú)立或共同包含這樣的核苷酸序列，其與靶核酸序列或其部分互補(bǔ)且具有足夠的長度以與靶核酸序列或其部分(例如，HCV RNA靶)相互作用(例如，堿基配對)。例如，X獨(dú)立地可以包含長度為約12個-約21個或更多(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個或更多)核苷酸的序列，其與靶RNA中的核苷酸序列或其部分互補(bǔ)。在另一個非限制性例子中，當(dāng)X存在時(shí)，與靶RNA或其部分(例如，HCV RNA靶)互補(bǔ)的X和Z的核苷酸序列一起的長度為約12個-約21個或更多核苷酸(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個或更多)。在另外一個非限制性例子中，當(dāng)X不存在時(shí)，與靶RNA或其部分互補(bǔ)的Z的核苷酸序列長度為約12個-約24個或更多核苷酸(例如，約12個、14個、16個、18個、20個、22個、24個或更多)。在一個實(shí)施方案中，X、Z和X′獨(dú)立地是寡核苷酸，其中X和/或Z包含足夠長度的核苷酸序列，以與靶RNA中的核苷酸序列或其部分(例如，HCV RNA靶)相互作用(例如，堿基配對)。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X′的長度相同。在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X′的長度不同。在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和Z，或Z和X’，或X、Z和X’的長度相同或不同。
當(dāng)序列在本說明書中被描述為具有“足夠的”長度以與另一種序列相互作用(即，堿基配對)時(shí)，它意指長度是這樣的，從而使得2種序列之間形成的鍵(例如，氫鍵)數(shù)目足以使得2種序列在目的條件下能夠形成雙鏈體。此種條件可以是體外的(例如，對于診斷或測定目的)或體內(nèi)的(例如，對于治療目的)。測定此種長度是簡單和常規(guī)的事情。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有式DFO-I(a)的雙鏈寡核苷酸構(gòu)建體 5′-p-X Z X′-3′ 3′-X′Z X-p-5′ 其中Z包含回文或重復(fù)核酸序列或者具有一個或多個經(jīng)修飾的核苷酸(例如具有經(jīng)修飾的堿基例如2-氨基嘌呤、2-氨基-1，6-二氫嘌呤或通用堿基的核苷酸)的回文或重復(fù)樣核酸序列，例如長度為偶數(shù)數(shù)目的約2個-約24個核苷酸(例如，約2個、4個、6個、8個、10個、12個、14個、16個、18個、20個、22個或24個核苷酸)，X代表例如長度約1個-約21個核苷酸(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)的核酸序列，X′包含例如長度約1個-約21個核苷酸(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)的、具有對于序列X或其部分的核苷酸序列互補(bǔ)性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的末端磷酸基，且其中X和Z各自獨(dú)立地包含這樣的核苷酸序列，其與靶核酸序列或其部分(例如，HCV RNA靶)互補(bǔ)且具有足夠的長度以與靶核酸序列或其部分(例如，HCV RNA靶)相互作用。例如，序列X獨(dú)立地可以包含長度為約12個-約21個或更多(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個或更多)核苷酸的序列，其與靶RNA中的核苷酸序列或其部分(例如，HCV RNA靶)互補(bǔ)。在另一個非限制性例子中，與靶RNA或其部分互補(bǔ)的X和Z的核苷酸序列一起(當(dāng)X存在時(shí))的長度為約12個-約21個或更多核苷酸(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個或更多)。在另外一個非限制性例子中，當(dāng)X不存在時(shí)，與靶RNA或其部分互補(bǔ)的Z的核苷酸序列長度為約12個-約24個或更多核苷酸(例如，約12個、14個、16個、18個、20個、22個、24個或更多)。在一個實(shí)施方案中，X、Z和X′獨(dú)立地是寡核苷酸，其中X和/或Z包含足夠長度的核苷酸序列，以與靶RNA中的核苷酸序列或其部分(例如，HCV RNA靶)相互作用(例如，堿基配對)。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X′的長度相同。在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X′的長度不同。在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和Z，或Z和X’，或X、Z和X’的長度相同或不同。在一個實(shí)施方案中，式I(a)的雙鏈寡核苷酸構(gòu)建體包括一個或多個，具體地1個、2個、3個或4個錯配，其程度至此種錯配不顯著地減少雙鏈寡核苷酸抑制靶基因表達(dá)的能力。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的DFO分子包含具有式DFO-II的結(jié)構(gòu) 5′-p-X X′-3′ 其中X和X′各自獨(dú)立地是長度約12個核苷酸-約21個核苷酸的寡核苷酸，其中X包含例如長度約12個-約21個核苷酸(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)的核酸序列，X′包含例如長度約12個-約21個核苷酸(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)的、具有對于序列X或其部分的核苷酸序列互補(bǔ)性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的末端磷酸基，且其中X包含這樣的核苷酸序列，其與HCV靶核酸序列(例如，HCV靶RNA)或其部分互補(bǔ)且具有足夠的長度以與HCV靶核酸序列或其部分相互作用(例如，堿基配對)。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X′的長度相同。在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X′的長度不同。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X’的長度足以形成相對穩(wěn)定的雙鏈寡核苷酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有式DFO-II(a)的雙鏈寡核苷酸構(gòu)建體 5′-p-X X′-3′ 3′-X′X-p-5′ 其中X和X′各自獨(dú)立地是長度約12個核苷酸-約21個核苷酸的寡核苷酸，其中X包含例如長度約12個-約21個核苷酸(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)的核酸序列，X′包含例如長度約12個-約21個核苷酸(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)的、具有對于序列X或其部分的核苷酸序列互補(bǔ)性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的末端磷酸基，且其中X包含這樣的核苷酸序列，其與HCV靶核酸序列或其部分(例如，HCV RNA靶)互補(bǔ)且具有足夠的長度以與靶核酸序列(例如，靶RNA)或其部分相互作用(例如，堿基配對)。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X′的長度相同。在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X′的長度不同。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X’的長度足以形成相對穩(wěn)定的雙鏈寡核苷酸。在一個實(shí)施方案中，式II(a)的雙鏈寡核苷酸構(gòu)建體包括一個或多個，具體地1個、2個、3個或4個錯配，其程度至此種錯配不顯著地減少雙鏈寡核苷酸抑制靶基因表達(dá)的能力。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有式DFO-I(b)的DFO分子 5′-p-Z-3′ 其中Z包含任選包括一個或多個非標(biāo)準(zhǔn)的或經(jīng)修飾的核苷酸(例如具有經(jīng)修飾的堿基例如2-氨基嘌呤或通用堿基的核苷酸)的回文或重復(fù)核酸序列，所述非標(biāo)準(zhǔn)的或經(jīng)修飾的核苷酸可以促進(jìn)與其他核苷酸的堿基配對。Z可以具有例如足以與靶核酸(例如，靶RNA)分子的核苷酸序列相互作用(例如，堿基配對)的長度，優(yōu)選長度至少12個核苷酸，具體地約12個-約24個核苷酸(例如，約12個、14個、16個、18個、20個、22個或24個核苷酸)。p表示可以存在或不存在的末端磷酸基。
在一個實(shí)施方案中，具有式DFO-I、DFO-I(a)、DFO-I(b)、DFO-II(a)或DFO-II中任何一個的DFO分子可以包含化學(xué)修飾，其如本文所描述，但不限于，例如具有式I-VII中任何一個的核苷酸、如表IV中描述的穩(wěn)定化學(xué)、或如本文的各種實(shí)施方案中描述的經(jīng)修飾的核苷酸和非核苷酸的任何其他組合。
在一個實(shí)施方案中，具有式DFO-I、DFO-I(a)和DFO-I(b)的DFO構(gòu)建體的Z中的回文或重復(fù)序列或經(jīng)修飾的核苷酸(例如，具有經(jīng)修飾的堿基例如2-氨基嘌呤或通用堿基的核苷酸)包含化學(xué)修飾的核苷酸，其能夠與HCV靶核酸序列的部分相互作用(例如，可以形成沃森克里克堿基對或非沃森克里克堿基對的經(jīng)修飾的堿基類似物)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的DFO分子，例如具有式DFO-I或DFO-II的DFO包含約15個-約40個核苷酸(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個或40個核苷酸)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的DFO分子包含一種或多種化學(xué)修飾。在一個非限制性例子中，將化學(xué)修飾的核苷酸和/或非核苷酸引入本發(fā)明的核酸分子內(nèi)提供了克服外源遞送的未修飾的RNA分子固有的體內(nèi)穩(wěn)定性和生物利用率的潛在局限性中的有力工具。例如，化學(xué)修飾的核酸分子的使用可以使對于給定療效較低劑量的特定核酸分子成為可能，因?yàn)榛瘜W(xué)修飾的核酸分子在血清中或在細(xì)胞或組織中傾向于具有較長的半衰期。此外，通過不僅增強(qiáng)半衰期而且促進(jìn)核酸分子靶向特定器官、細(xì)胞或組織和/或改善核酸分子的細(xì)胞攝取，某些化學(xué)修飾可以改善核酸分子的生物利用率和/或效力。因此，即使與天然/未修飾的核酸分子相比較，例如，當(dāng)與未修飾的RNA分子相比較時(shí)，化學(xué)修飾的核酸分子的活性在體外減少，但由于分子改善的穩(wěn)定性、效力、效應(yīng)持續(xù)時(shí)間、生物利用率和/或遞送，經(jīng)修飾的核酸分子的總體活性也可以大于天然或未修飾的核酸分子。
本發(fā)明的多功能或多靶向siNA分子 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含多功能短干擾核酸(多功能siNA)分子的siNA分子，其調(diào)節(jié)生物系統(tǒng)例如細(xì)胞、組織或生物中的一種或多種基因的表達(dá)。本發(fā)明的多功能短干擾核酸(多功能siNA)分子可以靶向HCV或細(xì)胞/宿主靶核酸序列的超過一個區(qū)域，或可以靶向超過一種不同的靶核酸分子(例如，HCV RNA或細(xì)胞/宿主RNA靶)的序列。本發(fā)明的多功能siNA分子可以化學(xué)合成或由轉(zhuǎn)錄單位和/或載體表達(dá)。本發(fā)明的多功能siNA分子提供用于多種人應(yīng)用、治療、診斷、農(nóng)業(yè)、獸醫(yī)、靶確認(rèn)、基因組發(fā)現(xiàn)、基因工程和藥物基因組學(xué)應(yīng)用的有用試劑和方法。
申請人:在本文中證實(shí)某些寡核苷酸是基因表達(dá)的序列特異性調(diào)節(jié)的有效介質(zhì)，所述寡核苷酸為了方便起見且非限制性地在本文中稱為多功能短干擾核酸或多功能siNA分子。本發(fā)明的多功能siNA分子與本領(lǐng)域已知的其他核酸序列(例如，siRNA、miRNA、stRNA、shRNA、反義寡核苷酸等)的不同之處在于它們代表這樣設(shè)計(jì)的一類多核苷酸分子，從而使得多功能siNA構(gòu)建體中的每條鏈包含與一種或多種靶核酸分子中的不同核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明的單個多功能siNA分子(一般是雙鏈分子)因此可以靶向超過一種(例如，2種、3種、4種、5種或更多)不同的靶核酸靶分子。本發(fā)明的核酸分子也可以靶向相同靶核酸序列的超過一個(例如，2個、3個、4個、5個或更多)區(qū)域。照這樣，本發(fā)明的多功能siNA分子在下調(diào)或抑制一種或多種靶核酸分子的表達(dá)中是有用的。例如，本發(fā)明的多功能siNA分子可以靶向編碼病毒或病毒蛋白質(zhì)和病毒感染和/或復(fù)制所需的對應(yīng)細(xì)胞蛋白質(zhì)、或特定病毒(例如，HCV)的不同品系的核酸分子。通過用一種多功能siNA構(gòu)建體減少或抑制超過一種靶核酸分子的表達(dá)，本發(fā)明的多功能siNA分子代表一類有效的治療劑，其可以提供疾病或病原體相關(guān)途徑內(nèi)的多重靶的同時(shí)抑制。此種同時(shí)抑制可以提供協(xié)同治療處理策略，而無需分開的臨床前和臨床開發(fā)努力或復(fù)雜的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)過程。
靶向靶核酸分子(例如，信使RNA或HCV RNA)的超過一個區(qū)域的多功能siNA分子的用途預(yù)期提供基因表達(dá)的有效抑制。例如，本發(fā)明的單個多功能siNA構(gòu)建體可以靶向靶核酸分子(例如，HCV RNA)的保守和可變區(qū)，從而允許下調(diào)或抑制不同品系變體或病毒、或由單一宿主基因編碼的剪接變體，或允許靶向宿主靶核酸分子的編碼和非編碼區(qū)。
一般地，雙鏈寡核苷酸由2種不同的寡核苷酸裝配形成，其中一條鏈的寡核苷酸序列與第二條鏈的寡核苷酸序列互補(bǔ)；此種雙鏈寡核苷酸一般由2種分開的寡核苷酸(例如，siRNA)裝配?？商娲?，雙鏈體可以由在其自身上折疊的單個分子(例如，shRNA或短發(fā)夾RNA)形成。這些雙鏈寡核苷酸是本領(lǐng)域已知介導(dǎo)RNA干擾的且全部具有共同特征，其中只有1個核苷酸序列區(qū)域(引導(dǎo)序列或反義序列)與靶核酸序列具有互補(bǔ)性，且另一條鏈(有義序列)包含與靶核酸序列同源的核苷酸序列。一般地，反義序列保留在活性RISC復(fù)合物中，且通過反義序列與靶序列的互補(bǔ)堿基配對將RISC引導(dǎo)至靶核苷酸序列，用于介導(dǎo)序列特異性RNA干擾。本領(lǐng)域已知在一些細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，某些類型的未修飾的siRNAs可以顯示出“脫靶”效應(yīng)。假設(shè)這種脫靶效應(yīng)涉及在RISC復(fù)合物中siRNA的有義序列而不是反義序列的參與(參見例如Schwarz等人，2003，Cell，115，199-208)。在這種情況下，有義序列被認(rèn)為將RISC復(fù)合物指導(dǎo)至不同于預(yù)期靶序列的序列(脫靶序列)，從而導(dǎo)致脫靶序列的抑制。在這些雙鏈核酸分子中，每條鏈與不同的靶核酸序列互補(bǔ)。然而，受這些dsRNAs影響的脫靶是完全無法預(yù)測的且是非特異性的。
不同于本領(lǐng)域已知的雙鏈核酸分子，申請人已開發(fā)了使用單個多功能siNA構(gòu)建體下調(diào)或抑制超過一種靶核酸序列的表達(dá)的新的、潛在地節(jié)省成本和簡化的方法。本發(fā)明的多功能siNA分子被設(shè)計(jì)為雙鏈或部分雙鏈的，從而使得多功能siNA的每條鏈或區(qū)域的部分與選擇的靶核酸序列互補(bǔ)。照這樣，本發(fā)明的多功能siNA分子不限于彼此互補(bǔ)的靶向序列，而是任何2種不同的靶核酸序列。本發(fā)明的多功能siNA分子被這樣設(shè)計(jì)，從而使得與給定靶核酸序列互補(bǔ)的多功能siNA分子的每條鏈或區(qū)域具有合適的長度(例如，長度為約16個-約28個核苷酸，優(yōu)選長度為約18個-約28個核苷酸)用于介導(dǎo)針對靶核酸序列的RNA干擾。靶核酸序列和多功能siNA的鏈或區(qū)域之間的互補(bǔ)性必須是足夠的(至少約8個堿基對)以用于經(jīng)由RNA干擾切割靶核酸序列。本發(fā)明的多功能siNA預(yù)期使對于某些siRNA序列例如(Schwarz等人，同上)中描述的那些可見的脫靶效應(yīng)降到最低。
已報(bào)道長度29個堿基對-36個堿基對的dsRNAs(Tuschl等人，國際PCT公開號WO 02/44321)不介導(dǎo)RNAi。這些dsRNAs無活性的一個原因可能是缺乏周轉(zhuǎn)或與靶RNA序列相互作用的鏈的解離，從而使得RISC復(fù)合物不能與靶RNA的多個拷貝有效相互作用，從而導(dǎo)致RNAi過程的效力和功效顯著下降。申請人已驚訝地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多功能siNAs可以克服這個障礙且能夠增強(qiáng)RNAi過程的功效和效力。照這樣，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，長度約29個-約36個堿基對的多功能siNAs可以這樣設(shè)計(jì)，從而使得多功能siNA分子的每條鏈的部分包含長度足以有效介導(dǎo)RNAi(例如，約15個-約23個堿基對)的與靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列區(qū)域和與靶核酸不互補(bǔ)的核苷酸序列區(qū)域。通過在多功能siNA的每條鏈中具有互補(bǔ)和非互補(bǔ)部分，多功能siNA可以介導(dǎo)針對靶核酸序列的RNA干擾，而不被抑制周轉(zhuǎn)或解離(例如，當(dāng)每條鏈的長度太長而不能介導(dǎo)針對分別的靶核酸序列的RNAi時(shí))。此外，具有內(nèi)部重疊區(qū)的本發(fā)明多功能siNA分子的設(shè)計(jì)允許多功能siNA分子具有有利的(減少的)大小用于介導(dǎo)RNA干擾，和具有非常適合于用作治療劑的大小(例如，其中每條鏈獨(dú)立地長度為約18個-約28個核苷酸)。非限制性例子在圖16-28中舉例說明。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能siNA分子包含第一個區(qū)域和第二個區(qū)域，其中多功能siNA的所述第一個區(qū)域包含與第一種靶核酸分子的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且多功能siNA的所述第二個區(qū)域包含與第二種靶核酸分子的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能siNA分子包含第一個區(qū)域和第二個區(qū)域，其中多功能siNA的所述第一個區(qū)域包含與靶核酸分子的第一個區(qū)域的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且多功能siNA的所述第二個區(qū)域包含與靶核酸分子的第二個區(qū)域的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在另一個實(shí)施方案中，多功能siNA的第一個區(qū)域和第二個區(qū)域可以包含共享某一程度的互補(bǔ)性(例如，約1個-約10個互補(bǔ)核苷酸)的分開的核酸序列。在某些實(shí)施方案中，包含分開的核酸序列的多功能siNA構(gòu)建體可以通過本領(lǐng)域已知的方法和試劑容易地進(jìn)行合成后連接，并且此種連接的構(gòu)建體在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？商娲兀喙δ躶iNA的第一個區(qū)域和第二個區(qū)域可以包含具有某一程度的自互補(bǔ)性的單一核酸序列，例如在發(fā)夾或莖環(huán)結(jié)構(gòu)中。此種雙鏈和發(fā)夾多功能短干擾核酸的非限制性例子分別在圖16和17中舉例說明。這些多功能短干擾核酸(多功能siNAs)可以任選包括某些重疊核苷酸序列，其中此種重疊核苷酸序列存在于多功能siNA的第一個區(qū)域和第二個區(qū)域之間(參見例如圖18和19)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于多功能短干擾核酸(多功能siNA)分子，其中多功能siNA的每條鏈獨(dú)立地包含與不同的靶核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的第一個區(qū)域和與靶序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的第二個區(qū)域。每條鏈的靶核酸序列在相同靶核酸分子或不同靶核酸分子中。
在另一個實(shí)施方案中，多功能siNA包含2條鏈，其中(a)第一條鏈包含與靶核酸序列具有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域1)，和與靶核苷酸序列沒有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(非互補(bǔ)區(qū)域1)；(b)多功能siNA的第二條鏈包含與靶核酸序列具有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域2)，所述靶核酸序列不同于與第一條鏈核苷酸序列互補(bǔ)的靶核苷酸序列，和與互補(bǔ)區(qū)域2的靶核苷酸序列沒有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(非互補(bǔ)區(qū)域2)；(c)第一條鏈的互補(bǔ)區(qū)域1包含與第二條鏈的非互補(bǔ)區(qū)域2中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且第二條鏈的互補(bǔ)區(qū)域2包含與與第一條鏈的非互補(bǔ)區(qū)域1中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列?；パa(bǔ)區(qū)域1和互補(bǔ)區(qū)域2的靶核酸序列在相同靶核酸分子或不同靶核酸分子中。
在另一個實(shí)施方案中，多功能siNA包含2條鏈，其中(a)第一條鏈包含與衍生自基因(例如，HCV或宿主基因)的靶核酸序列具有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域1)，和與互補(bǔ)區(qū)域1的靶核苷酸序列沒有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(非互補(bǔ)區(qū)域1)；(b)多功能siNA的第二條鏈包含與衍生自基因的靶核酸序列具有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域2)，所述基因不同于與互補(bǔ)區(qū)域1的基因，和與互補(bǔ)區(qū)域2的靶核苷酸序列沒有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(非互補(bǔ)區(qū)域2)；(c)第一條鏈的互補(bǔ)區(qū)域1包含與第二條鏈的非互補(bǔ)區(qū)域2中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且第二條鏈的互補(bǔ)區(qū)域2包含與與第一條鏈的非互補(bǔ)區(qū)域1中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
在另一個實(shí)施方案中，多功能siNA包含2條鏈，其中(a)第一條鏈包含與衍生自基因(例如，HCV或宿主基因)的靶核酸序列具有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域1)，和與互補(bǔ)區(qū)域1的靶核苷酸序列沒有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(非互補(bǔ)區(qū)域1)；(b)多功能siNA的第二條鏈包含與靶核酸序列具有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(互補(bǔ)區(qū)域2)，所述靶核酸序列不同于互補(bǔ)區(qū)域1的靶核酸序列，然而，前提是關(guān)于互補(bǔ)區(qū)域1的靶核酸序列和關(guān)于互補(bǔ)區(qū)域2的靶核酸序列都衍生自相同基因，和與互補(bǔ)區(qū)域2的靶核苷酸序列沒有序列互補(bǔ)性的區(qū)域(非互補(bǔ)區(qū)域2)；(c)第一條鏈的互補(bǔ)區(qū)域1包含與第二條鏈的非互補(bǔ)區(qū)域2中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且第二條鏈的互補(bǔ)區(qū)域2包含與與第一條鏈的非互補(bǔ)區(qū)域1中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于多功能短干擾核酸(多功能siNA)分子，其中所述多功能siNA包含2種互補(bǔ)核酸序列，其中第一種序列包含與靶核酸分子內(nèi)的核苷酸序列具有核苷酸序列互補(bǔ)性的第一個區(qū)域，且其中第二種序列包含與相同靶核酸分子內(nèi)的不同核苷酸序列具有核苷酸序列互補(bǔ)性的第一個區(qū)域。優(yōu)選地，第一種序列的第一個區(qū)域也與第二種序列的第二個區(qū)域的核苷酸序列互補(bǔ)，且第二種序列的第一個區(qū)域與第一種序列的第二個區(qū)域的核苷酸序列互補(bǔ)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于多功能短干擾核酸(多功能siNA)分子，其中所述多功能siNA包含2種互補(bǔ)核酸序列，其中第一種序列包含與第一種靶核酸分子內(nèi)的核苷酸序列具有核苷酸序列互補(bǔ)性的第一個區(qū)域，且其中第二種序列包含與第二種靶核酸分子內(nèi)的不同核苷酸序列具有核苷酸序列互補(bǔ)性的第一個區(qū)域。優(yōu)選地，第一種序列的第一個區(qū)域也與第二種序列的第二個區(qū)域的核苷酸序列互補(bǔ)，且其中第二種序列的第一個區(qū)域與第一種序列的第二個區(qū)域的核苷酸序列互補(bǔ)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含第一個區(qū)域和第二個區(qū)域的多功能siNA分子，其中所述第一個區(qū)域包含與第一種靶核酸分子內(nèi)的核酸序列互補(bǔ)的具有約18個-約28個核苷酸的核酸序列，且所述第二個區(qū)域包含與第二種靶核酸分子內(nèi)的不同核酸序列互補(bǔ)的具有約18個-約28個核苷酸的核苷酸序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于包含第一個區(qū)域和第二個區(qū)域的多功能siNA分子，其中所述第一個區(qū)域包含與靶核酸分子內(nèi)的核酸序列互補(bǔ)的具有約18個-約28個核苷酸的核酸序列，且所述第二個區(qū)域包含與相同靶核酸分子內(nèi)的不同核酸序列互補(bǔ)的具有約18個-約28個核苷酸的核苷酸序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于雙鏈多功能短干擾核酸(多功能siNA)分子，其中多功能siNA的一條鏈包含具有與第一種靶核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的第一個區(qū)域，且第二條鏈包含具有與第二種靶核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的第一個區(qū)域。第一種和第二種靶核酸序列可以存在于分開的靶核酸分子中，或可以是相同靶核酸分子內(nèi)的不同區(qū)域。照這樣，本發(fā)明的多功能siNA分子可以用于靶向不同基因、相同基因的剪接變體、一種或多種基因轉(zhuǎn)錄物的突變和保守區(qū)、或相同或不同基因或基因轉(zhuǎn)錄物的編碼和非編碼序列的表達(dá)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸分子編碼單一蛋白質(zhì)。在另一個實(shí)施方案中，靶核酸分子編碼超過一種蛋白質(zhì)(例如，1種、2種、3種、4種、5種或更多蛋白質(zhì))。照這樣，本發(fā)明的多功能siNA構(gòu)建體可以用于下調(diào)或抑制幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如，在一條鏈中包含與衍生自病毒基因組(例如，HCV)的第一種靶核酸序列具有核苷酸序列互補(bǔ)性的區(qū)域，和第二條鏈包含與衍生自編碼2種蛋白質(zhì)的基因(例如，涉及HCV生活周期的2種不同宿主蛋白質(zhì))的靶核酸分子中存在的第二種靶核酸序列具有核苷酸序列互補(bǔ)性的區(qū)域的多功能siNA分子可以用于下調(diào)、抑制或關(guān)閉特定生物途徑，其通過靶向例如病毒RNA(例如，HCV RNA)和涉及病毒感染或病毒生活周期的一種或多種宿主RNAs(例如，La抗原或干擾素調(diào)節(jié)因子)實(shí)現(xiàn)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明利用細(xì)胞因子或配體和關(guān)于細(xì)胞因子或配體的受體的不同同工型中存在的保守核苷酸序列。通過設(shè)計(jì)多功能siNAs，其方式為其中一條鏈包括與細(xì)胞因子的各種同工型中保守的靶核酸序列互補(bǔ)的序列，且另一條鏈包括與關(guān)于細(xì)胞因子的受體中保守的靶核酸序列互補(bǔ)的序列，可能使用單個多功能siNA有選擇地和有效地調(diào)節(jié)或抑制生物途徑或生物途徑中的多重基因。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能短干擾核酸(多功能siNA)包含第一個區(qū)域和第二個區(qū)域，其中所述第一個區(qū)域包含與第一種靶的第一種靶RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，且所述第二個區(qū)域包含與第二種靶的第二種靶RNA互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，第一個和第二個區(qū)域可以包含與相同靶序列內(nèi)的不同靶位點(diǎn)的共享或保守RNA序列或不同靶序列中共享的互補(bǔ)的核苷酸序列。
在另一個非限制性例子中，在一條鏈中包含與衍生自編碼病毒或病毒蛋白質(zhì)(例如，HIV)的靶核酸分子的第一種靶核酸序列具有核苷酸序列互補(bǔ)性的區(qū)域，和第二條鏈包含與編碼細(xì)胞蛋白質(zhì)(例如，關(guān)于病毒的受體，例如關(guān)于HIV的CCR5受體)的靶核酸分子中存在的第二種靶核酸序列具有核苷酸序列互補(bǔ)性的區(qū)域的多功能siNA分子可以用于下調(diào)、抑制或關(guān)閉病毒復(fù)制和感染，其通過靶向病毒和病毒感染或復(fù)制所需的細(xì)胞蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)。
