專利名稱：：用于治療自身免疫疾病、過敏反應(yīng)和癌癥的干擾素α和C-藻藍蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物科學(xué)、生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)，特別是神經(jīng)學(xué)、腫瘤學(xué)、內(nèi)科學(xué)，以及總體而言涉及已知免疫調(diào)節(jié)劑藥物的組合療法用于治療自身免疫疾病、過敏反應(yīng)和癌癥的用途，所述免疫調(diào)節(jié)劑藥物作為自然產(chǎn)物的有效成分存在。本發(fā)明基于獲得具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗增殖和抗胂瘤效應(yīng)，并且特別是具有調(diào)節(jié)T細胞誘導(dǎo)效應(yīng)的藥物化合物，所述調(diào)節(jié)T細胞誘導(dǎo)效應(yīng)已在本發(fā)明中首次得到證實。它在自身免疫疾病(AD)例如多發(fā)性硬化癥(MS)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中，以及在過敏性疾病(ALD)例如支氣管哞喘(BA)中具有有利效應(yīng)，這通過減少它們的復(fù)發(fā)性臨床形式的復(fù)發(fā)或危象(crisis)的次數(shù)或者阻止它們的單相臨床形式的進展而獲得，而在癌癥(CA)中，它阻止腫瘤細胞的生長和增殖，從而避免腫瘤的進展?，F(xiàn)有技術(shù)流行病學(xué)研究已提供了關(guān)于在過去的30年期間在發(fā)達國家中ALD和AD增加的有力證據(jù)。這2種類型的疾病的發(fā)病率已增加哮喘(WoolcockAJ等人，Evidencefortheincreaseinasthmaworldwide.(1997)CIBAFoundSymp206:122-134)，鼻炎(UptonMN等人，Intergenerational20yearstrendsintheprevalenceofasthmaandhayfeverinadults:TheMidspanfamilystudysurveysofparentsandoffspring(2000)BMJ321:88-92)和特應(yīng)性皮炎(WilliamsHC，Istheprevalenceofatopicdermatitisincreasing(1992)ClinExpDermatol17:385-391)，代表性的ALD和MS(RosatiG等人，IncidenceofMultiplesclerosisinthetownofSassari,Sardinia,1965to1985:evidenceforincreasingoccurrenceofthedisease.(1988)Neurology38:384-388;PoserS等人，IncreasingincidenceofMSinSouthLowerSaxony,Germany.(1989)Neuroepidemiology8:207-213)，特別是在未成年人中的胰島素依賴型糖尿病(I型糖尿病)(TID)(E翻DIABACEstudygroup.VariationandtrendsinincidenceofchildhooddiabetesinEurope.(2000)Lancet355:873-876)和克羅恩病(SwarbrickET等人，Acriticalreviewofepidemiologicalstudiesininflammatoryboweldisease.(2001)ScandJGastroenterol36:560a)，作為AD的代表。同時，由于使用抗生素、疫苗接種，或者更簡單地，通過改善衛(wèi)生和社會經(jīng)濟條件，在發(fā)達國家中已出現(xiàn)許多傳染病發(fā)病率的明顯減少。關(guān)于AD和ALD增加的解釋主要與參與其發(fā)病機理的遺傳和環(huán)境因素相關(guān)。關(guān)于遺傳因素，例如在日本，存在低頻率的等位基因DR3和DR4-DQB1*0302,其增加對于青少年TID的易感性。因此，這種疾病的發(fā)病率很低，而TID的發(fā)病率對于撒丁島居民(當(dāng)與鄰近區(qū)域相比較時)而言，以及在已移居至歐洲大陸意大利的撒丁島居民的直系后代中很高(MuntoniS等人，Incidenceofinsulin-dependentdiabetesmellitusamongSardinian—heritagechildrenborninLazioregion,Italy.(1997)Lancet349:160-2)。環(huán)境因素可以解釋發(fā)達國家中AD和ALD的快速增加。存在關(guān)于在從一個國家移居至另一個國家的人群中MS、TID和BA發(fā)病率的信息，所述國家在這些疾病的發(fā)生率方面不同。移居至英國的巴基斯坦裔兒童中的TID形成率與大不列顛兒童的TID形成率(11.7/100000)相同或者為巴基斯坦中的TID發(fā)病率(1/100000)的大約IO倍(BodanskyHJ等人，Evidenceforanenvironmentaleffectintheaetiologyofinsulindependentdiabetesinatransmigratorypopulation.(1992)BMJ304:1020-2)。在以色列中，MS在來自歐洲的移民中常見并且在來自非洲或亞洲的移民中不常見，相反地，在歐洲、亞洲或非洲裔的土生以色列人中，MS的患病數(shù)與歐洲移民中一樣高(LeibowUzOR等人，ThechangingfrequencyofmultiplesclerosisinIsrael.(1973)ArchNeurol29:107-10)。還值得注意的是，全身性紅斑狼療(SLE)的頻率在來自東非的人中比美國黑人中顯著更低，這是來源于相同種族群體但暴露于不同環(huán)境的2種人群(Sym畫s■FrequencyoflupusinpeopleofAfricanorigin(1995)Lupus4:176-8)。遺傳和環(huán)境因素對于AD和ALD易感性的影響仍有待確定。重要信息來自這些疾病在單卵雙生中的發(fā)病率。該比例對于MS是25%(MurnfordCJ等人,TheBritishIslessurveyofmultiplesclerosisintwins.(1994)Neurology44:11-5)，對于TID是40%(BachJF.Insulin-dependentdiabetesmellitusasanautoimmunedisease.(1994)EndocrRev15:516-42)，和對于哞喘是75%(SkadhaugeLR等人，Geneticandenvironmentalinfluenceonasthma:topopulation-basedstudyof11，688Danishtwinpairs.(1999).EurRespirJ13.8-14)?？梢约俣?，這種一致與疾病的外顯率直接相關(guān)，條件是在這種分析中包括成對的這樣的雙胞胎是不可能的，其中所述2個雙胞胎均具有所有誘病基因但沒有疾病。最近已在染色體區(qū)域的鑒定中出現(xiàn)了重要的突破，所述染色體區(qū)域包括產(chǎn)生人對于MS(OksenbergJR等人，MS:genomicrewards.(2001)JNeuroimm畫l113:171-84)、TID(ToddJA.GeneticsoftypeIdiabetes.(1997)Pathol(Paris)45:219-27)和哮喘(CooksonWOC.Asthmagenetics.(2002)Chest121:Suppl:7S-13S)的傾向性的基因，但關(guān)于與疾病相關(guān)的基因可獲得的信息非常少，除了AD中的HLA基因。關(guān)鍵因素是鑒定哪種/哪些基因直接調(diào)節(jié)易感性從而促進我們受環(huán)境因素的影響或保護我們不受環(huán)境因素的影響。例子是在具有特應(yīng)性疾病的患者中的觀察，其中在編碼IL-10和TGF-P的基因中發(fā)現(xiàn)唯一的多態(tài)現(xiàn)象(HobbsK等人，Interleukin-lOandtransforminggrowthfactor—betapromotepolymorphismsinallergyandasthma.(1'998)AmJRespirCritCareMed158:1958-62)，這是可以促成對于過敏性疾病的感染保護效應(yīng)的2種細胞因子。大多數(shù)AD的發(fā)展依賴于由Thl細胞產(chǎn)生的IL-2和IFN-y細胞因子，而過敏性疾病的發(fā)展需要由Th2細胞產(chǎn)生的IL-4和IL-5。Thl細胞對于Th2細胞因子和Th2細胞對于Thl細胞因子的相互反饋指出，這些細胞因子可能參與針對AD或ALD的由感染介導(dǎo)的保護。與最初的報道(TheEURODIABSubstudy2studygroup.Decreasedprevalenceofatopicdiseasesinchildrenwithdiabetes.(2000)JPediatr137:470-4)相反，在個體患者中在AD和ALD之間存在關(guān)聯(lián)特應(yīng)性疾病的頻率在具有糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中增加(KeroJ等人，TH1andTH2diseasecoexistEvaluationofasthmaincidenceinchildrenwithcoeliacdisease,typeIdiabetes,orrheumatoidarthritis:toregisterstudy.(2001)JAllergyCIinImmunol108:781-3;SimsonCR等人，Coincidenceofimmune-mediateddiseasesdrivenbyThlandTh2subsetssuggesttocommonaetiology:topopulation-basedstudyusingcomputerizedgeneralpracticedates.(2002)ClinExpAllergy32:37-42)。這些觀察結(jié)果支持了自身免疫和過敏反應(yīng)之間的共同機制的概念。相當(dāng)多的關(guān)注已投向表達IL-2受體(CD25)的oc鏈的CD4+T細胞，其被稱為調(diào)節(jié)T細胞(rTc)，因為這些細胞在健康小鼠中的耗竭誘導(dǎo)多自身免疫綜合征(polyautoimmuneSyndrome)(AssanoM等人，AutoimmunediseaseasaconsequenceofdevelopmentalabnormalityoftoTcellsubpopulation.(1996)JExpMed184:387-96)。這種觀察結(jié)果支持了維持這種細胞亞群的水平和合適功能以避免AD產(chǎn)生的重要性。這些預(yù)防性自身免疫細胞的下列詳細表型表征無疑地表明了調(diào)節(jié)T細胞作為動物和人模型中自身耐受的關(guān)鍵介質(zhì)的存在。具有調(diào)節(jié)性質(zhì)的細胞可以分成2種類型天然的rTc，其是由胸腺產(chǎn)生的那些，和誘導(dǎo)的rTc，其是在特定條件下在外周中由抗原刺激產(chǎn)生的那些，稱為'Th3，、'Trl，或'適應(yīng)性調(diào)節(jié)細胞，(BluestoneJA等人，NaturalversusadaptiveregulatoryTcells.(2003)NatRevImmunol3:253-257)。關(guān)于誘導(dǎo)的rTc的抑制機制基本上通過細胞因子例如IL-IO和TGF-(3的分泌(GrouxH，Type1T-regulatorycells:theirroleinthecontrolofimmuneresponses.(2003)Transplantation75:8S-12S),然而，天然的rTc優(yōu)先使用細胞間接觸。Sakaguchi等人首次將CD5分子鑒定為rTc標記(SakaguchiS等人，Organ—specificautoimmunediseasesinducedinmicebyeliminationofTcellsubset:I.EvidencefortheactiveparticipationofTcellsinnaturalself—tolerance;deficitoftoTcellsubsetastopossiblecausesofautoimmunedisease.