專利名稱：免疫rna構(gòu)建體的制作方法
免疫RNA構(gòu)建體
本發(fā)明的主題是由以下部分組成的化合物特異性結(jié)合與疾病相關(guān) 的細胞表面標志物的靶向部分、特異性誘導細胞死亡的核酸部分以及將 耙向部分與核酸部分共價連接的接頭。本發(fā)明的主題還包括所述化合物
的治療用途、包含所述化合物的藥物、其相關(guān)DNA和細胞。
目前可用的治療增生性疾病的藥物(例如化學治療劑)具有由于其 相對非特異性而誘發(fā)可觀的副作用的缺點。已經(jīng)嘗試通過多種治療觀念 來減輕這些副作用。 一種可能的方法是使用免疫治療劑來提高藥物的特 異性。這種方法已在腫瘤治療中特別有用。
一種類型的免疫治療劑是免疫毒素(immunotoxin， IT)。免疫毒素包 括對患病靶細胞的表面標志物具有特異性的單克隆抗體(moAb)或重組 抗體片段，所述抗體或片段與細胞毒劑偶聯(lián)。另一種類型的免疫治療劑 是抗免疫綴合物。它們包含作為自身免疫病、組織反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)發(fā)病 機制的致病劑(causative agent)的多肽結(jié)構(gòu)，所述多肽結(jié)構(gòu)也與具催化活 性的細胞毒素偶聯(lián)。細胞毒劑目前選自毒素或放射性元素。其中細胞毒 劑為放射性元素的免疫治療劑被稱作放射性免疫綴合物。免疫毒素和免 疫綴合物均已被開發(fā)并用于治療不同的惡性腫瘤。將放射性標記的抗B 細胞moAb應(yīng)用于患有B細胞淋巴瘤的患者導致腫瘤消退甚至完全消除 (1)。相反，moAb針對實體瘤的結(jié)果相當令人失望。
這些臨床研究中使用的IT尺寸相對較大，這似乎干擾了其穿透胂 瘤的能力。對血管化較差的腫瘤而言，低腫瘤穿透率產(chǎn)生了特別具有挑 戰(zhàn)性的問題。為了獲得更好的組織和腫瘤穿透以及普遍改善的擴散特 性，將IT小型化。推測更小的IT由于減小的抗原決定簇尺寸(2)而免 疫原性更低。因此，首先將蛋白質(zhì)水解切割的抗體片段與上述效應(yīng)子功 能(放射性標記的元件或毒素)綴合。
改進的克隆技術(shù)允許制備完全重組的IT。通過合成接頭(例如 (Gly4Ser)3)將通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區(qū) 的編碼區(qū)接合在一起。將得到的可變區(qū)基因單鏈片段(scFv)與催化活性酶的編碼區(qū)遺傳融合，所述催化活性酶包括有細胞毒素活性的蛋白質(zhì)或
多肽(3)。
迄今為止主要使用的肽類(peptidic)細胞毒素是細菌毒素白喉毒素 (DT)、假單胞菌外毒素A(PE)和未自植物的蓖麻毒素A(Ricin-A，RA)(4)。 細胞毒活性的機制在所有這些毒素中基本相同，盡管它們有不同的進化 背景。所述酶通過抑制真核延伸因子(eEF2)插入其在核糖體中的結(jié)合溝 來敲低(knock down )蛋白質(zhì)的生物合成，eEF2是RNA翻譯為蛋白質(zhì) 的關(guān)鍵元件。這通過a)直接l務(wù)飾eEF2 (DT、 PE)或通過失活核糖體 28S-rRNA亞基(RA)中的eEF2結(jié)合位點來完成。
作為肽類細胞毒素的備選試劑，可以使用核酸如小干擾RNA(siRNA) 或短發(fā)夾RNA(shRNA)、反義DNA或RNA、雙鏈RNA(dsRNA)或小 RNA(miRNA)來下調(diào)細胞調(diào)節(jié)途徑中特定的關(guān)鍵元件。另外，可以通過 抑制性適體(aptamer)來實現(xiàn)引發(fā)疾病的蛋白質(zhì)的進一步下調(diào)。靶蛋 白質(zhì)的生物學功能被抑制性適體的結(jié)合所抑制，從而該類分子也可以用 于實現(xiàn)療效。
Song等，2002公開了通過魚精蛋白-抗體融合蛋白將小干擾 RNA(siRNAs)遞送進入HIV感染的或被膜轉(zhuǎn)染的細胞中。該融合蛋白 對核酸具有高親和力并裝有siRNA。在得到的復合體中，RNA非共價 結(jié)合。然而，通過使用靶向不同蛋白質(zhì)的不同siRNA的混合物僅輕微 地實現(xiàn)靶細胞中凋亡。
根據(jù)Khaled等，使用RNA適配體將siRNA分子在復合體中遞送 給靼細胞，其中所述適配體部分非共價地附著在siRNA部分上。該復 合體為三聚體，其中一部分含有適配體部分，另一部分含有siRNA。兩 種單體均通過環(huán)對環(huán)的相互作用裝配。
WO 2005/059135公開了通過僅應(yīng)用srRNA分子或與用于遞送進把 細胞的遞送試劑(例如脂質(zhì)體)復合的siRNA分子來將siRNA分子遞 送進哺乳動物神經(jīng)細胞。
US 2003/0166512 Al 7>開了反義寡核苷酸和siRNA，其與移動蛋 白(血清蛋白)如白蛋白共價偶聯(lián)，從而提高血清半衰期并降低未綴合
核酸的免疫原性。蛋白質(zhì)綴合物不具有用于細胞特異性遞送治療性寡核
苷酸或siRNA的靶向功能。
CA2447161公開了綴合物、可降解的接頭和由葉酸鹽、半乳糖等組 成的組合物，并表征了生物活性化合物。使用抗體或適配體，但是不具 有乾向功能并替代siRNA。
US 2004/0204377公開了通過與樹狀體或肽偶聯(lián)而將siRNA遞送進 細胞中的方法。所述肽是非特異性的細胞穿透肽。偶聯(lián)siRNA的細胞 攝入與游離siRNA相比有所增強，但是沒有用于特異性遞送治療性 siRNA的乾向功能。
最近公開了關(guān)于siRNA治療性應(yīng)用的若干報道和專利。在這方面最 有前途的方法是沉默疾病相關(guān)基因。US2005/0159381 Al要求保護靶向 基因的siRNA序列，所述基因為例如與染色體轉(zhuǎn)運和癌癥發(fā)展相關(guān)的 BCR-ABL和ERG。 US2005/0176025描述了通過敲低Bcl-2家族蛋白而 在乾細胞中誘導凋亡的siRNA。在WO 2005/040379中，可以通過乾向 Ras家族蛋白的siRNA來誘導腫瘤細胞的生長抑制，Ras家族是已知在 多種癌癥中過表達的一個常見的癌基因蛋白家族。專利WO 98/41648 公開了對細胞生存力很重要的siRNA。所要求保護的大部分基因?qū)儆谡{(diào) 節(jié)細胞歧異(deviation)過程的基因。除了直接沉默疾病相關(guān)蛋白質(zhì)以外， 還可以使用siRNA來使得細胞對某種其他操作敏感。在專利WO 2005/042558 Al中，描述了耙向?qū)儆贗AP (凋亡蛋白抑制劑)家族的多 種蛋白質(zhì)的siRNA。敲低這些蛋白質(zhì)會導致針對小分子毒素如紫杉醇的 敏感性更高。
另外，在文獻(5，6)中公開了關(guān)于siRNA治療潛力的若干綜述文章。 所有這些綜述中的常識是除了鑒定高度有效的siRNA以外，必須開發(fā) 用于體內(nèi)施用活性siRNA的有效、安全且為細胞類型特異性的遞送策 略。在WO 2004/044141 A2中，要求保護siRNA與可能提供乾向功能 的分子的綴合物。這些分子是細胞表面受體的小分子配體，如維生素和 肽。US 2003/0104985 Al描述了將生物活性化合物與可介導特異性結(jié)合 細胞表面蛋白的分子(如葉酸鹽、人血清白蛋白或N-乙酰半乳糖胺) 綴合。關(guān)于成功地體內(nèi)施用經(jīng)化學修飾的siRNA的第一篇報導由 Soutchek等發(fā)表。在該研究中，與膽固醇綴合的siRNA在注射進小鼠
尾靜脈時顯示沉默活性。另外，siRNA的細胞穿透可由Rana和同事實 現(xiàn)，他們使用細胞穿透肽TAT使siRNA穿過細胞膜(7)。
所有這些有價值的專利或科學報道均有助于開發(fā)基于siRNA的藥 物。但是上述研究或?qū)＠芯赐ㄟ^將siRNA部分與適配體或全長抗 體共價綴合來解決siRNA遞送的問題。本發(fā)明的內(nèi)在問題是提供避免 上述問題的基于治療性RNA的藥物。特別地，本發(fā)明的藥物應(yīng)當是高 度特異性的，而不引起嚴重的副作用。它們應(yīng)當在靶細胞中高度有效， 而不顯著影響其它細胞。
令人驚奇的是，權(quán)利要求1到24中任一項的化合物、DNA、藥物、 其用途和方法解決了上述問題。根據(jù)本發(fā)明，適配體siRNA綴合物在 與高分子量復合體(如適配體或多肽)共價連接時具有組成型活性，而 不需要進一步加工(例如切割接頭序列)來實現(xiàn)完全的生物活性。如果 所述核酸部分是抑制性適配體，則兩個部分的結(jié)合活性(例如細胞表面 結(jié)合活性和抑制性適配體的結(jié)合活性)均保持不受影響。另外令人驚奇 的是，提高靶向部分(例如適配體)的親合力會得到遠優(yōu)于本領(lǐng)域目前 用于細胞類型特異遞送siRNA的遞送載體的組合物。
令人驚奇的是，權(quán)利要求l到21中任一項的化合物、DNA、藥物、 其用途和方法解決了上文提到的問題。根據(jù)本專利申請，適配體siRNA 綴合物在與高分子量復合體(如適配體或多肽)共價連接時具有組成型 活性，而不需要進一步加工(例如切割接頭序列)來實現(xiàn)完全的生物活 性。如果所述核酸部分是抑制性適配體，則兩個部分的結(jié)合活性(例如 細胞表面結(jié)合活性和抑制性適配體的結(jié)合活性)均保持不受影響。與靶 向細胞表面抗原的基于蛋白質(zhì)的免疫療法(例如重組免疫毒素)相比， 結(jié)合價的提高不必然與顯著但輕微的活性改變相關(guān)，因此無法預測。本 專利申請所述的基于這類核酸的構(gòu)建體的數(shù)據(jù)目前還沒有。因此，令人 非常驚訝的是提高靶向部分(例如適配體)的親合力得到了遠優(yōu)于一價 構(gòu)建體的組合物。提高多種適配體親合力的一種一般方式是通過足夠長 的雙鏈接頭序列將兩個適配體部分分開。該接頭序列提供了高水平的剛 性，這確保了所摻入適配體部分的獨立折疊。本發(fā)明解決了非特異性副 作用以及免疫原性的問題，這是通過不將siRNA與作為特異性配體的 蛋白質(zhì)偶聯(lián)而是與核酸偶聯(lián)來實現(xiàn)的，后者的免疫原性通常較弱或沒
有，并誘導序列特異性mRNA降解。
本發(fā)明解決了非特異性副作用以及免疫原性的問題，這是通過不將 siRNA與作為特異性配體的蛋白質(zhì)偶聯(lián)而是與核酸偶聯(lián)來實現(xiàn)的，后者 的免疫原性通常較弱或沒有，并誘導序列特異性mRNA降解。
在本發(fā)明的化合物中，核酸部分優(yōu)選是小干擾RNA(siRNA)、短發(fā) 夾RNA(shRNA)、反義DNA或RNA、雙鏈RNA(dsRNA)或小RNA (miRNA)或抑制性適配體。在本發(fā)明中，將核酸(如siRNA)與乾向部 分共價偶聯(lián)，這使得這些復合體更加穩(wěn)定，因為siRNA部分不易從所 述靶向部分上解離。如果所述siRNA僅通過復合體形成進行結(jié)合，則 該復合體可能在體內(nèi)遞送時解離，導致療效降低，因為siRNA有效載 荷降低了，另外，游離siRNA分子可在非靶向組織或細胞中引起副作 用。對于siRNA適配體綴合物的情況，人們也能對化學計量有充分的 控制，因為siRNA和適配體部分是從一條DNA鏈轉(zhuǎn)錄而來.