在另一個非限制性例子中，在一條鏈中包含與靶核酸分子例如病毒基因組(例如，HCV RNA)中存在的第一種靶核酸序列(例如，保守序列)具有核苷酸序列互補(bǔ)性的區(qū)域，和第二條鏈包含與衍生自編碼病毒蛋白質(zhì)(例如，HIV蛋白質(zhì))的基因的靶核酸分子中存在的第二種靶核酸序列(例如，保守序列)具有核苷酸序列互補(bǔ)性的區(qū)域的多功能siNA分子下調(diào)、抑制或關(guān)閉病毒復(fù)制和感染，其通過靶向病毒基因組和病毒感染或復(fù)制所需的病毒編碼的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明利用病毒的不同品系、同種型或形式和由病毒(例如，HCV)的這些不同品系、同種型和形式編碼的基因中存在的保守核苷酸序列。通過設(shè)計(jì)多功能siNAs，其方式為其中一條鏈包括與病毒的各種品系、同種型或形式中保守的靶核酸序列互補(bǔ)的序列，且另一條鏈包括與由病毒編碼的蛋白質(zhì)中保守的靶核酸序列互補(bǔ)的序列，可能使用單個多功能siNA有選擇地和有效地調(diào)節(jié)或抑制病毒復(fù)制或感染。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能短干擾核酸(多功能siNA)包含第一個區(qū)域和第二個區(qū)域，其中所述第一個區(qū)域包含與第一種病毒品系的HCV病毒RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，且所述第二個區(qū)域包含與第二種病毒品系的HCV病毒RNA互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，第一個和第二個區(qū)域可以包含與不同病毒品系或種類或病毒品系的共享或保守RNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能短干擾核酸(多功能siNA)在每條鏈中包含區(qū)域，其中一條鏈中的區(qū)域包含與編碼一種或多種HCV病毒(例如，一種或多種HCV品系)的HCV病毒RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，且第二條鏈中的區(qū)域包含與編碼一種或多種干擾素激動劑蛋白質(zhì)的病毒RNA互補(bǔ)的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，第一個區(qū)域可以包含與不同HCV病毒品系或HCV病毒品系種類的共享或保守RNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列。干擾素激動劑蛋白質(zhì)的非限制性例子包括能夠抑制或阻抑RNA沉默的任何蛋白質(zhì)(例如，RNA結(jié)合蛋白例如E3L或NS1或其等價(jià)物，參見例如Li等人，2004，PNAS，101，1350-1355)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能短干擾核酸(多功能siNA)包含第一個區(qū)域和第二個區(qū)域，其中所述第一個區(qū)域包含與HCV病毒RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，且所述第二個區(qū)域包含與涉及HCV病毒感染和/或復(fù)制的細(xì)胞RNA互補(bǔ)的核苷酸序列。涉及病毒感染和/或復(fù)制的細(xì)胞RNAs的非限制性例子包括細(xì)胞受體、細(xì)胞表面分子、細(xì)胞酶、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子、和/或細(xì)胞因子、第二信使和細(xì)胞輔助分子，包括但不限于，La抗原，F(xiàn)AS，干擾素激動劑蛋白質(zhì)(例如，E3L或NS1或其等價(jià)物，參見例如Li等人，2004，PNAS，101，1350-1355)，干擾素調(diào)節(jié)因子(IRFs)；細(xì)胞PKR蛋白激酶(PKR)；人真核起始因子2B(elF2Bγ和/或elF2γ)；人DEAD Box蛋白質(zhì)(DDX3)；和與HCV 3′-UTR的聚尿苷酸片結(jié)合的細(xì)胞蛋白質(zhì)，例如多嘧啶片結(jié)合蛋白。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈多功能siNA分子包含具有式MF-I的結(jié)構(gòu) 5′-p-X Z X′-3′ 3′-Y′Z Y-p-5′ 其中5’-p-XZX’-3’和5’-p-YZY’-3’各自獨(dú)立地是長度約20個核苷酸-約300個核苷酸的寡核苷酸，優(yōu)選約20個-約200個核苷酸，約20個-約100個核苷酸，約20個-約40個核苷酸，約20個-約40個核苷酸，約24個-約38個核苷酸，或約26個-約38個核苷酸；XZ包含與第一種靶核酸序列互補(bǔ)的核酸序列；YZ是包含與第二種靶核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的寡核苷酸；Z包含自互補(bǔ)的長度約1個-約24個核苷酸(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個核苷酸)的核苷酸序列；X包含與區(qū)域Y’中存在的核苷酸序列互補(bǔ)的長度約1個-約100個核苷酸的核苷酸序列，優(yōu)選約1個-約21個核苷酸(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)；Y包含與區(qū)域X’中存在的核苷酸序列互補(bǔ)的長度約1個-約100個核苷酸的核苷酸序列，優(yōu)選約1個-約21個核苷酸(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)；每個p包含獨(dú)立地存在或不存在的末端磷酸基；XZ和YZ各自獨(dú)立地具有足以分別與第一種和第二種靶核酸序列或其部分穩(wěn)定地相互作用(即，堿基配對)的長度。例如，每種序列X和Y可以獨(dú)立地包含長度為約12個-約21個或更多核苷酸(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個或更多)的序列，其與不同靶核酸分子例如靶RNAs或其部分中的靶核苷酸序列互補(bǔ)。在另一個非限制性例子中，與第一種靶核酸序列或其部分互補(bǔ)的X和Z的核苷酸序列一起的長度為約12個-約21個或更多核苷酸(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個或更多)。在另一個非限制性例子中，與第二種靶核酸序列或其部分互補(bǔ)的Y和Z的核苷酸序列一起的長度為約12個-約21個或更多核苷酸(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個或更多)。在一個實(shí)施方案中，第一種靶核酸序列和第二種靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，HCV RNA或宿主RNA)中。在另一個實(shí)施方案中，第一種靶核酸序列和第二種靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如，HCV RNA和宿主RNA)中。在一個實(shí)施方案中，Z包含回文或重復(fù)序列。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X’的長度相同。在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X’的長度不同。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸Y和Y’的長度相同。在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸Y和Y’的長度不同。在一個實(shí)施方案中，式I(a)的雙鏈寡核苷酸構(gòu)建體包括一個或多個，具體地1個、2個、3個或4個錯配，其程度至此種錯配不顯著地減少雙鏈寡核苷酸抑制靶基因表達(dá)的能力。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能siNA分子包含具有式MF-II的結(jié)構(gòu) 5′-p-X X′-3′ 3′-Y′Y-p-5′ 其中5’-p-XX’-3’和5’-p-YY’-3’各自獨(dú)立地是長度約20個核苷酸-約300個核苷酸的寡核苷酸，優(yōu)選約20個-約200個核苷酸，約20個-約100個核苷酸，約20個-約40個核苷酸，約20個-約40個核苷酸，約24個-約38個核苷酸，或約26個-約38個核苷酸；X包含與第一種靶核酸序列互補(bǔ)的核酸序列；Y是包含與第二種靶核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的寡核苷酸；X包含與區(qū)域Y′中存在的核苷酸序列互補(bǔ)的長度約1個-約100個核苷酸的核苷酸序列，優(yōu)選約1個-約21個核苷酸(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)；Y包含與區(qū)域X′中存在的核苷酸序列互補(bǔ)的長度約1個-約100個核苷酸的核苷酸序列，優(yōu)選約1個-約21個核苷酸(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或21個核苷酸)；每個p包含獨(dú)立地存在或不存在的末端磷酸基；X和Y各自獨(dú)立地具有足以分別與第一種和第二種靶核酸序列或其部分穩(wěn)定地相互作用(即，堿基配對)的長度。例如，每種序列X和Y可以獨(dú)立地包含長度為約12個-約21個或更多核苷酸(例如，約12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個或更多)的序列，其與不同靶核酸分子例如靶RNAs或其部分中的靶核苷酸序列互補(bǔ)。在一個實(shí)施方案中，第一種靶核酸序列和第二種靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，HCV RNA或宿主RNA)中。在另一個實(shí)施方案中，第一種靶核酸序列和第二種HCV靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如，HCV RNA和宿主RNA)中。在一個實(shí)施方案中，Z包含回文或重復(fù)序列。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X′的長度相同。在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸X和X′的長度不同。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸Y和Y′的長度相同。在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸Y和Y′的長度不同。在一個實(shí)施方案中，式I(a)的雙鏈寡核苷酸構(gòu)建體包括一個或多個，具體地1個、2個、3個或4個錯配，其程度至此種錯配不顯著地減少雙鏈寡核苷酸抑制靶基因表達(dá)的能力。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能siNA分子包含具有式MF-III的結(jié)構(gòu) XX′ Y′-W-Y 其中X、X’、Y和Y’各自獨(dú)立地是長度約15個核苷酸-約50個核苷酸的寡核苷酸，優(yōu)選約18個-約40個核苷酸，或約19個-約23個核苷酸；X包含與區(qū)域Y′中存在的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；X′包含與區(qū)域Y中存在的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；在一個實(shí)施方案中，X和X′各自獨(dú)立地具有足以分別與第一種和第二種靶核酸序列或其部分穩(wěn)定地相互作用(即，堿基配對)的長度；W代表使序列Y′和Y連接的核苷酸或非核苷酸接頭；且多功能siNA經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)第一種和第二種靶序列的切割。nt，第一種靶核酸序列和第二種靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，HCV RNA或宿主RNA)中。在另一個實(shí)施方案中，第一種靶核酸序列和第二種靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如，HCV RNA和宿主RNA)中。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的3′-末端與序列Y的3′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的3′-末端與序列Y的5′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的5′-末端與序列Y的5′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的5′-末端與序列Y的3′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列X的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列X′的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列Y的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列Y′的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，W經(jīng)由生物可降解的接頭使序列Y和Y′連接。在一個實(shí)施方案中，W進(jìn)一步包含綴合物、標(biāo)記、適體、配體、脂質(zhì)或聚合物。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能siNA分子包含具有式MF-IV的結(jié)構(gòu) XX′ Y′-W-Y 其中X、X’、Y和Y’各自獨(dú)立地是長度約15個核苷酸-約50個核苷酸的寡核苷酸，優(yōu)選約18個-約40個核苷酸，或約19個-約23個核苷酸；X包含與區(qū)域Y′中存在的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；X′包含與區(qū)域Y中存在的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；Y和Y′各自獨(dú)立地具有足以分別與第一種和第二種靶核酸序列或其部分穩(wěn)定地相互作用(即，堿基配對)的長度；W代表使序列Y′和Y連接的核苷酸或非核苷酸接頭；且多功能siNA經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)第一種和第二種靶序列的切割。在一個實(shí)施方案中，第一種靶核酸序列和第二種靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，HCV RNA或宿主RNA)中。在另一個實(shí)施方案中，第一種靶核酸序列和第二種靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如，HCV RNA和宿主RNA)中。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的3′-末端與序列Y的3′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的3′-末端與序列Y的5′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的5′-末端與序列Y的5′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的5′-末端與序列Y的3′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列X的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列X′的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列Y的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列Y′的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，W經(jīng)由生物可降解的接頭使序列Y和Y′連接。在一個實(shí)施方案中，W進(jìn)一步包含綴合物、標(biāo)記、適體、配體、脂質(zhì)或聚合物。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能siNA分子包含具有式MF-V的結(jié)構(gòu) XX′ Y′-W-Y 其中X、X’、Y和Y’各自獨(dú)立地是長度約15個核苷酸-約50個核苷酸的寡核苷酸，優(yōu)選約18個-約40個核苷酸，或約19個-約23個核苷酸；X包含與區(qū)域Y′中存在的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；X′包含與區(qū)域Y中存在的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；X、X’、Y或Y’各自獨(dú)立地具有足以分別與第一種、第二種、第三種或第四種靶核酸序列或其部分穩(wěn)定地相互作用(即，堿基配對)的長度；W代表使序列Y′和Y連接的核苷酸或非核苷酸接頭；且多功能siNA經(jīng)由RNA干擾指導(dǎo)第一種、第二種、第三種和/或第四種靶序列的切割。在一個實(shí)施方案中，第一種、第二種、第三種和第四種靶核酸序列全都存在于相同靶核酸分子(例如，HCV RNA或宿主RNA)中。在另一個實(shí)施方案中，第一種、第二種、第三種和第四種靶核酸序列獨(dú)立地存在于不同靶核酸分子(例如，HCV RNA和宿主RNA)中。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的3′-末端與序列Y的3′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的3′-末端與序列Y的5′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的5′-末端與序列Y的5′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，區(qū)域W使序列Y′的5′-末端與序列Y的3′-末端連接。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列X的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列X′的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列Y的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，末端磷酸基存在于序列Y′的5′-末端處。在一個實(shí)施方案中，W經(jīng)由生物可降解的接頭使序列Y和Y′連接。在一個實(shí)施方案中，W進(jìn)一步包含綴合物、標(biāo)記、適體、配體、脂質(zhì)或聚合物。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能siNA分子(例如，具有式MF-I-MF-V中的任何一個)的區(qū)域X和Y與相同靶核酸分子的部分的不同靶核酸序列互補(bǔ)。在一個實(shí)施方案中，此種靶核酸序列位于RNA轉(zhuǎn)錄物的編碼區(qū)內(nèi)的不同位置處。在一個實(shí)施方案中，此種靶核酸序列包含相同RNA轉(zhuǎn)錄物的編碼和非編碼區(qū)。在一個實(shí)施方案中，此種靶核酸序列包含可變剪接轉(zhuǎn)錄物或此種可變剪接轉(zhuǎn)錄物的前體的區(qū)域。
在一個實(shí)施方案中，具有式MF-I-MF-V中的任何一個的多功能siNA分子可以包含化學(xué)修飾，其如本文所描述但不限于，例如具有本文描述的式I-VII中任何一個的核苷酸、如表IV中描述的穩(wěn)定化學(xué)、或如本文的各種實(shí)施方案中描述的經(jīng)修飾的核苷酸和非核苷酸的任何其他組合。
在一個實(shí)施方案中，具有式MF-I或MF-II的多功能siNA構(gòu)建體的Z中的回文或重復(fù)序列或經(jīng)修飾的核苷酸(例如，具有經(jīng)修飾的堿基例如2-氨基嘌呤或通用堿基的核苷酸)包含化學(xué)修飾的核苷酸，其能夠與靶核酸序列的部分相互作用(例如，可以形成沃森克里克堿基對或非沃森克里克堿基對的經(jīng)修飾的堿基類似物)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能siNA分子，例如具有式MF-I-MF-V的多功能siNA的每條鏈獨(dú)立地包含約15個-約40個核苷酸(例如，約15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個或40個核苷酸)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多功能siNA分子包含一種或多種化學(xué)修飾。在非限制性例子中，將化學(xué)修飾的核苷酸和/或非核苷酸引入本發(fā)明的核酸分子內(nèi)提供了克服外源遞送的未修飾的RNA分子固有的體內(nèi)穩(wěn)定性和生物利用率的潛在局限性中的有力工具。例如，化學(xué)修飾的核酸分子的使用可以使對于給定療效較低劑量的特定核酸分子成為可能，因?yàn)榛瘜W(xué)修飾的核酸分子在血清中或在細(xì)胞或組織中傾向于具有較長的半衰期。此外，通過不僅增強(qiáng)半衰期而且促進(jìn)核酸分子靶向特定器官、細(xì)胞或組織和/或改善核酸分子的細(xì)胞攝取，某些化學(xué)修飾可以改善核酸分子的生物利用率和/或效力。因此，即使與天然/未修飾的核酸分子相比較，例如，當(dāng)與未修飾的RNA分子相比較時(shí)，化學(xué)修飾的核酸分子的活性在體外減少，但由于分子改善的穩(wěn)定性、效力、效應(yīng)持續(xù)時(shí)間、生物利用率和/或遞送，經(jīng)修飾的核酸分子的總體活性也可以大于天然或未修飾的核酸分子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于多功能siNAs，其中所述多功能siNAs由2種分開的雙鏈siNAs裝配，其中每條有義鏈的一個末端與另一種siNA分子的有義鏈的末端栓系，從而使得2條反義siNA鏈與其相應(yīng)的有義鏈退火，所述有義鏈在一個末端處彼此栓系(參見圖22)。系鏈或接頭可以是如本領(lǐng)域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接頭或非基于核苷酸的接頭。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2種分開的雙鏈siNAs裝配，其中siNA的一條有義鏈的5′-末端與另一種siNA分子的有義鏈的5′-末端栓系，從而使得2條反義siNA鏈的5′-末端與其相應(yīng)的有義鏈退火，所述有義鏈在一個末端處彼此栓系，彼此背向(在相反方向上)(參見圖22(A))。系鏈或接頭可以是如本領(lǐng)域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接頭或非基于核苷酸的接頭。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2種分開的雙鏈siNAs裝配，其中siNA的一條有義鏈的3′-末端與另一種siNA分子的有義鏈的3′-末端栓系，從而使得2條反義siNA鏈的5′-末端與其相應(yīng)的有義鏈退火，所述有義鏈在一個末端處彼此栓系，彼此面對(參見圖22(B))。系鏈或接頭可以是如本領(lǐng)域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接頭或非基于核苷酸的接頭。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2種分開的雙鏈siNAs裝配，其中siNA的一條有義鏈的5′-末端與另一種siNA分子的有義鏈的3′-末端栓系，從而使得一條反義siNA鏈的5′-末端與其相應(yīng)的有義鏈退火，所述有義鏈在一個末端處彼此栓系，面對另一條反義鏈的3′-末端(參見圖22(C-D))。系鏈或接頭可以是如本領(lǐng)域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接頭或非基于核苷酸的接頭。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2種分開的雙鏈siNAs裝配，其中siNA的一條反義鏈的5′-末端與另一種siNA分子的反義鏈的3′-末端栓系，從而使得一條有義siNA鏈的5′-末端與其相應(yīng)的反義鏈退火，所述反義鏈在一個末端處彼此栓系，面對另一條有義鏈的3′-末端(參見圖22(G-H))。在一個實(shí)施方案中，第一條反義鏈的5′-末端和第二條反義鏈的3′-末端之間的鍵以這樣的方式設(shè)計(jì)，以便容易地切割(例如，生物可降解的接頭)，從而使得多功能siNA的每條反義鏈的5′末端具有適合于介導(dǎo)基于RNA干擾的靶RNA切割的游離5′-末端。系鏈或接頭可以是如本領(lǐng)域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接頭或非基于核苷酸的接頭。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2種分開的雙鏈siNAs裝配，其中siNA的一條反義鏈的5′-末端與另一種siNA分子的反義鏈的5′-末端栓系，從而使得一條有義siNA鏈的3′-末端與其相應(yīng)的反義鏈退火，所述反義鏈在一個末端處彼此栓系，面對另一條有義鏈的3′-末端(參見圖22(E))。在一個實(shí)施方案中，第一條反義鏈的5′-末端和第二條反義鏈的5′-末端之間的鍵以這樣的方式設(shè)計(jì)，以便容易地切割(例如，生物可降解的接頭)，從而使得多功能siNA的每條反義鏈的5′末端具有適合于介導(dǎo)基于RNA干擾的靶RNA切割的游離5′-末端。系鏈或接頭可以是如本領(lǐng)域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接頭或非基于核苷酸的接頭。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2種分開的雙鏈siNAs裝配，其中siNA的一條反義鏈的3′-末端與另一種siNA分子的反義鏈的3′-末端栓系，從而使得一條有義siNA鏈的5′-末端與其相應(yīng)的反義鏈退火，所述反義鏈在一個末端處彼此栓系，面對另一條有義鏈的3′-末端(參見圖22(F))。在一個實(shí)施方案中，第一條反義鏈的5′-末端和第二條反義鏈的5′-末端之間的鍵以這樣的方式設(shè)計(jì)，以便容易地切割(例如，生物可降解的接頭)，從而使得多功能siNA的每條反義鏈的5′末端具有適合于介導(dǎo)基于RNA干擾的靶RNA切割的游離5′-末端。系鏈或接頭可以是如本領(lǐng)域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接頭或非基于核苷酸的接頭。
在上述實(shí)施方案中的任何一個中，第一種靶核酸序列或第二種靶核酸序列可以獨(dú)立地包含HCV RNA或其部分，或涉及HCV感染或復(fù)制、或與HCV感染相關(guān)的疾病過程的細(xì)胞或宿主靶的多核苷酸編碼或非編碼序列，例如細(xì)胞受體、細(xì)胞表面分子、細(xì)胞酶、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子、和/或細(xì)胞因子、第二信使、和細(xì)胞輔助分子，包括但不限于，La抗原(參見例如Costa-Mattioli等人，2004，Mol Cell Biol.，24，6861-70，例如，Genbank登記號NM_003142)；FAS(例如Genbank登記號NM_000043)或FAS配體(例如，Genbank登記號NM_000639)；干擾素調(diào)節(jié)因子(IRFs；例如，Genbank登記號AF082503.1)；細(xì)胞PKR蛋白激酶(例如，Genbank登記號XM_002661.7)；人真核起始因子2B(elF2Bγ；例如，Genbank登記號AF256223和/或elF2γ；例如，Genbank登記號NM_006874.1)；人DEAD Box蛋白質(zhì)(DDX3；例如，Genbank登記號XM_018021.2)；和與HCV 3′-UTR的聚尿苷酸片結(jié)合的細(xì)胞蛋白質(zhì)，例如多嘧啶片結(jié)合蛋白(例如，Genbank登記號NM_031991.1和XM_042972.3)。在一個實(shí)施方案中，第一種HCV靶核酸序列是HCVRNA或其部分，且第二種HCV靶核酸序列是HCV RNA或其部分。在一個實(shí)施方案中，第一種HCV靶核酸序列是HCV RNA或其部分，且第二種HCV靶核酸序列是宿主RNA或其部分。在一個實(shí)施方案中，第一種HCV靶核酸序列是宿主RNA或其部分，且第二種HCV靶核酸序列是宿主RNA或其部分。在一個實(shí)施方案中，第一種HCV靶核酸序列是宿主RNA或其部分，且第二種HCV靶核酸序列是HCV RNA或其部分。
核酸分子的合成 長度超過100個核苷酸的核酸合成使用自動化方法是困難的，且此種分子的治療成本是價(jià)格高得驚人的。在本發(fā)明中，小核酸基序(“小”指核酸基序長度只不過100個核苷酸，優(yōu)選長度只不過80個核苷酸，和最優(yōu)選長度只不過50個核苷酸；例如串聯(lián)合成的個別siNA寡核苷酸序列或siNA序列)優(yōu)選用于外源遞送。這些分子的簡單結(jié)構(gòu)增加了核酸侵入蛋白質(zhì)和/或RNA結(jié)構(gòu)的靶區(qū)的能力。本發(fā)明的示例性分子是化學(xué)合成的，且其他類似地可以是合成的。
寡核苷酸(例如，某些經(jīng)修飾的寡核苷酸或缺乏核糖核苷酸的寡核苷酸的部分)使用本領(lǐng)域已知的規(guī)程合成，例如如下述參考文獻(xiàn)中所述Caruthers等人，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Thompson等人，國際PCT公開號WO 99/54459，Wincott等人，1995，Nucleic AcidsRes.23，2677-2684，Wincott等人，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，Brennan等人，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，和Brennan，美國專利號6,001,311。所有這些參考文獻(xiàn)都引入本文作為參考。寡核苷酸的合成利用常見的核酸保護(hù)和偶聯(lián)基團(tuán)，例如在5′-末端處的二甲氧三苯甲基，和在3′-末端處的亞磷酰胺。在非限制性例子中，小規(guī)模的合成在394Applied Biosystems，Inc.合成儀上進(jìn)行，其使用0.2μmol規(guī)模規(guī)程，對于2′-O-甲基化核苷酸使用2.5分鐘的偶聯(lián)步驟和對于2′-脫氧核苷酸或2′-脫氧-2′-氟核苷酸使用45秒的偶聯(lián)步驟。表V概述了在合成循環(huán)中使用的試劑的量和接觸時(shí)間?？商娲?，以0.2μmol規(guī)模的合成可以在96孔板合成儀上進(jìn)行，例如由Protogene(Palo Alto，CA)生產(chǎn)的儀器，其伴隨對循環(huán)最低限度的修改。相對于聚合物結(jié)合的5′-羥基，在2′-O-甲基殘基的每個偶聯(lián)循環(huán)中可以使用33倍過量的(0.11M的60μL＝6.6μmol)2′-O-甲基亞磷酰胺和105倍過量的S-乙基四唑(0.25M的60μL＝15μmol)。相對于聚合物結(jié)合的5′-羥基，在脫氧殘基的每個偶聯(lián)循環(huán)中可以使用22倍過量(0.11M的40μL＝4.4μmol)脫氧亞磷酰胺和70倍過量的S-乙基四唑(0.25M的40μL＝10μmol)。通過三苯甲基級分的比色定量測定的，在394Applied Biosystems，Inc.合成儀上的平均偶聯(lián)得率一般為97.5-99％。關(guān)于394Applied Biosystems，Inc.合成儀的其他寡核苷酸合成試劑包括下述脫三苯甲基作用溶液是溶于二氯甲烷的3％TCA(ABI)；加帽用溶于THF的16％N-甲基咪唑(ABI)和溶于THF的10％乙酸酐/10％2，6-二甲基吡啶(ABI)來進(jìn)行；且氧化溶液是溶于THF的16.9mM I2，49mM吡啶，9％水(PerSeptiveBiosystems，Inc.)。Burdick & Jackson Synthesis Grade乙腈直接從試劑瓶中使用。S-乙基四唑溶液(溶于乙腈的0.25M)由從AmericanInternational Chemical，Inc.獲得的固體制成。可替代地，對于硫代磷酸酯鍵的引入，使用Beaucage試劑(3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物，溶于乙腈的0.05M)。