(1985)JExpMed161:72-87)，而CD45RB被鑒定為另一種rTc標記(PowrieF等人,PhenotypicaUydistinctsubsetsofCD4+TcellsinducesorProjectfromchronicintestinalinflammationinC.B-17scidmice.(1993)IntImmunol5.1461-1471)。現(xiàn)在使用的主要表面標記是CD25(SakaguchiS等人，Immunologicself-tolerancemaintainedbyactivatedTcellsexpressingIL-2receivingalphachains(CD25).Breakdownoftoitsailsmechanismofself-toleranceyoucausevariousautoimmunediseases.(1995)JImmunol155:1151-1164)。在小鼠中，大約5-10%的CD4+細胞和1%的CD8+細胞表達CD5*和CD45RB低(ItohM等人，Thymusandautoimmunity:productionofCD25+CD4+naturallyanergicandsuppressiveTcellsastokeyfunctionofthethymusinmaintainingimmunologicself-tolerance.(1999)JImmunol162:5317-5326)，在人中rTc是6-10%的CD4+細胞(NgWF等人，HumanCD4+CD25+eelIs:tonaturallyoccurringpopulationofregulatoryTcells(2001)Blood98:2736-2744)。在不存在明顯的抗原刺激的情況下，rTc顯示高水平的CDlla(LFA-1)、CD44、CD54(ICAM-1)和CD103(McHughRS等人，CD4+CD25+im瞧oregulatoryTcells:geneexpressionanalysisrevealsthefunctionalroleoftheglucocorticoid-inducedTNFreceptor.(2002)Immunity16:311-323)。另外，rTc表達CD152(CTLA-4),其是只在細胞活化后表達的分子(TakahashiT等人,Immunologicself-tolerancemaintainedbyCD25+CD4+regulatoryTcellsconstitutivelyexpressingcytotoxicTlymphocyte-associatedantigen-4(2000)JExpMed192:303-310)。rTc在人中表達高水平的趨化因子受體CCR5及其對應(yīng)物(CCR4和CCR8)(BystryRS等人，BcellsandprofessionalAPCsrecruitregulatoryTcellsviaCCL4.(2001)NatImmunol2:1126-1132)。趨化因子受體表達的這種特殊模式暗示，rTc可以被快速召募至炎癥區(qū)域且有效地控制免疫應(yīng)答。許多團體已報道了糖皮質(zhì)激素的表達在CD4+CD25+細胞中誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體(GITR)(McHughRS等人，CD4+CD25+immunoregulatoryTcells:geneexpressionanalysisrevealstofunctionalrolefortheglucocorticoid—inducedTNFreceptor.(2002)Immunity16:311-323)。rTc標記也在活化細胞中被發(fā)現(xiàn)這一事實阻礙其分離和將CD25鑒定為抑制性細胞的標記(ShevachEM.CD4+CD25+suppressorTcells:Morequestionsthananswers.(2002)NatRevImmunol2:389-400)。近期研究已顯示，rTc在屬于表達高水平的IL-2受體oc鏈的CD4+T細胞的CD25高細胞中富集。CD4+CD25*T細胞完全抑制CD4+T細胞的增殖和細胞因子分泌。CD4+CD25*T細胞在CD45RO和HLA-DR的表達水平方面不同于CD4+CD25+T細胞(Baecher-AllanC等人，CD4+CD25一regulatorycellsinhumanperipheralblood.(2001)JImmunol167:1245-1253)。來源于小鼠和人胸腺的rTc已得到描述。在小鼠中，rTc的缺失產(chǎn)生器官特異性自身免疫。近來，已證實，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3對于rTc在小鼠中的功能是重要的。已顯示，F(xiàn)oxp3的表達是004+0025+T細胞的典型特征并且與這些細胞的抑制活性相關(guān)。這暗示，無法產(chǎn)生rTc可以促成AD，并且它還暗示Foxp3在治療這些疾病中具有治療作用(WalkerMR等人,InductionofFoxp3andacquisitionofTregulatoryactivitybystimulatedhumanCD4+CD25+Tcells.(2003)JClinInvest112:1437-1443)。編碼Scurfin蛋白的Foxp3轉(zhuǎn)錄因子似乎是略微更專有的rTc標記(BrunkowME等人，Disruptionoftonewforkhead/winged-helixprotein,scurfin,resultsinthefatallymphoproliferativedisorderofthescurfymouse.(2001)NatGenet27:68-73)，盡管在其他活化條件和其他細胞群中不排除表達其的可能性(MorganME等人，ExpressionofF0XP3mRNAisnotconfinedtoCD4(+)CD25(+)Tregulatorycellsinhumans.(2005)HumImmunol.1:13-20)。經(jīng)誘導(dǎo)的rTc的作用機制涉及TGF-P(NakamuraK等人，Cellcontact-dependentimmuno-suppressionbyCD4(+)CD25(+)regulatoryTcellsismediatedbycellsurface-boundtransforminggrowthfactorbeta.(2001)JExpMed194:629-44)。具有NK和T細胞性質(zhì)的NK細胞可以促成這種免疫調(diào)節(jié)(BendelacA等人，MouseCDl-specificMlTcells:development,specificity,andfunction(1997)A匪RevIm畫l15:535-62)。由經(jīng)誘導(dǎo)的rTc、單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的IL-10(Th2細胞因子)在實驗?zāi)Ｐ椭袦p緩AD和ALD的進展(MooreKW等人，Interleukin-10andthereceptorinterleukin-10.(2001)AnnuRevImmunol19:683-765)。IL-10還可以通過減少經(jīng)活化的嗜酸性粒細胞的存活而在ALD中起重要作用(TakanashiS等人，Interleukin-10inhibitslypopolisaccharide-inducedsurvivalandcytokineproductionbyhumanperipheralbloodeosinophils(1994)JExpMed180:711-5)。2個研究者團體已發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者的肺中存在比健康對照的肺中明顯更低的IL一IO量(LimS等人，HaplotypeassociatedwithlowinterleuHn-10productioninpatientswithsevereasthma.(1998)Lancet352:113;TakanashiS等人,Interleukin-l0levelinsputurnisreducedinbronchialasth歸，COPDandinsmokers.(1999)EurRespJ14:309-14)。這暗示，由rTc產(chǎn)生的IL-10和TGF-p可以抑制兩種應(yīng)答(Thl和Th2)，從而成為這種調(diào)節(jié)的介質(zhì)。rTc在免疫應(yīng)答的控制中起重要作用，例如，它們可以限制微生物或抗腫瘤免疫應(yīng)答。需要時，可以進行rTc的策略性操作以增加或減少免疫應(yīng)答(Feh6rvariZ等人，Toparagonofself-tolerance:CD25+CD4+regulatoryTcellsandthecontrolofimmuneresponses(2004)ArthritisHeadTher6:19-25)。在我們的發(fā)明中證實的IFN-oc/藻藍蛋白組合的對于rTc的誘導(dǎo)效應(yīng)證明在AD和ALD中使用其是準確的，在所述AD和ALD中存在效應(yīng)細胞和rTc的不平衡，伴隨rTc的數(shù)目和/或功能的減少。自身免疫疾病是免疫系統(tǒng)US)的機能障礙，其中負責(zé)鑒定和破壞有害侵入微生物的細胞將自身組織鑒定為外源的并攻擊它們。研究者提供了備選解釋，例如病毒或細菌病因人皰疹病毒6、EB病毒和肺炎衣原體(C/a/pj^Z/ap/e咖o//a)。傳染劑在不同實驗條件下可以誘導(dǎo)AD，其中某些具有其臨床對應(yīng)物。已考慮了許多機制以解釋這些觀察結(jié)果，包括分子模擬和在靶器官中由炎癥引起的自身抗原免疫原性的增加(OlsonJK等人，Virus-inducedautoimmunity:potentialroleofvirusesininitiation,perpetuation,andprogressionofT-cellmediatedautoimmunedisease.(2001)viralImmunol14:227-250)。矛盾的是，傳染劑也可以抑制自身免疫和變應(yīng)性機能障礙。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性和脫髓鞘疾病，其顯示出使得它能夠被視為多發(fā)性硬化癥的動物模型的臨床和病理學(xué)特征。大量證據(jù)顯示，EAE是伴隨著促炎細胞因子例如千擾素y(IFN-y)或腫瘤壞死因子-oc(TNF-oc)的分泌的Thl疾病，并且暗示，由細胞因子誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可以在EAE神經(jīng)病理學(xué)中起重要作用。然而，這些和其他細胞因子在疾病發(fā)病機理中的個體效應(yīng)仍不明了。在這個報道中，MirrorC等人(MirrorC等人，Interferon-gam隨regulatesoxidativestressduringexperimentalautoimmuneencephalomyelitis.(2002)ExpNeurol177:21-31)4吏用IFN-y受體敲除小鼠(IFN-yR(-/_))分析了IFN-y在EAE期間的作用。用大鼠髓鞘少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白(M0G)的40-55肽來免疫小鼠。氧化應(yīng)激的水平通過下述過程來測定誘導(dǎo)型一氧化氮(NO)合酶、硝化酪氨酸和丙二酰二醛(malonyldialdehyde)的免疫反應(yīng)性的分析，以及組織保護性抗氧化因子金屬硫蛋白I+II(MT-I+II)的表達。他們還通過使用TUNNEL技術(shù)測定了發(fā)展出凋亡的細胞的數(shù)目。由EAE引起的氧化應(yīng)激、mt-i+ii和凋亡細胞死亡的水平在所有小鼠(ifn-yr(-/-)和野生型)中明顯增加，但它在IFN-yr(-/-)小鼠中更加大。這支持了IFN-y起針對EAE的保護作用這一假設(shè)。EM是主要影響青壯年的自身免疫脫髓鞘疾病。