在一個優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明的化合物中一個或多個靶向部 分與一個或多個核酸部分連接。在該實施方案中，因為兩個部分均以定 點方式共價附著，所以兩個部分的比例總是清楚的，并且所述化合物不 是這兩個部分的隨機X連接聚集體。這意味著本發(fā)明的構(gòu)建體能夠包含 多個靶向部分(這導致提高的親合力)和多個核酸部分(這提高了生物 學效率，例如每個分子的siRNA有效負荷)。
本文使用的"細胞死亡"是指凋亡和壞死。本發(fā)明化合物的核酸部 分優(yōu)選地誘導凋亡。
本發(fā)明的"接頭"是在引入化合物中特定位置的分子。優(yōu)選地，所 述化合物包含一個或多個接頭分子。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明使用或組合兩種機制來特異性調(diào) 節(jié)基因表達反義技術(shù)和RNA干擾(RNAi) (8)。反義技術(shù)利用寡核普酸 或其類似物，所述寡核苷酸或其類似物通過Watson-Crick雜交與靶 RNA結(jié)合(9)。 一旦結(jié)合后，反義試劑通過RNAse H資導耙mRNA降 解，從而防止產(chǎn)生不期望的蛋白質(zhì)。
RNA干擾是是一種基因沉默現(xiàn)象，其中雙鏈RNA觸發(fā)同源mRNA
的特異性降解(IO)。特異性dsRNA被加工為小干擾RNA(siRNA)，其作 為在RNA誘導的沉默復合體(RISC)中切割同源mRNA的指導(ll)。 RNAi是于大部分原始單細胞生物中即已存在的提供對病毒(病毒 RNA)的保護的機制，這一發(fā)現(xiàn)預示著重大的科學突破，并代表了當前 生物學和藥物發(fā)現(xiàn)中最有前途和迅速發(fā)展的前沿之一。RNAi是發(fā)生在 從植物到哺乳動物的生物中的天然基因沉默過程。已經(jīng)顯示，RNAi選 擇性關(guān)閉小鼠模型中的疾病基因(12)。通過利用發(fā)生在細胞中的RNAi 的天然生物學過程，產(chǎn)生了稱為RNAi療法的一類重要的新藥物。RNAi 療法通過有效沉默特異性信使RNA來靶向疾病的"根源"遺傳因素， 由此阻止產(chǎn)生引起疾病的蛋白質(zhì)。RNAi療法具有治療惡性疾病并以全 新的方式幫助患者的潛力(13)。
盡管反義技術(shù)和RNAi在體外有著很有前途的結(jié)果，但本領(lǐng)域的關(guān) 鍵問題是將活性RNA特異性遞送進入靶細胞。RNA本身不能穿透進入 靶細胞。在體外，通過脂轉(zhuǎn)染或電穿孔將RNA轉(zhuǎn)染進細胞的胞質(zhì)溶膠 中。對體內(nèi)實驗而言，這些方法是不適用的。
根據(jù)本發(fā)明，通過將核酸部分與介導特異性細胞攝入的靶向部分綴 合而解決了所述核酸部分的細胞通透能力弱的問題。這可通過將核酸部 分與細胞表面特定配體共價綴合來實現(xiàn)，所述細胞表面特異配體例如誘 導受體介導的胞吞作用。本發(fā)明允許在體內(nèi)細胞特異性地遞送生物活性 RNA。
在一個優(yōu)選的實施方案中，配體可以是抗體、其衍生物或片段，雙 抗體或適配體或多聚適配體及其組合。優(yōu)選地，所述抗體是單克隆抗體 或全長抗體?？贵w的片段和衍生物是保留了對抗原的特異性結(jié)合特性的 抗體片段和衍生物?？贵w片段可以是融合蛋白的一部分。
適配體是能采取高度特異性三維構(gòu)象的寡核苷酸(DNA或RNA) 鏈(通常是短鏈)。特異性結(jié)合的適配體已經(jīng)基于其對核酸、蛋白質(zhì)、 小有機化合物和甚至完整生物的結(jié)合能力而從隨機庫中進行選擇(14)。 適配體被^殳計為對某些靼分子(例如MCF-7細胞上的Her3、 LNCaP 細胞上的PSMA)具有適當?shù)挠H合力和特異性(15)。由于其高度特異性 的結(jié)合活性，這些分子可用于醫(yī)藥和生物技術(shù)中的許多潛在應(yīng)用(16)。 在一些情況下，觀察到適配體與其細胞表面特異性抗原(例如LNCaP
細胞上的PSMA)結(jié)合后誘導受體介導的胞吞作用。特別地，本發(fā)明的 靶向部分由至少一個、優(yōu)選至少兩個適配體來代表。
因此，根據(jù)本發(fā)明，特異性誘導mRNA降解的核酸部分可一方面與 蛋白質(zhì)共價連接，或另一方面與適配體共價連接。在例如受體介導的胞 吞作用后，該化合物被轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)溶膠中，在此處該化合物的RNA部 分能夠誘導序列特異性mRNA降解。
令人驚奇的是，根據(jù)本發(fā)明，所述核酸部分(例如siRNA)與靶向 部分(例如與蛋白質(zhì)或適配體)共價偶聯(lián)，而不降低核酸的降解活性和 靶向部分的結(jié)合活性。產(chǎn)生其中例如siRNA仍然能夠觸發(fā)RNAi級聯(lián)的 化合物。
優(yōu)選地，在siRNA與基于蛋白質(zhì)的結(jié)合配體綴合的情況下，使用異 雙功能接頭實現(xiàn)偶聯(lián)，由此通過在RNA和蛋白質(zhì)之間形成二硫橋來使 RNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)。在適配體作為特異性結(jié)合配體的情況下，siRNA 優(yōu)選與適配體遺傳融合。
本發(fā)明涉及由至少一個靶向部分和至少一個核酸部分形成的合成 化合物，其中所述乾向部分包含針對胞外表面結(jié)構(gòu)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述 結(jié)合結(jié)構(gòu)域在與該化合物的靶向部分結(jié)合后被內(nèi)化。核酸部分由至少一 個核酸分子和/或修飾核酸分子組成，其在內(nèi)化后誘導序列特異性 mRNA降解或序列特異性翻譯抑制。這導致由相應(yīng)mRNA編碼的蛋白 質(zhì)的合成降低，并因此調(diào)控蛋白質(zhì)功能，導致細胞死亡。
本發(fā)明的化合物選擇性地結(jié)合與疾病相關(guān)的細胞表面標志物。結(jié)合 特異性是由靶向部分介導的。與其正常對應(yīng)物相比，患病細胞經(jīng)常在其 細胞表面組成中發(fā)生顯著的差異這主要包括細胞表面蛋白質(zhì)/抗原的 不同的表達模式或提高的表達水平，或者改變的細胞表面糖基化狀態(tài)。 這些形態(tài)學差異可以用于產(chǎn)生靶向部分，所述靶向部分選擇性地結(jié)合這 些疾病特異性細胞表面抗原或這些抗原上相應(yīng)的獨特表位?；衔锱c細 胞結(jié)合后，所述化合物被細胞內(nèi)化。
因此，本發(fā)明的化合物清除患病細胞，而不顯著影響其正常對應(yīng)物 或未患病細胞(甚至是在相同組織中或來源于相同組織的)。本發(fā)明的
靶向部分就治療應(yīng)用進行選擇。例如，如果要破壞特定類型的腫瘤細胞， 則選擇靶向部分以使其與已知的腫瘤細胞表面標志物特異性結(jié)合。
本文使用的"與疾病相關(guān)的細胞表面標志物"指細胞表面結(jié)構(gòu)，通 常是蛋白質(zhì)或糖或糖基化的蛋白質(zhì)，其以提高的量或優(yōu)選以顯著高于正 常細胞的量存在于患病細胞的細胞表面。
優(yōu)選地，所述標記以未患病的相應(yīng)細胞上2、 5、 10或100倍的水 平存在于患病細胞的細胞表面上。"特異性地"表示靶向部分是針對細 胞表面標記的選擇性結(jié)合配偶體。
在一個優(yōu)選的實施方案中，靶向部分是活性結(jié)合結(jié)構(gòu)，如抗體。在 一個本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，靶向部分選自抗體或其衍生物或片段和 /或非蛋白質(zhì)類分子如核酸，特別是適配體，適配體是與存在于細胞表 面的結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的DNA或RNA分子或經(jīng)修飾的DNA或RNA分 子。
在其它一些優(yōu)選的實施方案中，靶向部分是具有特異性受體結(jié)合活 性的分子，其選自碳水化合物、脂質(zhì)、維生素、小受體配體、細胞表面 碳水化合物結(jié)合蛋白及其配體(如凝集素、r型凝集素、半乳凝素及其 衍生物)、受體結(jié)合分子如分化簇(CD )抗原(如CD30、 CD40等)的 天然配體、細胞因子(如趨化因子、集落刺激因子、1型細胞因子、2 型細胞因子、干擾素、白介素、淋巴因子、單核因子等)和/或粘附分 子(包括其衍生物和突變體)和/或任何上文所列的活性結(jié)合結(jié)構(gòu)的衍 生物或組合。
優(yōu)選地，靶向部分特異性結(jié)合CD抗原、細胞因子受體、激素受體、 生長因子受體、離子泵、多聚體的細胞外基質(zhì)蛋白、金屬蛋白酶或通道 形成蛋白。
把向部分也可以選自由變應(yīng)原(優(yōu)選肽變應(yīng)原或重組變應(yīng)原)、變 應(yīng)原獨特型抗體、激發(fā)自身免疫的結(jié)構(gòu)、誘導組織排斥的結(jié)構(gòu)、免疫球 蛋白恒定區(qū)及其衍生物、突變體或其組合組成的被動結(jié)合結(jié)構(gòu)。本發(fā)明 的化合物受其針對乾細胞表面的把向部分指導，所述靶細胞表面包含針 對上述優(yōu)選的靶向部分之一的結(jié)合配偶體。在另一實施方案中，化合物
的靶向部分通過包含兩個或更多個相同和/或不同的結(jié)合結(jié)構(gòu)而具有更 高的價。
本發(fā)明的化合物包含核酸部分，其在內(nèi)化進靶細胞后誘導細胞死
亡。優(yōu)選地，核酸部分誘導序列特異性mRNA降解或序列特異性翻譯 抑制。核酸部分可進行化學^f務(wù)飾，例如通過修飾核糖部分的2，位置，這 導致核酸酶抗性提高。核酸部分可以由單鏈DNA和/或化學修飾的單鏈 DNA或者單鏈RNA和/或化學修飾的單鏈RNA或者雙鏈RNA和/或化 學^f務(wù)飾的雙鏈RNA組成。如果核酸部分是雙鏈RNA,則兩條RNA鏈 可以通過發(fā)夾環(huán)共價連接。如果靶向部分是蛋白質(zhì)，則優(yōu)選用反應(yīng)性化 學基團修飾核酸來產(chǎn)生化合物，所述化學基團被誘導為與靶向部分形成 共價鍵。如果靶向部分帶有由其氨基酸序列編碼的標簽，則核酸部分可 以以定點方式與乾向部分共價綴合。在一個優(yōu)選的實施方案中，進入靶 細胞后共價鍵被切開，這導致給定化合物的靶向部分與核酸部分解離。 如果靶向部分是核酸，則核酸部分優(yōu)選通過糖磷酸主鏈中的磷酸二酯鍵 與靶向部分融合。在另一優(yōu)選的實施方案中，兩種官能團通過接頭序列 被分開，從而維持正確折疊并具有活性的化合物。如果靶向部分、接頭 和核酸部分是RNA，則它們可以遺傳融合。這意味著該化合物可以通 過體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄來獲得。