基于DNA的寡核苷酸的脫保護(hù)如下進(jìn)行將聚合物結(jié)合的三苯甲基依賴寡核糖核苷酸轉(zhuǎn)移至4mL玻璃螺旋蓋小瓶，且于65℃懸浮于40％含水甲胺(1mL)中10分鐘。冷卻至-20℃后，從聚合物支持體中取出上清液。將支持體用1.0mL EtOH∶MeCN∶H2O/3∶1∶1洗滌3次，渦旋且隨后將上清液加入第一次的上清液中。使包含寡核糖核苷酸的組合的上清液干燥成白色粉末。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子根據(jù)下述專利中描述的方法進(jìn)行合成、脫保護(hù)和分析US 6,995,259、US6,686,463、US 6,673,918、US 6,649,751、US 6,989,442和USSN10/190,359，所述所有專利整體引入本文作為參考。
對于包括本發(fā)明的某些siNA分子的RNA使用的合成方法遵循如下述參考文獻(xiàn)中描述的程序Usman等人，1987，J.Am.Chem.Soc.，109，7845；Scaringe等人，1990，Nucleic Acids Res.，18，5433；和Wincott等人，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684 Wincott等人，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，且利用常見的核酸保護(hù)和偶聯(lián)基團(tuán)，例如在5′-末端處的二甲氧三苯甲基，和在3′-末端處的亞磷酰胺。在非限制性例子中，小規(guī)模的合成在394 Applied Biosystems，Inc.合成儀上進(jìn)行，其使用0.2μmol規(guī)模規(guī)程，對于烷基甲硅烷基保護(hù)的核苷酸使用7.5分鐘的偶聯(lián)步驟和對于2′-O-甲基化核苷酸使用2.5分鐘的偶聯(lián)步驟。表V概述了在合成循環(huán)中使用的試劑的量和接觸時(shí)間?？商娲兀?.2μmol規(guī)模的合成可以在96孔板合成儀上進(jìn)行，例如由Protogene(Palo Alto，CA)生產(chǎn)的儀器，伴隨對循環(huán)最低限度的修改。相對于聚合物結(jié)合的5′-羥基，在2′-O-甲基殘基的每個偶聯(lián)循環(huán)中可以使用33倍過量的(0.11M的60μL＝6.6μmol)2′-O-甲基亞磷酰胺和75倍過量的S-乙基四唑(0.25M的60μL＝15μmol)。相對于聚合物結(jié)合的5′-羥基，在核糖(ribo)殘基的每個偶聯(lián)循環(huán)中可以使用66倍過量(0.11M的120μL＝13.2μmol)烷基甲硅烷基(核糖)保護(hù)的亞磷酰胺和150倍過量的S-乙基四唑(0.25M的120μL＝30μmol)。通過三苯甲基級分的比色定量測定的，在394 Applied Biosystems，Inc.合成儀上的平均偶聯(lián)得率一般為97.5-99％。關(guān)于394 Applied Biosystems，Inc.合成儀的其他寡核苷酸合成試劑包括下述脫三苯甲基作用溶液是溶于二氯甲烷的3％TCA(ABI)；加帽用溶于THF的16％N-甲基咪唑(ABI)和溶于THF的10％乙酸酐/10％2，6-二甲基吡啶(ABI)來進(jìn)行；氧化溶液是溶于THF的16.9mM I2，49mM吡啶，9％水(PerSeptive Biosystems，Inc.)。Burdick& Jackson Synthesis Grade乙腈直接從試劑瓶中使用。S-乙基四唑溶液(溶于乙腈的0.25M)由從American International Chemical，Inc.獲得的固體制成?？商娲?，對于硫代磷酸酯鍵的引入，使用Beaucage試劑(3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物，溶于乙腈的0.05M)。
RNA的脫保護(hù)使用雙罐或單罐規(guī)程進(jìn)行。對于雙罐規(guī)程，將聚合物結(jié)合的三苯甲基依賴寡核糖核苷酸轉(zhuǎn)移至4mL玻璃螺旋蓋小瓶，且于65℃懸浮于40％含水甲胺(1mL)中10分鐘。冷卻至-20℃后，從聚合物支持體中取出上清液。將支持體用1.0mL EtOH∶MeCN∶H2O/3∶1∶1洗滌3次，渦旋且隨后將上清液加入第一次的上清液中。使包含寡核糖核苷酸的組合的上清液干燥成白色粉末。將堿基脫保護(hù)的寡核糖核苷酸重懸浮于無水TEA/HF/NMP溶液(300μL的1.5mL N-甲基吡咯烷酮、750μL TEA和1mL TEA·3HF溶液以提供1.4M HF濃度)中且加熱至65℃。1.5小時(shí)后，寡聚體用1.5M NH4HCO3猝滅。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子根據(jù)下述專利中描述的方法進(jìn)行合成、脫保護(hù)和分析US 6,995,259、US 6,686,463、US 6,673,918、US 6,649,751、US6,989,442和USSN 10/190,359，所述所有專利整體引入本文作為參考。
可替代地，對于單罐規(guī)程，將聚合物結(jié)合的三苯甲基依賴寡核糖核苷酸轉(zhuǎn)移至4mL玻璃螺旋蓋小瓶，且于65℃懸浮于33％乙醇甲胺/DMSO1/1(0.8mL)溶液中15分鐘。將小瓶置于室溫，加入TEA·3HF(0.1mL)且使小瓶于65℃加熱15分鐘。使樣品于-20℃冷卻且隨后用1.5M NH4HCO3猝滅。
對于三苯甲基依賴寡聚體的純化，將猝滅的NH4HCO3溶液裝載到包含C-18的藥液筒上，所述藥液筒用乙腈隨后為50mM TEAA預(yù)先洗滌。用水將裝載的藥液筒洗滌后，RNA用0.5％TFA脫三苯甲基13分鐘。藥液筒隨后再次用水洗滌，用1M NaCl進(jìn)行鹽交換且再次用水洗滌。寡核苷酸隨后用30％乙腈進(jìn)行洗脫。
平均逐步偶聯(lián)得率一般為＞98％(Wincott等人，1995 Nucleic AcidsRes.23，2677-2684)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到合成的規(guī)?？梢哉{(diào)整至大于或小于上述例子，包括但不限于96孔形式。
可替代地，本發(fā)明的核酸分子可以分開合成且在合成后連接在一起，例如通過連接(Moore等人，1992，Science 256，9923；Draper等人，國際PCT公開號WO 93/23569；Shabarova等人，1991，Nucleic AcidsResearch 19，4247；Bellon等人，1997，Nucleosides & Nucleotides，16，951；Bellon等人，1997，Bioconjugate Chem.8，204)，或通過在合成和/或脫保護(hù)后雜交。
本發(fā)明的siNA分子可以經(jīng)由如本文實(shí)施例1中描述的串聯(lián)合成方法進(jìn)行合成，其中2條siNA鏈被合成為由可切割接頭分開的單個鄰接寡核苷酸片段或鏈，其隨后進(jìn)行切割以提供分開的siNA片段或鏈，所述siNA片段或鏈雜交且允許siNA雙鏈體的純化。接頭可以是多核苷酸接頭或非核苷酸接頭。如本文所描述的siNA的串聯(lián)合成可以容易地適應(yīng)多孔/多板合成平臺，例如96孔或類似地更大的多孔平臺。如本文所描述的siNA的串聯(lián)合成還可以容易地適應(yīng)使用分批反應(yīng)器、合成柱等的大規(guī)模合成平臺。
siNA分子還可以由2種不同的核酸鏈或片段裝配，其中一個片段包括有義區(qū)且第二個片段包括RNA分子的反義區(qū)。
本發(fā)明的核酸分子可以通過用核酸酶抗性基團(tuán)修飾進(jìn)行廣泛修飾以增強(qiáng)穩(wěn)定性，所述核酸酶抗性基團(tuán)例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H(關(guān)于綜述參見Usman和Cedergren，1992，TIBS 17，34；Usman等人，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163)。siNA構(gòu)建體可以通過凝膠電泳使用一般方法進(jìn)行純化，或可以通過高壓液相層析(HPLC；參見Wincott等人，同上，其在此整體引入本文作為參考)進(jìn)行純化且重懸浮于水中。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的siNA分子由插入到DNA或RNA載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)。重組載體可以是DNA質(zhì)?；虿《据d體。表達(dá)siNA的病毒載體可以基于但不限于下述進(jìn)行構(gòu)建腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或甲病毒。能夠表達(dá)siNA分子的重組載體可以如本文所描述的遞送，且在靶細(xì)胞中持續(xù)。可替代地，可以使用提供siNA分子的瞬時(shí)表達(dá)的病毒載體。
本發(fā)明的核酸分子的活性最優(yōu)化 化學(xué)合成具有修飾(堿基、糖和/或磷酸)的核酸分子可以防止其經(jīng)由血清核糖核酸酶的降解，這可以增加其效力(參見例如，Eckstein等人，國際公開號WO 92/07065；Perrault等人，1990 Nature 344，565；Pieken等人，1991，Science 253，314；Usman和Cedergren，1992，Trendsin Biochem.Sci.17，334；Usman等人，國際公開號WO 93/15187；和Rossi等人，國際公開號WO 91/03162；Sproat，美國專利號5,334,711；Gold等人，美國專利號6,300,074；和Burgin等人，同上；所述所有專利引入本文作為參考)。所有上述參考文獻(xiàn)描述了可以對本文描述的核酸分子的堿基、磷酸和/或糖部分進(jìn)行的各種化學(xué)修飾。描述了增強(qiáng)其在細(xì)胞中的功效的修飾，和從核酸分子中去除堿基以縮短寡核苷酸合成時(shí)間且減少化學(xué)需求。
在本領(lǐng)域中存在描述糖、堿基和磷酸修飾的幾個例子，所述修飾可以引入核酸分子內(nèi)，顯著增強(qiáng)其核酸酶穩(wěn)定性和功效。例如，通過用核酸酶抗性基團(tuán)修飾對寡核苷酸進(jìn)行修飾以增強(qiáng)穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)生物活性，所述核酸酶抗性基團(tuán)例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、2′-H、核苷酸堿基修飾(關(guān)于綜述參見Usman和Cedergren，1992，TIBS.17，34；Usman等人，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163；Burgin等人，1996，Biochemistry，35，14090)。核酸分子的糖修飾在本領(lǐng)域中已得到廣泛描述(參見Eckstein等人，國際公開PCT號WO 92/07065；Perrault等人，Nature，1990，344，565-568；Pieken等人，Science，1991，253，314-317；Usman和Cedergren，Trends in Biochem.Sci.，1992，17，334-339；Usman等人，國際公開PCT號WO 93/15187；Sproat，美國專利號5,334,711和Beigelman等人，1995，J.Biol.Chem.，270，25702；Beigelman等人，國際PCT公開號WO 97/26270；Beigelman等人，美國專利號5,716,824；Usman等人，美國專利號5,627,053；Woolf等人，國際PCT公開號WO 98/13526；Thompson等人，于1998年4月20日提交的USSN 60/082,404；Karpeisky等人，1998，Tetrahedron Lett.，39，1131；Earnshaw和Gait，1998，Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)，48，39-55；Verma和Eckstein，1998，Annu.Rev.Biochem.，67，99-134；和Burlina等人，1997，Bioorg.Med.Chem.，5，1999-2010；所述所有參考文獻(xiàn)在此整體引入本文作為參考)。此種出版物描述了確定糖、堿基和/或磷酸修飾等摻入核酸分子內(nèi)而不調(diào)節(jié)催化的位置的一般方法和策略，并且引入本文作為參考。考慮到此種教導(dǎo)，類似修飾可以如本文所描述的用于修飾本發(fā)明的siNA核酸分子，只要siNA在細(xì)胞中促進(jìn)RNAi的能力未被顯著抑制。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子如US 20050020521中所述的進(jìn)行化學(xué)修飾，所述專利整體引入本文作為參考。
盡管用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5′-甲基膦酸酯鍵化學(xué)修飾寡核苷酸核苷酸間鍵改善穩(wěn)定性，但過度修飾可以引起某些毒性或減少的活性。因此，當(dāng)設(shè)計(jì)核酸分子時(shí)，這些核苷酸間鍵的量應(yīng)降到最低。這些鍵濃度中的減少應(yīng)降低毒性，從而導(dǎo)致這些分子增加的功效和更高的特異性。
提供了具有維持或增強(qiáng)活性的化學(xué)修飾的短干擾核酸(siNA)分子。此種核酸一般也比未修飾的核酸對核酸酶更有抵抗力。因此，體外和/或體內(nèi)活性不應(yīng)顯著降低。在其中調(diào)節(jié)是目的的情況下，外源遞送的治療核酸分子應(yīng)最優(yōu)地在細(xì)胞內(nèi)是穩(wěn)定的，直至靶RNA的翻譯已足夠長久地調(diào)節(jié)，以減少不希望有的蛋白質(zhì)的水平。取決于疾病狀態(tài)，這個時(shí)間段從小時(shí)到天不等。RNA和DNA化學(xué)合成中的改善(Wincott等人，1995，Nucleic Acids Res.23，2677；Caruthers等人，1992，Methods inEnzymology 211，3-19(引入本文作為參考))已通過引入核苷酸修飾以增強(qiáng)其核酸酶穩(wěn)定性擴(kuò)大修飾核酸分子的能力，如上文描述的。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包括一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)G-封條(clamp)核苷酸。G-封條核苷酸是經(jīng)修飾的胞嘧啶類似物，其中所述修飾給予與雙鏈體內(nèi)的互補(bǔ)鳥嘌呤的沃森-克里克和Hoogsteen面氫鍵合的能力，參見例如Lin和Matteucci，1998，J.Am.Chem.Soc.，120，8531-8532。當(dāng)與互補(bǔ)寡核苷酸雜交時(shí)，寡核苷酸內(nèi)的單個G-封條類似物置換可以導(dǎo)致基本上增強(qiáng)的螺旋熱穩(wěn)定性和錯配區(qū)分。在本發(fā)明的核酸分子中包括此種核苷酸導(dǎo)致對核酸靶、互補(bǔ)序列或模板鏈增強(qiáng)的親和力和特異性。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包括一個或多個(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)LNA“鎖定核酸”核苷酸，例如2′，4′-C亞甲基二環(huán)核苷酸(參見例如Wengel等人，國際PCT公開號WO 00/66604和WO 99/14226)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于本發(fā)明的siNA分子的綴合物和/或復(fù)合物。此種綴合物和/或復(fù)合物可以用于促進(jìn)siNA分子遞送到生物系統(tǒng)例如細(xì)胞內(nèi)。由本發(fā)明提供的綴合物和復(fù)合物可以給予治療活性，其通過將治療化合物轉(zhuǎn)移經(jīng)過細(xì)胞膜，改變藥物代謝動力學(xué)和/或調(diào)節(jié)本發(fā)明的核酸分子的定位實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明包含用于使分子遞送經(jīng)過細(xì)胞膜的新綴合物和復(fù)合物的設(shè)計(jì)和合成，所述分子包括但不限于，小分子、脂質(zhì)、膽固醇、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗體、毒素、負(fù)電荷聚合物和其他聚合物，例如蛋白質(zhì)、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或聚胺。一般而言，描述的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被設(shè)計(jì)為單獨(dú)或作為多組分系統(tǒng)的部分使用，包括或不包括可降解接頭。這些化合物預(yù)期改善本發(fā)明的核酸分子在血清的存在或不存在下在源于不同組織的許多細(xì)胞類型內(nèi)的遞送和/或定位(參見Sullenger和Cech，美國專利號5,854,038)。本文描述的分子的綴合物可以經(jīng)由接頭與生物活性分子附著，所述接頭是生物可降解的，例如生物可降解的核酸接頭分子。
如本文所使用的，術(shù)語“生物可降解的接頭”指核酸或非核酸接頭分子，其被設(shè)計(jì)為生物可降解的接頭，以使一種分子與另一種分子例如生物活性分子與本發(fā)明的siNA分子或本發(fā)明的siNA分子的有義與反義鏈連接。生物可降解的接頭被這樣設(shè)計(jì)，使得它的穩(wěn)定性可以就特定目的進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如遞送給特定組織或細(xì)胞類型。基于核酸的生物可降解的接頭分子的穩(wěn)定性可以通過使用各種化學(xué)進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸和化學(xué)修飾的核苷酸的組合，所述化學(xué)修飾的核苷酸例如2′-O-甲基、2′-氟、2′-氨基、2′-O-氨基、2′-C-烯丙基、2′-O-烯丙基、和其他2′-修飾的或堿基修飾的核苷酸。生物可降解的核酸接頭分子可以是二聚物、三聚物、四聚物或更長的核酸分子，例如長度為約2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個核苷酸的寡核苷酸，或可以包含具有基于磷的鍵例如氨基磷酸酯或磷酸二酯鍵的單個核苷酸。生物可降解的核酸接頭分子還可以包含核酸主鏈、核酸糖、或核酸堿基修飾。
如本文所使用的，術(shù)語“生物可降解的”指生物系統(tǒng)中的降解，例如酶促降解或化學(xué)降解。
如本文所使用的，術(shù)語“生物活性分子”指能夠在系統(tǒng)中引發(fā)或修飾生物應(yīng)答的化合物或分子。由本發(fā)明預(yù)期的單獨(dú)或與其他分子組合的生物活性siNA分子的非限制性例子包括治療活性分子，例如抗體、膽固醇、激素、抗病毒劑、肽、蛋白質(zhì)、化療劑、小分子、維生素、輔因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶促核酸、反義核酸、三鏈體形成寡核苷酸、2，5-A嵌合體、siNA、dsRNA、同種異型酶、適體、誘餌及其類似物。本發(fā)明的生物活性分子還包括能夠調(diào)節(jié)其他生物活性分子的藥物代謝動力學(xué)和/或藥物動力學(xué)的分子，所述其他生物活性分子例如脂質(zhì)和聚合物，例如聚胺、聚酰胺、聚乙二醇和其他聚醚。
如本文所使用的，術(shù)語“磷脂”指包含至少一個磷基團(tuán)的疏水性分子。例如，磷脂可以包含含磷基團(tuán)和飽和或不飽和的烷基，任選由OH、COOH、氧、胺、或取代或未取代的芳基取代。
外源遞送的治療核酸分子(例如siNA分子)最優(yōu)地在細(xì)胞內(nèi)是穩(wěn)定的，直至RNA的逆轉(zhuǎn)錄已足夠長久地調(diào)節(jié)，以減少RNA轉(zhuǎn)錄物的水平。核酸分子對核酸酶是有抵抗力的以充當(dāng)有效的細(xì)胞內(nèi)治療劑。本發(fā)明和本領(lǐng)域中描述的核酸分子的化學(xué)合成中的改善已通過如上文描述的引入核苷酸修飾以增強(qiáng)其核酸酶穩(wěn)定性擴(kuò)大修飾核酸分子的能力。
在另外一個實(shí)施方案中，提供了具有化學(xué)修飾的siNA分子，所述化學(xué)修飾維持或增強(qiáng)涉及RNAi的蛋白質(zhì)的酶促活性。此種核酸一般也比未修飾的核酸對核酸酶更有抵抗力。因此，體外和/或體內(nèi)活性不應(yīng)顯著降低。
本發(fā)明的基于核酸的分子的使用通過提供組合療法的可能性(例如，靶向不同基因的多重siNA分子；與已知小分子調(diào)節(jié)劑偶聯(lián)的核酸分子；或使用分子組合的間歇療法，所述分子組合包括不同基序和/或其他化學(xué)或生物分子)將導(dǎo)致更佳的治療。用siNA分子治療受試者還可以包括不同類型的核酸分子的組合，例如酶促核酸分子(核酶)、同種異型酶、反義、2，5-A寡腺苷酸、誘餌和適體。
在另一個方面，本發(fā)明的siNA分子包含一個或多個5′和/或3′-帽結(jié)構(gòu)，例如僅在有義siNA鏈、反義siNA鏈或2條siNA鏈上。
“帽結(jié)構(gòu)”意指化學(xué)修飾，其已在寡核苷酸的任一末端處摻入(參見例如引入本文作為參考的Adamic等人，美國專利號5,998,203)。這些末端修飾保護(hù)核酸分子不受外切核酸酶降解，且可以幫助在細(xì)胞內(nèi)的遞送和/或定位。帽可以存在于5′-末端處(5′-帽)或3′-末端處(3′-帽)，或可以存在于2個末端上。在非限制性例子中，5′-帽包括但不限于，甘油基，反向脫氧脫堿基殘基(部分)；4′，5′-亞甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃型赤蘚糖基(erythrofuranosyl)核苷酸，4′-硫代核苷酸；碳環(huán)核苷酸；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；經(jīng)修飾的堿基核苷酸；二硫代磷酸酯鍵；蘇糖型-呋喃型戊糖基核苷酸；無環(huán)3′，4′-斷裂核苷酸；無環(huán)3，4-二羥丁基核苷酸；無環(huán)3，5-二羥戊基核苷酸；3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-反向脫堿基部分；3′-2′-反向核苷酸部分；3′-2′-反向脫堿基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨己基磷酸酯；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或橋連或非橋連甲基膦酸酯部分。帽部分的非限制性例子顯示于圖10中。
3′-帽的非限制性例子包括但不限于，甘油基，反向脫氧脫堿基殘基(部分)；4′，5′-亞甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃型赤蘚糖基核苷酸，4′-硫代核苷酸；碳環(huán)核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨丙基磷酸酯；6-氨己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羥丙基磷酸酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；經(jīng)修飾的堿基核苷酸；二硫代磷酸酯；蘇糖型-呋喃型戊糖基核苷酸；無環(huán)3′，4′-斷裂核苷酸；3，4-二羥丁基核苷酸；3，5-二羥戊基核苷酸；5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向脫堿基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；橋連或非橋連5′-氨基磷酸酯，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，橋連或非橋連甲基膦酸酯和5′-巰基部分(關(guān)于更多細(xì)節(jié)參見Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925；引入本文作為參考)。
術(shù)語“非核苷酸”意指任何基團(tuán)或化合物，其可以摻入核酸鏈內(nèi)代替一個或多個核苷酸單位，包括糖和/或磷酸置換，且允許剩余堿基顯示出其酶促活性。基團(tuán)或化合物是脫堿基的，因?yàn)樗话ǔ９J(rèn)的核苷酸堿基，例如腺苷、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，且因此在1′-位置處缺乏堿基。
“烷基”指飽和脂族烴，包括直鏈、支鏈和環(huán)狀烷基。優(yōu)選地，烷基具有1個-12個碳。更優(yōu)選地，它是1個-7個碳的低級烷基，更優(yōu)選地1個-4個碳。烷基可以是取代或未取代的。當(dāng)取代時(shí)，取代基團(tuán)優(yōu)選是羥基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2或N(CH3)2、氨基或SH。該術(shù)語還包括鏈烯基，其是包含至少一個碳-碳雙鍵的不飽和烴基團(tuán)，包括直鏈、支鏈和環(huán)狀基團(tuán)。優(yōu)選地，鏈烯基具有1個-12個碳。更優(yōu)選地，它是1個-7個碳的低級鏈烯基，更優(yōu)選地1個-4個碳。鏈烯基可以是取代或未取代的。當(dāng)取代時(shí)，取代基團(tuán)優(yōu)選是羥基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2、鹵素、N(CH3)2、氨基或SH。術(shù)語“烷基”還包括炔基，其是包含至少一個碳-碳三鍵的不飽和烴基團(tuán)，包括直鏈、支鏈和環(huán)狀基團(tuán)。優(yōu)選地，炔基具有1個-12個碳。更優(yōu)選地，它是1個-7個碳的低級炔基，更優(yōu)選地1個-4個碳。炔基可以是取代或未取代的。當(dāng)取代時(shí)，取代基團(tuán)優(yōu)選是羥基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2或N(CH3)2、氨基或SH。
此種烷基還可以包括芳基、烷芳基、碳環(huán)芳基、雜環(huán)芳基、酰胺和酯基團(tuán)?！胺蓟敝阜甲寤鶊F(tuán)，其具有含共軛π電子系統(tǒng)的至少一個環(huán)且包括碳環(huán)芳基、雜環(huán)芳基和聯(lián)芳基，所有這些可以是任選取代的。芳基的優(yōu)選取代基是鹵素、三鹵甲基、羥基、SH、OH、氰基、烷氧基、烷基、鏈烯基、炔基和氨基。“烷芳基”指與芳基(如上所述)共價(jià)連接的烷基(如上所述)。碳環(huán)芳基是其中芳族環(huán)上的環(huán)原子都是碳原子的基團(tuán)。碳原子是任選取代的。雜環(huán)芳基是在芳族環(huán)中具有1個-3個雜原子作為環(huán)原子和剩余環(huán)原子是碳原子的基團(tuán)。合適的雜原子包括氧、硫和氮，且包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低級烷基吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，全部任選取代。“酰胺”指-C(O)-NH-R，其中R是烷基、芳基、烷芳基或氫?！磅ァ敝?C(O)-OR′，其中R是烷基、芳基、烷芳基或氫。
如本文所使用的，“核苷酸”如本領(lǐng)域公認(rèn)的包括天然堿基(標(biāo)準(zhǔn))和本領(lǐng)域眾所周知的經(jīng)修飾的堿基。此種堿基一般位于核苷酸糖部分的1’位置處。核苷酸一般包含堿基、糖和磷酸基。核苷酸可以是未修飾的或在糖、磷酸和/或堿基部分處修飾的(也可互換地稱為核苷酸類似物，經(jīng)修飾的核苷酸，非天然核苷酸，非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸等；參見例如，Usman和McSwiggen，同上；Eckstein等人，國際PCT公開號WO 92/07065；Usman等人，國際PCT公開號WO 93/15187；Uhlman & Peyman，同上，所有在此引入本文作為參考)。如由Limbach等人，1994，Nucleic AcidsRes.22，2183概括的，存在本領(lǐng)域已知的經(jīng)修飾的核酸堿基的幾個例子?？梢砸牒怂岱肿觾?nèi)的堿基修飾的一些非限制性例子包括，肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，胸腺嘧啶核苷)、5-鹵尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔等(Burgin等人，1996，Biochemistry，35，14090；Uhlman & Peyman，同上)。“經(jīng)修飾的堿基”在這個方面意指在1′位置處除腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶外的核苷酸堿基或其類似物。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有磷酸主鏈修飾的經(jīng)修飾的siNA分子，所述磷酸主鏈修飾包含一種或多種硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、嗎啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺化(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、氨磺酰、氨基磺酸酯、甲縮醛(formacetal)、硫甲縮醛和/或烷基甲硅烷基、取代。關(guān)于寡核苷酸主鏈修飾的綜述，參見Hunziker和Leumann，1995，Nucleic AcidAnaloguesSynthesis and Properties，in Modern Synthetic Methods，VCH，331-417，和Mesmaeker等人，1994，Novel Backbone Replacements forOligonucleotides，in Carbohydrate Modifications in Antisense Research，ACS，24-39。
“脫堿基”意指在糖部分的1′位置處缺乏核堿基(nucleobase)或具有氫原子(H)或其他非核堿基化學(xué)基團(tuán)代替核堿基的糖部分，參見例如Adamic等人，美國專利號5,998,203。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的脫堿基部分是核糖、脫氧核糖或雙脫氧核糖。
“未修飾的核苷”意指與β-D-呋喃型核糖的1′碳連接的下述堿基之一腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
“經(jīng)修飾的核苷”意指在未修飾的核苷酸堿基、糖和/或磷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含修飾的任何核苷酸堿基。經(jīng)修飾的核苷酸的非限制性例子由式I-VII和/或本文描述的其他修飾顯示。
與如關(guān)于本發(fā)明描述的2′-經(jīng)修飾的核苷酸結(jié)合，“氨基”意指2′-NH2或2′-O-NH2，其可以是修飾的或未修飾的。此種經(jīng)修飾的基團(tuán)在例如Eckstein等人，美國專利號5,672,695和Matulic-Adamic等人，美國專利號6,248,878中得到描述，所述2個專利整體引入作為參考。
可以對核酸siNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種修飾以增強(qiáng)這些分子的效用。此種修飾將增強(qiáng)保存期限、體外半衰期、穩(wěn)定性和易于將此種寡核苷酸引入靶位點(diǎn)，例如以增強(qiáng)細(xì)胞膜的滲透，并且給予識別靶細(xì)胞且與靶細(xì)胞結(jié)合的能力。