在古巴中MS發(fā)病率的最保守值是10/100000居民(Hernandez-ValeroE等人，ClinicalfeaturesofmultiplesclerosisinWesternCuba.Acomparisonwithtwootherregionsinthecountry.(2004)RevNeurol.May1-15;38(9):818-23)。它在女性中流行，比例根據(jù)疾病的起始而不同(WingerchukDM等人，Theclinicalcourseofopticneuromyelitis(Devic'ssyndrome)(1999)Neurology53:1107-14)。就種族而言，它在白種人中更常見。MS是影響腦和脊髓的CNS疾病。它具有下述2個基本特征脫髓鞘和軸突喪失。癥狀、嚴重度和臨床過程可以依斑塊的位置和脫髓鞘的程度而變化。因此，它可以分成2個主要類別復(fù)發(fā)-緩解型形式和進行性慢性形式。MS稱為AD。在理論上，當(dāng)免疫系統(tǒng)受遺傳或環(huán)境因素或兩者損害時發(fā)展出這種病狀，導(dǎo)致針對自身組織的攻擊。在MS的情況下，所述組織是髓鞘。生物體還執(zhí)行校正事件以"關(guān)閉"髓鞘生成細胞(少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞)的破壞的影響。例如，已觀察到了具有電負荷的鈉通道的密度增加，這增加了其數(shù)目，從而神經(jīng)細胞盡管喪失了髓鞘但仍可繼續(xù)溝通；另一方面，神經(jīng)保留了一些髓鞘再生能力。多種傳染性生物已被提議為MS發(fā)展中的致病因子或輔因子(JohnsonRT.ViralPossiblecausesofmultiplesclerosis(1998)In:Viralinfectionsofnervoussystem2nded.Philadelphia:Uppincott-Raven248-258)，HIV-1感染(BlancheP等人，Devic'sneuromyelitisopticandHIV-linfection(2000)JNeurolNeurosurgPsychiatry68:795-796)在這項研究中與本土群體中的MS相關(guān)。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ERV)已參與MS發(fā)病機理，并且不同團體已鑒定出了與MS相關(guān)的特定ERVs(PerronH等人，Molecularidentificationoftobeginnerretrovirusrepeatedlyisolatedfrompatientswithmultiplesclerosis.(1997)TheCollaborativeResearchGroupmultipleonSclerosis.ProcNatl.AcadSciUSA94:7583-7588;ChristensenT等人,ReversetranscriptaseactivityandparticleproductioninBlymphoblastoidcelllinesestablishedfromlymphocytesofpatientswithmultiplesclerosis.(1999)AIDSHeadHumRetroviruses15:285-291)。這支持了具有抗病毒性質(zhì)的藥物在這些疾病中的用途。MS的病因不明，但廣泛承認它是由受限制的MHCIICD4+T細胞起始的AD，所述受限制的MHCIICD4+T細胞偏向于產(chǎn)生IFN-y、IL-2、TNF-oc和淋巴毒素，換言之，它們是Thl細胞。證據(jù)顯示，MS是由Thl細胞介導(dǎo)的AD(CD4-Thl模型)(LassmannH等人，TheCD4-Thlmodelformultiplesclerosis:tocrucialre-appraisal.(2004)TrendinIminunology25:3，132-137)。所實現(xiàn)的對于這種模型的預(yù)測是a)CD4+T細胞在MS損傷處的淋巴細胞群中應(yīng)當(dāng)是占優(yōu)勢的。淋巴細胞的其他群體應(yīng)當(dāng)是附屬的少數(shù)群體。b)偏向于Thl的CD4+T細胞以及它們的主要效應(yīng)細胞因子TNF-cc和IFN-y在MS損傷處應(yīng)當(dāng)是致病性的。c)偏向于Th2的CD4+T細胞在MS損傷處應(yīng)當(dāng)是調(diào)節(jié)性的或抗炎的。該CD4-Thl模型應(yīng)當(dāng)解釋了在MS的臨床和病理學(xué)特征中觀察到的可變性。d)該過程將明顯是自身免疫的，這意味著必須存在證據(jù)表明宿主的CNS在受到由CD4-Thl介導(dǎo)的機制所引起的自身免疫攻擊前未受損害。關(guān)于MS的發(fā)病機理，已假設(shè)，在遺傳易感宿主中，包含與自身髓鞘抗原交叉反應(yīng)的序列的常見病原體通過ToU-樣受體(TLR)而激活抗原呈遞細胞(APC)，這是關(guān)于誘導(dǎo)CNS自身免疫炎性疾病的最低要求。根本的免疫調(diào)節(jié)缺陷，例如MS患者血流中調(diào)節(jié)T細胞的減少，導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細胞的最終病理性激活?；罨乃枨史磻?yīng)T細胞遷移至CNS，并且它們識別由小神經(jīng)膠質(zhì)細胞(局部APCs)呈遞的抗原。Thl細胞因子被分泌，并且炎癥級聯(lián)開始。天然發(fā)生的機制可以調(diào)節(jié)自身免疫應(yīng)答，包括誘導(dǎo)由T細胞(IL-4，IL-5,IL-13)、Th3(TGF-p)或Trl(IL-10)分泌的Th2細胞因子，所述細胞遷移至CNS并且負面調(diào)節(jié)Thl炎性自身反應(yīng)性T細胞(HafierDA.Multiplesclerosis(2004)JCIinInv113:788-94)。在正常狀態(tài)下，血腦屏障(BBB)提供了血細胞和髓鞘之間的有效分隔，從而使得如果存在不正確地進行編程的白細胞也沒有關(guān)系，因此，已假設(shè)了在MS攻擊期間BBB的不適當(dāng)?shù)墓δ堋S的某些細胞產(chǎn)生溶解細胞外基質(zhì)的酶。在大多數(shù)生物中，這導(dǎo)致白細胞更接近感染區(qū)域；然而，當(dāng)這些細胞在CNS內(nèi)的毛細管中釋放化學(xué)物質(zhì)時，存在BBB的破裂，從而至少在某些個體中產(chǎn)生損傷?？梢杂砂准毎尫诺幕瘜W(xué)物質(zhì)之一是減弱細胞間"粘結(jié)(cement)"的金屬蛋白酶(MMPs)。當(dāng)它們被釋放時它們不是有活性的，但它們經(jīng)由其他酶而被激活(MaedaA等人，MatrixMetalloproteinasesinthenormalhumancentralnervoussystem,microglialnodules,MultipleandSclerosislesions(1996)JNeuropatholExpNeurol.55(3):300-309)。因此，關(guān)于這些疾病的潛在治療的另一個特征將是抑制畫Ps和/或刺激其抑制劑。存在影響B(tài)BB完整性的另一種潛在機制。因此，當(dāng)白細胞破壞入侵的微生物時，它們釋放非常活躍并且可以破壞其許多靶標的超氧化物和自由基，然而，當(dāng)該過程在BBB中發(fā)生時，它開始產(chǎn)生損傷，這可以產(chǎn)生針對BBB完整性的一種或多種攻擊(JeanClaudeMonboisse等人，Non-enzymaticdegradationofacid-solublecalf-skincollagenbysuperoxideion:protectiveeffectsofflavonoids.(1983)BiochemPharmacol.32(1):53-58)。因此，在我們的發(fā)明中證實的IFN-ot/C-藻藍蛋白組合的抗氧化性質(zhì)是其在這種疾病中的應(yīng)用的理論根據(jù)。MS斑塊包含大量巨噬細胞，所述巨噬細胞似乎通過消化其蛋白質(zhì)和脂質(zhì)來破壞髓鞘。這些酶的抑制劑可以減少髓鞘的破壞或干擾巨噬細胞朝向組織的移動。在這種疾病中使用以治療急性病狀的藥物的原理基于其抗炎性質(zhì)(W.A.SibleyandtheTherapeuticClaimsCommitteeoftheInternationalFederationMultipleofSclerosisSocieties,TherapeuticClaimsinMultipleSclerosis,第3版,1992)。用于MS的療法已在過去20年中出現(xiàn)，證實了對于MS早期階段有影響的3類免疫調(diào)節(jié)療法的有效性免疫抑制藥物例如米托蒽醌和環(huán)磷酰胺；干擾素P，和關(guān)于與T細胞受體(TCR)偶聯(lián)的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的連接肽，乙酸格拉默(GA)。目前，F(xiàn)DA批準用于這種疾病的藥物是1993年的干擾素P-Ib(Betaseron)，1996年的干擾素P-la(A雨ex)和1996年的Copaxone(GA或共聚物1)，并且它們是非常昂貴的。IFN-p在復(fù)發(fā)-緩解型MS中具有重大影響，盡管我們不知道這是否可以防止轉(zhuǎn)變成進行性繼發(fā)性MS。IFN-P的作用機制不明。它可能涉及許多不同機制的改變，所述機制包括通過阻斷金屬蛋白酶來誘導(dǎo)IL-IO和抑制T細胞的移動(Stuve，0.等人，Interferonbeta-lbdecreasesthemigrationofTlymphocytesinvitro:effectsonmatrixmetalloproteinase-9(1996)Ann.Neurol.40:853-863)?；贗L-12和IL-23的共有p40鏈阻斷的臨床試驗現(xiàn)在已開始。這些臨床試驗還包括通過B7-CD28與IgCTLA-4的相互作用來阻斷共刺激信號。關(guān)于GA，在大多數(shù)患者中，每日注射GA產(chǎn)生關(guān)于CD4+T細胞的IL-5和IL-13分泌，這表明朝向Th2應(yīng)答的改變(DudaPW等人，HumanandmurineCD4Tcellreactivitytocomplexantigen:recognitionofthesyntheticrandompolypeptideglatirameracetate.(2000)JImmunol165:7300-7307;Qin,Y等人，CharacterizationofTeel1linesderivedfromglatiramer-acetate-treatedmultiplesclerosispatients.(2000)JNeuroimmunol108:201-206;Dabbert，D.等人，Glatirameracetate(copolymer-l)-specific，humanTcelllines:cytokineprofileandsuppressionofTcelllinesreactiveagainstmyelinbasicprotein.(2000)Neurosci.Lett289:205-208)。此外，通過其與各種各樣肽交叉反應(yīng)的能力所測量的，與GA具有反應(yīng)性的存活T細胞顯示出高度退化。目前，存在正在免疫學(xué)中討論的最初構(gòu)思，因為它們超越了常規(guī)規(guī)則，所述規(guī)則限制了對于與克隆選擇及其備選方案(突出的耐受性)的范例相沖突的證據(jù)的解釋，所述范例得到調(diào)節(jié)T細胞的存在的支持。由我們的發(fā)明給出的治療選擇尤其集中于恢復(fù)這種效應(yīng)物/調(diào)節(jié)劑不平衡，我們認為這種不平衡通過其增加下列這種細胞群的能力而在自身免疫疾病中起重要作用CD4+CD25高，F(xiàn)oxp3+天然rTc，或者產(chǎn)生IL-10或TGF-p的經(jīng)誘導(dǎo)的rTc。RA是產(chǎn)生極大妨礙的另一種自身免疫炎性疾病。認為50-90%的受RA侵襲的人在第一次診斷后10年具有嚴重的殘疾(MarkensonJA.(1991).Worldwidetrendsinthesocioeconomicimpactandlong-termprognosisorrheumatoidarthritis.SeminArthritisRheum:21(2)，4-12)。