靶向部分與靶細胞的細胞表面受體結(jié)合并介導化合物隨后轉(zhuǎn)運進 入耙細胞的胞質(zhì)溶膠。乾細胞通過乾向部分結(jié)合其細胞表面上存在的至 少一個結(jié)構(gòu)的能力來定義。
優(yōu)選核酸部分能夠誘導序列特異性地抑制靶細胞中任何mRNA的 翻譯。作為本發(fā)明另一實施方案，所述核酸部分誘導基因的翻譯抑制， 所述基因通過如改變靶細胞的功能、基因表達或生存力來影響細胞調(diào)節(jié) 途徑。在一個優(yōu)選的實施方案中，核酸部分誘導基因的翻譯抑制，這導 致耙細胞的凋亡。例如，這些基因是編碼直接參與蛋白質(zhì)合成的蛋白質(zhì) (例如真核延伸因子2(eEF-2))的基因，或已知負調(diào)節(jié)凋亡途徑，意味 著這些蛋白質(zhì)的敲低可在靶細胞中誘導凋亡。相關(guān)的蛋白質(zhì)為例如 Bcl2、 Bcl-XL、 Bcl國W、 Mcl國l、 Al、 Ced9、 E1B19K或BHRF1。 一些 Bcl-2結(jié)合蛋白還包括抗凋亡效應(yīng)，如Bag-l、 Raf-l、釣依賴磷酸酶、 Smn、 Beclin、 ANT和VDAC。另外，IAP-1、 IAP隱2、存活素和x隱IAP
的敲低能夠誘導凋亡。另一些抗凋亡蛋白為IKK-a、 IkB或NF-kB、 FLIP、 Akt、 PI3K或PDK1。
本發(fā)明的另一實施方案是包含至少一個其它部分的化合物，所述其 它部分使得能夠純化和/或檢測該化合物或其部分，和/或便于至少一個 核酸部分轉(zhuǎn)運進入靶細胞及其在細胞內(nèi)的分離和/或活化該核酸部分。
本發(fā)明的具體實施方案是名為ki4-siEEF2的化學偶聯(lián)化合物。該分 子由作為靶向部分的蛋白質(zhì)和作為基因沉默部分的化學修飾siRNA組 成。SiRNA部分的化學修飾使得能夠與蛋白質(zhì)配體(ki4抗體)共價綴 合，另外，化學修飾導致核酸酶穩(wěn)定性提高。
本發(fā)明另一具體實施方案是基于RNA的靶向構(gòu)建體xPSM-A-3、 A30-siEEF2 、 PSMBl-siEEF2 、 PSMB2-siEEF2 和 PSMA biv anneal-siEEF2。構(gòu)建體A30-siEEF2由RNA組成。構(gòu)建體xPSM-A-3、 PSMBl畫siEEF2、 PSMB2-siEEF2和PSMAbiv anneal-siEEF2由化學修 飾的RNA組成。A30-siEEF2的siRNA部分由RNA組成，所有其它構(gòu) 建體的siRNA部分均由化學1務(wù)飾的RNA組成。除了 PSMA biv anneal-siEEF2以外，siRNA部分一般與把向部分遺傳融合，這意味著 這些分子可由單個DNA模板獲得。
合理地i更計構(gòu)建體PSMBl-siEEF2和PSMB2-siEEF2的序列，以橫> 得根據(jù) RNA 二級結(jié)構(gòu)預測算法 Mfold 3.2 (http:〃molbio.info.nih.gov/molbio-nih/mfold.html)， 它4門組成兩個獨立 折疊的功能性適配體單元。這兩個適配體單元被—助正確折疊的短雙鏈 間隔區(qū)序列分開。對于PSMAbiv anneal-siEEF2的情況，通過引入在 獨立的反應(yīng)中退火的互補性3，突出端序列而將兩個適配體部分非共價 接合。這些修飾導致這些RNA構(gòu)建體的親合力提高。因為間隔區(qū)序列 必須是雙鏈的，所以這些構(gòu)建體的基因沉默部分可見于間隔區(qū)序列內(nèi) 部。根據(jù)所使用的間隔區(qū)序列數(shù)，可以增加功能性基因沉默部分的數(shù)目 (PSMABl-siEEF2帶有一個siRNA部分，PSMAB2-siEEF2顯示兩個 siRNA部分)。
令人驚奇的是，根據(jù)本發(fā)明， 一個遞送單元內(nèi)結(jié)合部分的增加和功 能性siRNA序列的增加導致更高的生物效力。
優(yōu)選地，本發(fā)明允許將確定的凋亡誘導核酸細胞類型特異地遞送進 入耙細胞中。
本發(fā)明的另一實施方案是包含乾向部分、接頭和用于誘導細胞死亡
的部分的RNA。所述RNA可以通過轉(zhuǎn)錄各自的DNA來獲得。
本發(fā)明還包括細胞、器官和非人動物，它們在用編碼所述本發(fā)明化 合物的核酸轉(zhuǎn)染后合成完整的化合物或其個體組分。
對于核酸部分抑制翻譯參與調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導途徑的基因的情況， 本發(fā)明包括器官和/或組織和/或用于將有生物活性的核酸轉(zhuǎn)運至靶細胞 的細胞特異性遞送栽體。
優(yōu)選地，所述核酸部分抑制細胞生存力重要基因的翻譯。本發(fā)明的 化合物可用作多種疾病的藥物，例如癌性或非癌性增生疾病、變態(tài)反應(yīng)、 自身免疫病和/或慢性炎癥。
本發(fā)明的化合物是異源綴合物，其包含至少兩個結(jié)構(gòu)域，即一個效 應(yīng)子結(jié)構(gòu)域和至少一個細胞特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的化合物可用于 疾病的診斷和治療。上文或下文引用的出版物、專利和專利申請通過參 考并入本文。
本發(fā)明的化合物是嵌合分子，其中靶向部分是細胞結(jié)合分子，可以 是適配體(特異性結(jié)合的DNA或RNA分子)，或者是與核酸部分化學 偶聯(lián)或遺傳融合的單克隆抗體或其片段，所述核酸部分由反義寡核苷 酸、siRNA或小RNA組成。術(shù)語"免疫RNA構(gòu)建體"是本發(fā)明的同 義詞。
本文使用術(shù)語的"靶向部分"代表本發(fā)明化合物的主動結(jié)合結(jié)構(gòu)， 其介導對疾病相關(guān)細胞表面標志物的特異性結(jié)合。靶向部分選自以下主 動結(jié)合結(jié)構(gòu)抗體或其衍生物或其片段、合成肽如scFv、 minitope，或 者化學分子如一價、二價或多價DNA或RNA適配體(特異性結(jié)合的核 酸分子或其衍生物)、碳水化合物、脂質(zhì)、肽、維生素等，和/或具有多 至100個原子的具有受體結(jié)合活性的小分子如配體(尤其是單原子的)， 肽分子、非肽分子等，和/或細胞表面碳水化合物結(jié)合蛋白及其配體(如 凝集素、r型凝集素、半乳凝素及其衍生物)、基質(zhì)蛋白、金屬蛋白酶和
/或受體結(jié)合分子如分化簇(CD)抗原(如CD30、 CD40等)的天然配體， 細胞因子如趨化因子、集落剌激因子、l型細胞因子、2型細胞因子、 千擾素、白介素、淋巴因子、單核因子等，和/或粘附分子(包括其突 變體和/或其衍生物)，或者任何上文列出的主動結(jié)合結(jié)構(gòu)的組合，所述 主動結(jié)合結(jié)構(gòu)結(jié)合CD抗原、細胞因子受體、激素受體、生長因子受體、 離子泵、通道形成蛋白。靶向部分也可選自以下被動結(jié)合結(jié)構(gòu)變應(yīng)原、 肽變應(yīng)原、重組變應(yīng)原、變應(yīng)原獨特型抗體、激發(fā)自身免疫的結(jié)構(gòu)、誘 導組織排斥的結(jié)構(gòu)、免疫球蛋白恒定區(qū)及其衍生物、突變體或其組合。 可以通過組合選自上述組中的至少兩個相同或不同的結(jié)合結(jié)構(gòu)來產(chǎn)生 具有更高價的靶向部分。
本文使用的術(shù)語"抗體"指多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、 單鏈抗體及其片段如Fab、 F(ab，)2、 Fv以及保留親本抗體結(jié)合功能和 特異性的其它片段。本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"指具有均質(zhì)抗體群 的抗體組合物。該術(shù)語不受限于抗體的物種或來源，也不旨在受其產(chǎn)生 方式的限制。該術(shù)語涵蓋完整的免疫球蛋白以及片段如Fab、 F(ab，)2、 Fv和保留抗體結(jié)合功能和特異性的其它片段。任何哺乳動物物種的單 克隆抗體均可用于本發(fā)明。然而在實踐中，抗體一般是大鼠或小鼠細胞 系的抗體，所述細胞系用于產(chǎn)生所需的雜交細胞系或雜交瘤以生產(chǎn)單克 隆抗體。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是人抗體。本文使用 的術(shù)語"人抗體"指免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)來自人免疫球蛋白序列。本文 使用的術(shù)語"單鏈抗體片段"(scFv)指如下制備的抗體確定結(jié)合抗體 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(重鏈和輕鏈二者)，并提供允許保留結(jié)合功能的連接部 分。這事實上形成了顯著截短的抗體，所述抗體僅具有與抗原結(jié)合所必 需的可變結(jié)構(gòu)域部分。單鏈抗體的測定和構(gòu)建由Ladner等描述于U.S. Pat. No. 4， 946， 778中。
本文使用的術(shù)語"適配體"指與靶細胞的細胞表面上的結(jié)構(gòu)特異性 結(jié)合的核酸分子，優(yōu)選地，適配體與細胞表面受體結(jié)合，所述受體在結(jié) 合后被內(nèi)化，從而介導本發(fā)明復合體的細胞類型特異性攝入。適配體可 以由DNA、 RNA或化學修飾的DNA或RNA組成。適配體可以通過被 稱作"通過指數(shù)式富集進行的配體選擇性進化(selective evolution of