核酸分子的施用 本發(fā)明的siNA分子可以適合單獨(dú)或與其他療法組合用于治療、預(yù)防、抑制、或減少HCV感染、肝衰竭、肝細(xì)胞癌、肝硬化和/或涉及細(xì)胞或組織中的HCV水平或?qū)?xì)胞或組織中的HCV水平反應(yīng)的任何其他性狀、疾病或狀況。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子及其制劑或組合物如本領(lǐng)域一般已知的施用于肝(參見例如Wen等人，2004，World J Gastroenterol.，10，244-9；Murao等人，2002，Pharm Res.，19，1808-14；Liu等人，2003，Gene Ther，10，180-7；Hong等人，2003，JPharm Pharmacol.，54，51-8；Herrmann等人，2004，Arch Virol.，149，1611-7；和Matsuno等人，2003，Gene Ther.，10，1559-66)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA組合物可以包含對于給受試者施用的遞送媒介物包括脂質(zhì)體，載體和稀釋劑及其鹽，和/或可以存在于藥學(xué)上可接受的制劑中。用于遞送核酸分子的方法在下述參考文獻(xiàn)中得到描述Akhtar等人，1992，Trends Cell Bio.，2，139；Delivery Strategiesfor Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995，Maurer等人，1999，Mol.Membr.Biol.，16，129-140；Hofland和Huang，1999，Handb.Exp.Pharmacol.，137，165-192；和Lee等人，2000，ACS Symp.Ser.，752，184-192，所有這些參考文獻(xiàn)引入本文作為參考。Beigelman等人，美國專利號6,395,713和Sullivan等人，PCT WO 94/02595進(jìn)一步描述了用于遞送核酸分子的一般方法。這些規(guī)程可以用于遞送事實(shí)上任何核酸分子。核酸分子可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法施用于細(xì)胞，包括但不限于，被囊化在脂質(zhì)體中，通過離子電滲療法，或通過摻入其他媒介物內(nèi)，所述其他媒介物例如生物可降解聚合物、水凝膠、環(huán)糊精(參見例如Gonzalez等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，1068-1074；Wang等人，國際PCR公開號WO 03/47518和WO 03/46185)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和PLCA小球體(參見例如美國專利6,447,796和美國專利申請公開號US 2002130430)、生物可降解納米膠囊(nanocapsule)、和生物粘附小球體，或通過蛋白質(zhì)載體(O′Hare和Normand，國際PCT公開號WO 00/53722)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子還可以用聚乙烯亞胺及其衍生物配制或與聚乙烯亞胺及其衍生物復(fù)合，例如聚乙烯亞胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亞胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子如美國專利申請公開號20030077829中所述進(jìn)行配制，所述專利申請整體引入本文作為參考。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子配制為下述專利中所述的組合物美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/678,531以及于2005年7月29日提交的相關(guān)美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/703,946，于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN11/353,630(Vargeese等人)，所有這些專利都整體引入本文作為參考。此種siNA制劑一般稱為“脂質(zhì)核酸顆?！?LNP)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子用本文表VI中描述的一種或多種LNP組合物進(jìn)行配制(還參見引入本文作為參考的USSN 11/353,630和11/586,102)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子及其制劑或組合物如US2006/0062758；US 2006/0014289；和US 2004/0077540中所述施用于組織和細(xì)胞。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子與膜破裂試劑例如美國專利申請公開號20010007666中描述的那些復(fù)合，所述專利包括附圖整體引入本文作為參考。在另一個實(shí)施方案中，一種或多種膜破裂試劑和siNA分子還與陽離子脂質(zhì)或輔助脂質(zhì)分子例如美國專利號6,235,310中描述的那些脂質(zhì)復(fù)合，所述專利包括附圖整體引入本文作為參考。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子與如下述專利中描述的遞送系統(tǒng)復(fù)合美國專利申請公開號2003077829以及國際PCT公開號WO 00/03683和WO 02/087541，所有專利包括附圖整體引入本文作為參考。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子經(jīng)由去端肽膠原(atelocollagen)復(fù)合或綴合施用于骨骼組織(例如，骨、軟骨、腱、韌帶)或骨轉(zhuǎn)移性腫瘤(參見例如Takeshita等人，2005，PNAS，102，12177-12182)。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于作為與去端肽膠原復(fù)合的組合物的一種或多種dsiNA分子。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于經(jīng)由如本文所描述的或本領(lǐng)域其他方面已知的接頭與去端肽膠原綴合的一種或多種siNA分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子及其制劑(例如，本發(fā)明的雙鏈核酸分子的LNP制劑)經(jīng)由肺遞送施用，例如通過經(jīng)由吸入設(shè)備或噴霧器施用的氣溶膠或噴霧干燥制劑的吸入，從而提供核酸分子快速的局部攝取進(jìn)入相關(guān)肺組織內(nèi)。包含微粉化核酸組合物的可吸收干燥顆粒的固體微粒組合物可以通過下述制備將干燥或凍干的核酸組合物研磨，且隨后使微粉化組合物通過例如400目篩以破碎或分出大附聚物。包含本發(fā)明的核酸組合物的固體微粒組合物可以任選包含分散劑，所述分散劑用于促進(jìn)氣溶膠以及其他治療化合物的形成。合適的分散劑是乳糖，其可以與核酸化合物以任何合適的比率如1∶1重量比摻合。
包含本發(fā)明的核酸組合物的液體顆粒的氣溶膠可以通過任何合適的方法產(chǎn)生，例如用噴霧器(參見例如US 4,501,729)。噴霧器是商購可得的設(shè)備，其借助于使壓縮氣體一般是空氣或氧通過狹窄的文丘里管孔加速或借助于超聲攪拌，將活性成分的溶液或懸浮液轉(zhuǎn)變成治療氣溶膠霧。用于在噴霧器中使用的合適制劑包含以最高達(dá)40％w/w優(yōu)選小于20％w/w制劑的量溶于液體載體的活性成分。載體一般是水或稀釋含水醇溶液，優(yōu)選通過添加例如氯化鈉或其他合適的鹽制成與體液等滲。任選的添加劑包括防腐劑，如果制劑未制成無菌的話，例如羥基苯甲酸酯，抗氧化劑，調(diào)味劑，揮發(fā)性油，緩沖劑和乳化劑及其他制劑表面活性劑。包含活性組合物和表面活性劑的固體顆粒的氣溶膠可以同樣地用任何固體微粒氣溶膠發(fā)生器來生產(chǎn)。用于給受試者施用固體微粒療法的氣溶膠發(fā)生器產(chǎn)生可吸收的顆粒，如上文說明的，且以適合于人施用的速率產(chǎn)生包含治療組合物的預(yù)定計(jì)量劑量的氣溶膠體積。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的固體微粒氣溶膠發(fā)生器是吹入器。用于通過吹入法施用的合適制劑包括精細(xì)搗碎的粉末，其可以借助于吹入器進(jìn)行遞送。在吹入器中，粉末例如有效執(zhí)行本文描述的治療的其計(jì)量劑量包含在一般由明膠或塑料制成的膠囊或藥液筒中，其穿入或原位打開并且經(jīng)由在吸入后通過設(shè)備吸取的空氣或借助于手工操作的泵遞送粉末。吹入器中使用的粉末單獨(dú)由活性成分組成，或由包含活性成分、合適的粉末稀釋劑例如乳糖和任選的表面活性劑的粉末摻合物組成?；钚猿煞忠话銟?gòu)成0.1-100w/w制劑。第二種類型的舉例說明性氣溶膠發(fā)生器包含計(jì)量劑量吸入器。計(jì)量劑量吸入器是增壓氣溶膠分配器，一般包含活性成分在液化推進(jìn)劑的懸浮液或溶液制劑。在使用期間，這些設(shè)備通過適合于遞送計(jì)量容積的閥排出制劑，以產(chǎn)生包含活性成分的細(xì)顆粒噴霧。合適的推進(jìn)劑包括某些含氯氟烴，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。制劑可以另外包含一種或多種助溶劑例如乙醇，乳化劑和其他制劑表面活性劑例如油酸或失水山梨醇三油酸酯，抗氧化劑和合適的調(diào)味劑。用于肺遞送的其他方法在例如美國專利申請?zhí)?0040037780以及美國專利號6,592,904；6,582,728；6,565,885中得到描述，所有專利引入本文作為參考。
在一個實(shí)施方案中，本文提供的用于在肺遞送中使用的siNA和LNP組合物和制劑進(jìn)一步包含一種或多種表面活性劑。用于增強(qiáng)本發(fā)明的組合物攝取的合適表面活性劑或表面活性劑組分包括合成和天然以及完整和截短形式的表面活性蛋白A，表面活性蛋白B，表面活性蛋白C，表面活性蛋白D和表面活性蛋白E，二飽和磷脂酰膽堿(除二棕櫚酰外)，二棕櫚酰磷脂酰膽堿，磷脂酰膽堿，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸；磷脂酸，泛醌，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰膽堿，棕櫚酰-溶血磷脂酰膽堿，脫氫表雄酮，多萜醇，sulfatidic acid，甘油-3-磷酸，二羥丙酮磷酸，甘油，甘油-3-磷酸膽堿，二羥丙酮，棕櫚酸鹽，胞苷二磷酸(CDP)二酰甘油，CDP膽堿，膽堿，磷酸膽堿；以及天然和人造片層體，其是關(guān)于表面活性劑組分的天然載體媒介物，ω-3脂肪酸，聚烯酸(polyenic acid)，多烯酸，卵磷脂，棕櫚酸，氧化乙烯或丙烯的非離子嵌段共聚物，聚氧丙烯、單體和聚合的，聚氧乙烯、單體和聚合的，具有葡聚糖和/或烷?；鶄?cè)鏈的聚乙烯胺，Brij 35，TritonX-100和合成表面活性劑ALEC，Exosurf，Survan和Atovaquone，除了別的以外。這些表面活性劑可以在制劑中作為單個表面活性劑或多組分表面活性劑的部分使用，或作為與本文的藥物組合物的核酸組分的5′和/或3′末端共價(jià)結(jié)合的附加物使用。
本發(fā)明的組合物可以作為包括可吸收大小的顆粒的制劑施用到呼吸系統(tǒng)內(nèi)，例如大小足夠小的顆粒以在吸入后經(jīng)過鼻、口和喉以及通過肺的支氣管和肺泡。一般而言，可吸收顆粒大小為約0.5-10微米。包括在氣溶膠中的不可吸收大小的顆粒傾向于沉積在喉中且被吞咽，并且氣溶膠中不可吸收顆粒的量因此降到最低。對于鼻施用，10-500um的粒度是優(yōu)選的，以確保保留在鼻腔中。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子及其制劑或組合物如本領(lǐng)域一般已知的施用于肝(參見例如Wen等人，2004，World JGastroenterol.，10，244-9；Murao等人，2002，Pharm Res.，19，1808-14；Liu等人，2003，gene Ther，10，180-7；Hong等人，2003，J PharmPharmacol.，54，51-8；Herrmann等人，2004，Arch Virol.，149，1611-7；和Matsuno等人，2003，gene Ther.，10，1559-66)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于將本發(fā)明的核酸分子遞送給中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)的方法的用途。實(shí)驗(yàn)已證實(shí)核酸經(jīng)由神經(jīng)元的有效體內(nèi)攝取。作為給神經(jīng)細(xì)胞局部施用核酸的例子，Sommer等人，1998，Antisense Nuc.Acid Drug Dev.，8，75，描述了其中針對c-fos的15聚體硫代磷酸酯反義核酸分子經(jīng)由顯微注射到腦內(nèi)施用于大鼠的研究。用四甲基羅丹明-異硫氰酸酯(TRITC)或異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的反義分子在注射后30分鐘經(jīng)由神經(jīng)元專有地吸收。在這些細(xì)胞中觀察到彌散細(xì)胞質(zhì)染色和核染色。作為給神經(jīng)細(xì)胞全身施用核酸的例子，Epa等人，2000，Antisense Nuc.Acid Drug Dev.，10，469，描述了其中β-環(huán)糊精-金剛烷-寡核苷酸綴合物用于靶向神經(jīng)元分化的PC12細(xì)胞中的p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的體內(nèi)小鼠研究。2周IP施用過程后，在背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細(xì)胞中觀察到p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體反義的顯著攝取。此外，在DRG神經(jīng)元中觀察到p75明顯和一致的下調(diào)。使核酸靶向神經(jīng)元的另外方法在下述參考文獻(xiàn)中得到描述Broaddus等人，1998，J.Neurosurg.，88(4)，734；Karle等人，1997，Eur.J.Pharmocol.，340(2/3)，153；Bannai等人，1998，Brain Research，784(1，2)，304；Rajakumar等人，1997，Synapse，26(3)，199；Wu-pong等人，1999，BioPharm，12(1)，32；Bannai等人，1998，Brain Res.Protoc.，3(1)，83；Simantov等人，1996，Neuroscience，74(1)，39。本發(fā)明的核酸分子因此順應(yīng)經(jīng)由細(xì)胞遞送和攝取，所述細(xì)胞表達(dá)重復(fù)擴(kuò)充的等位基因變體用于調(diào)節(jié)RE基因表達(dá)。靶向RE的本發(fā)明核酸分子的遞送通過多種不同策略提供?？梢允褂玫膶τ贑NS遞送的傳統(tǒng)方法包括但不限于，鞘內(nèi)和腦室內(nèi)施用、導(dǎo)管和泵的植入、在損傷或損害位點(diǎn)處直接注射或灌注、注射到腦動脈系統(tǒng)內(nèi)、或通過血腦屏障的化學(xué)或滲透開放。其他方法可以包括各種轉(zhuǎn)運(yùn)和載體系統(tǒng)的使用，例如通過使用綴合物和生物可降解聚合物。此外，基因治療方法例如如Kaplitt等人，US 6,180,613和Davidson，WO 04/013280中描述的，可以用于在CNS中表達(dá)核酸分子。
本發(fā)明的核酸分子給CNS的遞送通過多種不同策略提供?？梢允褂玫膶τ贑NS遞送的傳統(tǒng)方法包括但不限于，鞘內(nèi)和腦室內(nèi)施用、導(dǎo)管和泵的植入、在損傷或損害位點(diǎn)處直接注射或灌注、注射到腦動脈系統(tǒng)內(nèi)、或通過血腦屏障的化學(xué)或滲透開放。其他方法可以包括各種轉(zhuǎn)運(yùn)和載體系統(tǒng)的使用，例如通過使用綴合物和生物可降解聚合物。此外，基因治療方法例如如Kaplitt等人，US 6,180,613和Davidson，WO04/013280中描述的，可以用于在CNS中表達(dá)核酸分子。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA化合物和組合物約每1-50周(例如，約每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50周)全身或局部地進(jìn)行施用，單獨(dú)或與本文的其他化合物和/或療法組合。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA化合物和組合物約每1-50周(例如，約每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50周)全身地(例如，經(jīng)由靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、輸注、泵、植入等)進(jìn)行施用，單獨(dú)或與本文描述的和/或本領(lǐng)域其他方面已知的其他化合物和/或療法組合。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子用離子透入法施用于例如特定器官或區(qū)室(例如，肝、腫瘤、CNS等)。離子透入法遞送的非限制性例子在例如WO 03/043689和WO 03/030989中得到描述，所述專利整體引入本文作為參考。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子及其制劑或組合物如本領(lǐng)域一般已知的施用于肝(參見例如Wen等人，2004，World JGastroenterol.，10，244-9；Murao等人，2002，Pharm Res.，19，1808-14；Liu等人，2003，Gene Ther.，10，180-7；Hong等人，2003，J PharmPharmacol.，54，51-8；Herrmann等人，2004，Arch Virol.，149，1611-7；和Matsuno等人，2003，Gene Ther.，10，1559-66)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于將本發(fā)明的核酸分子遞送給造血細(xì)胞，包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的方法的用途。這些方法由Hartmann等人，1998，J.Phamacol.Exp.Ther.，285(2)，920-928；Kronenwett等人，1998，Blood，91(3)，852-862；Filion和Phillips，1997，Biochim.Biophys.Acta.，1329(2)，345-356；Ma和Wei，1996，Leuk.Res.，20(11/12)，925-930；和Bongartz等人，1994，Nucleic AcidsResearch，22(22)，4681-8詳細(xì)描述。如上所述的此種方法包括使用游離寡核苷酸、陽離子脂質(zhì)制劑、包括pH敏感性脂質(zhì)體和免疫脂質(zhì)體的脂質(zhì)體制劑、以及包括與融合肽綴合的寡核苷酸的生物綴合物，用于由寡核苷酸轉(zhuǎn)染造血細(xì)胞。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子及其制劑或組合物如本領(lǐng)域一般已知的直接或地方性地(例如，局部地)施用于真皮或?yàn)V泡(參見例如Brand，2001，Curr.Opin.Mol.Ther.，3，244-8；Regnier等人，1998，J.Drug Target，5，275-89；Kanikkannan，2002，BioDrugs，16，339-47；Wraight等人，2001，Pharmacol.Ther.，90，89-104；和Preat和Dujardin，2001，STP PharmaSciences，11，57-68)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子及其制劑或組合物直接或地方性地施用，其中使用包含醇(例如，乙醇或異丙醇)、水且任選包括另外試劑例如肉豆蔻酸異丙酯和卡波姆980的含水醇凝膠制劑。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的遞送系統(tǒng)包括例如，含水和非水凝膠、乳膏、多重乳劑、微乳、脂質(zhì)體、軟膏、水性和非水溶液、洗劑、氣溶膠、烴基質(zhì)和粉末，并且可以包含賦形劑例如增溶劑、滲透增強(qiáng)劑(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、和親水聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一個實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體是脂質(zhì)體或經(jīng)皮增強(qiáng)劑?？梢栽诒景l(fā)明中使用的脂質(zhì)體例子包括下述(1)CellFectin，陽離子脂質(zhì)N，NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕櫚基-精胺和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1∶1.5(M/M)脂質(zhì)體制劑(GIBCO BRL)；(2)Cytofectin GSV，陽離子脂質(zhì)和DOPE的2∶1(M/M)脂質(zhì)體制劑(Glen Research)；(3)DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧)-N，N，N-三甲基-甲基硫酸銨)(Boehringer Manheim)；和(4)Lipofectamine，聚陽離子脂質(zhì)DOSPA和中性脂質(zhì)DOPE的3∶1(M/M)脂質(zhì)體制劑(GIBCO BRL)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的遞送系統(tǒng)包括貼劑、片劑、栓劑、陰道栓、凝膠和乳膏，并且可以包含賦形劑例如增溶劑和增強(qiáng)劑(例如，丙二醇、膽汁鹽和氨基酸)、和其他媒介物(例如，聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物、以及親水聚合物例如羥丙基甲基纖維素和透明質(zhì)酸)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子用聚乙烯亞胺(例如，線性或分支PEI)和/或聚乙烯亞胺衍生物配制，或與聚乙烯亞胺(例如，線性或分支PEI)和/或聚乙烯亞胺衍生物復(fù)合，所述聚乙烯亞胺衍生物包括例如接枝PEIs例如半乳糖PEI、膽固醇PEI、抗體衍生的PEI及其聚乙二醇PEI(PEG-PEI)衍生物(參見例如Ogris等人，2001，AAPAPharmSci，3，1-11；Furgeson等人，2003，Bioconjugate Chem.，14，840-847；Kunath等人，2002，Phramaceutical Research，19，810-817；Choi等人，2001，Bull.Korean Chem.Soc.，22，46-52；Bettinger等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，558-561；Peterson等人，2002，BioconjugateChem.，13，845-854；Erbacher等人，1999，Journal of Gene MedicinePreprint，1，1-18；Godbey等人，1999.，PNAS USA，96，5177-5181；Godbey等人，1999，Journal of Controlled Release，60，149-160；Diebold等人，1999，Journal of Biological Chemistry，274，19087-19094；Thomas和Klibanov，2002，PNAS USA，99，14640-14645；和Sagara，US 6,586,524，引入本文作為參考。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子包含生物綴合物，例如如Vargeese等人，于2003年4月30日提交的USSN 10/427,160；US6,528,631；US 6,335,434；US 6,235,886；US 6,153,737；US 5,214,136；US 5,138,045中描述的核酸綴合物，所述所有專利引入本文作為參考。
因此，本發(fā)明的特征在于在可接受的載體例如穩(wěn)定劑、緩沖劑等中包含本發(fā)明的一種或多種核酸的藥物組合物。本發(fā)明的多核苷酸可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法施用(例如，RNA、DNA或蛋白質(zhì))且引入受試者中，包括或不包括穩(wěn)定劑、緩沖劑等，以形成藥物組合物。當(dāng)需要使用脂質(zhì)體遞送機(jī)制時(shí)，可以遵從用于脂質(zhì)體配制的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程。本發(fā)明的組合物還可以如本領(lǐng)域已知的配制且用作乳膏、凝膠、噴霧劑、油及其他合適的組合物，用于地方性、皮膚、或經(jīng)皮施用。
本發(fā)明還包括所述化合物的藥學(xué)上可接受的制劑。這些制劑包括上述化合物的鹽，例如酸加成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、乙酸和苯磺酸的鹽。
藥理學(xué)組合物或制劑指以適合于施用，例如全身或局部施用到細(xì)胞或受試者內(nèi)的形式的組合物或制劑，所述受試者包括例如人。合適的形式部分依賴使用或進(jìn)入途徑，例如經(jīng)口、經(jīng)皮或通過注射。此種形式不應(yīng)阻止組合物或制劑達(dá)到靶細(xì)胞(即，需要給其遞送帶負(fù)電荷核酸的細(xì)胞)。例如，注射到血流內(nèi)的藥理學(xué)組合物應(yīng)當(dāng)是可溶的。其他因素是本領(lǐng)域已知的，且包括考慮，如阻止組合物或制劑發(fā)揮其作用的毒性和形式。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子通過全身施用在藥學(xué)上可接受的組合物或制劑中施用于受試者?！叭硎┯谩币庵杆幬镌谘髦械捏w內(nèi)全身性吸收或積累隨后分布遍及整個身體。導(dǎo)致全身性吸收的施用途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、皮下、門靜脈、腹膜內(nèi)、吸入、經(jīng)口、肺內(nèi)和肌內(nèi)。這些施用途徑中的每一種使本發(fā)明的siNA分子暴露于可到達(dá)的患病組織。藥物進(jìn)入循環(huán)內(nèi)的速率已顯示是分子量或大小的函數(shù)。包含本發(fā)明的化合物的脂質(zhì)體或其他藥物載體的使用可以潛在地使藥物局部化于例如某些組織類型，例如網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的組織?？梢源龠M(jìn)藥物與細(xì)胞例如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面結(jié)合的脂質(zhì)體制劑也是有用的。這種方法通過利用異常細(xì)胞的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞免疫識別的特異性可以提供藥物對靶細(xì)胞的增強(qiáng)遞送。
“藥學(xué)上可接受的制劑”或“藥學(xué)上可接受的組合物”意指允許本發(fā)明的核酸分子在最適合于其所需活性的物理位置中有效分布的組合物或制劑。適合于與本發(fā)明的核酸分子一起配制的試劑的非限制性例子包括P-糖蛋白抑制劑(例如Pluronic P85)；生物可降解聚合物，例如用于持續(xù)釋放遞送的DL-丙交酯-乙交酯共聚物小球體(Emerich，DF等人，1999，Cell Transplant，8，47-58)；和裝載的納米顆粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些。關(guān)于本發(fā)明的核酸分子的遞送策略的其他非限制性例子包括在下述參考文獻(xiàn)中描述的材料Boado等人，1998，J.Pharm.Sci.，87，1308-1315；Tyler等人，1999，F(xiàn)EBS Lett.，421，280-284；Pardridge等人，1995，PNAS USA.，92，5592-5596；Boado，1995，Adv.Drug Delivery Rev.，15，73-107；Aldrian-Herrada等人，1998，Nucleic AcidsRes.，26，4910-4916；和Tyler等人，1999，PNAS USA.，96，7053-7058。
本發(fā)明的特征還在于包含表面修飾的脂質(zhì)體的組合物的用途，所述表面修飾的脂質(zhì)體包含聚乙二醇脂質(zhì)(PEG修飾的，或長循環(huán)脂質(zhì)體或隱形脂質(zhì)體)和本發(fā)明的核酸分子。這些制劑提供用于增加藥物(例如，siNA)在靶組織中積累的方法。這類藥物載體經(jīng)得住經(jīng)由單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS或RES)的調(diào)理作用和消除，從而使膠囊化的藥物更長的血液循環(huán)時(shí)間和增強(qiáng)的組織暴露成為可能(Lasic等人，Chem.Rev.1995，95，2601-2627；Ishiwata等人，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。此種脂質(zhì)體已顯示在腫瘤中選擇性積累，推測是通過在新血管形成的靶組織中的外滲和捕獲(Lasic等人，Science 1995，267，1275-1276；Oku等人，1995，Biochim.Biophys.Acta，1238，86-90)。長循環(huán)脂質(zhì)體增強(qiáng)DNA和RNA的藥物代謝動力學(xué)和藥物動力學(xué)，特別是與已知在MPS組織中積累的常規(guī)陽離子脂質(zhì)體相比較(Liu等人，J.Biol.Chem.1995，42，24864-24870；Choi等人，國際PCT公開號WO 96/10391；Ansell等人，國際PCT公開號WO 96/10390；Holland等人，國際PCT公開號WO 96/10392)。基于其避免在代謝攻擊性MPS組織例如肝和脾中積累的能力，長循環(huán)脂質(zhì)體也可能保護(hù)藥物不受核酸酶降解至與陽離子脂質(zhì)體相比較更大的程度。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑包含用下述專利中描述的化合物和組合物配制，或與下述專利中描述的化合物和組合物復(fù)合的本發(fā)明的雙鏈核酸分子(例如，siNA)US 6,858,224；6,534,484；6,287,591；6,835,395；6,586,410；6,858,225；6,815,432；US 6,586,001；6,120,798；US 6,977,223；US 6,998,115；5,981,501；5,976,567；5,705,385；US2006/0019912；US 2006/0019258；US 2006/0008909；US 2005/0255153；US 2005/0079212；US 2005/0008689；US 2003/0077829，US2005/0064595，US 2005/0175682，US 2005/0118253；US 2004/0071654；US 2005/0244504；US 2005/0265961和US 2003/0077829，所述所有專利都整體引入本文作為參考。
本發(fā)明還包括制備用于貯存或施用的組合物，其包括在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中藥學(xué)有效量的所需化合物。用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑是藥學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的，并且例如在引入本文作為參考的Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編輯1985)中得到描述。例如可以提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和調(diào)味劑。這些包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。此外，可以使用抗氧化劑和懸浮劑。