在美國由RA產(chǎn)生的治療和殘疾的成本每年高達65億美元(FanciA等人(編輯)(1998).Harrison'sprincipalsofInternalMedicine.(第14版)(第376章第2412頁)NewCork:McGrawHill;YelinE.(1996).Thecostofrheumatoidarthritis:absolute,incremental，andmarginalestimates.JRheumatol:(suppl44)23,47-51)。RA是在全世界0.5-1%的成人群體內(nèi)最常見的炎性關(guān)節(jié)炎和殘疾的主因。RA是主要影響手和腳的小關(guān)節(jié)的多關(guān)節(jié)對稱炎癥。除了滑膜炎癥外，稱為血管翳的組織團塊侵入并破壞局部關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)。在RA中，CD4+T細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞浸潤滑膜，并且有時被組織為具有生發(fā)中心的不連續(xù)的淋巴樣聚集物。內(nèi)膜層的增生是成纖維細胞和巨噬細胞類型的滑膜細胞顯著增加的結(jié)果。局部表達的降解酶包括金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和聚集蛋白聚糖酶(aggreganases)，消化亞細胞基質(zhì)，并破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)(FiresteinGS.Evolvingconceptsofrheumatoidarthritis(2003)Nature423:356-61)。RA的發(fā)病機理一般而言仍是未知的；特別地，存在關(guān)于針對關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的特定抗原的自身免疫作用的討論。存在支持包括遺傳、傳染性和神經(jīng)內(nèi)分泌因素的多因素機制的實驗證據(jù)，所述這些因素導(dǎo)致該疾病發(fā)病機理中獲得性免疫的抗原特異性激活的流行。在約70%受累的高加索人患者中HLA-DR4/Dw4的存在已得到證實(StastnyP.AssociationoftheB-cellalloantigenDRw4withRA.(1978)NEnglJMed298:869-71)。關(guān)于致病機制，"表位共享"可以充當(dāng)關(guān)于致關(guān)節(jié)炎肽或可能關(guān)于模擬外源抗原的自身抗原(分子模擬)的結(jié)合位點。某些傳染劑已被提i義為起始RA的可能實體(FeldmannM等人，RoleofcytokinesinRA.(1996)AnnuRevImmunol14:397-440),特別是細小病毒B19，其導(dǎo)侵襲性質(zhì)的能力已得到證實(RayNB等人，InductionofaninvasivephenotypebyhumanparvovirusB19innormalhumansynovialfibroblasts.(2001)ArthritisRheum44:1582-6)。另一種重要的病原體是奇異變形菌(戶ro"^/z/ra6/7")(EbringerA等人，SequencesimilaritybetweenHLA-DRlandDR4subtypesassociatedwithRAandProteus/Serratiamembranehaemolysins.(1992)AnnRheumDis51:1245-6)。最近，重點已放在先天免疫性在該疾病進展中的直接作用上。RA的自然過程的特征在于3個時期誘導(dǎo)、維持和組織破壞。在了解參與T細胞活化的分子、T細胞在侵蝕機制中的作用和關(guān)于參與"歸巢"和血管發(fā)生過程的趨化因子的研究中的進展支持了適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的抗原特異性激活的理論。因此，在RA期間，滑膜炎和侵蝕的發(fā)病機理涉及先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的機制，從而產(chǎn)生關(guān)節(jié)損傷的最終誘導(dǎo)(ValenisiG，BaroneF等人，Advancesinimmunologyandrheumatoidarthritispathogenesis.(2004)rheumatism56:9-20)。近來，對于與膜或特異性可溶介質(zhì)相結(jié)合的分子所使用的生物試劑的開發(fā)已使RA的治療完全改變。TNF-a的成功抑制，和較不重要地IL-1的成功抑制，已在RA的臨床處理中提供了穩(wěn)固建立的療法。盡管具有在臨床試驗和真實生活經(jīng)驗中使用TNF-a抑制劑的數(shù)據(jù)，但大部分患者對這些試劑沒有應(yīng)答或已喪失其對它們的初始應(yīng)答，這使得必須尋找新的療法。去年，顯示出，使用單克隆抗體利妥昔單抗耗竭B細胞產(chǎn)生了該疾病的癥狀和征兆的顯著改善。同時，通過使用IgCTLA-4抑制T細胞的共刺激信號，發(fā)現(xiàn)了改善和可接受的毒性。選擇性地抑制IL-6(RA中的關(guān)鍵促炎細胞因子)已產(chǎn)生該疾病狀態(tài)的臨床改善，特別是在與RA相關(guān)的急性應(yīng)答期中(SinghR等人，Emergingbiologictherapiesinrheumatoidarthriis:celltargetsandcytokines.(2005)CurrOpinRheumatol17:274-79)。過敏性疾病包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、食物過敏反應(yīng)、對于藥物的過敏反應(yīng)和特應(yīng)性變應(yīng)性濕滲/皮炎綜合征及其他，其是似乎由免疫球蛋白E介導(dǎo)的一組普遍的機能障礙。全世界任何國家中所有年齡的人均患有這些疾病。過敏反應(yīng)的患病率近年來已增加。它影響全世界30-40%的人口，并且被視為21世紀3種主要疾病之一。在過去的20年中，炎癥已成為過敏反應(yīng)的主要病理生理學(xué)特征之一。肥大細胞是過敏反應(yīng)的主要介質(zhì)，并且它們的激活是關(guān)于在暴露于過敏原的敏感個體中微脈管系統(tǒng)滲透性和組織水肺快速發(fā)展的充分和必要條件。肥大細胞是過敏性炎癥的介質(zhì)的主要來源，所述介質(zhì)包括組胺、中性蛋白酶、蛋白聚糖、前列腺素D2、白三烯C4和某些細胞因子(ParikhINC等人，Preformedenzymesinmastcellgranulatesandtheirpotentialroleinallergicrhinitis.(2003)CurrAsthmaRep3:266-272)。在這些中，組胺是在津喘中所涉及的病理生理學(xué)改變的第一種介質(zhì)。支氣管哞喘是氣道的慢性炎癥的表現(xiàn)，可能繼發(fā)于對過敏原的超敏性。因此，這種疾病的治療由下列組成控制環(huán)境以使與過敏原刺激有關(guān)的炎癥應(yīng)答降到最低，以及使用抗炎療法以減少炎癥和阻止疾病的進展(CraigML.Diversityofasthma:evolvingconceptsofpathophysiologyandlessonsfromgenetics.(2005)JAllergyClinImmunol115:S526-31)。哞喘是發(fā)達國家中的地方流行病并且它可以影響每4個兒童中的1個(AsherMl,KeilOR等人，Internationalstudyofasthmaandallergiesinchildhood(ISAAC):rationaleandmethods.(1995)EurRespJ8:483-91)。在譯喘的生理學(xué)構(gòu)架內(nèi)發(fā)現(xiàn)支氣管高反應(yīng)性，但它也出現(xiàn)于沒有哮喘的個體中(在10-15%的一般人口中)。目前，哞喘被視為具有復(fù)雜免疫生物學(xué)的由遺傳-環(huán)境相互作用產(chǎn)生的疾病。通過過敏原釋放到氣道中，它在生命早期開始。當(dāng)抗原進入免疫細胞時，哮喘的免疫識別中的第一個階段發(fā)生。APC(包括樹突狀細胞)合并入可以充當(dāng)抗原的外源蛋白；它們將其水解成小的多肽，所述小的多肽可以在II類MHC背景中在它們的表面上表達。這種呈遞伴隨著APC表面上輔助分子的表達。該過程可以在氣道表面附近發(fā)生，并且通過在CCR7配體，EBI-1和次級淋巴組織趨化因子的影響下具有CCR7的這些細胞朝向淋巴組織的遷移而繼續(xù)，它們還吸引具有CCR7的記憶和"原初"T細胞。在區(qū)域性淋巴組織中，T細胞被裝載在APC上的抗原激活。細胞因子的局部表達可以對T細胞針對抗原呈遞的應(yīng)答具有深遠影響，這個過程稱為免疫偏離。在IL-12的存在下，這些細胞具有表達IFN-y的Thl表型。在IL-10的影響下，這些細胞可以發(fā)展出調(diào)節(jié)物表型，這可能在限制哞喘的進展中是重要的。IL-4和IL-13的影響導(dǎo)致發(fā)展出Th2表型，這是哞喘存在所需的。有趣的是，由活化誘導(dǎo)的IL-4、IL-13、CD40和稱為胞苷脫氨酶的酶的聯(lián)合作用產(chǎn)生在B淋巴細胞重組中的刪除改變和針對過敏原的特異性IgE的產(chǎn)生，所述過敏原的水平在過敏性哮喘中增加。正是IgE與在過敏性應(yīng)答的效應(yīng)細胞上的過敏原和受體特異性結(jié)合的這種能力導(dǎo)致引起哮喘癥狀的介質(zhì)釋放，所述效應(yīng)細胞包括肥大細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞。哞喘中的效應(yīng)分子包括組胺、血小板活化因子、蛋白酶和花生四烯酸(AA)的代謝物。前列腺素(PG)和白三烯(LT)是AA在過敏和哞喘反應(yīng)期間酶促產(chǎn)生的代謝物，并且它們存在于氣道環(huán)境內(nèi)的有限部位，影響肺中的常駐細胞，同時作用于特定受體(DrazenJM.Leukotrienesinasthma.(2003)AdvExpMedBiol525:1-5)。哮喘中的效應(yīng)炎癥細胞產(chǎn)生白三烯，而肺的結(jié)構(gòu)細胞產(chǎn)生前列腺素(HolgateST等人，Rolesofcysteinylleukotrienesinairwayinflammation.(2003)JAllergyClinImmunol111(suppl):SI8-36)。PG和LT也可以作為氧化應(yīng)激的結(jié)果而形成。包含過氧化物酶的呼吸道粒細胞的活化與這種水平上的氧化劑的產(chǎn)生相關(guān)。當(dāng)活性氮和氧類別的形成超過呼吸道環(huán)境的還原能力時，可以發(fā)生脂質(zhì)膜的過氧化。這個過程導(dǎo)致異前列腺烷(isoprostane)的形成；這些是氧化應(yīng)激的標記。多態(tài)性標記和具有幾個患有哮喘的成員的在表型上經(jīng)表征的家族的可用性，已使得能夠鑒定與該疾病有關(guān)的基因變體。在來自懷疑與哮喘相關(guān)的基因(IL4、IL13、Tbet和GATA3)的12項研究的人群中的檢查顯示與該疾病無關(guān)。已與哮喘相關(guān)的基因包括某些眾所周知的多因素基因，例如去整聯(lián)蛋白(desintegrin)和金屬蛋白酶33(ADAM33)(VanEerdeweghP，LittleRD等人，AssociationoftheADAM33genewithasthmaandbronchialhyperresponsiveness.(2002)Nature418:426-30)、二肽基肽酶10(DPP10)和PHD指形蛋白ll(PHFll)(ZhangY等人，Positionalcloningoftoquantitativetraitlocusonchromosome13ql4thatinfluencesimmunoglobulinElevelsandasthma.(2003)NatGenet34:181-6)。這些基因的變體影響哞喘發(fā)病機理的機制目前正在研究中。哞喘的發(fā)病機理方面存在新興模型。關(guān)于哮喘的傳統(tǒng)模型集中于平滑肌在呼吸道和炎癥途徑中的功能?