ligands by exponential enrichment, SELEX)"的方法獲得。從核普酸 序列的多樣庫開始，通過反復多輪次的選擇和擴增來分離對其靶標具有 高親和力的分子。
本發(fā)明化合物的"核酸部分"代表核酸，所述核酸在該化合物進入 細胞后在細胞的胞質(zhì)溶膠中具有活性。本發(fā)明的這些核酸部分可以選自
其序列特異性地阻斷選定靶蛋白的蛋白質(zhì)合成的任何核酸分子類別。優(yōu) 選地，核酸部分選自兩個主要的核酸分子類別1.反義寡核苷酸(ODN) 2.短干擾RNA (siRNA)。如果核酸部分選擇為反義寡核苷酸，則它可 由單鏈DNA或RNA組成，所述單鏈DNA或RNA可以在其糖磷酸主 鏈上或在核堿基上被化學修飾。修飾可以是將磷酸二酯主鏈中非橋接的 氧原子替換為硫原子，以產(chǎn)生硫代磷酸酯鍵。反義寡核苷酸與靶蛋白 mRNA上的互補區(qū)退火，并通過RNase H介導的RNA/DNA雙鏈體切 割或通過位阻來阻斷翻譯。優(yōu)選地，反義寡核苷酸包含10到40個、更 優(yōu)選15-30個或17到25個堿基。另外，核酸部分也可以由肽核酸組成， 肽核酸是一類反義分子，其中糖磷酸主鏈被N-(2-氨乙基)-甘氨酸主鏈代 替。如果核酸部分選自siRNA類別，則它可由雙鏈RNA或化學修飾的 雙鏈RNA組成。為了提高核酸酶穩(wěn)定性，可以將化學修飾插入糖磷酸 主鏈中。修飾可以是將磷酸二酯鍵中的非橋接氧原子替換為硫原子，以 產(chǎn)生硫代磷酸酯鍵。核糖單元的2，-羥基可以替換成2，-氟原子或2，-甲 氧基或2，-乙氧基或2，-甲氧基乙基。RNA也可含有所謂的鎖核酸(locked nucleic acid)，其含有2，-0，4，-C-亞甲基-a-D-呋喃核糖基核苷酸 (2，-0，4，-C-methylene -a-D-ribofuranosyl nucleotide).
帶有這些修飾的核普酸在RNA序列兩條鏈中的任何位置均可插入。 優(yōu)選地，雙鏈RNA具有17至40個核苷酸的長度。
本文使用的術(shù)語"共價連接"指在靶向部分所包含反應(yīng)基團與核酸 部分所包含反應(yīng)基團之間的化學反應(yīng)中獲得的化學綴合，所述化學反應(yīng) 后兩個部分通過共價鍵連接。
共價鍵合可以用二硫鍵、胺鍵、酰胺鍵、磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯 鍵、醚鍵、硫醚鍵、碳碳鍵、酯鍵、腙鍵、卡巴肼鍵(carbazide linkage) 或氨基甲酸酯鍵來實現(xiàn)。
核酸部分可在兩條鏈中任一個的3，或5'端包含反應(yīng)基團。它可包含團。
如果靶向部分是蛋白質(zhì)，則其包含可用于偶聯(lián)或用接頭分子進行修 飾的氨基、巰基、羥基、羧基或糖部分。如果靶向部分是重組表達的蛋 白質(zhì)，則可以通過將人工氨基酸插入一級氨基酸序列來插入與上述不同 的反應(yīng)基團。這將導致核酸部分與靶向部分的定點綴合。
本文使用的接頭分子指合成分子，其與靶向部分或核酸部分反應(yīng)， 從而引入可用于共價偶聯(lián)這兩個部分的特殊反應(yīng)基團。
在交聯(lián)操作之前，可以用接頭分子在獨立的反應(yīng)中對靶向部分、核 酸部分或二者進行修飾。用于修飾靶向部分或核酸部分的接頭分子的選
擇取決于所使用的偶聯(lián)策略。
通過形成酰胺鍵而得到的綴合可以通過活化羧基并隨后與伯胺反 應(yīng)來介導?；罨瘎┛梢允嵌喾N碳二亞胺，如EDC(l-乙基-3-(3-二甲基氨 基丙基)碳二亞胺鹽酸化物)、EDAC (l-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳 二亞胺鹽酸化物)、DCC (二環(huán)己基碳二亞胺)、CMC (l-環(huán)己基-3-(2-嗎 啉代乙基)碳二亞胺)、DIC (二異丙基碳二亞胺)或Woodward's試劑K (N-乙基-3-苯基異嗯唑鏡-3，-磺酸鹽)。
活化的NHS-酯與伯胺的反應(yīng)也引起酰胺鍵的形成。
通過形成仲胺進行綴合可以通過胺與醛基反應(yīng)隨后用ff供體(如氰 基硼氫化鈉)還原來實現(xiàn)。
可以例如通過氧化糖部分或通過與SFB(琥珀酰亞胺基-對甲酰苯甲 酸酯)或SFPA (琥珀酰亞胺基-對甲酰苯氧基乙酸酯)反應(yīng)來引入醛。
通過形成二硫鍵進行綴合可以通過二硫化吡啶(pyridyldisulfide)介 導的巰基-二硫化物交換來完成。巰基的引入例如由Traut，s試劑(2-亞 氨基硫醇(2-Iminothiolane) )SATA(N-琥珀酰亞胺基S-乙酰硫代乙酸酯)、 SATP(琥珀酰亞胺基乙酰硫代丙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亞胺基3-(2-p比 咬基二硫代)丙酸酯)、SMPT (琥珀酰亞胺基氧代羰基-a-甲基-a -(2-吡啶
基二硫代)甲苯)、N-乙酰基高半胱氨酸硫代內(nèi)酯、SAMSA (S-乙?；鶐€ 基琥珀酸酐)、AMBH (2-乙酰胺-4-巰基丁酸酰肼)、胱胺(2,2，-二硫代雙 (乙胺)來介導。
通過形成硫醚鍵進行綴合可以通過含巰基的組分與含馬來酰亞胺 或碘代乙?；姆肿拥奶囟ǚ磻?yīng)來進行，或者通過環(huán)氧化物活化的把向 部分或核酸部分的反應(yīng)來進行。馬來酰亞胺基團可以通過以下化合物引 入靶向部分或核酸部分中SMCC (琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲 基)環(huán)己烷-l-羧酸酯)、磺基(sulfo) SMCC (磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-l-羧酸酯)、MBS (間馬來酰亞胺基苯甲?；?-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、磺基MBS (間馬來酰亞胺基苯曱酖基-N-磺基羥 基琥珀酰亞胺酯)、SMPB (琥珀酰亞胺基-4-(對馬來酰亞胺基)苯基)丁酸 酯)、磺基SMPB(磺基琥珀酰亞胺基4-(對馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯)、 GMBS (N-a-馬來酰亞胺基丁酰基-氧代琥珀酰亞胺酯)、碌基GMBS (N-a-馬來酰亞胺基丁基-氧代磺基琥珀酰亞胺酯)。
碘代乙?；梢允褂靡韵禄衔锊迦隨IAB (N-琥珀酰亞胺基(4-碘代乙?；?氨基苯甲酸酯)、磺基SIAB (磺基-琥珀酰亞胺基(4-碘代乙 酰基)-氨基苯甲酸酯)、SIAX (琥珀酰亞胺基6-[(碘代乙酰基-氨基)己酸 酯、SIAXX (琥珀酰亞胺基6-[6-(((碘代乙?；?氨基)-己酰基)氨基]己酸 酯)、SIAC (琥珀酰亞胺基4-(((碘代乙?；?氨基)曱基)-環(huán)己烷-l-羧酸 酯)、SIACX (琥珀酰亞胺基6國((((4-(碘代乙?；?氨基)甲基)-環(huán)己烷國1國 羰基)氨基)己酸酯)、NPIA(對硝基苯基碘代乙酸酯)。
通過形成氨基甲酸酯鍵得到的綴合可按以下進行將靶向部分或核 酸部分的羥基殘基與CDI (N，N，-羰基二咪唑)或DSC (N，N，-二琥珀酰亞 胺基碳酸酯)或N-羥基琥珀酰亞胺基氯曱酸酯反應(yīng)，隨后與存在于乾向 部分或核酸部分中的胺反應(yīng)。
靶向部分與核酸部分的交聯(lián)也可以通過向一個部分中引入光反應(yīng) 基團來實現(xiàn)。光反應(yīng)基團為芳基疊氮化物、卣代芳基疊氮化物、二苯曱 酮、某些重氮化合物和diazirine衍生物。它們與氨基或活化的氫鍵反 應(yīng)。
通過醚鍵進行綴合可以通過含環(huán)氧化物的分子與靶向部分或核酸
部分中羥基的反應(yīng)來介導。
如果把向部分是一價、二價或多價適配體，則RNA的兩條鏈通過 有義鏈3，末端的發(fā)夾環(huán)共價連接。如果乾向部分是適配體，則核酸部分 通過磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵連接。
選定的基因沉默核酸的序列由靶蛋白的mRNA序列確定。原則上 講，基因沉默核酸可以針對在細胞中表達的任何蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一個 目標是靶向細胞生存力必需蛋白質(zhì)的mRNA序列的基因沉默核酸。這 些蛋白質(zhì)的敲低會引起凋亡。與細胞結(jié)合部分組合，將有可能選擇性地 在多細胞生物的某些細胞中誘導凋亡。
凋亡可通過敲低編碼翻譯機器中重要因子的基因來誘導，所述因子 例如為人延伸因子2、核糖體或tRNA中發(fā)揮重要的催化功能的核糖體 RNA。蛋白質(zhì)合成水平的降低導致凋亡途徑的觸發(fā)，從而導致細胞死亡。
用于在靶細胞中誘導凋亡的第二種方法是敲低下調(diào)或抑制凋亡途 徑的蛋白質(zhì)，即所謂的抗凋亡蛋白。這些蛋白質(zhì)可以是內(nèi)部途徑(其通 過線粒體釋放細胞色素c和其后活化半胱天冬酶家族蛋白酶來傳導)或 外部途徑的部分。外部途徑由胞外死亡信號觸發(fā)，并通過直接活化多種 半胱天冬酶來傳導，而不涉及線粒體的酶。內(nèi)部途徑的潛在靶標是屬于 Bcl2家族的蛋白質(zhì)，如Bcl2、 Bcl畫XL、 Bcl-W、 Mcl-l、 Al、 Ced9、 E1B19K 或BHRF1。 一些Bcl-2結(jié)合蛋白也通過增強Bcl-2的效應(yīng)而包含抗凋亡 效應(yīng)，如Bag-l、 Raf-l、鉀依賴罅酸酶、Smn、 Beclin、 ANT和VDAC。 外部途徑受凋亡抑制劑(IAP)蛋白家族成員如IAP-1、 IAP-2、存活素和 x-IAP的負調(diào)節(jié)。這些蛋白質(zhì)抑制TNFa和CD-95所介導的凋亡，并且 也是半胱天冬酶活化的抑制劑。還可通過對破壞NF-kB信號轉(zhuǎn)導的蛋 白質(zhì)進行敲低來誘導凋亡，所述蛋白質(zhì)為IKK-a、 IkB或NF-kB自身。 FLIP蛋白通過在CD95觸發(fā)的死亡信號轉(zhuǎn)導中阻止半胱天冬酶8釋放 而發(fā)揮凋亡抑制劑作用。
另外，也可以通過抑制原癌基因(如Akt或Akt活化蛋白如PI3K 或PDK1)來誘導凋亡。
優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物是可溶的。術(shù)語"可溶的"指在重組表達聯(lián)步驟中)復合體在溶液中留存的能力。該術(shù)語也指從任何種類的摻入 載體中釋放后，該復合體在細胞中的狀態(tài)。