藥學(xué)有效劑量是預(yù)防、抑制發(fā)生、或治療(使癥狀減輕至某一程度，優(yōu)選所有癥狀)疾病狀態(tài)所需的那種劑量。藥學(xué)有效劑量取決于疾病類型、使用的組合物、施用途徑、待治療的哺乳動物類型、正在考慮的具體哺乳動物的身體特征、并存的藥療法、以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到的其他因素。一般地，取決于帶負(fù)電荷聚合物的效力，施用0.1mg/kg-100mg/kg體重/天的活性成分量。
本發(fā)明的核酸分子及其制劑可以在包含常規(guī)無毒的藥學(xué)上可接受的載體、佐劑和/或媒介物的劑量單位制劑中經(jīng)口、地方性、腸胃外、經(jīng)由吸入或噴霧、或經(jīng)直腸施用。如本文所使用的，術(shù)語腸胃外包括經(jīng)皮、皮下、血管內(nèi)(例如，靜脈內(nèi))、肌內(nèi)、或鞘內(nèi)注射或輸注技術(shù)等。此外，提供了包含本發(fā)明的核酸分子和藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑。本發(fā)明的一種或多種核酸分子可以與一種或多種無毒的藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑和/或佐劑，以及需要時(shí)其他活性成分結(jié)合存在。包含本發(fā)明的核酸分子的藥物組合物可以是適合于經(jīng)口使用的形式，例如作為片劑、錠劑、糖錠、水性或油性懸浮液、可分散的粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。
預(yù)期用于經(jīng)口使用的組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的用于制備藥物組合物的任何方法進(jìn)行制備，并且此種組合物可以包含一種或多種此種甜味劑、調(diào)味劑、著色劑或防腐劑以便提供藥學(xué)上精致和可口的制劑。片劑包含與無毒的藥學(xué)上可接受的賦形劑混合的化學(xué)成分，所述賦形劑適合于制備片劑。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑；例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化和崩解劑，例如玉米淀粉、或藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；和潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以是無包被的，或它們可以通過已知技術(shù)進(jìn)行包被。在某些情況下此種包被可以通過已知技術(shù)進(jìn)行制備，以延遲在胃腸道中的崩解和吸收且因此提供經(jīng)過較長時(shí)間段的持續(xù)作用。例如，可以使用時(shí)間延遲材料例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于經(jīng)口使用的制劑也可以呈現(xiàn)為其中活性成分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合的硬明膠膠囊，或呈現(xiàn)為其中活性成分與水或油介質(zhì)例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合的軟明膠膠囊。
水性懸浮液包含與適合于制備水性懸浮液的賦形劑混合的活性材料。此種賦形劑是懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散或濕潤劑可以是天然存在的磷脂例如卵磷脂，或烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物例如十七乙烯氧基鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物例如聚乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。水性懸浮液還可以包含一種或多種防腐劑例如對羥基苯甲酸乙酯或?qū)αu基苯甲酸正丙酯，一種或多種著色劑，一種或多種調(diào)味劑，和一種或多種甜味劑例如蔗糖或糖精。
油性懸浮液可以通過使活性成分懸浮于植物油或礦物油例如液體石蠟中來制備，所述植物油例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油。油性懸浮液可以包含增稠劑例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇?？梢蕴砑犹鹞秳┖驼{(diào)味劑以提供可口的經(jīng)口制劑。這些組合物可以通過添加抗氧化劑例如抗壞血酸進(jìn)行防腐。
適合于通過添加水制備水性懸浮液的可分散的粉末和顆粒提供與分散或濕潤劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合的活性成分。合適的分散或濕潤劑或懸浮劑由上文已提及的那些例示。還可以存在另外的賦形劑例如甜味劑、調(diào)味劑和著色劑。
本發(fā)明的藥物組合物也可以是水包油乳劑的形式。油相可以是植物油或礦物油或這些的混合物。合適的乳化劑可以是天然存在的樹膠例如阿拉伯樹膠或黃蓍樹膠，天然存在的磷脂例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如山梨糖醇酐單油酸酯，和所述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。乳劑還可以包含甜味劑和調(diào)味劑。
糖漿和酏劑可以用甜味劑例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖進(jìn)行配制。此種制劑還可以包含緩和劑、防腐劑以及調(diào)味劑和著色劑。藥物組合物可以是無菌可注射的水性或含油懸浮液的形式。這種懸浮液可以根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行配制，其中使用上文已提及的那些合適的分散或濕潤劑和懸浮劑。無菌可注射的制劑也可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如作為溶于1，3-丁二醇的溶液。在可以使用的可接受的媒介物和溶劑中有水、林格液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的、固定油照慣例用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個目的，可以使用任何溫和的固定油包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸在可注射物的制備中找到用途。
本發(fā)明的核酸分子也可以以栓劑的形式施用，例如用于藥物的直腸施用。這些組合物可以通過將藥物與合適的非刺激性賦形劑混合進(jìn)行制備，所述賦形劑在常溫下是固體的但在直腸溫度下是液體的，并且因此在直腸中將熔化以釋放藥物。此種材料包括可可脂和聚乙二醇。
本發(fā)明的核酸分子可以在無菌介質(zhì)中腸胃外施用。取決于使用的媒介物和濃度，藥物可以懸浮于或溶解于媒介物中。有利地，佐劑例如局部麻醉藥、防腐劑和緩沖劑可以溶解于媒介物中。
約0.1mg-約140mg/千克體重/天的級別的劑量水平在上述狀況的治療中是有用的(約0.5mg-約7g/受試者/天)?？梢耘c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量依賴于治療的宿主和具體施用方式而變。劑量單位形式一般包含約1mg-約500mg活性成分。
應(yīng)當(dāng)理解對于任何特定受試者的具體劑量水平取決于多種因素，包括使用的具體化合物的活性、年齡、體重、一般健康、性別、飲食、施用時(shí)間、施用途徑、和排泄率、藥物組合和經(jīng)歷治療的特定疾病的嚴(yán)重度。
對于給非人動物的施用，組合物也可以加入動物飼料或飲用水中。配制動物飼料和飲用水組合物可以是方便的，以便動物連同其飲食接受治療合適量的組合物。將組合物呈現(xiàn)為預(yù)混合料用于加入飼料或飲用水中也可以是方便的。
本發(fā)明的核酸分子也可以與其他治療化合物組合施用于受試者以增加總體療效。使用多重化合物以治療適應(yīng)癥可以增加有利效應(yīng)，同時(shí)減少副作用的存在。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包含適合于給特定細(xì)胞類型施用本發(fā)明的核酸分子的組合物。例如，脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPr)(Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262，4429-4432)是肝細(xì)胞特有的并且結(jié)合分支半乳糖-末端糖蛋白，例如脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)。在另一個例子中，葉酸受體在許多癌癥細(xì)胞中超表達(dá)。此種糖蛋白、合成復(fù)合糖、或葉酸與受體的結(jié)合以強(qiáng)烈依賴寡糖鏈的分支程度的親和力發(fā)生，例如，三觸角(triatennary)結(jié)構(gòu)以比二觸角(biatenarry)或單觸角(monoatennary)鏈更大的親和力結(jié)合(Baenziger和Fiete，1980，Cell，22，611-620；Connolly等人，1982，J.Biol.Chem.，257，939-945)。Lee和Lee，1987，Glycoconjugate J.，4，317-328，通過使用N-乙酰-D-半乳糖胺作為碳水化合物部分獲得這種高特異性，與半乳糖相比較所述N-乙酰-D-半乳糖胺具有對受體更高的親和力。這種“成簇效應(yīng)”也已對于甘露糖-末端糖蛋白或復(fù)合糖的結(jié)合和攝取進(jìn)行描述(Ponpipom等人，1981，J.Med.Chem.，24，1388-1395)。使用基于半乳糖、半乳糖胺或葉酸的綴合物轉(zhuǎn)運(yùn)外源化合物跨越細(xì)胞膜可以提供例如治療肝病、肝癌或其他癌癥的靶向遞送方法。生物綴合物的使用還提供對于治療所需的治療化合物的所需劑量中的減少。此外，治療生物利用率、藥物動力學(xué)和藥物代謝動力學(xué)參數(shù)可以通過使用本發(fā)明的核酸生物綴合物進(jìn)行調(diào)節(jié)。此種生物綴合物的非限制性例子在2001年8月13日提交的Vargeese等人，USSN 10/201,394；和2002年3月6日提交的Matulic-Adamic等人，USSN 60/362,016中得到描述。
可替代地，本發(fā)明的某些siNA分子可以在細(xì)胞內(nèi)從真核啟動子表達(dá)(例如，Izant和Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry和Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 83，399；Scanlon等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，10591-5；Kashani-Sabet等人，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Dropulic等人，1992，J.Virol.，66，1432-41；Weerasinghe等人，1991，J.Virol.，65，5531-4；Ojwang等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen等人，1992，Nucleic AcidsRes.，20，4581-9；Sarver等人，1990 Science，247，1222-1225；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Good等人，1997，Gene Therapy，4，45。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到任何核酸都可以在真核細(xì)胞中從合適的DNA/RNA載體表達(dá)。此種核酸的活性可以通過其經(jīng)由酶促核酸從初級轉(zhuǎn)錄物中釋放得到增大(Draper等人，PCT WO 93/23569，和Sullivan等人，PCT WO 94/02595；Ohkawa等人，1992，Nucleic Acids Symp.Ser.，27，15-6；Taira等人，1991，Nucleic Acids Res.，19，5125-30；Ventura等人，1993，Nucleic Acids Res.，21，3249-55；Chowrira等人，1994，J.Biol.Chem.，269，25856。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的RNA分子可以由插入到DNA或RNA載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄單位(參見例如Couture等人，1996，TIG.，12，510)表達(dá)。重組載體可以是DNA質(zhì)?；虿《据d體。表達(dá)siNA的病毒載體可以基于但不限于下述進(jìn)行構(gòu)建腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或甲病毒。在另一個實(shí)施方案中，基于polIII的構(gòu)建體用于表達(dá)本發(fā)明的核酸分子(參見例如Thompson，美國專利號5,902,880和6,146,886)。能夠表達(dá)siNA分子的重組載體可以如本文所描述的遞送，且在靶細(xì)胞中持續(xù)?？商娲?，可以使用提供核酸分子的瞬時(shí)表達(dá)的病毒載體。必要時(shí)此種載體可以重復(fù)施用。一旦被表達(dá)，siNA分子就與靶mRNA相互作用且產(chǎn)生RNAi應(yīng)答。siNA分子表達(dá)載體的遞送可以是全身性的，例如通過靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用，通過施用于從受試者外植的靶細(xì)胞隨后重新引入受試者內(nèi)，或通過將允許引入所需靶細(xì)胞內(nèi)的任何其他方式(關(guān)于綜述參見Couture等人，1996，TIG.，12，510)。
在一個方面，本發(fā)明的特征在于包含編碼本發(fā)明的至少一種siNA分子的核酸序列的表達(dá)載體。表達(dá)載體可以編碼siNA雙鏈體的一條或兩條鏈，或自我雜交成siNA雙鏈體的單條自互補(bǔ)鏈。編碼本發(fā)明的siNA分子的核酸序列可以以允許siNA分子表達(dá)的方式可操作地連接(參見例如Paul等人，2002，Nature Biotechnology，19，505；Miyagishi和Taira，2002，Nature Biotechnology，19，497；Lee等人，2002，NatureBiotechnology，19，500；和Novina等人，2002，Nature Medicine，預(yù)先在線公開doi10.1038/nm725)。
在另一個方面，本發(fā)明的特征在于包含下述的表達(dá)載體a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(例如，真核pol I、II或III起始區(qū))；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(例如，真核pol I、II或III終止區(qū))；和c)編碼本發(fā)明的至少一種siNA分子的核酸序列，其中所述序列以允許siNA分子表達(dá)和/或遞送的方式與所述起始區(qū)和所述終止區(qū)可操作地連接。載體可以任選包括關(guān)于在編碼本發(fā)明siNA的序列的5′側(cè)或3′-側(cè)上可操作地連接的蛋白質(zhì)的可讀框(ORF)；和/或內(nèi)含子(間插序列)。
siNA分子序列的轉(zhuǎn)錄可以由用于真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)、或RNA聚合酶III(pol III)的啟動子驅(qū)動。來自pol II或pol III啟動子的轉(zhuǎn)錄在所有細(xì)胞中以高水平表達(dá)；給定pol II啟動子在給定細(xì)胞類型中的水平取決于附近存在的基因調(diào)節(jié)序列(增強(qiáng)子、沉默基因等)的性質(zhì)。原核RNA聚合酶啟動子也可以使用，只要原核RNA聚合酶在合適的細(xì)胞中表達(dá)(Elroy-Stein和Moss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，6743-7；Gao和Huang 1993，Nucleic Acids Res.，21，2867-72；Lieber等人，1993，Methods Enzymol.，217，47-66；Zhou等人，1990，Mol.Cell.Biol.，10，4529-37)。幾個研究者已證實(shí)由此種啟動子表達(dá)的核酸分子可以在哺乳動物細(xì)胞中起作用(例如，Kashani-Sabet等人，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Ojwang等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen等人，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Yu等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6340-4；L′Huillier等人，1992，EMBO J.，11，4411-8；Lisziewicz等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，8000-4；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Sullenger和Cech，1993，Science，262，1566)。更具體而言，轉(zhuǎn)錄單位例如衍生自編碼U6小核(snRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的那些在細(xì)胞中產(chǎn)生高濃度的所需RNA分子例如siNA方面是有用的(Thompson等人，同上；Couture和Stinchcomb，1996，同上；Noonberg等人，1994，Nucleic Acid Res.，22，2830；Noonberg等人，美國專利號5,624,803；Good等人，1997，Gene Ther，4，45；Beigelman等人，國際PCT公開號WO 96/18736。上述siNA轉(zhuǎn)錄單位可以摻入多種載體內(nèi)用于引入哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，包括但不限于，質(zhì)粒DNA載體、病毒DNA載體(例如，腺病毒或腺伴隨病毒載體)、或病毒RNA載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或甲病毒載體)(關(guān)于綜述參見Couture和Stinchcomb，1996，同上)。
在另一個方面，本發(fā)明的特征在于以允許那種siNA分子表達(dá)的方式包含編碼本發(fā)明的至少一種siNA分子的核酸序列的表達(dá)載體。在一個實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；和c)編碼siNA分子的至少一條鏈的核酸序列，其中所述序列以允許siNA分子表達(dá)和/或遞送的方式與起始區(qū)和終止區(qū)可操作地連接。
在另一個實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)可讀框；和d)編碼siNA分子的至少一條鏈的核酸序列，其中所述序列與可讀框的3′-末端可操作地連接，且其中所述序列以允許siNA分子表達(dá)和/或遞送的方式與起始區(qū)、可讀框和終止區(qū)可操作地連接。在另外一個實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)內(nèi)含子；和d)編碼至少一種siNA分子的核酸序列，其中所述序列以允許核酸分子表達(dá)和/或遞送的方式與起始區(qū)、內(nèi)含子和終止區(qū)可操作地連接。
在另一個實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)內(nèi)含子；d)可讀框；和e)編碼siNA分子的至少一條鏈的核酸序列，其中所述序列與可讀框的3′-末端可操作地連接，且其中所述序列以允許siNA分子表達(dá)和/或遞送的方式與起始區(qū)、內(nèi)含子、可讀框和終止區(qū)可操作地連接。
HCV生物學(xué)和生物化學(xué) 在1989年，丙型肝炎病毒(HCV)被確定為RNA病毒并且鑒定為大多數(shù)非甲非乙型病毒性肝炎的致病因子(Choo等人，1989，Science，244，359-362)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒例如HIV不同，HCV不經(jīng)歷DNA復(fù)制期，并且尚未檢測到病毒基因組進(jìn)入宿主染色體內(nèi)的整合形式(Houghton等人，1991，Hepatology，14，381-388)。相反，編碼(正)鏈的復(fù)制由復(fù)制(負(fù))鏈的產(chǎn)生介導(dǎo)，從而導(dǎo)致產(chǎn)生正鏈HCV RNA的幾個拷貝。該基因組由翻譯成多蛋白的單個、大可讀框組成(Kato等人，1991，F(xiàn)EBS Letters，280325-328)。這種多蛋白隨后經(jīng)歷翻譯后切割，從而產(chǎn)生幾種病毒蛋白質(zhì)(Leinbach等人，1994，Virology，204163-169)。
HCV的9.5千堿基基因組的檢查已證實(shí)病毒核酸可以以高比率突變(Smith等人，1997Mol.Evol.45，238-246)。這種突變比率已導(dǎo)致進(jìn)化出共享約70％序列同一性的幾種不同的HCV基因型(Simmonds等人，1994，J.Gen.Virol.75，1053-1061)。應(yīng)重點(diǎn)指出這些序列在進(jìn)化上相當(dāng)遙遠(yuǎn)。例如，人和靈長類動物例如黑猩猩之間的遺傳同一性為約98％。此外，已證實(shí)在單個患者中的HCV感染由在RNA水平上具有98％同一性的幾種不同且進(jìn)化中的準(zhǔn)種組成。因此，HCV基因組是高變的且不斷改變的。盡管HCV基因組是高變的，但存在高度保守的3個基因組區(qū)域。這些保守序列發(fā)生于5′和3′非編碼區(qū)以及核心蛋白編碼區(qū)的5′-末端，并且被認(rèn)為對于HCV RNA復(fù)制以及HCV多蛋白翻譯是至關(guān)重要的。因此，靶向這些保守HCV基因組區(qū)域的治療劑可以對廣泛范圍的HCV基因型具有重要影響。此外，使用對HCV基因組的保守區(qū)域特異的酶促核酸將不太可能發(fā)生抗藥性。相比之下，靶向酶例如病毒蛋白酶或解旋酶的抑制的治療方式可能導(dǎo)致關(guān)于抗藥性品系的選擇，因?yàn)殛P(guān)于這些病毒編碼的酶的RNA位于HCV基因組的高變部分中。
最初暴露于HCV后，患者經(jīng)歷肝酶中的暫時(shí)升高，這指出炎癥性過程正在發(fā)生(Alter等人，INSeeff LB，Lewis JH，eds.CurrentPerspectives in Hepatology.New YorkPlenum Medical Book Co；198983-89)。肝酶中的這種上升在最初暴露后至少4周時(shí)發(fā)生并且可以持續(xù)最高達(dá)2個月(Farci等人，1991，New England Journal of Medicine.325，98-104)。在肝酶中的升高之前，可能使用RT-PCR分析檢測患者的血清中的HCV RNA(Takahashi等人，1993，American Journal ofGastroenterology.88，240-243)。這個疾病階段稱為急性期且通常變得無法檢測，因?yàn)榛加杏捎贖CV感染的急性病毒性肝炎的75％患者是無癥狀的。剩余25％的這些患者發(fā)展黃疸或其他肝炎癥狀。
盡管急性HCV感染是良性疾病，但多達(dá)80％的急性HCV患者進(jìn)展至慢性肝病，如由血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平的持續(xù)上升和由循環(huán)HCVRNA的連續(xù)存在證明的(Sherlock，1992，Lancet，339，802)。慢性HCV感染經(jīng)過10-20年時(shí)間段的自然進(jìn)展在20-50％的患者中導(dǎo)致肝硬化(Davis等人，1993，Infectious Agents and Disease，2，150，154)，并且HCV感染進(jìn)展至肝細(xì)胞癌已被充分證明(Liang等人，1993，Hepatology.18，1326-1333；Tong等人，1994，Western Journal ofMedicine，160，133-138)。沒有已確定最可能進(jìn)展至肝硬化和/或肝細(xì)胞癌的亞群的研究，因此所有患者具有相等的進(jìn)展危險(xiǎn)。
應(yīng)重點(diǎn)指出關(guān)于診斷患有肝細(xì)胞癌的患者的存活從初次診斷開始僅為0.9-12.8個月(Takahashi等人，1993，American Journal ofGastroenterology.88，240-243)。用化學(xué)治療劑治療肝細(xì)胞癌未被證明有效，并且由于肝的廣泛腫瘤侵入，只有10％的患者將從外科手術(shù)獲益(Trinchet等人，1994，Presse Medicine.23，831-833)?？紤]到原發(fā)性肝細(xì)胞癌的攻擊性質(zhì)，外科手術(shù)的唯一可行的治療替代方案是肝移植(Pichlmayr等人，1994，Hepatology.20，33S-40S)。
進(jìn)展至肝硬化后，患有慢性HCV感染的患者呈現(xiàn)臨床特征，所述臨床特征是臨床肝硬化共有的，而不管最初病因如何(D′Amico等人，1986，Digestive Diseases and Sciences.31，468-475)。這些臨床特征可以包括出血性食管曲張、腹水、黃疸和腦病(Zakim D，Boyer TD.Hepatology a textbook of liver disease.第2版第1卷.1990 W.B.SaundersCompany.Philadelphia)。在肝硬化的早期中，患者被分類為代償性的，在這個階段患者的肝仍能夠使血流中的代謝物解毒，盡管肝組織損傷已發(fā)生。此外，具有代償性肝病的大多數(shù)患者是無癥狀的，并且具有癥狀的少數(shù)人報(bào)道僅有次要癥狀，例如消化不良和虛弱。在肝硬化的晚期中，患者被分類為失代償?shù)模谶@個階段肝使血流中的代謝物解毒的能力減少。正是在失代償期時(shí)上文描述的臨床特征呈現(xiàn)。
在1986年，D′Amico等人描述了在患有酒精性和病毒相關(guān)性肝硬化的1155個患者中的臨床表現(xiàn)和存活率(D′Amico同上)。在1155個患者中，435個(37％)具有代償性疾病，盡管70％在研究開始時(shí)是無癥狀的。剩余720個患者(63％)具有失代償性肝病，其中78％呈現(xiàn)具有腹水史，31％具有黃疸，17％具有出血和16％具有腦病。在患有代償性疾病的6個(.5％)患者和患有失代償性疾病的30個(2.6％)患者中觀察到肝細(xì)胞癌。
經(jīng)過6年的過程，患有代償性肝硬化的患者以每年10％的速率發(fā)展出失代償性疾病的臨床特征。在大多數(shù)情況下，腹水是失代償?shù)牡谝环N表現(xiàn)。此外，在6年的研究結(jié)束時(shí)最初呈現(xiàn)代償性疾病的59個患者中發(fā)展出肝細(xì)胞癌。
關(guān)于存活，D′Amico研究指出關(guān)于研究中的所有患者的5年存活率僅為40％。關(guān)于最初患有代償性肝硬化的患者的6年存活力為54％，而關(guān)于最初呈現(xiàn)失代償性疾病的患者的6年存活率僅為21％。在患有酒精性肝硬化的患者和患有病毒相關(guān)性肝硬化的患者之間在存活率中沒有顯著差異。關(guān)于在D′Amico研究中的患者的主要死因是49％中肝衰竭；22％中肝細(xì)胞癌；和13％中出血(D′Amico同上)。
慢性丙型肝炎是由病毒(HCV)介導(dǎo)的肝的慢性進(jìn)行性炎性疾病，其經(jīng)過10-20年的時(shí)間段可以導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭和/或肝細(xì)胞癌。在美國，估計(jì)由HCV感染每年在美國占50,000個急性肝炎的新病例(NIHConsensus Development Conference Statement on Management ofHepatitis C March 1997)。HCV在美國的流行率估計(jì)為1.8％，且CDC列出慢性感染的美國人數(shù)目為約4.5百萬人。CDC還估計(jì)每年最高達(dá)10,000例死亡由慢性HCV感染引起。
在慢性HCV感染治療中使用干擾素(IFN-α)的眾多良好控制的臨床試驗(yàn)已證實(shí)在6個月的治療結(jié)束時(shí)，每周治療3次導(dǎo)致患者的血清ALT值降低約50％(40％-70％)(Davis等人，1989，New EnglandJournal of Medicine，321，1501-1506；Marcellin等人，1991，Hepatology，13，393-397；Tong等人，1997，Hepatology，26，747-754；Tong等人，1997，Hepatology，26，1640-1645)。然而，干擾素治療停止后，約50％的響應(yīng)患者復(fù)發(fā)，從而如通過約20-25％的血清ALT濃度的標(biāo)準(zhǔn)化評估的，導(dǎo)致“持久的”應(yīng)答率。
HCV RNA的直接測量通過使用分支DNA或逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析是可能的。一般而言，RT-PCR方法更靈敏且導(dǎo)致臨床過程更精確的評估(Tong等人，同上)。已使用HCV RNA值中的改變作為臨床終點(diǎn)檢查6個月的1型干擾素治療的研究已證實(shí)最高達(dá)35％的患者在治療結(jié)束時(shí)具有HCV RNA的喪失(Marcellin等人，同上)。然而，與ALT終點(diǎn)一樣，約50％的患者在治療停止后6個月內(nèi)復(fù)發(fā)，從而導(dǎo)致僅12％的持久病毒學(xué)應(yīng)答(Marcellin等人，同上)。已檢查48周治療的研究已證實(shí)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答最高達(dá)25％(NIH共識聲明(consensus statement)1997)。因此，關(guān)于用1型干擾素治療慢性HCV感染的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)目前是使用HCV RNA濃度中的改變作為主要功效評估的48周治療(Hoofnagle等人，1997，New England Journal of Medicine，336，347-356)。
起因于1型干擾素治療的副作用可以分成4個一般種類，其包括(1)流感樣癥狀；(2)神經(jīng)精神?。?3)實(shí)驗(yàn)室異常；和(4)其他(Dusheiko等人，1994，Journal ofViral Hepatitis，1，3-5)。流感樣癥狀的例子包括疲勞、發(fā)燒、肌痛、不適、食欲喪失、心動過速、僵直、頭痛和關(guān)節(jié)痛。流感樣癥狀通常是短期的且在給藥的前4周后傾向于減少(Dushieko等人，同上。神經(jīng)精神病副作用包括應(yīng)激性、情感淡漠、心情改變、失眠、認(rèn)知改變和抑郁。這些神經(jīng)精神病副作用中最重要的是抑郁，并且具有抑郁史的患者不應(yīng)給予1型干擾素。實(shí)驗(yàn)室異常包括髓樣細(xì)胞中的減少，包括粒細(xì)胞、血小板和至較少程度的紅細(xì)胞。血細(xì)胞計(jì)數(shù)中的這些改變很少導(dǎo)致任何顯著的臨床后遺癥(sequellae)(Dushieko等人，同上)。此外，已觀察到甘油三酯濃度中的增加以及血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶濃度中的上升。最后，甲狀腺異常已被報(bào)道。這些甲狀腺異常在干擾素治療停止后通常是可逆的，且在治療時(shí)可以用合適的藥療法加以控制。其他副作用包括惡心、腹瀉、腹痛和背痛、瘙癢、脫發(fā)和鼻漏。一般而言，大多數(shù)副作用在治療4-8周后將減輕(Dushieko等人，同上)。