，F(xiàn)在，它引入了影響細胞因子和趨化因子表達的調(diào)節(jié)系統(tǒng)的概念，并且它包括過敏原對氣道中的常駐細胞的生長和增殖的影響(HolgateST等人，Rolesofcysteinylleukotrienesinairwayinflammation.(2003)JAllergyClinImmunol111(suppl):S18-36)，其解釋了前列腺素類DP受體在哞喘中的作用。在這個模型中，暴露于刺激性試劑、毒素或過敏原，不僅允許適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的偏離以及Th2淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞朝向氣道的召募，它還間接作用于使肥大細胞定位于呼吸道的平滑肌細胞的附近(BrightlingCE等人，Mast-cellinfi1trationofairwaysmoothmuscleinasthma.(2002)NEnglJMed346:1699-705)并激活前列腺素類DP受體已促進其存活(GervaisFG等人，Selectivemodulationofchemokinesis,degranulation,andapoptosisineosinophilsthroughthePGD2receptorsCRTH2andDP.(2001)JAllergyClinImmunol108:982-8)。反復(fù)暴露于過敏原產(chǎn)生氣道上皮細胞的活化條件中的變化，并且釋放引起上皮下成纖維細胞轉(zhuǎn)化成分泌膠原的成肌細胞表型的因子。膠原在呼吸道的基底膜上的沉積改變了影響腔區(qū)域的氣道平滑肌的收縮應(yīng)答(WiggsBR等人，Amodelofairwaynarrowinginasthmaandinchronicobstructivepulmonarydisease.(1992)AmRevRespDis145:1251-8)。哮喘癥狀通過來自呼吸道的嗜酸性粒細胞和肥大細胞的促收縮介質(zhì)的釋放事件而產(chǎn)生。新興的概念是，哮喘是由傳染劑、過敏原和環(huán)境毒素產(chǎn)生的疾病，這些因素隨著時間過去而導(dǎo)致細胞組成和氣道結(jié)構(gòu)的變化。已描述了在哞喘中的抑制或調(diào)節(jié)T細胞的不同亞型，所述T細胞可以阻止動物模型中效應(yīng)細胞的"體外，，和"體內(nèi)，，激活。近期的證據(jù)暗示了CD"+)CD2S(+)天然調(diào)節(jié)T細胞和產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)T細胞的抑制活性的缺陷，所述T細胞可以在變應(yīng)性致敏的發(fā)展中起作用。療法應(yīng)當(dāng)針對在哮喘中維持調(diào)節(jié)T細胞和效應(yīng)細胞之間的平衡(RobinsonDS.Theroleofregulatorylymphocytesinasthmapathogenesis.(2005)CurrAllergyAsthmaRep5:135-41)。關(guān)于腫瘤發(fā)生所提議的模型基于不同類型癌癥的特征性主要共性的分析。近期的研究(KarpinetsV等人，Tumorigenesis:theadaptationofmammaliancellstosustainedstressenvironmentbyepigeneticalterationsandsucceedingmatchedmutations.(2005)Carcinogenesis26:1323-1334)表明，在致瘤性轉(zhuǎn)化期間，由于在伴隨著具有產(chǎn)生錯誤和異常有絲分裂的傾向的聚合酶參與的細胞分裂期間的趨向定型錯誤，細胞可以自身產(chǎn)生突變。這些機制可以通過在持續(xù)應(yīng)激環(huán)境(SSE)中的存活信號傳導(dǎo)和繼續(xù)增殖在細胞中被活化長期暴露于這種信號傳導(dǎo)使某些細胞的基因組后生地重新編程并引起其衰老。所述后生的重新編程導(dǎo)致參與細胞周期停滯的起始、DM修復(fù)和凋亡的腫瘤抑制基因的超甲基化，與持續(xù)增殖活性相關(guān)的原癌基因低甲基化，總體基因組脫甲基化和DNA重復(fù)序列的活化。根據(jù)這種模型，SSE中的持續(xù)增殖和信號傳導(dǎo)可以通過在暴露于持久攻擊的組織中細胞因子的連續(xù)生產(chǎn)來引起，例如作為暴露于致癌物的結(jié)果。與類似應(yīng)激相關(guān)的信號傳導(dǎo)可以由其他生理學(xué)和環(huán)境因素誘導(dǎo)，包括非常熟知的癌癥誘導(dǎo)劑如炎癥、激素和病毒感染。參與癌癥的起源和發(fā)展的激素是經(jīng)充分證明的。已知許多激素在許多細胞中激活增殖應(yīng)答和存活信號傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)其增殖以及凋亡抑制(MoggsJG等人，Phenotypicanchoringofgeneexpressionchangesduringestrogen-induceduterinegrowth.(2004)EnvironHealthPerspect112:1589-1606)。這些問題對于理解細胞周期和凋亡機制的調(diào)控在贅生物的生長和發(fā)展中為何重要是關(guān)鍵的，這些是可以導(dǎo)致激活程序性細胞死亡途徑的信號傳導(dǎo)點，如果細胞損傷不能修復(fù)(PietenpolJA等人，Cellcyclecheckpointsignalling:cellcyclearrestversusapoptosis.(2002)Toxicology181-182:475-481)。研究已顯示，p53和p21在維持細胞周期滯留于G2/M期以及DNA損傷后的凋亡中是必需的。p53依賴性G2/M停滯機制涉及關(guān)于p21的Bl/Cdc2細胞周期蛋白活性的最初抑制以及B1和Cdc2細胞周期蛋白的蛋白質(zhì)水平的后續(xù)減少(FlattPM等人，p53regulationofG(2)checkpointiretinoblastomaproteindependent.(2000)MolCellBiol20:4210-23;I畫centeINC等人，p53regulatestoG2checkpointthroughcyclinBl.(1999)ProcNat1AcadSciUSA96:2147-52)。除了Bl/Cdc2細胞周期蛋白水平和p21活性的調(diào)節(jié)外，p53還通過在該級聯(lián)下的另外革巴基因的正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)來執(zhí)行檢查應(yīng)答(ChanTA等人，14-3—3SigmaisrequiredtopreventmitoticcatastropheafterDNAdamage.(1999)Nature410:616-20)。已報道，凋亡的誘導(dǎo)與該級聯(lián)下的p53的靶基因例如p21的正調(diào)節(jié)相關(guān)(KannanK等人，DMmicroarraysidentificationofprimaryandsecondarytargetgenesregulatedbyp53.(2001)Oncogene20:2225-2234)。轉(zhuǎn)化性病毒對細胞進程的影響模擬了SSE的許多方面。由某些病毒編碼的癌蛋白的表達以與存活和增殖信號相同的方式改變宿主細胞進程。約1/4的惡性病通過慢性炎癥階段(CoussensLM等人，Inflammationandcancer(2002)Nature420:860—7)。類似于由致癌物所強加的SSE,這種細胞環(huán)境導(dǎo)致作為系統(tǒng)的細胞防御中的重要要素的活性氧類別的產(chǎn)生。因此，不管其病因，炎癥還引起細胞攻擊、DNA損傷，并產(chǎn)生富含誘導(dǎo)SSE的細胞因子和生長因子的微環(huán)境。存在支持存在有針對腫瘤的免疫監(jiān)視的天然機制的許多證據(jù)，所述天然才幾制可以是稱為"癌癥免疫編輯(cancerinmuno-edition)，，的更總體過程的一部分。這包括先天性和獲得性免疫對腫瘤發(fā)展的影響的完全系列過程，所述過程包括從識別和腫瘤消除到腫瘤逃逸(DunnGP等人,TheThreeisofcancerimmunoediting:fromimmunosurvei1lancetotumorescapes.(2004)AnnuRevImmunol22:329-360)。令人驚訝的是，在不存在完整免疫系統(tǒng)的情況下形成的胂瘤比在具有免疫活能力的宿主中形成的那些更具有免疫原性；這不僅證明了免疫系統(tǒng)在宿主針對腫瘤發(fā)展的保護中的作用，而且證明了其對于基于它們的免疫原性來選擇腫瘊變體的影響?；旧希槍υ贗類MHC背景中呈遞的抗原的CD8+T細胞(CTL)的淋巴毒性應(yīng)答被視為在抗腫瘤免疫應(yīng)答中獲得性免疫的主要效應(yīng)物分支，以這種方式，抗腫瘤免疫療法的主要趨勢集中于增加CTL應(yīng)答。針對肺瘤的免疫監(jiān)視理論無疑證實了，免疫系統(tǒng)能夠識別并清除腫瘤細力包。在針對腫瘤的免疫監(jiān)視機制中最相關(guān)方面之一是IFN-y的作用。由免疫系統(tǒng)細胞產(chǎn)生的IFN-y能夠使宿主免于經(jīng)移植的腫瘤的生長，以及免于化學(xué)誘導(dǎo)的或自發(fā)的腫瘤的誘導(dǎo)(DigheAS等人，Inhibitionofcellularresponsivenesstointerferon-y(IFN-y)inducedbyoverexpressionofinactiveformsoftheIFN-yreceptor(1993)JBiolChem268:10645-53)。存在支持先前陳述的證據(jù)，例如，在具有經(jīng)移植的胂瘤的小鼠中注射抗IFN-y單克隆抗體顯示出阻斷了由LPS誘導(dǎo)的它們的排斥；移植的纖維肉瘤在用抗IFN-y單克隆抗體處理的小鼠中比在未處理的小鼠中更快速和更有效地生長；(-/-)IFN-YR或(-/-)STAT1敲除小鼠對于經(jīng)由甲基膽蒽(MCA)的腫瘤誘導(dǎo)的敏感性為對照小鼠的10-20倍，特別是這些小鼠相比于對照在更少的時間內(nèi)和在更低劑量的MCA時發(fā)展出更多的腫瘤(QinZ等人，Inhibitionofmethylcholanthrene-inducedcarcinogenesisbyanIFN-yreceptordependentforeignbodyreaction.(2002)JExpMed195:1479—90)。對IFN-y不敏感的腫瘤系比敏感的腫瘤系生長得快得多。腫瘤免疫排斥以與在敲除小鼠中非常相似的方式被抑制。腫瘤細胞是在這種實驗?zāi)Ｐ椭械呐懦^程之中.IFN-y的生理學(xué)靶標。IFN-y呈現(xiàn)對腫瘤具有直接影響的抗增殖和促凋亡性質(zhì)。IFN-y依賴性MHCI抗原呈遞增加的重要性以及在產(chǎn)生抗腫瘤應(yīng)答中Thl應(yīng)答誘導(dǎo)的重要性已在類似的腫瘤誘導(dǎo)模型中得到證明。關(guān)于使用構(gòu)成IFN-ct/C-Fico組合的部分的2種獨立有效成分的合理性，存在暗示I型IFNs(IFN-ot和IFN-P)在MS中的有利作用的證據(jù)?？共《拘?yīng)I型IFNs具有有效的抗病毒效應(yīng)，它們在細胞受病毒感染后被誘導(dǎo)，并且它們促進干擾RNA或DNA病毒復(fù)制的大量酶例如2'-5'寡腺苷酸合成酶的合成。這種早期應(yīng)答(對抗原非特異性的)在針對抗原的特異性應(yīng)答能夠完全控制感染之前限制病毒感染的擴展方面是關(guān)鍵的。關(guān)于感染在MS傾向性中的作用存在矛盾，例如Sieve等人(SieveAN等人，ChronicrestraintstressduringearlyTheiler'svirusinfectionexacerbatesthesubsequentdemyelinatingdiseaseinS幾mice.(2004)JNeuroimmunol.Oct;155(l-2):103-18)在SJL小鼠中的脫髓鞘疾病動物模型之中證實，用泰氏病毒感染產(chǎn)生了脫髓鞘事件的增強，相反地，已報道血吸蟲病在EAE模型中提供了針對MS的保護，觀察到由于曼氏血吸蟲(Sc//Woso鵬則iSO/7/)感染而產(chǎn)生的對于MS起始的直接抑制(TheFlammeAC等人，Schistosomiasisprotectsagainstmultiplesclerosis.