術(shù)語合成的指自然界中不存在的人造復合體。該術(shù)語也包含重組的 含義。
實施例
在第一種方法中，將化學修飾的siRNA與腫瘤細胞特異性抗體共價 偶聯(lián)，從而獲得本發(fā)明的化合物(免疫RNA構(gòu)建體)。
第二種方法是使用RNA適配體作為靶向部分實現(xiàn)細胞特異性。 siRNA部分通過短接頭序列與適配體遺傳融合。另外，將使用其中存在 兩個特異性結(jié)合的適配體部分的二價適配體siRNA綴合物。
兩個抗原結(jié)合位點的存在以及多于一個siRNA部分的存在將可能 提高所得構(gòu)建體的親和力以及生物活性。
乾向部分與乾受體結(jié)合后，構(gòu)建體被內(nèi)化，siRNA轉(zhuǎn)運至靶細胞的 胞質(zhì)溶膠，在此處其誘導序列特異性mRNA降解。該siRNA靶向作為 翻譯的重要組分的人延伸因子2。延伸因子2的"敲低"阻斷了蛋白質(zhì) 合成，這繼而引起細胞的凋亡。
材料和方法
序列
使用以下序列
SEQ ID NO 1: xPSM-A-3-siGFP:
GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGG CGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUGAAGCUUGGAACUUCAGGGUCAGCUUGCCG
SEQ ID NO 2: xPSM-A-3-SiEEF2
GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGG CAGCGCCAUCAUGGACAAGAAUUGAAGCUUCUUCUUGUCCAUGAUGGCGCGG
SEQ ID NO 3: S枉F2序列1
有義r(AGG CCU AUC UGC CCG UCA A)dTdT
反義r(UUG ACG GGC AGA UAG GCC U)dTdG
SEQ ID NO 4: s舊EF2序列2
有義r(GCG CCA UCA UGG ACA AGA A)dTdT
反義r(UUC UUG UCC AUG AUG GCG C〉dGdG
SEQ ID NO 5: A30 siGFP
GGGMUUCCGCGUGUGCCAGCGAAAGUUGCGUAUGGGUCACAUCGCAGGCACAU GUCAUCUGGGCGGUCCGUUCGGGAUCCUCGGAAGCUUGCAAGCUGACCCUGAAG UUCAUGAAGCUUGGAACUUCAGGGUCAGOJUGCCG
SEQ ID NO 6: A30 s狂F2
GGGAAUUCCGCGUGUGCCAGCGAAAGUUGCGUAUGGGUCACAUCGCAGGCACAU GUCAUCUGGGCGGUCCGUUCGGGAUCCUCGAAGCUAGCGCCAUCAUGGACAAGAA UU GAAGCUUCUUCULJGUCCAUGAUGGCGCGG
SEQ ID NO 7: siGFP
有義5'-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT
反義5'-GAACTTCAGGGTCAGCTTGCCG
SEQ ID NO 8: PSMBl-siEEF2
GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGG CUAAAAAUUGCGCCAUCAUGGACAAGAAUUAAUUAAGGGAGGACGAUGCGGAUCA GCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAAAAAUUCUUGUCCAUGA UGGCGCGGGAGCTCGAATT
SECJ ID NO 9: PSMB2-siEEF2
GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGG C眼AAUUAGGCCUAUCUGCCCGUCAAUUAAAAAUUGGGAGGACGAUGCGGAUCA GCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGCGCCAUCAUGGACAAG 磨UGMGCUUCUUCUUGUCCAUGAUGGCGCGGAAAAAAAUUGACGGGCAGAUAG GCC, GAGCTCGAATTSEQ ID NO 10: PSMA biv anneal siEEF2-l_
GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGG CUAAAAAUUGCGCCAUCAUGGACAAGAAUU
SEQ ID NO 11: PSMA biv anneal siEEF2-2
GGGAGGACGATGCGGATCAGCCATGTTTACGTCACTCCTTGTCAATCCTCATCGGCA AAAATTCTTGTCCATGATGGCGCGG
抗體、適配體和小干擾RNA
全長抗體Ki-4特異性結(jié)合存在于L540細胞表面的CD30受體。適 配體A30和xPSM-A-3顯示對存在于MCF-7細胞上的抗原Her3和存 在于LNCaP細胞上的PSMA (前列腺特異性膜抗原)的特異性結(jié)合。
對siRNA實驗而言，使用三種不同的序列針對EGFP的 siRNA(SEQ ID NO 7)、針對EEF2的兩種不同的siRNA序列(SEQ ID NO 3和4)。
為了將抗體與siRNA綴合，修飾siRNA以保護其不受RNAse消化 (SEQ ID 3和4 )。修飾siRNA的合成由Dharmacon (Chicago, USA)
進行o
為了將適配體與shRNA序列遺傳融合(裝配PCR)至，設(shè)計DNA 引物并由MWG-Biotech (Ebersberg， Germany)合成。
使用大腸桿菌XLl-blue (supE44 hsdR17 recAl endAl gyr A46 thi relAl lacF，[pro AB+ laclq lacZ AM15 TnlO(tetr))來增殖質(zhì)粒。真核表 達載體psecTag2B-GFP來自psecTag質(zhì)粒(Invitrogen, Carlsberg， USA) 并來自pmaxGFP質(zhì)粒(Amaxa， K61n， Germany).在Xhol/Nhel激酶結(jié) 構(gòu)域中切出PmaxGFP質(zhì)粒的GFP編碼序列，并粘貼進psecTag質(zhì)粒的 相同結(jié)構(gòu)域中。通過堿裂解法制備質(zhì)粒，并使用來自Qiagen, Hilden, Germany的質(zhì)粒制備試劑盒進行純化。通過水平瓊脂糖凝膠電泳分離限 制性片段并用QIAquick (Qiagen)提取。所有的標準克隆操作均如 Sambrook， J等，1989所述進行。細胞培養(yǎng)
在補充有10% (體積/體積)熱滅活胎牛血清、50pg/ml青霉素、100 照/ml鏈霉素和2 mM L-谷氨酰胺的復合培養(yǎng)基(RPMI 1640)中培養(yǎng)所 有的細胞系，包括CD30陽性細胞系L540Cy (Kapp， U.等，1992)和CD30 陰性細胞系MCF-7 (ATCC， VA, USA)、 LNCaP (DSMZ, Germany)和 293T (ATCC)。所有的細胞均在37^0下在空氣氣氛中的5% C02中培^。 細胞系L540、 MCF-7和LNCaP也以含有載體psecTag2B-GFP的轉(zhuǎn)染 形式使用，所述載體非常強烈地表達GFP蛋白。為了選擇轉(zhuǎn)染細胞， 添加Zeocin (Invitrogen， Carlsbad, USA)至100 pg/ml的終濃度。
免疫RNA構(gòu)建體的構(gòu)建和合成
psecTag2B-GFP的克隆和表達
為了構(gòu)建載體，通過限制性位點XhoI/Nhel切出GFP編碼序列。 XhoI/Nhel消化后，將經(jīng)限制性處理的片段分別克隆進經(jīng)相同限制性酶 消化的真核表達載體psecTag2B。通過序列分析確認所得到的編碼GFP 的重組構(gòu)建體psecTag2B-GFP 。 GFP在使用核轉(zhuǎn)染(nucleofection) (Amaxa)轉(zhuǎn)化進L540、 MCF-7和LNCaP細胞后強烈表達。簡言之，根 據(jù)生產(chǎn)商的方案，對6孔細胞培養(yǎng)板使用2 pg質(zhì)粒DNA和100 jil核轉(zhuǎn) 染液。
通過計數(shù)綠色熒光細胞測定轉(zhuǎn)染效率在33-卯％之間。然后將轉(zhuǎn)染 細胞轉(zhuǎn)移進中等大小的細胞培養(yǎng)瓶(Nunc; 85m"中，并在補充有100 將/mlZeocin的RPMI復合培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 一到兩周后，有效轉(zhuǎn)染的克 隆發(fā)出綠色熒光。通過轉(zhuǎn)種這些克隆來建立轉(zhuǎn)染細胞群。
全長抗體Ki4與針對GFP的siRNA(SEO ID NO l)以及針對EEF2的 siRNA(SEO ID NO 4)綴合
對于抗體與siRNA序列之一的偶聯(lián)而言，RNA與蛋白質(zhì)共價連 接。通過Trauts試劑(2-Iminothiolane)活化抗體，從而在蛋白質(zhì)中引入 游離的巰基。通過4吏用nanosep 10k離心柱(Pall biosciences)進行脫鹽來 去除過量的Trauts試劑。通過與SPDP(N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡哽基二 硫代)丙酸酯)反應(yīng)進行siRNA的活化。使用centrispin 10k離心柱(EMP
biotech，Berlin)通過凝膠過濾去除未反應(yīng)的SPDP。對于交聯(lián)反應(yīng)而言， 以10倍過量的摩爾數(shù)向硫醇化抗體中添加活化的siRNA。在室溫下過 夜進行交聯(lián)。為了去除未綴合的siRNA，將溶液離心通過nanosep 100k 離心柱(Pall biosciences, East Hills NY, USA)。在將該構(gòu)建體用于體外毒 性測定之前，將所有的樣品進行無菌過濾。
適配體A30和xPSM-A-3與針對GFP的siRNA(SEO ID NO 5和l)和針 對EEF2的siRNA ( SEO ID NO 6和2 )遺傳融合