靶向HCV基因和與HIC生活周期有關(guān)的細(xì)胞/宿主基因靶的小干擾核酸分子的使用因此提供了一類新治療劑，其可以用于治療和診斷受試者或生物中的HCV感染、肝衰竭、肝細(xì)胞癌、肝硬化或響應(yīng)HCV基因調(diào)節(jié)(例如，抑制)的任何其他疾病或狀況。
實(shí)施例 下述是顯示本發(fā)明的核酸的選擇、分離、合成和活性的非限制性例子。
實(shí)施例1siNA構(gòu)建體的串聯(lián)合成 本發(fā)明的示例性siNA分子使用可切割接頭例如基于琥珀酰的接頭串聯(lián)合成。如本文所描述的串聯(lián)合成隨后為以高得率提供RNAi分子的單步純化過程。這種方法高度順應(yīng)siNA合成支持高通量RNAi篩選，并且可以容易地適應(yīng)多柱或多孔合成平臺。
其中5′-末端二甲氧三苯甲基(5′-O-DMT)保持完整(三苯甲基依賴合成)的siNA寡核苷酸(oligo)及其互補(bǔ)體串聯(lián)合成完成后，寡核苷酸如上所述進(jìn)行脫保護(hù)。脫保護(hù)后，允許siNA序列鏈自發(fā)地雜交。這種雜交產(chǎn)生其中一條鏈已保留5′-O-DMT基團(tuán)而互補(bǔ)鏈包含末端5′-羥基的雙鏈體。新形成的雙鏈體在常規(guī)固相提取純化(三苯甲基依賴(Trityl-On)純化)期間表現(xiàn)為單個分子，即使只有1個分子具有二甲氧三苯甲基。因?yàn)殒溞纬煞€(wěn)定的雙鏈體，所以這種二甲氧三苯甲基(或等價(jià)基團(tuán)，例如其他三苯甲基或其他疏水性部分)是純化寡核苷酸對所全部需要的，例如通過使用C18藥液筒。
使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺合成化學(xué)直至引入串聯(lián)接頭的點(diǎn)，例如反向脫氧脫堿基琥珀酸酯或琥珀酸甘油酯接頭(參見圖1)或等價(jià)可切割接頭?？梢允褂玫慕宇^偶聯(lián)條件的非限制性例子包括阻礙堿基例如二異丙基乙胺(DIPA)和/或DMAP，在活化劑例如六氟磷酸溴三吡咯烷鏻(PyBrOP)的存在下。接頭偶聯(lián)后，使用標(biāo)準(zhǔn)合成化學(xué)以完成第二種序列的合成，使末端5′-O-DMT保持完整。合成后，所得到的寡核苷酸根據(jù)本文描述的程序進(jìn)行脫保護(hù)，且用合適的緩沖液例如用50mM NaOAc或1.5M NH4H2CO3猝滅。
siNA雙鏈體的純化可以使用固相提取容易地完成，例如使用用1柱體積(CV)的乙腈、2CV H2O和2CV 50mM NaOAc調(diào)節(jié)的WatersC18SepPak 1g藥液筒。裝載樣品且隨后用1CV H2O或50mM NaOAc洗滌。失敗序列用1CV 14％ACN(水性具有50mM NaOAc和50mMNaCl)洗脫。隨后例如使用1CV H2O洗滌柱，隨后為柱上脫三苯甲基作用，例如通過使1CV 1％含水三氟乙酸(TFA)經(jīng)過柱，隨后向柱中添加第二次CV 1％含水TFA且允許靜置約10分鐘。去除剩余TFA溶液且用H2O隨后為1CV 1M NaCl和另外的H2O洗滌柱。隨后例如使用1CV 20％含水CAN洗脫siNA雙鏈體產(chǎn)物。
圖2提供了純化的siNA構(gòu)建體的MALDI-TOF質(zhì)譜分析法分析的例子，其中每個峰對應(yīng)于siNA雙鏈體的個別siNA鏈的計(jì)算質(zhì)量。當(dāng)通過毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)進(jìn)行分析時(shí)，相同純化的siNA提供了3個峰，1個峰推測對應(yīng)于雙鏈體siNA，且2個峰推測對應(yīng)于分開的siNA序列鏈。相同siNA構(gòu)建體的離子交換HPLC分析只顯示了單個峰。與由分開合成的寡核苷酸序列鏈產(chǎn)生的siNA構(gòu)建體相比較，使用下述螢光素酶報(bào)道分子測定測試純化的siNA構(gòu)建體證實(shí)相同的RNAi活性。
實(shí)施例2在任何RNA序列中潛在siNA靶位點(diǎn)的鑒定 例如通過使用計(jì)算機(jī)折疊算法就靶位點(diǎn)篩選目的RNA靶序列，例如病毒或人mRNA轉(zhuǎn)錄物(例如，在本文中通過Genbank登記號提及的任何序列)。在非限制性例子中，衍生自數(shù)據(jù)庫，例如Genbank的基因或RNA基因轉(zhuǎn)錄物的序列用于產(chǎn)生與靶具有互補(bǔ)性的siNA靶。此種序列可以從數(shù)據(jù)庫獲得，或可以如本領(lǐng)域已知的用實(shí)驗(yàn)方法測定。已知的靶位點(diǎn)，例如基于使用其他核酸分子例如核酶或反義的研究測定為有效靶位點(diǎn)的那些靶位點(diǎn)，或已知與疾病、性狀或狀況相關(guān)的那些靶例如包含突變或缺失的那些位點(diǎn)，可以用于設(shè)計(jì)靶向那些位點(diǎn)的siNA分子。各種參數(shù)可以用于測定哪些位點(diǎn)是靶RNA序列內(nèi)最合適的靶位點(diǎn)。這些參數(shù)包括但不限于，二級或三級RNA結(jié)構(gòu)，靶序列的核苷酸堿基組成，靶序列的各個區(qū)域之間的同源性程度，或靶序列在RNA轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的相對位置?；谶@些測定，可以選擇RNA轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的任何數(shù)目的靶位點(diǎn)，以例如通過使用體外RNA切割測定、細(xì)胞培養(yǎng)或動物模型就功效篩選siNA分子。在非限制性例子中，基于使用的siNA構(gòu)建體的大小選擇轉(zhuǎn)錄物內(nèi)1-1000個靶位點(diǎn)的任何地方?？梢蚤_發(fā)高通量篩選測定用于使用本領(lǐng)域已知的方法篩選siNA分子，例如使用多孔或多板測定以測定靶基因表達(dá)中的有效減少。
實(shí)施例3RNA中的siNA分子靶位點(diǎn)的選擇 下述非限制性步驟可以用于執(zhí)行靶向給定基因序列或轉(zhuǎn)錄物的siNAs的選擇。
1.靶序列在計(jì)算機(jī)芯片上分解成在靶序列內(nèi)包含的特定長度的所有片段或子序列例如23核苷酸片段列表。這個步驟一般使用定制Perl腳本進(jìn)行，但也可以使用商業(yè)序列分析程序例如Oligo、MacVector或GCG Wisconsin Package。
2.在一些情況下，siNAs對應(yīng)于超過一種靶序列；例如在靶向相同基因的不同轉(zhuǎn)錄物、靶向超過一種基因的不同轉(zhuǎn)錄物、或用于靶向人基因和動物同源物中確實(shí)如此。在這種情況下，對于每種靶產(chǎn)生特定長度的子序列列表，且隨后比較列表以發(fā)現(xiàn)每個列表中的匹配序列。子序列隨后根據(jù)包含給定子序列的靶序列數(shù)目進(jìn)行分級；目的是發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)或所有靶序列中的子序列。可替代地，分級可以鑒定靶序列獨(dú)有的子序列，例如突變體靶序列。此種方法將使得能夠使用siNA以特異性靶向突變序列且不影響正常序列的表達(dá)。
3.在一些情況下，siNA子序列在一種或多種序列中不存在而存在于所需靶序列中；如果siNA靶向具有保持未靶向的旁系同源家族成員的基因則確實(shí)如此。如上文情況2中一樣，對于每種靶產(chǎn)生特定長度的子序列列表，且隨后比較列表以發(fā)現(xiàn)存在于靶基因中但在未靶向的旁系同源物中不存在的序列。
4.分級的siNA子序列可以根據(jù)GC含量進(jìn)行進(jìn)一步分析且分級。對包含30-70％GC的位點(diǎn)給予優(yōu)先，而對于包含40-60％GC的位點(diǎn)給予進(jìn)一步優(yōu)先。
5.分級的siNA子序列可以根據(jù)自折疊和內(nèi)部發(fā)夾進(jìn)行進(jìn)一步分析且分級。較弱的內(nèi)部折疊是優(yōu)選的；強(qiáng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)是被避免的。
6.分級的siNA子序列可以根據(jù)它們在序列中是否具有GGG或CCC串進(jìn)行進(jìn)一步分析且分級。在任一鏈中的GGG(或甚至更多的Gs)可以使得寡核苷酸合成有問題且可以潛在干擾RNAi活性，因此只要較佳的序列是可用的它就被避免。在靶鏈中搜索CCC，因?yàn)槟菍⒃诜戳x鏈中放置GGG。
7.分級的siNA子序列可以根據(jù)它們在序列的3′-末端上是否具有二核苷酸UU(尿苷二核苷酸)，和/或在序列的5′-末端上是否具有AA(以在反義序列上產(chǎn)生3′UU)進(jìn)行進(jìn)一步分析且分級。這些序列允許人們設(shè)計(jì)具有末端TT胸苷二核苷酸的siNA分子。
8.從如上所述的分級的子序列列表中選擇4個或5個靶位點(diǎn)。例如，在具有23個核苷酸的子序列中，隨后對于siNA雙鏈體的上部(有義)鏈設(shè)計(jì)且合成每種所選23-聚體子序列的右側(cè)21個核苷酸，同時(shí)對于siNA雙鏈體的下部(反義)鏈設(shè)計(jì)且合成每種所選23-聚體子序列的左側(cè)21個核苷酸的反向互補(bǔ)物(參見表II)。如果末端TT殘基對于序列是所需的(如段落7中所述)，那么有義和反義鏈的2個3′末端核苷酸在合成寡核苷酸前由TT替換。
9.在體外、細(xì)胞培養(yǎng)或動物模型系統(tǒng)中篩選siNA分子，以鑒定最有活性的siNA分子或靶RNA序列內(nèi)最優(yōu)選的靶位點(diǎn)。
10.當(dāng)選擇靶核酸序列時(shí)可以使用其他設(shè)計(jì)考慮，參見例如，Reynolds等人，2004，Nature Biotechnology Advanced Online Publication，2004年2月1日，doi10.1038/nbt936和Ui-Tei等人，2004，Nucleic AcidsResearch，32，doi10.1093/nar/gkh247。
在可替代方法中，使用對靶序列特異的siNA構(gòu)建體庫以在表達(dá)靶RNA的細(xì)胞中篩選靶位點(diǎn)，所述細(xì)胞例如培養(yǎng)的Jurkat、HeLa、A549或293T細(xì)胞。在這種方法中使用的一般策略顯示于圖9中。表達(dá)靶RNA的細(xì)胞用siNA構(gòu)建體庫轉(zhuǎn)染且分選顯示與靶抑制相關(guān)的表型的細(xì)胞。siNA構(gòu)建體庫可以由插入到合適的載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄盒表達(dá)(參見例如圖7和圖8)。對來自顯示陽性表型改變(例如，減少的增殖，減少的靶mRNA水平或減少的靶蛋白質(zhì)表達(dá))的細(xì)胞的siNA進(jìn)行測序，以測定靶靶RNA序列內(nèi)最合適的一個或多個靶位點(diǎn)。
在一個實(shí)施方案中，使用下述方法選擇本發(fā)明的siNA分子。匯編下述指導(dǎo)以預(yù)測包含本文描述的化學(xué)修飾的高活性siNAs。這些規(guī)則由針對幾種不同靶的高活性(靶mRNA水平＞75％的擊倒)和無活性(靶mRNA水平＜75％的擊倒)siNAs的比較分析顯現(xiàn)出來。分析總共242個siNA序列。242個siNAs中的35個siNAs被分類成高活性的并且剩余siNAs被分類成無活性組。高活性siNAs在siNA序列內(nèi)的特定核苷酸位置上明顯顯示出對于某些堿基的優(yōu)先。例如，A或U核堿基在高活性siNAs的有義鏈的第19位上壓倒性地存在，并且對于無活性的siNAs確實(shí)是對立的。在高活性siNAs中還存在有義鏈的第15-19位之間A/U富含(5個堿基中的3個是A或U)區(qū)和第1-5位之間G/C富含區(qū)(5個堿基中的3個是G或C)的模式。如表VII中所示，鑒定高活性siNAs特有的12種此種模式。應(yīng)當(dāng)指出并非每種模式都存在于每種高活性siNA中。因此，為了設(shè)計(jì)用于預(yù)測高活性siNAs的算法，對每種模式指定不同得分。取決于此種模式在高活性siNAs對無活性siNAs中以多大頻率發(fā)生，對設(shè)計(jì)參數(shù)指定得分，其中最高的是10。如果某一核堿基在位置上不是優(yōu)選的，那么指定負(fù)得分。例如，在有義鏈的第9和13位上，G核苷酸在高活性siNAs中不是優(yōu)選的，且因此它們被給予-3分(減3)。關(guān)于每種模式的差別得分在表VII中給出。模式#4被給予-100的最大得分。這主要是淘汰包含4Gs或4Cs串的任何序列，因?yàn)樗鼈儗τ诤铣煽梢允歉叨炔幌嗳莸那铱梢栽试S序列自聚集，從而使得siNA無活性。使用這種算法，對于任何siNA可能的最高得分是66。因?yàn)榇嬖诳赡茚槍侠泶笮?～1000核苷酸)的任何給定靶的眾多siNA序列，所以這種算法對于產(chǎn)生高活性siNAs是有用的。
在一個實(shí)施方案中，表VII中顯示的規(guī)則1-11用于產(chǎn)生本發(fā)明的活性siNA分子。在另一個實(shí)施方案中，表VII中顯示的規(guī)則1-12用于產(chǎn)生本發(fā)明的活性siNA分子。
實(shí)施例4siNA設(shè)計(jì) siNA靶位點(diǎn)通過下述進(jìn)行選擇分析靶序列且任選基于上文實(shí)施例3中呈現(xiàn)的規(guī)則，和可替代地基于折疊(分析任何給定序列的結(jié)構(gòu)以測定siNA對靶的可接近性)將靶位點(diǎn)區(qū)分優(yōu)先次序，或使用如實(shí)施例3中描述的siNA分子文庫，或可替代地使用如本文實(shí)施例6中描述的體外siNA系統(tǒng)。設(shè)計(jì)這樣的siNA分子，其可以結(jié)合每種靶并且使用上文的算法進(jìn)行選擇且任選通過計(jì)算機(jī)折疊進(jìn)行個別分析，以評估siNA分子是否可以與靶序列相互作用?？梢赃x擇改變siNA分子的長度以最優(yōu)化活性。一般地，選擇足夠數(shù)目的互補(bǔ)核苷酸堿基，以與靶RNA結(jié)合或以其他方式相互作用，但可以調(diào)節(jié)互補(bǔ)性程度以適應(yīng)siNA雙鏈體或改變長度或堿基組成。通過使用此種方法，可以設(shè)計(jì)針對任何已知RNA序列內(nèi)的靶位點(diǎn)的siNA分子，例如對應(yīng)于任何基因轉(zhuǎn)錄物的那些RNA序列。
分析靶序列以產(chǎn)生由其設(shè)計(jì)雙鏈siNA的靶(表II)。為了產(chǎn)生合成siNA構(gòu)建體，使用實(shí)施例3中描述的算法以挑選活性雙鏈構(gòu)建體及其化學(xué)修飾的形式。例如，在表II中，顯示了靶序列連同siNA雙鏈體的上部(有義鏈)和下部鏈(反義鏈)。通過搜索不同靶序列之間的同源位點(diǎn)(例如，共享同源性的約5-約15核苷酸的區(qū)域)且允許非規(guī)范堿基對(例如GU擺動堿基配對)或錯配堿基對來設(shè)計(jì)多功能siNAs。
化學(xué)修飾的siNA構(gòu)建體如本文所描述的進(jìn)行設(shè)計(jì)(參見例如表III)，以提供用于在體內(nèi)全身施用的核酸酶穩(wěn)定性和/或改善的藥物代謝動力學(xué)、定位和遞送性質(zhì)，同時(shí)保持介導(dǎo)RNAi活性的能力。如本文所描述的化學(xué)修飾使用本文描述的合成方法和本領(lǐng)域一般已知的那些合成引入。隨后就在血清和/或細(xì)胞/組織提取物(例如，肝提取物)中的核酸酶穩(wěn)定性測定合成的siNA構(gòu)建體。還使用合適的測定就RNAi活性平行測試合成的siNA構(gòu)建體，所述測定例如如本文描述的螢光素酶報(bào)道分子測定或可以定量RNAi活性的另一種合適的測定。具有核酸酶穩(wěn)定性和RNAi活性的合成的siNA構(gòu)建體可以進(jìn)一步修飾且在穩(wěn)定性和活性測定中重新評估。穩(wěn)定的活性siNA構(gòu)建體的化學(xué)修飾隨后可以應(yīng)用于靶向任何所選RNA的任何siNA序列，且例如在靶篩選測定中用于挑選前導(dǎo)siNA化合物用于治療開發(fā)(參見例如圖11)。
實(shí)施例5siNA的化學(xué)合成、純化和分析 可以設(shè)計(jì)siNA分子以與RNA信使中的各個位點(diǎn)相互作用，例如本文描述的RNA序列內(nèi)的靶序列。一種或多種siNA分子的一條鏈的序列與上文描述的靶位點(diǎn)序列互補(bǔ)。siNA分子可以使用本文描述的方法進(jìn)行化學(xué)合成。用作對照序列的無活性siNA分子可以通過下述合成使siNA分子的序列混亂，從而使得它與靶序列不互補(bǔ)。一般地，siNA構(gòu)建體可以通過使用如本文所描述的固相寡核苷酸合成法進(jìn)行合成(參見例如Usman等人，美國專利號5,804,683；5,831,071；5,998,203；6,117,657；6,353,098；6,362,323；6,437,117；6,469,158；Scaringe等人，美國專利號6,111,086；6,008,400；6,111,086，全部整體引入本文作為參考)。
在非限制性例子中，RNA寡核苷酸以逐步方式使用如本領(lǐng)域已知的亞磷酰胺化學(xué)來合成。標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)涉及包含下述中的任何一種的核苷的使用5′-O-二甲氧三苯甲基、2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基、3′-O-2-氰乙基N，N-二異丙基亞磷酰胺基團(tuán)、和環(huán)外胺保護(hù)基團(tuán)(例如N6-苯甲酰腺苷、N4乙酰基胞苷、和N2-異丁酰鳥苷)?？商娲?，2′-O-甲硅烷基醚可以與酸不穩(wěn)定的2′-O-原酸酯保護(hù)基團(tuán)結(jié)合在如由Scaringe同上描述的RNA合成中使用。不同的2′化學(xué)可以需要不同的保護(hù)基團(tuán)，例如2′-脫氧-2′-氨基核苷可以利用如Usman等人，美國專利5,631,360中描述的N-鄰苯二甲酰保護(hù)，所述專利整體引入本文作為參考)。
在固相合成期間，向固體支持體結(jié)合的寡核苷酸中順次加入(3′-至5′-方向)每種核苷酸。在鏈的3′-末端處的第一個核苷使用各種接頭與固體支持體(例如，可控孔度玻璃或聚苯乙烯)共價(jià)附著。使核苷酸前體、核糖核苷亞磷酰胺和活化劑組合，從而導(dǎo)致第二個核苷亞磷酰胺偶聯(lián)在第一個核苷的5′-末端上。隨后洗滌支持體且用加帽試劑例如乙酸酐給任何未反應(yīng)的5′-羥基加帽，以產(chǎn)生無活性的5′-乙酰基部分。隨后使三價(jià)的磷鍵氧化成更穩(wěn)定的磷酸鍵。在核苷酸的加入循環(huán)結(jié)束時(shí)，在合適的條件下(例如用于基于三苯甲基的基團(tuán)的酸性條件和用于基于甲硅烷基的基團(tuán)的氟化物)切割5′-O-保護(hù)基團(tuán)。對于每個后續(xù)核苷酸重復(fù)該循環(huán)。
可以使用合成條件的修改以最優(yōu)化偶聯(lián)效率，取決于待合成的siNA的具體化學(xué)組成，例如通過使用不同的偶聯(lián)時(shí)間、不同的試劑/亞磷酰胺濃度、不同的接觸時(shí)間、不同的固體支持體和固體支持體接頭化學(xué)。siNA的脫保護(hù)和純化可以如下述參考文獻(xiàn)中一般描述的進(jìn)行Usman等人，US 5,831,071、US 6,353,098、US 6,437,117，和Bellon等人，US 6,054,576、US 6,162,909、US 6,303,773，或Scaringe同上，所述參考文獻(xiàn)整體引入本文作為參考。此外，可以修改脫保護(hù)條件以提供siNA構(gòu)建體最佳的可能得率和純度。例如，申請人已觀察到包含2′-脫氧-2′-氟核苷酸的寡核苷酸可以在不合適的脫保護(hù)條件下降解。此種寡核苷酸使用含水甲胺于約35℃30分鐘進(jìn)行脫保護(hù)。如果包含2′-脫氧-2′-氟的寡核苷酸還包含核糖核苷酸，那么用含水甲胺于約35℃30分鐘脫保護(hù)后，添加TEA-HF且使反應(yīng)于約65℃維持另外15分鐘。siNA脫保護(hù)的單鏈通過陰離子交換進(jìn)行純化，以達(dá)到高純度同時(shí)維持高得率。為了形成siNA雙鏈體分子，使單鏈在鹽水溶液中以等摩爾比率組合以形成雙鏈體。在凍干之前通過切向過濾使雙鏈體siNA濃縮且脫鹽。
siNA組合物的制備 在非限制性例子中，對于每種siNA組合物，使用固相合成分開合成siNA的2條單個的、互補(bǔ)鏈，隨后通過離子交換層析分開進(jìn)行純化。使互補(bǔ)鏈退火以形成雙鏈(雙鏈體)。隨后使雙鏈體超濾且凍干以形成固體siNA組合物(例如，藥物組合物)。制備過程的非限制性例子顯示于表VIII的流程圖中。
固相合成 使用亞磷酰胺化學(xué)在自動化固相合成儀，例如Amersham PharmaciaAKTA Oligopilot(例如，Oligopilot或Oligopilot 100plus)上合成單鏈寡核苷酸。將可調(diào)節(jié)的合成柱裝滿由第一個核苷殘基衍生的固體支持體。通過酸不穩(wěn)定的5′-O-二甲氧三苯甲基的脫三苯甲基作用以釋放5′-羥基來起始合成。將溶于乙腈的亞磷酰胺和合適的活化劑同時(shí)遞送給合成柱，從而導(dǎo)致亞磷酰胺(amidite)與5′-羥基的偶聯(lián)。隨后用乙腈洗滌柱。將碘泵過柱以使亞磷酸三酯鍵P(III)氧化成其磷酸三酯P(V)類似物。在2，6-二甲基吡啶和N-甲基咪唑的存在下，未反應(yīng)的5′-羥基使用試劑例如乙酸酐進(jìn)行加帽。對于下一個亞磷酰胺摻入，延伸循環(huán)由脫三苯甲基作用步驟重新開始。重復(fù)這個過程直至所需序列已合成。通過去除末端二甲氧三苯甲基終止合成。
切割和脫保護(hù) 合成結(jié)束時(shí)，將固體支持體和結(jié)合的寡核苷酸轉(zhuǎn)移至過濾漏斗，在真空下干燥，且轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器。添加水基且使混合物加熱，以實(shí)現(xiàn)琥珀酰鍵的切割，氰乙基磷酸保護(hù)基團(tuán)的去除和環(huán)外胺保護(hù)的脫保護(hù)。
對不包含核糖核苷酸的單鏈執(zhí)行下述過程用水基處理固體支持體后，在真空下過濾混合物以使固體支持體和脫保護(hù)的粗合成材料分開。隨后用水漂洗固體支持體，將其與濾液組合。所得到的堿性溶液用酸中和以提供粗制單鏈的溶液。
對包含核糖核苷酸的單鏈執(zhí)行下述過程用水基處理固體支持體后，在真空下過濾混合物以使固體支持體和脫保護(hù)的粗合成材料分開。隨后用二甲基亞砜(DMSO)漂洗固體支持體，將其與濾液組合。使混合物冷卻，添加氟化物試劑例如三氫氟酸三乙胺，并使溶液加熱。用合適的緩沖液猝滅反應(yīng)以提供粗制單鏈的溶液。
陰離子交換純化 每種粗制單鏈的溶液使用層析純化進(jìn)行純化。使用合適的緩沖液梯度洗脫產(chǎn)物。將級分收集在封閉衛(wèi)生處理的容器中，通過HPLC分析，且使合適的級分組合以提供產(chǎn)物庫，所述產(chǎn)物庫就純度(HPLC)、同一性(HPLC)和濃度(UV A260)進(jìn)行分析。
退火 基于產(chǎn)物庫的分析，將等摩爾量的(使用理論消光系數(shù)計(jì)算的)有義和反義寡核苷酸鏈轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器。將溶液混合且通過層析法就雙鏈體的純度進(jìn)行分析。如果分析指出任一鏈的過量，那么滴定另外的非過量鏈直至雙鏈體形成完成。當(dāng)分析指出已達(dá)到靶產(chǎn)物純度時(shí)，將材料轉(zhuǎn)移至切向流過濾(TFF)系統(tǒng)用于濃縮和脫鹽。
超濾 退火的產(chǎn)物溶液使用包含合適的分子量截止膜的TFF系統(tǒng)進(jìn)行濃縮。濃縮后，產(chǎn)物溶液經(jīng)由滲濾使用WFI質(zhì)量的水進(jìn)行脫鹽，直至濾液的傳導(dǎo)性是水的那種。
凍干 將濃縮的溶液轉(zhuǎn)移至在柜式冷凍干燥機(jī)中的衛(wèi)生處理的盤。隨后將產(chǎn)物冷凍干燥成粉末。從冷凍干燥機(jī)中取出盤且轉(zhuǎn)移至等級100的層氣流(Laminar Air Flow)(LAF)通風(fēng)櫥用于包裝。
藥品的包裝 包含冷凍干燥產(chǎn)物的冷凍干燥機(jī)盤在等級100的LAF通風(fēng)櫥中打開。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至合適大小的衛(wèi)生處理的容器中，隨后將所述衛(wèi)生處理的容器密封且加上標(biāo)簽。
藥品容器封閉系統(tǒng) 在具有衛(wèi)生處理的蓋的衛(wèi)生處理的Nalgene容器中批量包裝凍干的藥品。使用的瓶大小取決于在其內(nèi)放置材料的量。填充后，用聚乙烯帶在封閉處將每個瓶另外密封。
分析法和規(guī)格 原材料和過程中(In-Process)方法 在引入藥品制備過程內(nèi)前就同一性測試原材料。關(guān)鍵的原材料，摻入藥品分子內(nèi)的那些，使用適當(dāng)?shù)募兌葴y試或測定測試另外進(jìn)行測試。在制備方法中的關(guān)鍵控制點(diǎn)上測試過程中的樣品，以監(jiān)控且確保最終藥品的質(zhì)量。
藥品分析法和規(guī)格 合并關(guān)于寡核苷酸的分析法和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)的控制在批量siNA組合物的臨床測試前確立。下述測試法和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)反映了這些控制的例子。表IX概括了對于siNA藥物組合物的材料規(guī)格的例子。
分析法概括 同一性(ID)測試 ID寡核苷酸主峰藥品的同一性使用層析法確立。用于這種測定的數(shù)據(jù)通過HPLC測試法之一產(chǎn)生(參見純度測試)。比較藥品樣品和標(biāo)準(zhǔn)注射劑的峰保留時(shí)間。藥品同一性由主峰保留時(shí)間的有利比較支持。
分子量藥品的同一性使用分光鏡法確立。通過與含水乙酸銨一起沉淀制備藥品樣品用于分析。藥品的分子量通過質(zhì)譜分析法進(jìn)行測定。將測試控制在來自理論分子量的原子質(zhì)量單位的設(shè)定數(shù)目內(nèi)。
解鏈溫度這種方法通過測量雙鏈藥品的解鏈溫度(Tm)支持藥品的同一性。使溶液中的樣品加熱同時(shí)監(jiān)控溶液的紫外(UV)吸光度。Tm標(biāo)記為隨著由于雙鏈體解離成單鏈吸光度增加的吸光度曲線的拐點(diǎn)。
測定測試 寡核苷酸含量這種測定確定藥品中的寡核苷酸總含量。寡核苷酸吸收UV光，在260nm處具有局部極大值。存在的寡核苷酸種類由雙鏈siRNA產(chǎn)物和來自制備過程的其他較少的相關(guān)寡核苷酸物質(zhì)包括殘留單鏈組成。將藥品樣品精確地稱重，溶解，且測定體積地在水中稀釋。使用UV分光光度計(jì)在石英池中測量吸光度。使用工作標(biāo)準(zhǔn)的用實(shí)驗(yàn)測定的摩爾吸光系數(shù)計(jì)算寡核苷酸總測定值，且以微克鈉寡核苷酸/毫克固體藥品報(bào)告。
純度測試純度將使用一種或多種層析法進(jìn)行測量。取決于存在的藥品的核酸類似物的分離和數(shù)目，可以使用正交分離法以監(jiān)控API的純度。分離可以通過下述方法達(dá)到 SAX-HPLC寡核苷酸磷酸二酯和使用緩沖的鹽梯度的強(qiáng)陰離子交換HPLC柱之間的離子交換相互作用以進(jìn)行分離。
RP-HPLC寡核苷酸和使用含水緩沖液對有機(jī)溶劑梯度的疏水反相HPLC柱之間的分配相互作用以進(jìn)行分離。
毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)在凝膠填充的毛細(xì)管內(nèi)在緩沖溶液中通過分子篩的電泳分離。當(dāng)應(yīng)用電場時(shí)發(fā)生分離，從而隨著它們通過凝膠基質(zhì)遷移引起陰離子寡核苷酸按照分子大小分離。在所有分離法中，峰一般按寡核苷酸長度的順序洗脫且通過UV在260nm處進(jìn)行檢測。
其他測試 物理外觀視覺檢查藥品樣品。這種測試確定材料具有凍干固體的特征，鑒定固體的顏色，且確定是否存在任何可見的污染物。
細(xì)菌內(nèi)毒素測試細(xì)菌內(nèi)毒素測試通過鱟變形細(xì)胞溶解物(LAL)測定使用動態(tài)比濁法在96孔板中進(jìn)行。關(guān)于藥品的內(nèi)毒素限度將適當(dāng)?shù)卦O(shè)定，以便當(dāng)與賦形劑組合時(shí)，在施用的藥物產(chǎn)品中不超過關(guān)于內(nèi)毒素的每日容許限度。
需氧生物負(fù)荷需氧生物負(fù)荷通過合同實(shí)驗(yàn)室(contract laboratory)使用基于USP第<61>章的方法進(jìn)行。
乙腈含量殘留乙腈分析通過合同實(shí)驗(yàn)室使用氣相層析(GC)進(jìn)行。乙腈是上游合成步驟中使用的主要有機(jī)溶劑，盡管在合成中使用幾種其他有機(jī)試劑。后續(xù)純化過程步驟一般去除藥品中的溶劑。取決于過程發(fā)展工作的結(jié)果，可以監(jiān)控其他溶劑。溶劑將限制在ICH限度內(nèi)。
含水量含水量通過容量Karl Fischer(KF)滴定法使用固體蒸發(fā)器單位(烤箱)確定。水一般作為組合物的幾個重量百分比存在于核酸藥品中，且因此將得到監(jiān)控。
pH將監(jiān)控重構(gòu)藥品的pH以確保用于人注射的適合性。
離子含量關(guān)于鈉、氯化物和磷酸鹽的測試將通過合同實(shí)驗(yàn)室使用標(biāo)準(zhǔn)原子吸收作用和離子層析法進(jìn)行。將進(jìn)行離子的一般監(jiān)控，以確保摻入藥品的藥物產(chǎn)品的重量摩爾滲透壓濃度將在可接受的生理學(xué)范圍內(nèi)。
金屬含量關(guān)于有關(guān)材料的測試通過合同實(shí)驗(yàn)室使用標(biāo)準(zhǔn)分析法-電感偶合等離子體(ICP)光譜學(xué)進(jìn)行。
實(shí)施例6RNAi體外測定以評估siNA活性 在無細(xì)胞系統(tǒng)中重演RNAi的體外測定用于評估靶向靶RNA靶的siNA構(gòu)建體。該測定包含由Tuschl等人，1999，Genes and Development，13，3191-3197和Zamore等人，2000，Cell，101，25-33描述的適合對靶RNA使用的系統(tǒng)。衍生自合胞胚層的果蠅提取物用于在體外重構(gòu)RNAi活性。靶RNA經(jīng)由體外轉(zhuǎn)錄使用T7RNA聚合酶由合適的靶表達(dá)質(zhì)粒產(chǎn)生，或經(jīng)由如本文所描述的化學(xué)合成產(chǎn)生。有義和反義siNA鏈(例如各20uM)通過在緩沖液(例如100mM乙酸鉀，30mMHEPES-KOH，pH 7.4，2mM乙酸鎂)中于90℃溫育1分鐘隨后為于37℃1小時(shí)進(jìn)行退火，隨后在裂解緩沖液(例如100mM乙酸鉀，pH 7.4的30mM HEPES-KOH，2mM乙酸鎂)中進(jìn)行稀釋?？梢酝ㄟ^在瓊脂糖凝膠上在TBE緩沖液中凝膠電泳且用溴化乙錠染色監(jiān)控退火。果蠅裂解物使用來自酵母糖蜜瓊脂上收集的Oregon R蠅0-2小時(shí)齡的胚胎進(jìn)行制備，所述胚胎被去絨毛膜(dechorionated)且裂解。將裂解物離心且分離上清液。該測定包含反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)化合物包含50％裂解物[體積/體積]、RNA(10-50pM終濃度)、和包含siNA(10nM終濃度)的10％[體積/體積]裂解緩沖液。反應(yīng)混合物還包含10mM磷酸肌酸、10ug/ml肌酸磷酸激酶、100um GTP、100uM UTP、100uM CTP、500uM ATP、5mM DTT、0.1U/uL RNA酶抑制劑(RNasin)(Promega)和100uM的每種氨基酸。將乙酸鉀的終濃度調(diào)整至100mM。反應(yīng)在冰上預(yù)組裝且在加入RNA前于25℃預(yù)溫育10分鐘，隨后于25℃溫育另外60分鐘。反應(yīng)用4體積的1.25x Passive Lysis Buffer(Promega)猝滅。靶RNA切割通過RT-PCR分析或本領(lǐng)域已知的其他方法進(jìn)行測定，且與其中siNA從反應(yīng)中省略的對照反應(yīng)比較。
可替代地，關(guān)于該測定的內(nèi)部標(biāo)記的靶RNA通過在[α-32P]CTP的存在下的體外轉(zhuǎn)錄制備，通過旋轉(zhuǎn)層析經(jīng)過G50Sephadex柱，且無需進(jìn)一步純化用作靶RNA。任選地，靶RNA是使用T4多核苷酸激酶進(jìn)行5′-32P末端標(biāo)記的。測定如上所述進(jìn)行，并且通過RNAi產(chǎn)生的靶RNA和特異性RNA切割產(chǎn)物在凝膠的放射自顯影圖上顯現(xiàn)。切割百分比通過PHOSPHOR