(2004)MemInstOswaldoCruz;99(5Suppl1):33-6.Epub2004Oct13)?？乖鲋?、抗凋亡和細胞分化效應(yīng)IFN-ot和P可以影響所有細胞周期時期M、Gl和G2。當(dāng)成纖維細胞被血清、表皮生長因子(EGF)或胰島素刺激時，IFNs產(chǎn)生Gl期的延長，進入S期的速度降低并減緩S和G2期(BalkwillF等人，InterferonaffectsbothGlandS+G2incellsstimulatedfromquiescencetogrowth.(1978)Nature274:798-800;Gewert匪G等人，Inhibitionofcellproliferationbyinterferons1.EffectsoncelldivisionandDMsynthesisinhumanlymphoblasts(Daudi)cells(1984)EurJBiochem139:619-625)。在正常和腫瘤細胞中經(jīng)由IFN的細胞周期延長的累積效果產(chǎn)生白細胞淤積、細胞體積增力口和凋亡(0tsukiT等人，Humanmyelomacellapoptosisinducedbyinterferon-a.(1998)BrJHaematol103:518-529)。腫瘤細胞在將控制細胞周期的進展的一種或多種蛋白質(zhì)中顯現(xiàn)出改變。由IFN調(diào)節(jié)的原癌基因包括c-myc(RavehT等人，Double-strandedRNA-dependentproteinkinasemediatesc-MycsuppressioninducedbytypeIinterferons.(1996)JBiolChem271:25479-25484)、bcl-2(KoshijiM等人，Apoptosisofcolorectaladenocarcinoma(COL0201)bytumornecrosisfactor-alphaand/orinterferon-gammaresultingfromdown-regulationofBcl-2expression.(1998)ClinExpImunol111:211-218)、c-Ha-ras(SamidD等人,Biochemicalcorrelatesofphenotypicreversionininterferon-treatedmousecellstransformedbytohumanoncogene.(1984)BiochemBiophysResComm119.21-28)和c-src。在許多腫瘤中另一種重要的突變蛋白質(zhì)是成視網(wǎng)膜細胞瘤(Rb)蛋白質(zhì)。通過其與E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而引起的這種蛋白質(zhì)的高度磷酸化抑制細胞周期的進展；用IFN-oc處理產(chǎn)生這種高度磷酸化的抑制(KumarR等人，Interferon-ainducetheexpressionofretinoblastomageneproductinhumanBurkittlymphomaDaudicells:roleingrowthregulation.(1992)ProcNatlAcadSciUSA89:6599-6603;ResnitzkyD等人，Interferonsandinterleukin6suppressphosphorylationoftheretinoblastomaproteiningrowth-sensitivehematopoieticcells.(1992)ProcNatlAcadSciUSA89:402-406)。IFN-a效應(yīng)產(chǎn)生E2F、E2F-1蛋白質(zhì)的減少。在凋亡誘導(dǎo)中使用的途徑之一涉及Fas與FasL的結(jié)合，這導(dǎo)致包含死亡結(jié)構(gòu)域FADD的蛋白質(zhì)的募集和胱天蛋白酶例如胱天蛋白酶-8的后續(xù)活化。IFNs正調(diào)節(jié)Fas表達，并因此可以通過由Fas介導(dǎo)的凋亡途徑而起作用(WellerM等人，Anti-Fas/AP0-lantibody—mediatedapoptosisofculturedhumangliomacells.Inductionandmodulationofsensitivitybycytokines(1994)JClinInvest94:954-964)。Fas可以由IFN-ot正調(diào)節(jié)(GordonM等人，Treatmentwithinterferon-alphapreferentiallyreducesthecapacityforamplificationofgranulocyte-mecrophageprogenitors(CFU-GM)frompatientswithchronicmyeloidleukaemiabutnormalsparesCFU-GM.(1998)JClinInvest102:710-715),并且這個事件促進由Fas介導(dǎo)的凋亡(SelleriCMJ等人，F(xiàn)as-mediatedmodulationofbcr/ablinchronicmyeloidleukaemiaresultsindifferentialeffectsonapoptosis(1998)Blood92:981-989)?；蛘{(diào)節(jié)酶2-5寡腺苷酸合成酶(2-5A合成酶)、蛋白激酶(PKR)和p引咮胺2，3-雙加氧酶(ID0)由IFNs誘導(dǎo)，2-5A合成酶是IFN信號傳導(dǎo)的相對特異性標記(HasselBA等人，Adominantnegativemutantof2-5A-dependentRNasesuppressesanti-proliferativeandantiviraleffectsofinterferon(1993)EMB0J12:3297-3304)。潛伏的核糖核酸酶被2-5A活化；這些酶的誘導(dǎo)可以抑制RNA和蛋白質(zhì)合成酶促失活的核糖核酸酶(RNA酶-L)在細胞中的表達抑制IFNs的抗病毒和抗增殖效應(yīng)。凋亡在用不同凋亡試劑處理的無RNA酶-L的小鼠中被抑制(ZhouA等人,Interferonactionandapoptosisaredefectiveinmicedevoidof2'，5'—oligoadenylate—dependentRNaseI(1997)EMB0J16:6355-6363)。PKR的水平與不同的人腫瘤和腫瘤細胞系中的增殖活性反相關(guān)，并且在浸潤性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)少量PKR活性(HainesGKCR等人，Expressionofthedouble-strandedRNA-dependentproteinkinase(p68)inhumanbreasttissues.(1996)T翻rBiol17:5-12;Savi廳a0JB等人，AbnormallevelsandminimalactivityofthedsRM-activatedproteinkinase,PKR，inbreastcarcinomaeelIs(1999)IntBiochemCellBiol31:175-189)。PKR的表達可以受到IRF-1(由IFN誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子)的控制，因為IRF-1在生長期間的停滯階段時在細胞中快速增加，這可以影響參與細胞生長負控制的基因表達并且可以介導(dǎo)IFN的抗增殖效應(yīng)。色氨酸經(jīng)由IDO降解成quinurenin也與由于色氨酸耗竭而引起的蛋白質(zhì)合成的抑制和抗增殖效應(yīng)有關(guān)(ByrneG等人，Inductionoftryptophandegradationinvitroandinvivo:togamma-interferonstimulatedactivity.(1986)JInterferonRes6:389-396)。IFNs還在結(jié)腸癌的人細胞中負調(diào)節(jié)多抗藥性基因(mdrl)(SteinU等人，Modulationofmdrlexpressionbycytokinesinhumancoloncarcinomacells:anapproachforreversalofmulti-drugresistance.(1996)BrJCancer74:1384-1391)。核苷酸陣列已證實，bcr基因(斷裂點簇區(qū))也可以被IFN-a負調(diào)節(jié)(DerSD等人，Identificationofgenesdifferentiallyregulatedbyinterferon-oc，poryusingoligonucleotidearrays(1998)ProcNatlAcadSciUSA95:15623-15628)。免疫調(diào)節(jié)劑效應(yīng)產(chǎn)生IFN-y的細胞(Thl類型的細胞)的比例于在IFN-ot存在下培養(yǎng)并克隆的(ParronchiP等人，IL-4andIFNalphaandIFNgammaexertoppositeregulatoryeffectsonthedevelopmentofcytolyticpotentialbyThlorTh2humanTcellclones.(1992)JImmunol149:2977-2983)或經(jīng)由TCR/CD3復(fù)合物途徑直接刺激的(BrinkmannV等人，InterferonalphaincreasesthefrequencyofIFNgamma-producingCD4+Tcells(1993)JExpMed178:1655-1663)T細胞中增加。其他報道證實，IFN-a誘導(dǎo)IFN-Y。在IFN-y"敲除，，小鼠中，已觀察到炎癥和脫髓鞘的增加(TranEH等人,IFN-gammashapesimmuneinvasionofthecentralnervoussystemviaregulationofchemokines.(2000)JImmunol164:2759-2768)，這暗示了IFN-y在脫髓鞘自身免疫疾病例如MS中的保護作用，及其在顯示出IFN-Y增加的疾病中的后續(xù)有益作用，這與經(jīng)常歸因于其的致病性促炎作用相反。對效應(yīng)免疫細胞的影響IFNs增加免疫效應(yīng)物的所有細胞類型的有效性。這些包括細胞毒性T細胞和天然殺傷細胞(NK)?？贵w依賴性細胞毒性(ADCC)也可以由IFNs增加。除了人白細胞抗原(HLA)的分子的表達增加外，IFNs還直接增加關(guān)于腫瘤細胞的細胞毒性的相關(guān)T細胞的功能(KayagakiN等人，TypeIinterferonsregulatetumornecrosisfactor—relatedapoptosis-inducingligand(TRAIL)expressiononhumanTcells:anovelmechanismfortheanti-tumoraleffectsoftypeIInterferons(1999)JExpMed189:1451-1460)。IFNs增加NK細胞活性及單核細胞功能的能力已在體外和體內(nèi)得到證實。血管發(fā)生效應(yīng)IFN介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)的另一種組分是抑制血管發(fā)生。IFN-a的全身施用減少了在IFN敏感細胞中肺瘤細胞的生長速率，通過直接調(diào)節(jié)血管生成性蛋白質(zhì)bFGF的表達(DinneyCP等人，InhibitionofBasicfibroblastgrowthfactorexpression,angiogenesis，andgrowthofhumanbladdercarcinomainmice(1998)CancerRes58:808-814)。在臨床上，IFN-oc處理已成功誘導(dǎo)血管瘤消退，所述血管瘤是包含異常內(nèi)皮細胞的腫瘤(EzekowitzRAB等人，Interferonalpha-2btherapyfor1ife-threateninghemangiomasofinfancy(1992)NEnglJMed326:1456-1463)?？