為了合成適配體-間隔區(qū)-siRNA構(gòu)建體，通過基于網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計算 法來設(shè)計特異性DNA引物，并由MWG-Biotech合成，所述算法稱為 裝配PCR寡聚標記(assembly PCR oligo maker)。使用所有四種引物的 初始裝配PCR后，使用兩種側(cè)翼引物擴增全長DNA。最后通過體外轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)生RNA序列。將反應(yīng)物在8%的尿素PAGE凝膠上純化，通過UV 造影(UV shadowing)使RNA條帶可見并切下。之后從凝膠條中抽提 RNA。
因為適配體的正確折疊對其結(jié)合是很重要的，所以將構(gòu)建體在95 1C加熱3分鐘，最后在37"孵育30分鐘。計算一個轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)率， 之后通過260 nm處的UV吸光度來測定濃度。
二價適配體構(gòu)建體PSMBl-siEEF2 、 PSMB2-siEEF2與PSMA bivl anneal 1和PSMA biv anneal 2 (SEO ID NO 8、 9和10和ll)遺傳融合
由GENEART AG (Regensburg)合成PSMB1和PSMB2的DNA 序列，并使用5， Kpnl 3， Sacl限制性位點克隆進pUC19栽體中。使用 Durascribe T7轉(zhuǎn)錄試劑盒，通過run off體外轉(zhuǎn)錄由EcoRI消化的質(zhì)粒 DNA作為模板獲得RNA序列。如上所述純化RNA，得到如下的RNA 序列，其中由間隔區(qū)序列分隔的兩個適配體官能度與針對EEF2的 siRNA融合。
DNA模板PSMA biv anneal 1和2均使用互補性退火寡聚物通過 裝配PCR產(chǎn)生。使用Durascribe T7轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄。純化兩 種RNA片段后在退火反應(yīng)中使其彼此融合，所述退火反應(yīng)中互補的3， 突出端退火，從而形成二價的退火適配體。就退火而言，以等摩爾比合
并兩種單體并在95°C:加熱3分鐘，然后緩慢冷卻至37°C。 流式細胞術(shù)分析
使用FACSCalibur流式細胞儀和CellQuest軟件(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)來評價免疫RNA構(gòu)建體的細胞結(jié)合活 性。用結(jié)果中所述的FITC標記構(gòu)建體染色細胞(25)。簡言之，對每個 樣品收集一萬個事件，并使用適當?shù)纳⑸溟T控(scatter gate)進行完整細 胞分析，以排除細胞碎片和聚集體。將2-5*105個細胞與10ul濃度為 10-100nM的蛋白質(zhì)-RNA構(gòu)建體或RNA-RNA構(gòu)建體一起在水上孵育 30分鐘。用含有0.2% (重量/體積)BSA和0.05% (重量/體積)疊氮 化鈉(PBA)的lxpBS緩沖液將細胞洗滌兩次。最后一次洗滌后，在 FACScalibur (Becton Dickison, Heidelberg, Germany)上分析細胞。
通過流式細胞術(shù)進行的親和力分析
使用基于流式細胞術(shù)的平衡結(jié)合測定來測定所產(chǎn)生構(gòu)建體的結(jié)合 親和力。對恒定量的細胞使用濃度遞增的Fluoresceine標記適配體構(gòu)建 體。對于流式細胞術(shù)分析而言，將細胞在冰上暗中孵育20分鐘。用1 xPBS將細胞洗滌兩次并重懸于500uL 1*PBS中用于FACS分析。收 集一萬個事件并使用適當?shù)纳⑸溟T控進行分析，以排除聚集體和細胞碎 片。通過用Fll方向的平均熒光遷移對對數(shù)適配體濃度作圖來產(chǎn)生結(jié)合 曲線。
比色法細胞增殖測定
首先用來自BD Biosciences (Franklin Lakes, USA)的Annexin V 凋亡試劑盒進行凋亡分析，其中可記錄特定siRNA的輕微影響(數(shù)據(jù) 未顯示)。通過某些形態(tài)學特征來表征凋亡途徑，包括質(zhì)膜不對稱性和 附著的喪失、細胞質(zhì)和細胞核的凝聚以及DNA的核小體間切割。 Annexin V-FITC是用于鑒定凋亡細胞的靈敏探針。其以高于多數(shù)其它 磷脂的磷脂酰絲氨酸(PS)特異性結(jié)合帶負電的磷脂表面。如Annexin V-FITC染色方案中所述，Annexin V-FITC結(jié)合需要確定的鉀和鹽濃 度。純化的重組Annexin V在最適條件下與FITC綴合。使用被誘導 為發(fā)生凋亡性細胞死亡的原代細胞或細胞系來常規(guī)地測試Annexin
V-FITC。對600 fil完全培養(yǎng)基等分試樣中的2-4 x 104個靶細胞應(yīng)用確 定濃度的免疫RNA構(gòu)建體，并將板在371C孵育48小時。之后根據(jù)制 造商的說明進行分析。
如Barth， S.等2000所公開的，通過測量黃色四唑鹽(XTT)到水溶 性橙色甲月替染料的代謝來測定免疫RNA構(gòu)建體對靶細胞的細胞毒效 應(yīng)。向96孔板中100 nL完全培養(yǎng)基中的2-4 x 104個耙細胞添加100 pL 完全培養(yǎng)基中不同稀釋度的蛋白質(zhì)-RNA構(gòu)建體和RNA-RNA構(gòu)建體， 使得最終測試體積為200 pL。隨后將平板在37X:下孵育48小時。之后 用100 jil補充有XTT/PMS (終濃度分別為0.3 mg/mL和0.383 ng )的 新鮮培養(yǎng)基將細胞培養(yǎng)物脈沖處理24小時。用ELISA讀數(shù)計(MWG Biotech)在450 nm和650 nm (參照波長)處測量樣品的分光光度吸收。
測定達到相對于未處理的對照細胞而言蛋白質(zhì)合成降低50%(1<:5。)所需 的濃度。所有的測量一式三份進行。
還通過OPERA Sytem (Evotec technologies)證實免疫RNA構(gòu)建 體的效果。OPERA是一種新型共聚焦微孔板成像讀數(shù)器，其提供用于 全自動高速高分辨率篩選的溶液。高分辨率的關(guān)鍵是嚴格地共聚焦成像 和水浸透鏡的使用。實驗的過程與上述XTT-生存力測定之一相同。將 2-4乂104個乾細胞以100 pl的等分試樣分散在96孔板中。添加完全培 養(yǎng)基中Ki-4 RNA構(gòu)建體的100 pl等分試樣，并將板在37C孵育96小 時。將免疫RNA構(gòu)建體Ki-4-siRNA應(yīng)用于靶細胞之后，就細胞形態(tài)的 改變和偶聯(lián)siRNA (在該情況下為針對EEF2和GFP的siRNA)的沉 默效果來分析細胞。對于最終的測量而言，將細胞與DRUG5 (才艮據(jù)制 造商方案使用) 一起孵育以顯示細胞增殖。所有的測量一式三份進行。
結(jié)果
評價RNAi對真核延伸因子2的毒性
評價核酸部分(siRNA)
敲低綠色熒光蛋白(EGFP)
為了建立用于一般性評價siRNA沉默活性的參考體系，將不同濃 度的siEGFP轉(zhuǎn)染進用eGFP(293-LGFP-KMH)轉(zhuǎn)化的293T細胞中。48
小時后通過流式細胞術(shù)分析細胞，檢測到eGFP信號被敲低至約60%。
敲低真核延伸因子2 (EEF2)
對應(yīng)于上述的結(jié)果，使用相同濃度的針對EEF2的siRNA轉(zhuǎn)染 293T、 MCF-7、 LNCaP和L540細胞。所有的轉(zhuǎn)染實驗均使用一種用 于siRNA轉(zhuǎn)染的特殊脂轉(zhuǎn)染溶液——由Qiagen⑧提供的RNAifect 。
因為延伸因子2的敲低會抑制蛋白質(zhì)合成并會導致細胞死亡，所 以通過體外細胞毒性測試(XTT生存力測定)來評價siRNA的效力。 siRNA轉(zhuǎn)染后48小時，在ELISA-讀數(shù)器上通過測量450 nm(Ll)和650 nm(L2)處的吸光度(減少Ll-L2 )來分析細胞的生存力。所有的實驗一 式三份進行。
在所有四種靶細胞系中均觀察到，計算出的50%細胞生存力時的 中位數(shù)抑制濃度(ICso)均為0.9和1.1 pg/ml之間(

圖1-4 )。
免疫RNA構(gòu)建體的i殳計
蛋白質(zhì)-siRNA構(gòu)建體
將乾向淋巴瘤細胞上CD30的全長抗體Ki-4與針對EGFP或真核 延伸因子2(EEF2)的siRNA共價偶聯(lián)。
通過形成二硫橋?qū)NA與抗體綴合在綴合反應(yīng)前，用異雙功 能接頭SPDP(N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)修飾在其3， 末端含有反應(yīng)性氨基的合成siRNA。通過與Trauts試劑(2-Iminotholane) 的反應(yīng)將游離的巰基插入抗體中。最后簡單地混合兩種活化部分，通過 吡咬基二硫化物交換反應(yīng)實現(xiàn)共價綴合。
全RNA構(gòu)建體
評價針對EEF2的siRNA之后，通過使用短接頭序列的裝配PCR 將其與適配體部分(靶向HER3的A30和靶向PSMA的xPSM-A-3 ) 遺傳融合。用短發(fā)夾環(huán)連接siRNA的有義和反義鏈，從而允許從單個 DNA鏈合成適配體shRNA構(gòu)建體。
構(gòu)建體設(shè)計中最重要的一點是確保適配體區(qū)域的正確折疊(作為
結(jié)合的必要條件)和siRNA的正確折疊(作為誘導特異性mRNA降解 的必要條件)。最終的構(gòu)建體由獨立地折疊成其天然構(gòu)象而不受shRNA 部分影響的適配體區(qū)域組成。這可通過在適配體序列的3，末端插入短接 頭序列來實現(xiàn)(圖5和圖6)。
成功的PCR裝配后，通過DNA序列分析確認DNA序列。
為了獲得相應(yīng)的RNA序列，進行體外轉(zhuǎn)錄并隨后通過凝膠電泳 (8%尿素PAGE凝膠)純化產(chǎn)物。 一次體外轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)率通常在約15將 RNA的范圍內(nèi)。因為適配體的正確折疊是其結(jié)合活性所必需的，所以 在所有的實驗前將RNA在95t:加熱5分鐘并最后在37X:孵育15分鐘， 以允許形成正確的三級結(jié)構(gòu)。