(放射自顯影術(shù))定量條帶來測定，所述條帶代表完整對照RNA或來自無siNA的對照反應(yīng)的RNA和通過測定產(chǎn)生的切割產(chǎn)物。
在一個實(shí)施方案中，這種測定用于確定靶RNA靶中用于siNA介導(dǎo)的RNAi切割的靶位點(diǎn)，其中就RNAi介導(dǎo)的靶RNA靶的切割篩選多個siNA構(gòu)建體，例如通過分析經(jīng)由標(biāo)記的靶RNA的電泳的測定反應(yīng)，或通過RNA印跡，以及通過本領(lǐng)域眾所周知的其他方法。
實(shí)施例7HCV靶RNA在體內(nèi)的核酸抑制 如上所述設(shè)計(jì)且合成靶向人HCV RNA的siNA分子?？梢岳缡褂孟率龀绦蚓腕w內(nèi)切割活性測試這些核酸分子。HCV RNA內(nèi)的靶序列和核苷酸位置在表II和III中給出。
使用2種形式以測試靶向HCV的siNAs的功效。首先，使用例如人肝癌(Huh7)細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中測試試劑，以測定RNA和蛋白質(zhì)抑制的程度。如本文所描述的選擇針對HCV靶的siNA試劑(例如，參見表II和III)。在通過合適的轉(zhuǎn)染劑將這些試劑遞送給例如培養(yǎng)的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞后測量RNA抑制。使用擴(kuò)增的實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控(例如，ABI7700

)測量靶RNA對肌動蛋白的相對量。與對無關(guān)的靶制備的寡核苷酸序列的混合物或隨機(jī)化的siNA對照進(jìn)行比較，所述隨機(jī)化的siNA對照具有相同的總體長度和化學(xué)，但在每個位置上進(jìn)行隨機(jī)置換。就靶和進(jìn)行的最優(yōu)化選擇初級和次級前導(dǎo)試劑。選擇最佳轉(zhuǎn)染劑濃度后，用前導(dǎo)siNA分子進(jìn)行RNA的時(shí)程的抑制。此外，可以使用細(xì)胞鋪平板形式以測定RNA抑制。
此外，可以使用細(xì)胞鋪平板形式以測定RNA抑制。這個系統(tǒng)在Rice等人，US 5,874,565和US 6,127,116中得到描述，所述2個專利引入本文作為參考。
siNA給細(xì)胞的遞送 在轉(zhuǎn)染前一天例如以96孔板每孔溶于DMEM(Gibco)的8.5x103細(xì)胞接種Huh7b細(xì)胞，所述Huh7b細(xì)胞用HCV亞基因組復(fù)制子克隆A或Ava.5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。siNA(終濃度，例如25nM)和陽離子脂質(zhì)Lipofectamine2000(例如，終濃度0.5ul/孔)在Optimem(Gibco)中在聚丙烯(polypropelyne)微量管(microtube)中于37℃復(fù)合20分鐘。渦旋后，向每個孔中加入復(fù)合siNA且溫育24-72小時(shí)。
mRNA的

(擴(kuò)增的實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控)和Lightcycler定量。
siNA遞送后由細(xì)胞制備總RNA，例如對于6孔使用Qiagen RNA純化試劑盒或?qū)τ?6孔測定使用Rneasy提取試劑盒。對于

分析(擴(kuò)增的實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控)，合成雙重標(biāo)記的探針，其具有在5′-末端處共價(jià)連接的報(bào)道分子染料FAM或JOE，和與3′-末端綴合的猝滅劑染料TAMRA。在例如ABI PRISM 7700 Sequence Detector上進(jìn)行單步RT-PCR擴(kuò)增，其中使用由下述組成的50μl反應(yīng)物10μl總RNA，100nM正向引物，900nM反向引物，100nM探針，1X TaqMan PCR反應(yīng)緩沖液(PE-Applied Biosystems)，5.5mM MgCl2，各300μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，10U RNA酶抑制劑(RNase Inhibitor)(Promega)，1.25U AMPLITAQ

(DNA聚合酶)(PE-Applied Biosystems)和10U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)(Promega)。熱循環(huán)條件可以由下述組成于48℃30分鐘，于95℃10分鐘，隨后為于95℃15秒和于60℃1分鐘的40個循環(huán)。mRNA水平的定量相對于標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定，所述標(biāo)準(zhǔn)由系列稀釋的總細(xì)胞RNA(300、100、33、11ng/反應(yīng))產(chǎn)生，且在平行

反應(yīng)(擴(kuò)增的實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控)中對β-肌動蛋白或GAPDH mRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對于每種目的基因，設(shè)計(jì)上部和下部引物以及熒光標(biāo)記的探針。SYBR Green I染料向特異性PCR產(chǎn)物內(nèi)的實(shí)時(shí)摻入可以在玻璃毛細(xì)管中使用lightcyler進(jìn)行測量。使用對照cRNA對于每個引物對產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。值表示為每種樣品中針對GAPDH的相對表達(dá)。
蛋白質(zhì)印跡 siNA遞送后由細(xì)胞制備總RNA，例如對于大規(guī)模提取使用AmbionRnaqueous 4-PCR純化試劑盒或?qū)τ?6孔測定使用AmbionRnaqueous-96純化試劑盒。對于Taqman分析，合成雙重標(biāo)記的探針，其具有例如在5′-末端處共價(jià)連接的報(bào)道分子染料FAM或VIC，和與3′-末端綴合的猝滅劑染料TAMARA。在例如ABI PRISM 7700 Sequence檢測器上進(jìn)行單步RT-PCR擴(kuò)增，其中使用由下述組成的50uL反應(yīng)物10uL總RNA，100nM正向引物，100nM反向引物，100nM探針，1XTaqMan PCR反應(yīng)緩沖液(PE-Applied Biosystems)，5.5mM MgCl2，各100μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，0.2U RNA酶抑制劑(Promega)，0.025U AmpliTaq GOLD(PE-Applied Biosystems)和0.2UM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)。熱循環(huán)條件可以由下述組成于48℃30分鐘，于95℃10分鐘，隨后為于95℃15秒和于60℃1分鐘的40個循環(huán)。靶mRNA水平的定量相對于標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定，所述標(biāo)準(zhǔn)由系列稀釋的總細(xì)胞RNA(300、100、33、10ng/rxn)產(chǎn)生，且在平行或相同管TaqMan反應(yīng)中對例如36B4mRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對于HCV復(fù)制子mRNA定量，使用對新霉素基因特異的PCR引物和探針 neo-正向引物，5’-CCGGCTACCTGCCCATTC-3’；(SEQ ID NO2150) neo-反向引物，5’-CCAGATCATCCTGATCGACAAG-3’；(SEQ ID NO2151) neo-探針，5’FAM-ACATCGCATCGAGCGAGCACGTAC-TAMARA3’；(SEQ ID NO2152) 對于標(biāo)準(zhǔn)化，使用36B4PCR引物和探針 36B4-正向引物，5’-TCTATCATCAACGGGTACAAACGA-3’；(SEQ ID NO2153) 36B4反向引物，5’-CTTTTCAGCAAGTGGGAAGGTG-3’；(SEQ ID NO2154) 36B4探針，5’VIC-CCTGGCCTTGTCTGTGGAGACGGATTA-TAMARA3’；(SEQ ID NO2155) 實(shí)施例8用于評估HCV基因表達(dá)的下調(diào)的模型 細(xì)胞培養(yǎng) 盡管已存在HCV在細(xì)胞培養(yǎng)中復(fù)制的報(bào)道(參見下文)，但這些系統(tǒng)難以再現(xiàn)且已證明是不可靠的。因此，與對于開發(fā)其他抗HCV治療劑例如干擾素和病毒唑的情況一樣，在動物研究中證實(shí)安全性后，申請人可以直接進(jìn)行到臨床可行性研究。
幾個近期報(bào)道已證明HCV在人細(xì)胞系中的體外生長(Mizutani等人，Biochem Biophys Res Commun 1996227(3)822-826；Tagawa等人，Journal of Gasteroenterology and Hepatology 199510(5)523-527；Cribier等人，Journal of General Virology 76(10)2485-2491；Seipp等人，Journal of General Virology 199778(10)2467-2478；Iacovacci等人，Research Virology 1997148(2)147-151；Iocavacci等人，Hepatology 199726(5)1328-1337；Ito等人，Journal of General Virology199677(5)1043-1054；Nakajima等人，Journal of Virology 1996 70(5)3325-3329；Mizutani等人，Journal of Virology 1996 70(10)7219-7223；Valli等人，Res Virol 1995 146(4)285-288；Kato等人，Biochem Biophys Res Comm 1995 206(3)863-869)。已報(bào)道在T和B細(xì)胞系，以及衍生自人肝細(xì)胞的細(xì)胞系中的HCV復(fù)制。低水平復(fù)制的檢測使用基于RT-PCR的測定或b-DNA測定得到證明。應(yīng)著重指出關(guān)于HCV細(xì)胞培養(yǎng)的最近出版物證明最高達(dá)6個月的復(fù)制。然而，在這些細(xì)胞系中觀察到的HCV復(fù)制水平對于抗病毒化合物的篩選仍不足夠強(qiáng)。
除了可以用HCV感染的細(xì)胞系外，幾個團(tuán)體已報(bào)道用全長或部分HCV基因組的cDNA克隆成功轉(zhuǎn)化細(xì)胞系(Harada等人，Journal ofGeneral Virology，1995，76(5)1215-1221；Haramatsu等人，Journal ofViral Hepatitis 1997 4S(1)61-67；Dash等人，American Journal ofPathology 1997 151(2)363-373；Mizuno等人，Gasteroenterology 1995109(6)1933-40；Yoo等人，Journal Of Virology 1995 69(1)32-38)。
能夠在人肝癌細(xì)胞系Huh7中成功復(fù)制的亞基因組HCV RNA復(fù)制子的近期開發(fā)代表朝向可靠的細(xì)胞培養(yǎng)模型的重大進(jìn)展。這些復(fù)制子包含在HCV非結(jié)構(gòu)基因上游的新霉素基因，從而允許在Huh7細(xì)胞中選擇復(fù)制的RNAs。最初，RNA復(fù)制以低頻率檢測到(Lohmann等人，Science1999285110-113)，但在NS5A區(qū)域中具有細(xì)胞適應(yīng)性突變的復(fù)制子的鑒定已使復(fù)制效率提高10,000倍(Blight等人，Science 2000 2901972-1975)。HCV生活周期中的步驟，例如翻譯、蛋白質(zhì)加工和RNA復(fù)制在亞基因組復(fù)制子系統(tǒng)中重演，但不存在早期事件(病毒附著和脫殼)和病毒裝配。在復(fù)制子內(nèi)包括HCV的結(jié)構(gòu)基因?qū)е翲CV核和包膜蛋白的產(chǎn)生，但病毒裝配不發(fā)生(Pietschmann等人，Journal of Virology2002 764008-4021)。此種復(fù)制子系統(tǒng)已用于研究siRNA介導(dǎo)的HCVRNA抑制，參見例如，Randall等人，2003，PNAS USA，100，235-240。
在幾種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，陽離子脂質(zhì)已顯示增強(qiáng)寡核苷酸對于培養(yǎng)中的細(xì)胞的生物利用率(Bennet，等人，1992，Mol.Pharmacology，41，1023-1033)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的siNA分子與陽離子脂質(zhì)復(fù)合用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。siNA和陽離子脂質(zhì)混合物緊在加入細(xì)胞前在無血清DMEM中進(jìn)行制備。使DMEM加添加劑加熱至室溫(約20-25℃)，且加入陽離子脂質(zhì)至所需終濃度，且將溶液短暫渦旋。加入siNA分子至所需終濃度，且再次將溶液短暫渦旋，且在室溫下溫育10分鐘。在劑量響應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，在10分鐘溫育后將RNA/脂質(zhì)復(fù)合物在DMEM內(nèi)進(jìn)行系列稀釋。
動物模型 在動物模型中評估抗HCV試劑的功效是關(guān)于人臨床試驗(yàn)的重要先決條件。關(guān)于HCV感染最佳表征的動物系統(tǒng)是黑猩猩。此外，在黑猩猩和人中起因于HCV感染的慢性肝炎非常相似。盡管在臨床上相關(guān)，但黑猩猩模型經(jīng)歷使得這種模型的使用困難的幾個實(shí)踐阻礙。這些包括高成本、長培育需求和缺乏足夠量的動物。由于這些因素，許多團(tuán)體已嘗試開發(fā)慢性丙型肝炎感染的嚙齒類動物模型。雖然直接傳染已是不可能的，但幾個團(tuán)體已報(bào)道部分或完整HCV基因組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到嚙齒類動物內(nèi)(Yamamoto等人，Hepatology 1995 22(3)847-855；Galun等人，Journal of Infectious Disease 1995 172(1)25-30；Koike等人，Journalof general Virology 1995 76(12)3031-3038；Pasquinelli等人，Hepatology1997 25(3)719-727；Hayashi等人，Princess Takamatsu Symp 1995251430149；Mariya等人，Journal of General Virology 1997 78(7)1527-1531；Takehara等人，Hepatology 1995 21(3)746-751；Kawamura等人，Hepatology 1997 25(4)1014-1021)。此外，HCV感染的人肝移植到無免疫應(yīng)答的小鼠中導(dǎo)致HCV RNA在動物的血液中延長的檢測。
用于在體內(nèi)動物模型中表達(dá)丙型肝炎病毒的方法已得到開發(fā)(Vierling，國際PCT公開號WO 99/16307)。將存活的、HCV感染的人肝細(xì)胞移植到scid/scid小鼠宿主的肝實(shí)質(zhì)內(nèi)。scid/scid小鼠宿主隨后維持于存活狀態(tài)，由此存活的、形態(tài)學(xué)完整的人肝細(xì)胞在供體組織中持續(xù)，且丙型肝炎病毒在持續(xù)的人肝細(xì)胞中復(fù)制。這種模型提供了用于經(jīng)由酶促核酸的體內(nèi)HCV抑制研究的有效手段。
照這樣，這些模型可以用于評估本發(fā)明的siNA分子在抑制HCV表達(dá)中的功效。這些模型等可以類似地用于評估本發(fā)明的siNA分子在臨床前背景中的安全性和功效。
實(shí)施例9RNAi介導(dǎo)的靶基因表達(dá)的抑制 體外siNA介導(dǎo)的靶RNA的抑制 就在例如Huh7細(xì)胞中減少HCV RNA表達(dá)的功效測試siNA構(gòu)建體(表III)。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前約24小時(shí)以5,000-7,500細(xì)胞/孔，100μl/孔在96孔板中鋪平板，從而使得轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞為70-90％匯合。對于轉(zhuǎn)染，退火的siNAs與轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine 2000，Invitrogen)以50μl/孔的體積混合且在室溫下溫育20分鐘。將siNA轉(zhuǎn)染混合物加入細(xì)胞中，以產(chǎn)生在150μl的體積中25nM的siNA終濃度。將每種siNA轉(zhuǎn)染混合物加入3個孔中，用于一式三份的siNA處理。細(xì)胞在siNA轉(zhuǎn)染混合物的連續(xù)存在下于37℃溫育24小時(shí)。在24小時(shí)時(shí)，由每孔處理的細(xì)胞制備RNA。首先取出具有轉(zhuǎn)染混合物的上清液且棄去，隨后裂解細(xì)胞且由每個孔制備RNA。處理后的靶基因表達(dá)通過RT-PCR對于靶基因和用于標(biāo)準(zhǔn)化的對照基因(36B4，RNA聚合酶亞單位)進(jìn)行評估。一式三份的數(shù)據(jù)取平均值且對于每種處理測定標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)用圖表表示，且測定與其各自的反向?qū)φ誷iNAs相比較經(jīng)由活性siNAs的靶mRNA的百分比減少。
實(shí)施例10siNA分子在絨猴中的評估 GBV-B與人丙型肝炎病毒非常緊密相關(guān)且在絹毛猴和絨猴中引起肝炎。因此，GBV-B提供了用于測試關(guān)于HCV感染的抗病毒化合物和疫苗的小動物模型。這個研究調(diào)查靶向HCV RNA位點(diǎn)293和316的LNP配制的雙鏈siNA分子的功效。GBV-B模型是測試這種療法是否可能對由HCV慢性感染的人發(fā)揮作用的極佳系統(tǒng)。
在該研究中，2只動物用GBV-B進(jìn)行接種，且使用3mg/kg活性配制的siNA(Sirna化合物編號33149/47677和31703/38756，制劑LNP-086；參見表III和VI)的IV處理在感染后1天起始?；钚越M合物如于2005年11月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/737,024中所述進(jìn)行配制。另外2只動物用GBV-B進(jìn)行接種，且未處理以充當(dāng)陰性對照。監(jiān)控動物以測定GBV-B感染的治療效果。在研究過程中進(jìn)行抽血以測定病毒滴度。配制的siNA在處理的動物中的給藥在第0天接種后的第1、3和7天時(shí)重復(fù)。與未處理的對照動物相比較，這些動物顯示GBV-B經(jīng)過3周時(shí)程的顯著抑制(參見圖30)。此外，具有確立的GBV感染的動物在感染后第28、31和35天時(shí)用活性配制的siNA(Sirna化合物編號33149/47677和31703/38756，制劑LNP-086；參見表III和VI)進(jìn)行處理。與歷史上未處理的對照比較，這只動物在活性化合物給藥后顯示出下降至檢測限度的病毒滴度中的減少(參見圖31)。
實(shí)施例11siNA分子在黑猩猩中的評估 這個研究用于評估雙鏈核酸抗病毒制劑關(guān)于抑制HCV感染的黑猩猩中的丙型肝炎病毒(HCV)復(fù)制的能力。該化合物制劑包含針對HCV病毒基因組且經(jīng)由RNA干擾介導(dǎo)病毒RNA降解的siNA。該化合物經(jīng)由IV施用。待使用的黑猩猩選自HCV慢性動物組。該研究以2個時(shí)期進(jìn)行藥物代謝動力學(xué)和功效。
該研究的藥物代謝動力學(xué)部分在2只非HCV感染動物中進(jìn)行。血液樣品在時(shí)間0、15分鐘、30分鐘、24小時(shí)、以及3、7和14天時(shí)獲得。肝活組織檢查在24小時(shí)和14天時(shí)獲得。功效涉及抗病毒化合物在2只或更多HCV感染的黑猩猩中的測試。
動物接受4次每周一次的使用抗病毒siNA制劑的IV注射。血液樣品在-4、-2和0周時(shí)獲得，隨后每周一次共6周，和隨后每隔一周共另外4周。肝活組織檢查在-4周和+4周(最后注射后1周)時(shí)獲得。血液和組織取樣時(shí)間表顯示于下文。在所有放血時(shí)就血液化學(xué)和CBC監(jiān)控動物。在任何嚴(yán)重不良作用的病征時(shí)，停止處理。對于每只動物，需要總共11個血液樣品以監(jiān)控血清中的病毒RNA水平。需要2個時(shí)間點(diǎn)上的肝針活組織檢查用于分析肝中的病毒RNA負(fù)荷、靶向肝的siNA化合物的水平、siNA誘導(dǎo)的病毒RNA切割產(chǎn)物的存在、和肝基因表達(dá)中的變化。病毒RNA通過實(shí)時(shí)TaqMan定量RT-PCR監(jiān)控。血清樣品一式兩份地提取且一式四份地運(yùn)行。肝RNA水平一式兩份地運(yùn)行。
關(guān)于在2個未感染的黑猩猩中的SINA PK研究時(shí)間表 天周 給藥IV 血清 CBC化學(xué) 肝活組織檢查 第0天， X 10ml 2ml3ml 第0天，15分鐘 10ml 2ml3ml 第0天，30分鐘 10ml 2ml3ml 第1天，24小時(shí) 10ml 2ml3mlX 第3天 10ml 2ml3ml 第7天 10ml 2ml3ml 第14天10ml 2ml3mlX 血液，1x SST管至Lanford Lab。以1ml冷凍等分試樣加工。
活組織檢查冷凍。
關(guān)于在2只HCV慢性黑猩猩中的SINA功效研究時(shí)間表 周給藥IV 血清CBC化學(xué) 肝臟活組織檢查 前-4 20ml2ml3mlX 前-2 20ml2ml3ml 第0天，第0周 X 20ml2ml3ml 第7天，第1周 X 20ml2ml3ml 第2周 X 20ml2ml3ml 第3周 X 20ml2ml3ml 第4周 20ml2ml3mlX 第5周 20ml2ml3ml 第6周 20ml2ml3ml 第8周 20ml2ml3ml 第10周20ml2ml3ml 血液，2x SST管至Lanford Lab。以1ml冷凍等分試樣加工。
活組織檢查冷凍。分成2半，對于病毒RNA一半加工用于使用RNAzol的RNA。
實(shí)施例12SIRNA-AV34的單劑和多劑施用在患有慢性HCV感染的干擾素未實(shí)驗(yàn)過的和經(jīng)歷過的患者中的安全性、可容許性、PK、PD和抗病毒效應(yīng) 這個研究的第一個目的是確立單劑和多劑的Sirna-034在HCV陽性患者中的MTD。第二個目的是評估Sirna-034的單劑和穩(wěn)定狀態(tài)的藥物代謝動力學(xué)；評估單劑和多劑的Sirna-034的藥物動力學(xué)；和評估單劑和多劑的Sirna-034對病毒復(fù)制和感染性指數(shù)的作用。
這是Sirna-034在患有慢性丙型肝炎感染和代償性肝功能的患者中的I/II期、隨機(jī)化、雙盲、安慰劑對照的、單劑和多劑逐步上升的研究。對于研究的SAD部分符合合格標(biāo)準(zhǔn)的患者加入4-6個連續(xù)組。每個患者被臨床研究單位接受用于治療施用且在給藥后36小時(shí)允許離開，除非由研究者認(rèn)為需要進(jìn)一步的研究監(jiān)控?；颊呙咳盏皆\療所就診共另外5天，且在給藥后30天接受關(guān)于SAEs的隨訪電話拜訪。劑量逐步上升依賴來自先前組的安全性參數(shù)(體格檢查發(fā)現(xiàn)、生命體征、不利事件和實(shí)驗(yàn)室值)。
在就SAD期篩選時(shí)，患者經(jīng)歷靜脈切開放血術(shù)用于評估血清化學(xué)、血液學(xué)、凝固參數(shù)、血清β-HCG(僅女性)、HIV抗體狀態(tài)、HBsAg、甲胎蛋白、定量HCV病毒RNA和HCV基因型分型，且提供尿液用于尿分析。在治療期過程中，臨床實(shí)驗(yàn)室(化學(xué)、血液學(xué)、凝固參數(shù)和尿分析)在給藥前、以及給藥后24小時(shí)、3天和6天進(jìn)行評估。ECG在給藥前、以及給藥后4-6小時(shí)和6天進(jìn)行評估。體格檢查在給藥前和給藥后6天進(jìn)行。用于PK分析的血清樣品在給藥前、以及給藥后30分鐘、1、2、3、4、6、8、12、24和36小時(shí)、和2、3、4、5和6天進(jìn)行收集。病毒RNA和潛在地另一種病毒感染性標(biāo)記的評估在給藥前、以及給藥后1、2、3、4、5和6天進(jìn)行。
一旦已確定良好耐受的Sirna-034劑量導(dǎo)致病毒負(fù)荷中約90％的減少，患者就加入研究的MAD部分。選擇參與MAD期的來自研究的SAD部分的患者經(jīng)歷有限的再篩選，所述再篩選由間隔史、體格檢查、臨床實(shí)驗(yàn)室評估、和定量HCV病毒RNA組成。新加入者經(jīng)歷如上文對于SAD期所述的完全再篩選。加入每周1次給藥方案的患者在最后劑次后7天每周x 4訪問研究場所，且在最后劑次后30天接受關(guān)于SAEs的電話拜訪。隨機(jī)化至每隔一周的給藥方案的患者訪問2次研究場所，且具有類似的治療后隨訪。劑量逐步上升依賴來自先前組的安全性參數(shù)(體格檢查發(fā)現(xiàn)、生命體征、不利事件和實(shí)驗(yàn)室值)。
在MAD治療期過程中，臨床實(shí)驗(yàn)室(化學(xué)、血液學(xué)、凝固參數(shù)和尿分析)在每劑施用前和最后劑次后7天進(jìn)行評估。ECG在第1劑前和最后劑次后7天進(jìn)行評估。體格檢查在給藥前、最后劑次后和最后劑次后7天進(jìn)行。用于PK分析的血清樣品在第1劑前和之后2、4、8、12和24小時(shí)、每次后續(xù)劑次前、以及最后劑次后2、4、8、12和24小時(shí)和7天進(jìn)行收集。病毒RNA和潛在地另一種病毒感染性標(biāo)記的評估在第1劑前，且隨后每周一次直至最后劑次后7天進(jìn)行。
關(guān)于包含/排除的診斷和主要標(biāo)準(zhǔn) 無分娩可能性；18-60歲大；HCV陽性；在篩選時(shí)和前6個月內(nèi)一個其他機(jī)會時(shí)升高的ALT；HIV陰性；HBsAg陰性；正常PT、PTT、血紅蛋白、膽紅素、清蛋白和甲胎蛋白；血小板計(jì)數(shù)＞100K；無其他已知的肝病病因；干擾素未實(shí)驗(yàn)過的，在干擾素后復(fù)發(fā)，或?qū)Ω蓴_素?zé)o應(yīng)答者的男性和女性。
施用劑量和方式 用于IV注射的液體溶液，0.1-10mg/ml Sirna-034。對于研究的SAD部分，起始劑量為TBD，但估計(jì)來自4周猴毒物學(xué)研究的NOAEL的1/50。劑量逐步上升至MTD。對于研究的MAD部分，如果作為單劑良好耐受則產(chǎn)生病毒負(fù)荷90％減少的單劑將施用于后續(xù)群組，每周或每隔一周給藥，x 4周。
患者參與持續(xù)時(shí)間/研究持續(xù)時(shí)間/治療持續(xù)時(shí)間 對于SAD期，治療持續(xù)時(shí)間將是由下述組成的42天(范圍，38-49)1-14天篩選期，伴隨住院患者觀察36小時(shí)的1天治療，門診患者觀察另外5天和30天的SAE隨訪(經(jīng)由電話)。在MAD期過程中，相同患者以及必要時(shí)新招募的患者將處理由下述組成的72天(范圍，65-79)0-14天篩選期，4周治療期，7天隨訪期和第30天的SAE隨訪(經(jīng)由電話)。因此，對于加入研究的2個時(shí)期的那些患者，患者參與持續(xù)時(shí)間可能最高達(dá)128天，未包括研究的SAD和MAD部分之間的任何介入期。
參考療法，施用劑量和方式 安慰劑將配制為用于IV注射的液體溶液和在外觀方面與Sirna-034相同。
評估標(biāo)準(zhǔn) 對于功效和藥物動力學(xué)，HCV病毒RNA將可能連同HCV衣殼蛋白加工或病毒感染性的新生物學(xué)標(biāo)記一起進(jìn)行評估。對于安全性，將監(jiān)控生命體征、不利事件、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室測試和體格檢查。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 不利事件發(fā)生率、病征、癥狀、ECG參數(shù)和實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)；ECG參數(shù)和實(shí)驗(yàn)室值、PK和PD參數(shù)中的變化的描述性統(tǒng)計(jì)；和病毒負(fù)荷、復(fù)制和感染性測量的探索分析。
臨床計(jì)劃的主要目的是以這樣的方式評估Sirna-034作為慢性丙型肝炎的潛在治療的安全性和功效，以便支持靶概況(TP)和符合關(guān)于注冊的需求。在整個計(jì)劃中待研究的受試者總數(shù)目為約1200。
關(guān)于Sirna-034的這種CP設(shè)計(jì)為驗(yàn)證TP和符合作為用于慢性丙型肝炎治療的關(guān)于注冊的管理需求。最初的要求將是Sirna-034指示與PEG-干擾素和病毒唑組合在對PEG-干擾素和病毒唑無應(yīng)答的患者中用于治療慢性丙型肝炎，所述患者患有代償性肝病且18歲和更大。
在患有代償性和先前處理或未處理的慢性丙型肝炎的患者中的I/II期劑量逐步上升研究將確立多劑施用(每周上升的劑量共4周，或每2周共4周)的安全性，全身性暴露于化合物的程度，且通過血清HCV RNA的分析(1-2對數(shù)(logs)的減少)確立作為有效的單一療法的“機(jī)制證明(proof of mechanism)”。
這隨后為在對PEG-干擾素和病毒唑無應(yīng)答的臨床上活動性丙型肝炎患者中與PEG-干擾素和病毒唑組合的正式的II期劑量發(fā)現(xiàn)研究。48周研究將提供關(guān)于三重組合的安全性、有效性和PK的數(shù)據(jù)，其中Sirna-034每周施用。
III期研究將是隨機(jī)化、安慰劑對照的研究，其將證實(shí)功效證據(jù)且提供化合物的進(jìn)一步安全性數(shù)據(jù)。將設(shè)計(jì)2個關(guān)鍵性隨機(jī)化、安慰劑對照的多民族III期研究，以證實(shí)功效且提供支持注冊的安全性數(shù)據(jù)。初步的功效終點(diǎn)將是48周治療結(jié)束后24周時(shí)，由不可檢測的HCV RNA和ALT正?；?。在注冊時(shí)，超過1200個患者將已暴露于Sirna-034。
Sirna-034是由2個Sirna雙鏈體(配制為LNP-086的Sirna化合物編號33149/47677和31703/38756，(SEQ ID NOs1796/2102和1677/2103)，所述LNP-086由摩爾比為43/38/10/2/7的CLinDMA/DSPC/膽固醇/PEG-DMG/亞油醇組成；參見表III和VI)組成的經(jīng)修飾的抗HCV siNA，其具有抑制HCV復(fù)制的潛力。Sirna-034靶向HCV mRNA位點(diǎn)293和316。Sirna-034預(yù)期改善患者對于常規(guī)治療(PEG-干擾素和病毒唑)的總體癥狀應(yīng)答，且將提供使受試者對由HCV感染引起的殘疾、發(fā)病率和死亡率危險(xiǎn)的易感性安全地降到最低的最佳機(jī)會。
實(shí)施例13適應(yīng)癥 HCV研究中現(xiàn)有的大量知識指出需要用于研究、診斷和治療用途的測定HCV活性的方法和可以調(diào)節(jié)HCV表達(dá)的化合物。如本文所描述的，本發(fā)明的核酸分子可以在測定中用于診斷與HCV水平有關(guān)的疾病狀態(tài)。此外，核酸分子可以用于治療與HCV水平有關(guān)的疾病狀態(tài)。
可以與HCV表達(dá)調(diào)節(jié)相關(guān)的具體變性和疾病狀態(tài)包括但不限于，HCV感染、肝衰竭、肝細(xì)胞癌、肝硬化和/或與HCV感染相關(guān)的其他疾病狀態(tài)。