úㄎ魅饬?一種內(nèi)皮起源的贅生性疾病)也對IFN-oc治療有響應(yīng)(KrownSE.Interferon-a:evolvingtherapyforAIDS-associatedKaposi'sarcoma.(1998)JInterferonCytoResl8:209-214)。IFNs的抗腫瘤效應(yīng)已假定，其抗腫瘤效應(yīng)是對腫瘤細胞的功能能力或抗原組成進行直接影響的結(jié)果，或者是對與腫瘤細胞相互作用的免疫細胞群的調(diào)節(jié)進行間接影響的結(jié)果。然而，一定數(shù)目的由I型IFN誘導(dǎo)的基因參與凋亡并且包括PKR、PML、RAP46/Bag-1、磷脂爬行酶(scramblase)和低氧可誘導(dǎo)的a-l因子(DerSD等人，Identificationofgenesdifferentiallyregulatedbyinterferonot,Poryusingoligonucleotidearrays.ProcNatlAcadSciUSA(1998);95:15623-15628)。重要的是確定通過將IFNs與凋亡誘導(dǎo)試劑相組合是否可以增加體內(nèi)IFNs效應(yīng)。近期的研究(DunnGP等人，AcriticalfunctionfortypeIinterferonsincancerimmunoediting.(2005)NatureImmunol6:722-29)支持了I型IFN(IFNot/P)在腫瘤治療中的使用。這項研究將IFNcx/l3以及IFN-y鑒定為癌癥"免疫-編輯"過程中的關(guān)鍵組分。這個團體特別證實，在具有免疫能力的小鼠中，內(nèi)源產(chǎn)生的IFNsoc/P是高度免疫原性的MCA肉瘤的排斥所需的，并且還阻止由原始致癌物誘導(dǎo)的腫瘤的過度生長，因為宿主造血細胞是在保護性抗腫瘤應(yīng)答的發(fā)展期間IFNoc/P的關(guān)鍵靶標。人抗腫瘤效應(yīng)IFNs已在臨床實踐中起重要作用。作為單一試劑的IFN-a2的臨床上有益的治療活性已在許多疾病中得到證實。這些發(fā)現(xiàn)支持了IFNs作為增加癌癥患者的存活的第一種人蛋白質(zhì)。IFNs與其他藥物的組合已顯示出鼓舞人心的結(jié)果，以及新的和更有效的臨床應(yīng)用。當(dāng)與動物模型和細胞中的其他療法相組合時，IFNs已增加了在具有不同組織學(xué)的惡性疾病中的治療有效性。在大多數(shù)情況下，細胞數(shù)目或腫瘤大小的減少和存活的延長具有附加或協(xié)同效應(yīng)。IFNs對惡性血液學(xué)疾病的影響具有多毛細胞白血病(HCL)的患者的活力程度和生活質(zhì)量的改善導(dǎo)致在美國對于IFN所批準的第一個許可。超過85%的患者具有針對IFN-ot2的部分或完全血液學(xué)應(yīng)答的客觀證據(jù)(QuesadaJ等人，Treatmentofhairyeel1leukemiawithalphainterferon(1985)Blood1986:493-497)。在慢性髓樣白血病(CML)中，IFN-ot的應(yīng)用在大多數(shù)新近診斷的患者中產(chǎn)生重大的治療應(yīng)答(超過75%)(KantarjianHM等人，Chronicmyeloidleukemia:aconciseupdate(1993)Blood82:691-703;TalpazM.Useofinterferoninthetreatmentofchronicmyeloidleukemia.(1994)SeminOncol21:3-7)。在CML中的最佳結(jié)果已證實了使用IFN-ot2的顯著臨床應(yīng)答和細胞生成應(yīng)答(TalpazM.Useofinterferoninthetreatmentofchronicmyeloidleukemia.(1994)SeminOncol21:3-7)。對于持續(xù)治療，約25%的患者具有完全的細胞生成應(yīng)答，伴隨著費城(Ph)染色體的表達的喪失。顯示出細胞生成應(yīng)答(盡管不是完全應(yīng)答)跡象的應(yīng)答患者的平均存活為約6年超過90%的呈現(xiàn)出完全細胞生成應(yīng)答的那些患者具有超過10年的好轉(zhuǎn)期。10年的平均存活證實了與化學(xué)療法相比較的IFN-CC2的顯著益處(leukemiaTICSGoCM.Long-termfollow—upoftheItaliantrialofinterferon-alphaversusconventionalchemotherapyinchronicmyeloidleukemia.(1998)Blood92:1541-1548)。與對于Ph染色體陽性或陰性的骨髓增生紊亂相關(guān)的血小板增多可以用IFN—ct2力口以控制(LudwigH等人，TreatmentwithrecombinantIFNoc-2c:multiplemyelomaandthrombocythaemiainmyeloproliferativediseases.(1985)Oncology42(suppl1):19-25;Talpazm等人，RecombinantIFN-ot2therapyofchromosome-negativemyeloproliferativedisorderswiththrombocytosis.(1989)AraJMed86:554-558)。50%的先前未處理的多發(fā)性骨髓瘤患者對于使用IFN-ot2的療法有應(yīng)答(QuesadaJR等人，CollaborativephaseI-IIstudyofrecombinantDNA-producedleukocyteinterferon(cloneA)inmetastaticbreastcancer,malignantlymphoma,andmultiplemyeloma(1984)AmJMed77:427-432)。IFN-ct在具有不同組織學(xué)以及T和B細胞表型的淋巴瘤中具有治療作用(BordenEC.Innovativetreatmentstrategiesfornon-Hodgkin，slymphomaandmultiplemyeloma(1994)SemOncol21:14-22)。IFN-0C2在45。/。的具有晚期皮膚T細胞淋巴癌的患者中顯示出活性，在3-25個月時具有應(yīng)答(BordenEC.Innovativetreatmentstrategiesfornon-Hodgkin，slymphomaandmultiplemyeloma(1994)SemOncol21:14-22)。在分化不良的B細胞的淋巴瘤中，在用IFN-oc2治療后發(fā)現(xiàn)高于45%的應(yīng)答頻率(FoonKA等人，Treatmentofadvancednon-Hodgkin'slymphomawithrecombinantleukocyteainterferon.(1984)NEnglJMed311:1148-1152;(TConnellM，ColganJP，OkenMM等人，ClinicaltrialofrecombinantleukocyteAinterferonasinitialtherapyforfavorablehistologynon-Hodgkin'slymphomasandchroniclymphocyticleukaemia.AnEasternCooperativeOncologyGrouppilotstudy.(1986)JClinOncol4:128-136)。IFNs對實體瘤的影響在某些轉(zhuǎn)移性實體瘤的治療中，IFN-ot導(dǎo)致與最佳的化學(xué)治療劑等價的應(yīng)答。黑素瘤對于IFN-oc的應(yīng)答在2%-29%的范圍中變動(CreaganAND等人，PhaseIIstudyofrecombinantleukocyteinterferon(rIFN-alpha-A)indisseminatedmalignantmelanoma.(1984)Cancer54:2844-2849;RobinsonW等人，Treatmentofmetastaticmelanomawithrecombinantinterferonalpha2.(1986)Immunobiology172:275-282)。IFNs與激素、化學(xué)療法和/或IL-2的組合在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中可以增加應(yīng)答并延長存活，盡管其作為療法形式的整合受到其毒性的限制(LeghaSSRS等人，Developmentandresultsofbio-chemotherapyinmetastaticmelanoma:theUniversityofTexasM.D.AndersonCancerCenterexperience(1997)CancerJSciAm;3(suppl1):S9-S15)。在轉(zhuǎn)移性腎癌中，已使用了IFN-cc、IFN-ct+IL-2組合、IFN-a+IFN-y組合療法，但梅塔分析(meta-analysis)的結(jié)果暗示，用IFN-oc治療的患者具有比用組合療法治療的患者具有更佳的應(yīng)答，這主要是由于它們的毒性(HembergM等人，Regimenswithorwithoutinterferon-alphaastreatmentformetastaticmelanomaandrenalcellcarcinoma:anoverviewofrandomizedtrials(1999)JImm翻ther22:145-154)。在自然界中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的有機起源的生物活性物質(zhì)構(gòu)成了基本有效成分，其可以充當(dāng)具有基于個體自身的固有治愈潛力的形成的治療機制的藥物。這種方法基于使用用于促進、釋放或刺激個體的能力的生物調(diào)節(jié)產(chǎn)物和操作，以達到在該疾病中被改變的功能穩(wěn)態(tài)平衡的恢復(fù)。通過生理學(xué)機制和途徑，這些有效成分和生物應(yīng)答修飾劑的合理使用具有幫助患者以漸進和逐步的方式恢復(fù)被改變的功能的規(guī)律性的目的。在治療性質(zhì)的用途。這些生物藥物可以是天然起源的復(fù)雜混合物、或在工業(yè)中濃縮或半純化的分離的組分，其具有呈現(xiàn)可能治療應(yīng)用的一種或多種已知或提及的藥理學(xué)活性的共同特征，這是C-藻藍蛋白(C-Phyco)的情況。C-Phyco是與在綠-藍藻中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)合的色素。C-Phyco單體與2個不同的蛋白質(zhì)亞基a和P連接，包含至少3個共價連接的膽汁三烯生色團的和無金屬絡(luò)合物的四吡咯開鏈(DuerringM等人，Isolation,crystallization,crystalstructurean焱lisisandrefinementofconstitutivec-phycocyaninfromthechromaticallyadaptingCyanobacteriumfremyelladiplosiplonat1.66Aresolution(1991).JMolBiol;217:577-92)。這種輔基占約4%的藻類質(zhì)量，這表明存在約16個生色基團/分子量單位(0hEochaC.Phycobilins.In:LewinRA,editor.PhysiologyandBiochemistryofAlgae:NewCork:AcademyPress,1962:421-35)。存在4種不同的結(jié)構(gòu)形式單體、三聚體、六聚體和十聚體(MacCollR等人，Phycobiliproteins.BocaRat6n:CRCPress,1987:I-IO)，其是藍-綠藻中最豐富的色素(超過20%的藻類干重)(RichmondA.Largescalemicroalgalcultureandapplications.In:RoundChapman,editors.ProgressinPhycologicalResearch.Vol.7BiopresLtd.，1990:8)。C-Phyco中膽汁三烯生色團的化學(xué)結(jié)構(gòu)(四吡咯開鏈)非常類似于膽紅素。