二價適配體siRNA構(gòu)建體
為了提高適配體siRNA融合構(gòu)建體的價，以兩個適配體官能度均 最有可能折疊成其天然構(gòu)象的方式插入第二個適配體寡核苷酸序列。使 用MFold 3.2 (http:〃molbio.info.nih.gov/molbio-nih/mfold.htinl) RNA 折疊算法對所設(shè)計的二價RNA構(gòu)建體進行的二級結(jié)構(gòu)分析顯示，在兩 種構(gòu)建體(PSMBl-siEEF2以及PSMB2-siEEF2)中，兩個適配體部分 均采取與單體適配體x-PSM-A-3相同的二級結(jié)構(gòu)。另外，這些結(jié)構(gòu)是 兩種構(gòu)建體均具有最低的計算自由能(AG)的結(jié)構(gòu)(圖7和圖8)。
除了 PSMBl-siEEF2和PSMB2-siEEF2外，設(shè)計了第三種構(gòu)建體， 其中使用與siRNA部分相似的互補性3，突出端，通過Watson Crick堿 基配對將兩個適配體部分融合(圖9)。
測試全RNA構(gòu)建體的特異性沉默效果
為了測試適配體-shRNA構(gòu)建體的特異基因沉默功能，通過脂轉(zhuǎn) 染法將三種不同的RNA構(gòu)建體(兩種針對GFP， 一種針對EEF2)轉(zhuǎn) 染進293-LGFP-KMH細胞中。使用針對GFP和EEF2的siRNA作為 陽性對照。
令人驚奇的是，盡管在適配體-shRNA構(gòu)建體的情況中siRNA與 適配體共價連接，但是適配體-shRNA構(gòu)建體與未綴合siRNA的效果幾
乎相同。因此，共價附著的適配體不影響siRNA部分的基因沉默活性。
在圖10中，顯示了在轉(zhuǎn)染針對GFP的適配體構(gòu)建體和siRNA后， 293-LGFP-KMH細胞中降低的GFP表達(約60% )。使用碘化丙錠染 色來檢測凋亡細胞的量。轉(zhuǎn)染后48小時，通過流式細胞術(shù)分析用適配 體-shRNA構(gòu)建體以及siEEF2轉(zhuǎn)染并用碘化丙錠染色的細胞(圖11 )。 將細胞用冷的lxPBS洗滌兩次并最終重懸于500 pl lxpBS的樣品量 中。與未轉(zhuǎn)染細胞相反，在含siRNA的轉(zhuǎn)染樣品中檢測到大量凋亡細 胞。
抗體、適配體、蛋白質(zhì)-RNA構(gòu)建體和全RNA構(gòu)建體的結(jié)合特性 適配體A30
分析適配體A30對MCF-7細胞上Her3的結(jié)合親和力。使用細胞 系L540 (Her3陰性)作為陰性對照。RNA被3，氧化并用FITC標記， 這使得可以通過流式細胞術(shù)分析與細胞的結(jié)合。我們使用不同濃度的 FITC標記適配體A30，并平行4吏用抗體抗Her3 (特異性結(jié)合Her3 )， 因為使用了 GAMIgGPE(結(jié)合抗Her3抗體的fc部分)作為第二抗體。 將細胞用冷的lxPBS洗涂兩次，重懸于500 jillxpBS中，并與不同 濃度的FITC標記A30在暗中孵育30分鐘，或與第 一抗體抗Her3孵育。 第一個孵育步驟后用冷的1 xPBS洗滌細胞兩次，并在與FITC標記的 A30孵育后重懸于500 jtl lxpBS中并通過流式細胞術(shù)分析(示于圖 12)，或者在與抗Her3孵育后重懸于500 pl 1 x PBS中并與第二抗體 GAM IgG PE在暗中孵育30分鐘。第二個孵育步驟后，用lxpBS再 次洗滌細胞，重懸于500 pl 1 x PBS中，最后通過流式細胞術(shù)分析(示 于圖13)。
為了確保A30與MCF-7細胞上的抗原Her3特異性結(jié)合，測試適 配體在L540細胞上的結(jié)合親和力，其中檢測不到結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。
測試適配體的結(jié)合后，通過流式細胞術(shù)分析A30的適配體-shRNA 融合構(gòu)建體(示于圖14)。對該實驗而言，通過臨進行FACS分析前濾 過lOO]iun篩目來分離細胞，這得到更均質(zhì)的細胞群。
為了顯示適配體-shRNA構(gòu)建體的特異性，還在L540細胞上對其
進行測試，其中看不到構(gòu)建體的結(jié)合(示于圖15)。
適配體xPSM-A-3
如文獻中所述，適配體xPSM-A-3與LNCaP細胞表面上表達的 抗原PSMA (前列腺特異性膜抗原)特異性結(jié)合。為了顯示適配體即使 與shRNA遺傳融合仍以高特異性與抗原結(jié)合，對兩種RNA(xPSM-A-3 和xPSM-A-3-siGFP )均進行FITC標記，并分析其與LNCaP和MCF國7 (PSMA陰性)細胞的結(jié)合(圖16-17)。使用針對PSMA的特異性第一抗 體(抗PSMA)作為陽性對照，用第二抗體GAM IgG FITC (結(jié)合抗 PSMA抗體的fc部分)驗證細胞膜上PSMA的表達(圖18和19 )。如 上文所述制備和分離細胞。
由于流式細胞術(shù)分析的結(jié)果(其中在MCF-7細胞的直方圖中也能 看到FITC標記的適配體和適配體-shRNA構(gòu)建體的小遷移)，在熒光顯 微鏡下進一步分析細胞。
圖20顯示FITC標記的RNA-構(gòu)建體對LNCaP細胞表面的顯著 染色，使得染色細胞的形狀清晰可見。
相反，PSMA陰性細胞系MCF-7不被RNA-構(gòu)建體結(jié)合。輕微的 背景是由殘余的游離熒光素引起的。
最后能夠確定shRNA部分(核酸部分)與適配體xPSM-A-3或 A30 (復合體的靶向部分)的遺傳融合不影響結(jié)合活性。在xPSM-A-3 (其針對存在于LNCaP細胞的細胞表面上的前列腺特異膜抗原 (PSMA))和A30 (其針對MCF-7細胞表面上表達的抗原Her3 )的情 況下，兩種復合體均顯示結(jié)合特異性。
在基于流式細胞術(shù)的平衡結(jié)合測定中測定x-PSM-A3 siEEF2的親 和力。在圖21中用平均熒光強度(其在fll方向上以任意的熒光單位測 量)對熒光素標記適配體的濃度作圖。對數(shù)據(jù)進行S形擬合后，可以測 定在LNCaP細胞表面上觀察到的解離常數(shù)(Kd)為26.7 nM。
二價適配體構(gòu)建體PSMBl-siEEF2、PSMB2-siEEF2和PSMA biv anneal
二價適配體siRNA構(gòu)建體PSMBl-siEEF2和PSMB2-siEEF2的
特異性結(jié)合也通過流式細胞術(shù)證明。將熒光素標記的適配體構(gòu)建體與
2*105個細胞在300 nM的濃度下孵育，然后通過流式細胞術(shù)分析樣品。 如圖22所示，兩種二價適配體構(gòu)建體均顯示了在fll方向上的顯著遷移， 所述遷移與一價xPSM-A-3的遷移相當。這些結(jié)果清楚地表明，二價適 配體的適配體部分折疊成引起特異性抗原識別的活性構(gòu)象。
如上所述，二價適配體PSMA biv anneal是通過Watson crick堿 基配對形成的。因此，兩種單體在流式細胞術(shù)分析之前退火。以l:l的 比例將兩種單體在1 x PBS緩沖液中混合并在94"C加熱4分鐘，隨后緩 慢冷卻至37X:。形成的復合體在尿素PAGE凝膠中以約200個堿基的 預期大小電泳(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了證明二價適配體構(gòu)建體的特異性結(jié)合，在FACS分析之前對 形成二價構(gòu)建體PSMA biv anneal的兩種單體均進行熒光素標記，并在 雜交反應(yīng)中接合。如上所述制備細胞并使用300 nM濃度的退火二價適 配體。圖23顯示LNCaP細胞上FL1方向的顯著遷移。這表明兩種適 配體官能度均折疊為其天然構(gòu)象，使得二價適配體結(jié)合存在于LNCaP 細胞的細胞表面上的PSMA抗原。
像一價適配體構(gòu)建體x-PSM-A3 —樣，也在基于流式細胞術(shù)的平 衡結(jié)合測定中測定該二價適配體構(gòu)建體的親和力。圖24顯示S形曲線， 所述曲線得自用fll方向觀察到的平均熒光對熒光素標記PSMA的濃度 作圖?？蓽y定該退火二價適配體對LNCaP細胞細胞表面的親和力(Kd) 為46.5 nM。
全長抗體Ki-4
抗體Ki-4以高親和力結(jié)合存在于例如L540細胞上的CD30受體。 如文獻中所述，該抗體與CD30結(jié)合后觸發(fā)受體介導的胞吞作用。這是 抗體有可能轉(zhuǎn)移進胞質(zhì)溶膠中的原因。為了評價Ki-4與siRNA偶聯(lián)后 的結(jié)合親和力，將L540細胞與蛋白質(zhì)-siRNA構(gòu)建體Ki-4-siEEF2以及 與未綴合的全長抗體Ki-4一起孵育(示于圖25)。使用CD30陰性細胞 系293T作為陰性對照，與相同量的Ki-4-siEEF2和Ki-4 一起孵育(示 于圖26)。如上所述制備細胞并通過流式細胞術(shù)分析。最后，可觀察到 siRNA (核酸部分)與全長抗體(靶向部分)的共價偶聯(lián)不影響所得構(gòu)
建體的結(jié)合活性。
siRNA構(gòu)建體(免疫RNA構(gòu)建體)A30-siEEF2、 xPSM-A-3-siEEF2和 Ki-4-siEEF2的毒性分析
對應(yīng)于免疫RNA構(gòu)建體被動轉(zhuǎn)染進細胞后記錄的RNAi效應(yīng)以及 特異性結(jié)合分析，必須分析構(gòu)建體對其靶細胞的毒效應(yīng)。為了在體外表 征包含靶向區(qū)(作為靶向部分)和RNA (作為核酸部分)的免疫RNA 構(gòu)建體的細胞毒活性，在分別與不同濃度(0.2-0.31111101)的免疫RNA構(gòu) 建體Ki-4-siGFP、 Ki誦4-siEEF2、 xPSM-A-3-siGFP、 xPSM-A-3國siEEF2、 A30-siGFP和A30-siEEF2孵育后評價乾細胞的增殖。使用基于XTT的 比色測定來記錄細胞系MCF-7 (HER3陽性)、L540 (CD30陽性)和 LNCaP (PSMA陽性)的生長抑制。XTT生存力測定提供了關(guān)于與免疫 RNA構(gòu)建體孵育一段時間后測試細胞生存力的信息。最后，將XTT-Phenancin溶液加入在接下來的96小時中進行分析的細胞中(圖27、 29和30 )。