實(shí)施例14干擾素 干擾素代表可以與本發(fā)明的siNA分子結(jié)合用于治療本文描述的疾病和/或狀況的一類化合物的非限制性例子。I型干擾素(IFN)是一類天然細(xì)胞因子，其包括超過25種IFN-α(Pesta，1986，Methods Enzymol.119，3-14)以及IFN-β和IFN-ω的家族。盡管在進(jìn)化上衍生自相同基因(Diaz等人，1994，Genomics 22，540-552)，但這些分子的基本序列中存在許多差異，從而暗示生物活性中的進(jìn)化趨異。所有I型IFN共享從IFN與細(xì)胞表面受體的結(jié)合開始的生物學(xué)效應(yīng)的共同模式(Pfeffer和Strulovici，1992，Transmembrane secondary messengers for IFN-α/β.InInterferon.Principles and Medical Applications.，S.Baron，D.H.Coopenhaver，F(xiàn).Dianzani，W.R.Fleischmann Jr.，T.K.Hughes Jr.，G.R.Kimpel，D.W.Niesel，G.J.Stanton和S.K.Tyring，編輯151-160)。結(jié)合隨后為酪氨酸激酶包括Janus酪氨酸激酶和STAT蛋白質(zhì)的活化，這導(dǎo)致幾種IFN刺激的基因產(chǎn)物的產(chǎn)生(Johnson等人，1994，Sci.Am.270，68-75)。IFN刺激的基因產(chǎn)物負(fù)責(zé)I型IFN的多效性(pleotropic)生物學(xué)效應(yīng)，包括抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)諧效應(yīng)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)、以及HLA I類和II類調(diào)節(jié)(Pestka等人，1987，Annu.Rev.Biochem 56，727)。IFN刺激的基因產(chǎn)物的例子包括2-5-寡腺苷酸合成酶(2-5OAS)、β2-微球蛋白、新蝶呤、p68激酶、和Mx蛋白質(zhì)(Chebath和Revel，1992，The 2-5 A system2-5 A synthetase，isospecies and functions.InInterferon.Principles and Medical Applications，S.Baron，D.H.Coopenhaver，F(xiàn).Dianzani，W.R.Jr.Fleischmann，T.K.Jr Hughes，G.R.Kimpel，D.W.Niesel，G.J.Stanton和S.K.Tyring，編輯，第225-236頁；Samuel，1992，The RNA-dependent P1/eIF-2αprotein kinase.InInterferon.Principles and Medical Applications.S.Baron，D.H.Coopenhaver，F(xiàn).Dianzani，W.R.Fleischmann Jr.，T.K.Hughes Jr.，G.R.Kimpel，D.W.Niesel，G.H.Stanton和S.K.Tyring，編輯237-250；Horisberger，1992，MX proteinfunction and Mechanism of Action.InInterferon.Principlesand Medical Applications.S.Baron，D.H.Coopenhaver，F(xiàn).Dianzani，W.R.Fleischmann Jr.，T.K.Hughes Jr.，G.R.Kimpel，D.W.Niesel，G.H.Stanton和S.K.Tyring，編輯215-224)。盡管所有I型IFN具有類似的生物學(xué)效應(yīng)，但并非所有活性都由每種I型IFN共享，且在許多情況下，對于每種IFN亞型活性程度相當(dāng)大量地改變(Fish等人，1989，J.Interferon Res.9，97-114；Ozes等人，1992，J.Interferon Res.12，55-59)。更具體而言，深入IFN-α的不同亞型和IFN-α的分子雜種性質(zhì)之中的研究已顯示出藥理學(xué)性質(zhì)中的差異(Rubinstein，1987，J.Interferon Res.7，545-551)。這些藥理學(xué)差異可以起于少至3個氨基酸殘基變化(Lee等人，1982，Cancer Res.42，1312-1316)。
85-166個氨基酸在已知的IFN-α亞型中是保守的。除去IFN-α假基因，存在約25個已知的不同IFN-α亞型。這些非等位亞型的逐對比較顯示出2％-23％的基本序列差異。除了天然存在的IFNs外，稱為共有干擾素(CIFN)的非天然重組I型干擾素已作為治療化合物合成(Tong等人，1997，Hepatology 26，747-754)。
干擾素目前用于至少12種不同的適應(yīng)癥，包括傳染病和自身免疫疾病以及癌癥(Borden，1992，N.Engl.J.Med.326，1491-1492)。對于自身免疫疾病，IFN已用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化和Crohn氏病。對于癌癥治療，IFN已單獨(dú)或與許多不同化合物組合使用。IFN已用于其的癌癥的具體類型包括鱗狀細(xì)胞癌、黑素瘤、腎上腺樣瘤、血管瘤、毛細(xì)胞性白血病和卡波西肉瘤。在傳染病治療中，IFNs增加巨噬細(xì)胞的吞噬活性和淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性且抑制細(xì)胞病原體的繁殖。IFN已用作關(guān)于其的治療的具體適應(yīng)癥包括乙型肝炎、人乳頭瘤病毒6和11型(即生殖器疣)(Leventhal等人，1991，N Engl J Med 325，613-617)、慢性肉芽腫病和丙型肝炎病毒。
在慢性HCV感染治療中使用IFN-α的眾多良好控制的臨床試驗(yàn)已證實(shí)到6個月的治療結(jié)束時(shí)，每周治療3次導(dǎo)致約50％(范圍40％-70％)患者中的血清ALT值降低(Davis等人，1989，N.Engl.J.Med.321，1501-1506；Marcellin等人，1991，Hepatology 13，393-397；Tong等人，1997，Hepatology 26，747-754；Tong等人，Hepatology 26，1640-1645)。然而，干擾素治療停止后，約50％的響應(yīng)患者復(fù)發(fā)，從而如通過約20-25％的血清ALT濃度的標(biāo)準(zhǔn)化評估的，導(dǎo)致“持久的”應(yīng)答率。此外，已使用HCV RNA值中的改變作為臨床終點(diǎn)檢查6個月的1型干擾素治療的研究已證實(shí)最高達(dá)35％的患者到治療結(jié)束時(shí)將具有HCV RNA的喪失(Tong等人，1997，同上)。然而，與ALT終點(diǎn)一樣，約50％的患者在治療停止后6個月復(fù)發(fā)，從而導(dǎo)致僅12％的持久病毒學(xué)應(yīng)答(23)。已檢查48周治療的研究已證實(shí)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答最高達(dá)25％。
聚乙二醇化(Pegylated)干擾素，即與聚乙二醇(PEG)綴合的干擾素已證實(shí)超過干擾素的改善特征。由PEG綴合造成的優(yōu)點(diǎn)可以包括與缺乏PEG的干擾素相比較改善的藥物代謝動力學(xué)概況，從而給予更方便的給藥方案、改善的耐受和改善的抗病毒功效。此種改善已在聚乙二醇干擾素α-2a(PEGASYS，Roche)和聚乙二醇干擾素α-2b(VIRAFERONPEG，PEG-INTRON，Enzon/Schering Plough)的臨床研究中得到證實(shí)。
與干擾素和聚乙二醇干擾素組合的siNA分子具有改善HCV或上文討論的任何其他適應(yīng)癥治療的有效性的潛力。靶向與HCV感染相關(guān)的RNAs的siNA分子可以單獨(dú)或與其他療法例如干擾素和聚乙二醇干擾素組合使用以達(dá)到增強(qiáng)的功效。
實(shí)施例15靶RNA表達(dá)的多功能siNA抑制 多功能siNA設(shè)計(jì) 一旦已鑒定關(guān)于多功能siNA構(gòu)建體的靶位點(diǎn)，就設(shè)計(jì)具有長度例如約18個-約28個核苷酸的互補(bǔ)區(qū)的siNA的每條鏈，所述互補(bǔ)區(qū)與不同靶核酸序列互補(bǔ)。設(shè)計(jì)具有約4個-約22個核苷酸的鄰近側(cè)翼區(qū)的每個互補(bǔ)區(qū)，所述側(cè)翼區(qū)與靶序列不互補(bǔ)，但包含與另一種序列的互補(bǔ)區(qū)的互補(bǔ)性(參見例如圖16)?？梢酝瑯拥卦O(shè)計(jì)發(fā)夾構(gòu)建體(參見例如圖17)。在不同靶核酸序列之間共享的互補(bǔ)、回文或重復(fù)序列的鑒定可以用于縮短多功能siNA構(gòu)建體的總體長度(參見例如圖18和19)。
在非限制性例子中，呈現(xiàn)了另外3類另外的多功能siNA設(shè)計(jì)，其允許單個siNA分子沉默多個靶。第一種方法利用接頭以直接方式連接siNAs(或多功能siNAs)。這可以允許連接最有效的siNAs，而不產(chǎn)生有可能觸發(fā)干擾素應(yīng)答的長的、連續(xù)RNA段。第二種方法是重疊的或連接的多功能設(shè)計(jì)的樹狀聚體延伸；或可替代地siNA以超分子形式的組織。第三種方法使用長度超過30個堿基對的螺旋。這些siNAs經(jīng)由切酶加工將揭示新的、活性5′反義末端。因此，長siNAs可以靶向由原始5′末端限定的位點(diǎn)和由新末端限定的那些，所述新末端由切酶加工產(chǎn)生。當(dāng)與常規(guī)多功能siNAs(其中有義和反義鏈各自限定1個靶)組合時(shí)，該方法可以用于例如靶向4個或更多位點(diǎn)。
I.栓系的雙功能siNAs 基本想法是設(shè)計(jì)其中2條反義siNA鏈與單條有義鏈退火的多功能siNAs的新方法。有義鏈寡核苷酸包含接頭(例如，如本文所描述的非核苷酸接頭)和與反義siNA鏈退火的2個片段(參見圖22)。接頭還可以任選包含基于核苷酸的接頭。關(guān)于這種方法的幾個潛在優(yōu)點(diǎn)和變化包括但不限于 1.2個反義siNAs是獨(dú)立的。因此，靶位點(diǎn)的選擇不受關(guān)于2個位點(diǎn)之間的序列保守的需求的約束?？梢越M合任何2個高活性siNAs以形成多功能siNA。
2.當(dāng)與具有同源性的靶位點(diǎn)組合使用時(shí)，靶向存在于2種基因(例如，不同同工型)中的序列的siNAs，該設(shè)計(jì)可以用于靶向超過2個位點(diǎn)。單個多功能siNA可以例如用于靶向2種不同靶RNAs的RNA。
3.使用有義和反義鏈以靶向基因的多功能siNAs也可以摻入栓系的多功能設(shè)計(jì)內(nèi)。這使得展現(xiàn)用單個復(fù)合物靶向6個或更多位點(diǎn)的可能性。
4.可能使超過2個反義鏈siNAs與單個栓系的有義鏈退火。
5.該設(shè)計(jì)避免了長的連續(xù)dsRNA段。因此，不太可能起始干擾素應(yīng)答。
6.接頭(或與其附著的修飾，例如本文描述的綴合物)可以改善復(fù)合物的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)或改善其摻入脂質(zhì)體內(nèi)。對接頭引入的修飾不應(yīng)影響siNA活性至如果它們與siNA直接附著而具有的相同程度(參見例如圖27和28)。
7.有義鏈可以延長超過退火的反義鏈，以提供用于附著綴合物的另外位點(diǎn)。
8.復(fù)合物的極性可以這樣轉(zhuǎn)變，從而使得2個反義3′末端鄰近接頭，且5′末端遠(yuǎn)離接頭或其組合。
樹狀聚體和超分子siNAs 在樹狀聚體siNA方法中，siNA的合成通過首先合成樹狀聚體模板起始，隨后為附著各種功能siNAs。各種構(gòu)建體在圖23中描述?？梢愿街墓δ躶iNAs的數(shù)目僅受使用的樹狀聚體的尺寸限制。
關(guān)于多功能siNA的超分子方法 超分子形式簡化了樹狀聚體合成的挑戰(zhàn)。在這種形式中，siNA鏈通過標(biāo)準(zhǔn)RNA化學(xué)合成，隨后為各種互補(bǔ)鏈的退火。個別鏈合成在5′-末端處包含1個siNA的反義有義序列，隨后為核酸或合成接頭，例如六乙二醇(hexaethyleneglyol)，其依次隨后為以5′至3′方向的另一個siNA的有義鏈。因此，siNA鏈的合成可以以標(biāo)準(zhǔn)3′至5′方向進(jìn)行。三功能和四功能siNAs的代表性例子在圖24中描述。基于相似原則，可以設(shè)計(jì)更高功能性的siNA構(gòu)建體，只要達(dá)到各種鏈的有效退火。
切酶允許的多功能siNA 使用多重靶的生物信息學(xué)分析，可以鑒定長度約2個-約14個核苷酸的不同靶序列之間共享的相同序列段。這些相同區(qū)域可以設(shè)計(jì)成延長的siNA螺旋(例如，＞30個堿基對)，從而使得經(jīng)由切酶的加工揭示次級功能5′-反義位點(diǎn)(參見例如圖25)。例如，當(dāng)siNA反義鏈(例如，具有3′-TT突出端的雙鏈體中的21核苷酸鏈)的前17個核苷酸與靶RNA互補(bǔ)時(shí)，在25nM時(shí)觀察到強(qiáng)沉默。以相同形式由僅16核苷酸的互補(bǔ)性觀察到80％的沉默。
將這種性質(zhì)摻入約30個-40個或更多堿基對的siNAs設(shè)計(jì)內(nèi)導(dǎo)致另外的多功能siNA構(gòu)建體。圖25中的例子舉例說明了30堿基對雙鏈體在經(jīng)由切酶-RNA酶III加工后如何能夠靶向3個不同序列；這些序列可以在相同的mRNA或分開的RNAs上，例如病毒和宿主因子信使，或沿著給定途徑(例如，炎癥級聯(lián))的多重點(diǎn)。此外，40堿基對雙鏈體可以組合串聯(lián)雙功能設(shè)計(jì)，以提供靶向4個靶序列的單個雙鏈體。更加廣泛的方法可以包括使用同源序列以使得對于1個多功能雙鏈體能夠沉默5或6個靶。圖25中的例子舉例說明了如何能夠達(dá)到這點(diǎn)。30堿基對雙鏈體經(jīng)由切酶從任一末端切割成22和8堿基對產(chǎn)物(8b.p.片段未顯示)。為了易于呈現(xiàn)，由切酶產(chǎn)生的突出端未顯示-但可以被補(bǔ)償。顯示了3個靶向序列。重疊的所需序列同一性由灰色框指出。要求親本30b.p.siNA的N’s的2’-OH位置的位點(diǎn)以使切酶切割成為可能，如果這在穩(wěn)定化學(xué)中進(jìn)行測試的話。應(yīng)當(dāng)指出30聚體雙鏈體經(jīng)由切酶RNA酶III的加工不產(chǎn)生精確的22+8切割，而是產(chǎn)生一系列緊密相關(guān)的產(chǎn)物(其中22+8是主要位點(diǎn))。因此，經(jīng)由切酶的加工將產(chǎn)生一系列活性siNAs。另一個非限制性例子顯示于圖26中。40堿基對雙鏈體經(jīng)由切酶從任一末端切割成20堿基對產(chǎn)物。為了易于呈現(xiàn)，由切酶產(chǎn)生的突出端未顯示-但可以被補(bǔ)償。以4種顏色-藍(lán)色、淺藍(lán)色以及紅色和橙色顯示了4個靶向序列。重疊的所需序列同一性由灰色框指出。這種設(shè)計(jì)形式可以延伸至較大的RNAs。如果化學(xué)穩(wěn)定的siNAs由切酶結(jié)合，那么策略上定位的核糖核苷酸鍵可以使設(shè)計(jì)者切割產(chǎn)物成為可能，其允許更廣泛的多功能設(shè)計(jì)譜。例如不限于約22-核苷酸的切酶標(biāo)準(zhǔn)的切割產(chǎn)物可以允許多功能siNA構(gòu)建體具有例如約3個-約15個核苷酸的靶序列同一性重疊。
實(shí)施例16診斷用途 本發(fā)明的siNA分子可以在多種診斷應(yīng)用中使用，例如在多種應(yīng)用中的分子靶(例如，RNA)的鑒定中，例如在臨床、工業(yè)、環(huán)境、農(nóng)業(yè)和/或研究背景中。siNA分子的此種診斷用途涉及利用重構(gòu)的RNAi系統(tǒng)，例如使用細(xì)胞裂解物或部分純化的細(xì)胞裂解物。本發(fā)明的siNA分子可以用作診斷工具，以檢查在患病細(xì)胞內(nèi)的遺傳漂變和突變，或檢測內(nèi)源或外源例如病毒RNA在細(xì)胞中的存在。siNA活性和靶RNA的結(jié)構(gòu)之間的緊密關(guān)聯(lián)允許檢測分子的任何區(qū)域中的突變，所述突變改變靶RNA的堿基配對和三維結(jié)構(gòu)。通過使用在本發(fā)明中描述的多重siNA分子，人們可以對核苷酸變化作圖，這對于體外以及細(xì)胞和組織中的RNA結(jié)構(gòu)和功能是重要的。用siNA分子切割靶RNAs可以用于抑制基因表達(dá)，且限定特定基因產(chǎn)物在疾病或感染進(jìn)展中的作用。以這種方式，其他遺傳靶可以定義為疾病的重要介質(zhì)。通過提供組合療法(例如，靶向不同基因的多重siNA分子、與已知小分子抑制劑偶聯(lián)的siNA分子、或使用siNA分子和/或其他化學(xué)或生物分子組合的間歇療法)的可能性，這些實(shí)驗(yàn)將導(dǎo)致疾病進(jìn)展的更佳治療。本發(fā)明的siNA分子的其他體外用途是本領(lǐng)域眾所周知的，且包括與疾病、感染或相關(guān)狀況相關(guān)的mRNAs存在的檢測。此種RNA通過測定在用siNA治療后切割產(chǎn)物的存在進(jìn)行檢測，其中使用標(biāo)準(zhǔn)方法例如熒光共振發(fā)射轉(zhuǎn)移(FRET)。
在具體例子中，對于測定使用僅切割野生型或突變型靶RNA的siNA分子。第一種siNA分子(即，僅切割野生型靶RNA的那些)用于鑒定樣品中存在的野生型RNA，且第二種siNA分子(即，僅切割突變型靶RNA的那些)用于鑒定樣品中的突變型RNA。作為反應(yīng)對照，野生型和突變RNA的合成底物由2種siNA分子進(jìn)行切割，以證實(shí)在反應(yīng)和不存在“非靶向的”RNA種類切割的情況下的相對siNA有效性。來自合成底物的切割產(chǎn)物也用于產(chǎn)生大小標(biāo)記，用于分析樣品群體中的野生型和突變RNAs。因此，每次分析需要2種siNA分子、2種底物和1種未知樣品，其組合成6種反應(yīng)。使用RNA酶保護(hù)測定確定切割產(chǎn)物的存在，從而使得每種RNA的全長和切割片段可以在聚丙烯酰胺凝膠的1個泳道中進(jìn)行分析。并非絕對需要定量結(jié)果，以了解突變RNAs的表達(dá)和靶細(xì)胞中所需表型改變的推定危險(xiǎn)。其蛋白質(zhì)產(chǎn)物牽涉表型(即，疾病相關(guān)或感染相關(guān)的)發(fā)展的mRNA的表達(dá)足以確定危險(xiǎn)。如果對于2種轉(zhuǎn)錄物使用可比較比活性的探針，那么RNA水平的定性比較是足夠的且減少初次診斷的成本。較高的突變型與野生型比與較高的危險(xiǎn)相關(guān)，無論RNA水平進(jìn)行定性還是定量比較。
本說明書中提及的所有專利和出版物是本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平的指示。本公開內(nèi)容中引用的所有參考文獻(xiàn)引入作為參考，其程度如同每個參考文獻(xiàn)已個別地整體引入作為參考一樣。
技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明非常適合于執(zhí)行目標(biāo)且獲得提及的目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)，以及其中固有的那些。作為優(yōu)選實(shí)施方案的目前代表的本文描述的方法和組合物是示例性的且不意欲作為對本發(fā)明范圍的限制。其中的改變和其他用途對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，其包含在本發(fā)明的精神內(nèi)，且由權(quán)利要求的范圍限定。
在不背離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，可對本文公開的本發(fā)明進(jìn)行各種替換和修飾，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。因此，此種另外的實(shí)施方案在本發(fā)明和隨后權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員測試本文描述的化學(xué)修飾的各種組合和/或替換，以產(chǎn)生具有用于介導(dǎo)RNAi活性的改善活性的核酸構(gòu)建體。此種改善的活性可以包含改善的穩(wěn)定性、改善的生物利用率、和/或介導(dǎo)RNAi的細(xì)胞應(yīng)答的改善的活化。因此，本文描述的具體實(shí)施方案不是限制性的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解無需過度實(shí)驗(yàn)即可測試本文描述的修飾的具體組合，以鑒定具有改善的RNAi活性的siNA分子。
本文舉例說明性描述的本發(fā)明可以在不存在本文未具體公開的任何一種或多種元素、一種或多種限制的情況下適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行實(shí)踐。因此，例如，在本文的每種情況下，術(shù)語“包含”、“基本上由......組成”和“由......組成”中的任何一個可以用另2個術(shù)語中的任一替換。已使用的術(shù)語和表達(dá)用作描述性而非限制性的術(shù)語，并且在此種術(shù)語和表達(dá)的使用中不意欲排除所顯示和所描述的特征的任何等價(jià)物或其部分，但應(yīng)認(rèn)識到在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)的各種修飾是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選實(shí)施方案具體公開，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本文公開概念的任選特征、修飾和變化，并且此種修飾和變化視為在如由說明書和附加權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。
此外，當(dāng)本發(fā)明的特征或方面按照馬庫什(Markush)組或可替代方案的其他分組進(jìn)行描述時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到本發(fā)明因此也按照馬庫什組或其他組的任何個別成員或成員亞組進(jìn)行描述。
表IHCV登記號 表IIHCV siNA和靶序列 siNA構(gòu)建體的上部序列和下部序列的3′-末端可以包括例如長度為約1個、2個、3個或4個核苷酸，優(yōu)選長度為2個核苷酸的突出端序列，其中下部序列的突出端序列任選與靶序列的部分互補(bǔ)。上部序列也稱為有義鏈，而下部序列也稱為反義鏈。該表中的上部和下部序列可以進(jìn)一步包含具有式I-VII的化學(xué)修飾，例如圖4和5中顯示的示例性siNA構(gòu)建體，或具有表IV中描述的修飾或其任何組合。




























表IV 關(guān)于化學(xué)修飾的siNA構(gòu)建體的穩(wěn)定化學(xué)的非限制性例子


CAP＝任何末端帽，參見例如圖10。
所有Stab 00-34化學(xué)可以包含3′-末端胸苷(TT)殘基 所有Stab 00-34化學(xué)一般包含約21個核苷酸，但可以如本文所描述的改變。
所有Stab 00-36化學(xué)還可以包括如從反義或引導(dǎo)鏈的5′-末端測定的，在雙鏈核酸雙鏈體的第11個堿基配對位置處在有義或過客鏈中的單個核糖核苷酸(參見圖6C) S＝有義鏈 AS＝反義鏈 *Stab 23具有與3′-帽鄰近的單個核糖核苷酸 *Stab 24和Stab 28具有在5′-末端處的單個核糖核苷酸 *Stab 25、Stab 26、Stab 27、Stab 35和Stab 36具有的在5′-末端處3個核糖核苷酸 *Stab 29、Stab 30、Stab 31、Stab 33和Stab 34在來自5′-末端的前3個核苷酸位置處的任何嘌呤是核糖核苷酸 p＝硫代磷酸酯鍵

Stab 35具有在3′-突出端處的2′-O-甲基U和在5′-末端處的3個核糖核苷酸

Stab 36具有與靶序列互補(bǔ)的2′-O-甲基突出端(天然存在的突出端)和在5′-末端處的3個核糖核苷酸 表V A.2.5μmol合成循環(huán)ABI 394儀器 B.0.2μmol合成循環(huán)ABI 394儀器 C.0.2μmol合成循環(huán)96孔儀器 ·等待時(shí)間不包含遞送期間的接觸時(shí)間 ·串聯(lián)合成使用接頭分子的雙重偶聯(lián) 表VI 脂質(zhì)納米顆粒(LNP)制劑 N/P比＝陽離子脂質(zhì)和核酸之間的氮∶亞磷比 使用的2KPEG是PEG2000，一般可以從～1500到～3000Da不等的多分散性(即，其中PEG(n)為約33-約67，或平均～45)。
CLinDMA結(jié)構(gòu)
pCLinDMA結(jié)構(gòu)
eCLinDMA結(jié)構(gòu)
DEGCLinDMA結(jié)構(gòu)
PEG-n-DMG結(jié)構(gòu)
n＝約33至67，平均值＝45對于2KPEG/PEG2000 DMOBA結(jié)構(gòu)
DMLBA結(jié)構(gòu)
DOBA結(jié)構(gòu)
DSPC結(jié)構(gòu)
膽固醇結(jié)構(gòu)
2KPEG-膽固醇結(jié)構(gòu)
n＝約33至67，平均值＝45對于2KPEG/PEG2000 2KPEG-DMG結(jié)構(gòu)
n＝約33至67，平均值＝45對于2KPEG/PEG2000 COIM結(jié)構(gòu)
5-CLIM.和2-CLIM結(jié)構(gòu)
表VII 表VII用于預(yù)測高活性siNAs的描述模式與其相對得分的Sirna算法。
給出的所有位置是關(guān)于19聚體siNA的有義鏈。
表VIII制備流程圖
表IX用于siNA表征的分析法

權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含各自具有彼此互補(bǔ)的第一條鏈和第二條鏈的第一種雙鏈核酸和第二種雙鏈核酸分子，其中所述第一種雙鏈核酸分子的所述第二條鏈包含與包含SEQ ID NO1444的HCV序列互補(bǔ)的15-30個核苷酸的序列，且所述第二種雙鏈核酸分子的所述第二條鏈包含與包含SEQ ID NO1417的HCV序列互補(bǔ)的15-30個核苷酸的序列。
2.權(quán)利要求1的組合物，其進(jìn)一步包含陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)和聚乙二醇-綴合物。
3.權(quán)利要求1的組合物，其進(jìn)一步包含陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、聚乙二醇-綴合物和膽固醇。
4.權(quán)利要求1的組合物，其進(jìn)一步包含陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、聚乙二醇-綴合物、膽固醇和表面活性劑。
5.權(quán)利要求2的組合物，其中所述陽離子脂質(zhì)選自CLinDMA、pCLinDMA、eCLinDMA、DMOBA和DMLBA。
6.權(quán)利要求3的組合物，其中所述陽離子脂質(zhì)選自CLinDMA、pCLinDMA、eCLinDMA、DMOBA和DMLBA。
7.權(quán)利要求4的組合物，其中所述陽離子脂質(zhì)選自CLinDMA、pCLinDMA、eCLinDMA、DMOBA和DMLBA。
8.權(quán)利要求2的組合物，其中所述中性脂質(zhì)選自DSPC、DOBA和膽固醇。
9.權(quán)利要求3的組合物，其中所述中性脂質(zhì)選自DSPC、DOBA和膽固醇。
10.權(quán)利要求4的組合物，其中所述中性脂質(zhì)選自DSPC、DOBA和膽固醇。
11.權(quán)利要求2的組合物，其中所述聚乙二醇-綴合物選自PEG-二肉豆蔻酰甘油和PEG-膽固醇。
12.權(quán)利要求3的組合物，其中所述聚乙二醇-綴合物選自PEG-二肉豆蔻酰甘油和PEG-膽固醇。
13.權(quán)利要求4的組合物，其中所述聚乙二醇-綴合物選自PEG-二肉豆蔻酰甘油和PEG-膽固醇。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述PEG是2KPEG。
15.權(quán)利要求4的組合物，其中所述表面活性劑選自棕櫚醇、十八烷醇、油醇和亞油醇。
16.權(quán)利要求4的組合物，其中所述陽離子脂質(zhì)是CLinDMA，所述中性脂質(zhì)是DSPC，所述聚乙二醇綴合物是2KPEG-DMG，所述膽固醇是膽固醇，且所述表面活性劑是亞油醇。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述CLinDMA、所述DSPC、所述2KPEG-DMG、所述膽固醇和所述亞油醇分別以43∶38∶10∶2∶7的摩爾比存在。
18.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第一種雙鏈核酸分子的所述第一條鏈和所述第二條鏈分別包含SEQ ID NOs1796和2102，且所述第二種雙鏈核酸分子的所述第一條鏈和所述第二條鏈分別包含SEQ IDNOs1677和2103。
19.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第一種雙鏈核酸分子的所述第一條鏈和所述第二條鏈分別包含SEQ ID NOs1796和2010，且所述第二種雙鏈核酸分子的所述第一條鏈和所述第二條鏈分別包含SEQ IDNOs1677和2011。
20.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第一種雙鏈核酸分子的所述第一條鏈和所述第二條鏈分別包含SEQ ID NOs1796和2012，且所述第二種雙鏈核酸分子的所述第一條鏈和所述第二條鏈分別包含SEQ IDNOs1677和2013。
21.一種組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的權(quán)利要求18的組合物。
22.一種組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的權(quán)利要求19的組合物。
23.一種組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的權(quán)利要求20的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于研究、診斷和治療響應(yīng)基因表達(dá)和/或活性調(diào)節(jié)的性狀、疾病和狀況的化合物、組合物和方法。本發(fā)明還指向涉及性狀、疾病和狀況的化合物、組合物和方法，所述性狀、疾病和狀況響應(yīng)基因表達(dá)途徑或其他細(xì)胞過程中涉及的基因表達(dá)和/或活性的調(diào)節(jié)，所述基因介導(dǎo)此種性狀、疾病和狀況的維持或發(fā)展。具體而言，本發(fā)明涉及能夠介導(dǎo)針對基因表達(dá)的RNA干擾(RNAi)的雙鏈核酸分子，包括小核酸分子，例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、和短發(fā)夾RNA(shRNA)分子，包括此種小核酸分子的混合物和此種小核酸分子的脂質(zhì)納米顆粒(LNP)制劑。本發(fā)明還涉及小核酸分子，例如siNA，siRNA，和可以抑制內(nèi)源RNA分子功能，例如內(nèi)源微小RNA(miRNA)(例如，miRNA抑制劑)或內(nèi)源短干擾RNA(siRNA)(例如siRNA抑制劑)，或可以抑制RISC功能(例如，RISC抑制劑)的其他分子，以通過干擾此種內(nèi)源RNAs或與此種內(nèi)源RNAs相關(guān)的蛋白質(zhì)(例如，RISC)的調(diào)節(jié)功能來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，包括此種小核酸分子的混合物和此種小核酸分子的脂質(zhì)納米顆粒(LNP)制劑。此種小核酸分子在例如提供預(yù)防、抑制或減少疾病、性狀和狀況的組合物中是有用的，所述疾病、性狀和狀況與受試者或生物中的基因表達(dá)或活性相關(guān)。
文檔編號A61K9/127GK101605892SQ200680047821
公開日2009年12月16日 申請日期2006年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者J·麥斯維根, D·莫里西, R·格爾喬利尼, C·瓦格斯 申請人:瑟納治療公司