測定在96孔板中進行，并以ELISA讀數(shù)器中在450 nm(Ll)和650 nm(L2)波長處測量(減少Ll-L2 )。
如果將細胞與相同濃度的免疫RNA構(gòu)建體A30-siEEF2或游離 siEFF2 —起孵育，則能觀察到細胞生存力的顯著差異(圖27)。
另外，在顯微鏡下研究MCF-7細胞(圖28)。與XTT-生存力測 定的結(jié)果一致，在與A30-siEEF2孵育的細胞樣品中可觀察到顆粒細胞 數(shù)目(細胞凋亡的指示劑)的增加。
在兩種免疫RNA構(gòu)建體Ki4-siEEF2和xPSM-A-3-siEEF2的情況 下，可以以細胞類型選擇性方式誘導增殖抑制。Ki4-siEEF2導致L540 細胞的生存力降低多達70% (圖30)，而xPSM-A-3-siEEF2使增殖降 低多達50% (圖29)。
CD30及PSMA為陰性的細胞系MCF-7在后兩種情況下均不受免 疫RNA構(gòu)建體xPSM-A-3-siEEF2和Ki-4-siEEF2之一的影響(數(shù)據(jù)未 顯示)。使用多至10將/ml的濃度。因此復合體的靶向部分(結(jié)合CD30 的Ki-4和結(jié)合PSMA的抗PSMA)為完整的免疫RNA構(gòu)建體賦予了
特異性。
除了 XTT生存力測定的結(jié)果外，在Opera System (Evotec Technologies, Hamburg, Germany)中研究細胞。Opera是高通量成寸象系 統(tǒng)，其能夠詳細顯示應(yīng)用Ki-4-RNA-構(gòu)建體后細胞的形態(tài)改變。使用 Drug5通過核染色來染色細胞，以顯示整個細胞，最后在40.000倍分辨 率下觀察。與用Ki-4-siGFP或游離siEEF2孵育的細胞相反，用 Ki-4-siEEF2處理的細胞顯示提高的凋亡細胞數(shù)(圖31，圖片1至9 )。 在圖片1中顯示了正常生長條件下的L540-GFP細胞。圖片2顯示用 1.5|til RNAiFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen GmbH)處理的L540-GFP細胞。在圖 片3中，用約3pg Ki-4-siEEF2處理細胞，并顯示構(gòu)建體對形狀和生存 力的顯著影響。圖片4顯示與相同濃度的蛋白質(zhì)構(gòu)建體一起孵育的細胞， 但是siRNA的沉默效應(yīng)是針對GFP。這時看不到細胞形態(tài)學和生存力 的改變，但是GFP表達似乎降低了 。圖片5和6顯示用0.2nmo1針對 EFF2或GFP的siRNA以及1.5jil RNAiFect進行轉(zhuǎn)染的細胞作為陽性 對照。相應(yīng)于轉(zhuǎn)染的RNA量，圖片7和8顯示0.2nmol游離siRNA的 效果。該RNA不以任何方式影響細胞。作為XTT-生存力測定的陽性對 照，將細胞在添加了 lOOpg/mlZeocin的1640培養(yǎng)基中解育。
基于RNA的siRNA構(gòu)建體在LNCaP細胞上的定量增殖測定
為了進一步表征一價適配體siRNA構(gòu)建體并將其與二價適配體 siRNA構(gòu)建體PSMA-B1和PSMA-B2進行比較，以定量方式進行上述 增殖測定。因此，在從2 下至0.0022 濃度的范圍內(nèi)監(jiān)測所有 siRNA適配體融合物的濃度依賴性細胞毒性。所有的構(gòu)建體均在三個獨 立的實驗中一式三份進行測量。將得到的計量應(yīng)答曲線就ECso值和獲 得的最大應(yīng)答進行比較。
結(jié)果示于圖32。與一價構(gòu)建體x-PSM-A-3 siEEF2相比，兩種二 價適配體構(gòu)建體PSMABl和PSMAB2均顯示顯著更高的最大應(yīng)答，表 明細胞毒性顯著提高。另外，兩種二價構(gòu)建體均顯示顯著更低的EC50 (PSMBl-siEEF2: 0.517 jtM, PSMB2國siEEF2: 0.211 xPSM-A-3 siEEF2:1.51pM)值，這是另一效率更高的參數(shù)。綜上，這些結(jié)果清楚 地表明，價的提高引起細胞毒效力的改進。
如果對PSMBl-siEEF2和PSMB2 siEEF2進行比較，必須聲明兩 種構(gòu)建體的最大應(yīng)答是在相同的范圍內(nèi)，但是如果比較相應(yīng)的ECs。值， 則可顯示顯著的差異(PSMBl-siEEF2: 0.5174 ± 0.1246 ^M; N=3; PSMB2國siEEF2: 0.2115 ± 0.01282 pM N=4; p: 0.0336 * )。因為兩種構(gòu)建 體僅在于RNA中存在的siRNA/^列數(shù)上有所不同(PSMBl-siEEF2 = 一個siRNA部分，PSMB2-siEEF2-兩個siRNA部分)，所以該結(jié)果清 楚地表明，這些構(gòu)建體的整體效力取決于siRNA的化學計量。
所有的效應(yīng)都是細胞類型選擇性的，因為本文所示的免疫RNA構(gòu)建 體不在PSMA陰性MCF-7細胞中誘導任何細胞毒效應(yīng)(圖33 )。參考文獻
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權(quán)利要求
1.一種化合物，其包含-靶向部分，其特異性結(jié)合與疾病相關(guān)的細胞表面標志物，-核酸，其特異性誘導細胞死亡，和-接頭，其將所述靶向部分與所述核酸部分共價連接。
2. 權(quán)利要求l的化合物，其中接頭為二硫鍵、磷酸二酯鍵、硫代 磷酸酯鍵、酰胺鍵、胺鍵、硫醚鍵、醚鍵、酯鍵或碳-碳鍵。
3. 權(quán)利要求1或2的化合物，其中所述靶向部分是核酸或多肽。
4. 權(quán)利要求1至3中任一項的化合物，其中所述靶向部分是細胞表 面受體的結(jié)合配體。
5. 權(quán)利要求1至4中任一項的化合物，其中所述靶向部分是至少一 個適配體、抗體、雙抗體或者抗體的衍生物或片段。
6. 權(quán)利要求5的化合物，其中所述靶向部分由至少兩個適配體代表。
7. 權(quán)利要求1至6中任一項的化合物，其中所述靶向部分選自碳水 化合物、脂質(zhì)、維生素、小受體配體、核酸、細胞表面碳水化合物結(jié)合 蛋白及其配體、凝集素、r型凝集素、半乳凝素、分化簇(CD)抗原的配 體、CD30配體、CD40配體、細胞因子、趨化因子、集落刺激因子、1 型細胞因子、2型細胞因子、干擾素、白介素、淋巴因子、單核因子、 上述任一項的突變體、衍生物和/或組合。
8. 權(quán)利要求1至7中任一項的化合物，其中所述與疾病相關(guān)的細胞 表面標志物選自CD抗原、細胞因子受體、激素受體、生長因子受體、 離子泵、通道形成蛋白、多聚體的細胞外基質(zhì)蛋白、金屬蛋白酶、Her3 或PSMA。
9. 權(quán)利要求1至8中任一項的化合物，其中所述靶向部分與靶細胞 的細胞表面受體結(jié)合，并介導其后該化合物轉(zhuǎn)運進入靶細胞的胞質(zhì)溶 膠。
10. 權(quán)利要求9的化合物，其中所述核酸部分在該化合物轉(zhuǎn)運進入 靶細胞后誘導靶細胞的細胞死亡。
11. 權(quán)利要求1至10中任一項的化合物，其中所述核酸部分為siRNA、 shRNA、反義DNA或RNA、 dsRNA或miRNA。
12. 權(quán)利要求1至11中任一項的化合物，其中所述核酸部分的核酸 包含10到40個堿基對或堿基。
13. 權(quán)利要求1至12中任一項的化合物，其中所述核酸部分特異性 地抑制真核延伸因子2(eEF-2)或其任何同系物或類似物的活性。
14. 權(quán)利要求1至13中任一項的化合物，其中所述核酸部分特異性 地抑制凋亡抑制劑的活性，所述凋亡抑制劑為例如Bc12、 Bcl-XL、 Bcl-W、 Mcl國l、 Al、 Ced9、 E1B19K或BHRF1、 Bag-l、 Raf-l、鉤依 賴磷酸酶、Smn、 Beclin、 ANT和VDAC、 IAP-1、 IAP-2、存活素、x-IAP、 IKK-a、 IkB或NF畫kB、 FLIP、 PI3K或PDK1。
15. 權(quán)利要求l的化合物，其包含由磷酸二酯鍵或疏代磷酸酯鍵連 接的適配體和核酸。
16. 權(quán)利要求1的化合物，其包含由二硫鍵連接的抗體和RNA。
17. 權(quán)利要求15的化合物，其由RNA組成。
18. 權(quán)利要求l的化合物，其中所述核酸部分不誘導細胞死亡，但 是下調(diào)靶細胞調(diào)節(jié)途徑中特定的關(guān)鍵元件。
19. 編碼權(quán)利要求17的RNA的DNA。
20. 轉(zhuǎn)染了權(quán)利要求17或19的RNA或DNA的細胞、器官或非人 動物《
21. 權(quán)利要求1至18中任一項的化合物，其還包含允許純化和/或 檢測該化合物、便于該化合物轉(zhuǎn)運進入靶細胞和/或在其中進行胞內(nèi)分 離和/或活化所述核酸的部分。
22. 藥物，其包含權(quán)利要求1至17中任一項的化合物、權(quán)利要求 19的DNA或權(quán)利要求20的細胞。
23. 權(quán)利要求22的藥物，其中所述藥物局部給藥或全身性給藥，或 者與其它增強療效的化合物組合給藥。
24. 權(quán)利要求1至18中任一項的化合物、權(quán)利要求19的DNA或 權(quán)利要求20的細胞用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療癌性或非 癌性增生性疾病、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫病和/或慢性炎癥或感染。
全文摘要
本發(fā)明的主題是由以下部分組成的化合物特異性結(jié)合與疾病相關(guān)的細胞表面標志物的靶向部分、特異性誘導細胞死亡的核酸以及將靶向部分與核酸共價連接的接頭。本發(fā)明的主題還包括包含該化合物的藥物，及其作為治療疾病(包括增生性疾病)的藥物的用途。
文檔編號A61P37/00GK101340934SQ200680047937
公開日2009年1月7日 申請日期2006年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日
發(fā)明者烏爾里希·維爾納, 因加·尼夫, 斯特凡·巴爾特 申請人:弗蘭霍菲爾運輸應(yīng)用研究公司