Stocker等人(StockerR等人，Bilirrubinisanantioxidantofpossiblephysiologicalimportance(1987)Science;235:1043-6)據(jù)報道，膽紅素是具有生理學(xué)重要性的可能的抗氧化劑，因為它可以消除過氧化物原子團，將它們遞送給與四吡咯分子的c-io結(jié)合的氫原子，從而形成有著具有共振穩(wěn)定性的中央碳原子團，所述共振穩(wěn)定性擴展至整個膽色素分子。眾所周知，活性氧類別(0RS)參與醫(yī)學(xué)中的各種重要過程，包括炎癥、動脈粥樣硬化、癌癥、由于再灌注而引起的損傷(KehrerJP.Freeradicalsasmediatorsoftissueinjuryanddisease(1993)CritRevToxicol23:21-48)。物質(zhì)可以干擾這些過程的途徑之一是通過其作為抗氧化劑或自由基清除劑的作用?？寡趸?yīng)關(guān)于C-Phyco的抗氧化和抗炎性質(zhì)的第一篇報道由Romay等人完成(RomayC等人,Antioxidantandanti-inflammatorypropertiesofC-phycocyaninfromblue-greenalgae(1998)InflammRes47(1):36-41),其評估了C-Phyco"在體外"和"在體內(nèi)"作為抗氧化劑的潛力。C-Phyco能夠清除羥基(IC5q=0.91mg/ml)(IC5。:誘導(dǎo)過氧化損害的50%抑制的添加物濃度)，和烷氧基(IC5。=76|jg/ml),活性類似于0.125mg/ml二甲亞砜(DMS0)和0.038|ag/mlTrolox,所述DMS0和Trolox分別是這些原子團的特異性清除劑。C-Phyco還抑制肝微粒體脂質(zhì)過氧化(IC5。=12mg/ml)(HalliwellB.Howtocharacterizeabiologicalantioxidant.(1990)FreeradResCoram;9:1-32)。有興趣的是強調(diào)C-Phyco的氧清除活性為何正好為超氧化物歧化酶(SOD)的3分之一，向C-Phyco中添加SOD不改變其抗氧化能力，這暗示了不同的作用機制。其抗氧化作用的另一個指示是以位點特異性方式抑制脫氧核糖的損害的能力。在脫氧核糖測定法中，對于C-Phyco所計算的速率常數(shù)類似于對于某些非類固醇抗炎藥物例如吲哚美辛和布洛芬使用相同方法所獲得的那種(L8xl(TMl1)(ParijN等人,Linearandnonlinearcompetitionplotsinthedeoxyriboseassayfordeterminationofrateconstantsforreactionofnonsteroidalanti-inflammatorydrugswithhydroxy1radicals(1995).FreeRadHead;23:571-9)。同一個團體最近已報道，C-Phyco以與非常眾所周知的抗氧化劑Trolox和抗壞血酸類似的方式抑制由2，2'-偶氮二(脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)引起的紅細胞溶血(RomayC等人，Phycocyaninisanantioxidantprotectiveofhumanerythrocytesagainstlysisbyperoxylradicals(2000)JPharmPharmacol52:367-368)?；贗Cs。值，證實C-Phyco是有效性為Trolox的16倍和抗壞血酸的約20倍的抗氧化劑。這些發(fā)現(xiàn)被另一項研究所證實(HirataT等人，AntioxidantactivitiesofPhycocyanobi1inpreparedfromSpirulinaplatensis(2000)JApplPhycol435-439)，所述研究證實藻藍膽素(C-Phyco的組分)的抗氧化劑活性在摩爾量方面高于otTocoferol。藻藍膽素的抗氧化效應(yīng)在疏水系統(tǒng)中或使用磷脂酰膽堿脂質(zhì)體針對亞油酸曱酯的氧化進行評估。該研究還顯示，來自噴霧干燥的螺旋藻(i^'r"/Z/7a)的C-Phyco具有與來自新鮮螺旋藻的C-Phyco相似的抗氧化活性。這些結(jié)果暗示，C-Phyco的抗氧化劑活性可歸因于藻藍膽素(C-Phyco的輔基)，因為脫輔基蛋白質(zhì)組分在干燥處理過程中可以變性。干燥的C-Phyco顯示出與完整蛋白質(zhì)相似的活性水平這一事實使得C-Phyco的制備和使用在商業(yè)上是可行的。根據(jù)Reddy等人(ReddyCM等人，Selectiveinhibitionofciclooxygenase-2byC-phycocyanin,abiliproteinfromSpirulinaplatensis(2000)BiochemBiophysResCommun3:599-603)的結(jié)果，來自鈍頂螺旋藻(5^/ru〃/a;7/^e/^")的C-Phyco是具有非常低的IC5。COX-2/IC5。COX-l(0.04)比的環(huán)加氧酶-2(C0X-2)選擇性抑制劑。有趣的是，這項研究顯示，由C-Phyco對于COX-2所達到的抑制值IC5。比非常眾所周知的COX-2選擇性抑制劑塞來考昔(255nM)和羅非考昔(401nM)小得多(180nM)。C-Phyco脫輔基蛋白質(zhì)組分負責(zé)COX-2抑制，因為藻藍膽素和還原型C-Phyco是無效的。作者暗示，在該文獻中報道的C-Phyco的抗關(guān)節(jié)炎、抗炎和保肝性質(zhì)部分地是由于COX-2選擇性抑制性質(zhì)，盡管他們不排除C-Phyco通過其有效地消除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的能力而具有類似效應(yīng)。C-Phyco以劑量依賴性方式抑制魯米諾放大的化學(xué)發(fā)光(LCL)，可能通過其消除在吞噬細胞的呼吸爆發(fā)期間增加的自由基(OH.、H202、RO.)和過氧化物的能力。然而，還可能的是，C-Phyco可以通過其他途徑減少LGL水平，例如影響參與由激活的吞噬細胞產(chǎn)生活性氧類別的酶、NADPH氧化酶和髓過氧化物酶，或者干擾活化劑的結(jié)合或花生四烯酸代謝途徑。近來，在炎癥動物模型中證明，C-Phyco抑制了白三烯B4(LTB4)的釋放。已在"體外"模型中評估了由過氧化物誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答，以鑒定具有&02和0H的潛在清除效應(yīng)的試劑。在小鼠爪中注射的葡萄糖氧化酶(G0)與內(nèi)源葡萄糖反應(yīng)并產(chǎn)生H202，伴隨著0H原子團的順次產(chǎn)生；兩者負責(zé)組織損傷和伴隨的炎癥變化(SpillertCR等人，Aperoxide-inducedinflammationmodelfordrugtesting(1987)21:297-8)。C-Phyco減少葡萄糖氧化酶在小鼠爪中誘導(dǎo)的水腫。這種抗炎效應(yīng)可能至少部分由于羥基的消除。由&02誘導(dǎo)的許多體內(nèi)損傷是由于其轉(zhuǎn)化成強反應(yīng)性氧化劑(主要是0H)，這是常見的一致意見(HalliwellB.Howtocharacterizeabiologicalantioxidant(1990)FreeRadResComm9:1-32),因此，C-Phyco的OH清除作用對于其抗炎作用可能是重要的?？寡仔?yīng)C-Phyco是在螺旋藻中發(fā)現(xiàn)的藻膽素。鑒于這種微型藻類在許多國家(包括古巴)用作營養(yǎng)補充物，可以設(shè)想C-Phyco也可以在具有重要的炎癥因子的疾病中使用，因為存在關(guān)于其抗炎活性的報道(GonzdlezR等人，Anti-inflammatoryactivityofPhycocyaninextractinaceticacid-inducedcolitisinrats.(1999)PharmHead39;1:55-59)。Gonz"ez等人評估了C-Phyco提取物在乙酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中的效應(yīng)，所述乙酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎是模擬在潰瘍性結(jié)腸炎中觀察到的某些急性炎癥反應(yīng)的動物模型(FrettlandDJ等人，Eicosanoidsandinflammatoryboweldisease:regulationandprospectsfortherapy(1990)ProstLeukotrEssFattyAcids;41:215-33)。在這項研究中最重要的發(fā)現(xiàn)是，C-Phyco減少大鼠中的乙酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，這是C-Phyco的抗結(jié)腸炎效應(yīng)的第一篇報道，這經(jīng)由其組織學(xué)特征以及通過結(jié)腸組織的結(jié)構(gòu)分析進行評估并且通過髓過氧化物酶(MP0)活性測量加以證實。在這項研究中，在用C-Phyco治療的具有結(jié)腸炎的動物的受損結(jié)腸粘膜中發(fā)現(xiàn)嗜中性粒細胞浸潤和MPO活性的顯著減少，這支持了其對于這種病狀的有利作用。使用相同的劑量范圍，在大鼠爪中的角叉菜誘導(dǎo)的水腫之中和在大鼠中的棉絨肉芽肺(cottonspeckgranuloma)之中也已發(fā)現(xiàn)C-Phyco的抗炎活寸生(RomayCh等人，F(xiàn)urtherstudiesonanti—inflammatoryactivityofphycocyanininsomeanimalmodelsofinflammation(1998)InflammHead47(8):334-8)。在這些炎癥實驗?zāi)Ｐ鸵约皩嶒炐越Y(jié)腸炎中，花生四烯酸的代謝物起重要作用。C-Phyco以劑量依賴性方式顯著減少在大鼠中由花生四烯酸誘導(dǎo)的耳水腫，以及由角叉菜誘導(dǎo)的大鼠爪水腫。C-Phyco還在棉絨亞慢性肉芽腫測定法中顯示出抗炎活性，其中將無菌的棉絨植入大鼠腋窩中。口服施用C-Phyco在每種所測試的模型中導(dǎo)致顯著的抗炎活性。觀察到的抗炎活性歸因于C-Phyco的氧清除和抗氧化活性，并且可能是由于其對花生四烯酸代謝的抑制作用。其他報道已評估了衍生自其所提及的抗氧化和抗炎效應(yīng)的C-Phyco在防止化學(xué)誘導(dǎo)的肝損害中的作用(VadirajaBB等人，HepatoprotectiveeffectofC-Phycocyanin:ProtectionforcarbontetrachlorideandR-(+)-pulegone-mediatedhepatotoxicityinrats(1998)BiochemandBiophysResCom249:428-431)。Vadiraja等人研究了C-Phyco對于在大鼠中由R-(+)-長葉薄荷酮和CC"誘導(dǎo)的肝毒性的影響。在這項研究中，在施用R-(+)-長葉薄荷酮(250mg/kg)或CC14(0.6ml/kg)前1-3小時給大鼠腹膜內(nèi)施用的單次劑量的C-Phyco(200mg/kg)明顯減少由這些化學(xué)試劑產(chǎn)生的肝毒性。已暗示，這2種試劑通過產(chǎn)生自由基而引起肝毒性。保肝效應(yīng)因此，C-Phyco的保肝效應(yīng)歸因于參與反應(yīng)性代謝物產(chǎn)生的反應(yīng)的抑制并可能歸因于其自由基去除活性。C-Phyco抑制參與反應(yīng)性代謝物的形成、由細胞色素P450介導(dǎo)的某些反應(yīng)。在這種情況下，還可能的是，C-Phyco可以充當(dāng)有效的自由基去除劑。近來，Bhat等人(BhatVB等人,C-phycocyanin:apotentperoxylradicalscavengerinvivoandinvitro(2000)BiochemBiophysResComun1:20-25)報道了，C-Phyco"在體內(nèi)"抑制在大鼠肝中由CCh誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，這種抑制是濃度依賴性的，其ICs。為11.35juM。這些研究已清楚地證實，C-Phyco是有效的過氧化氫原子團去除劑，其恒速率為1.54,而關(guān)于尿酸(眾所周知的過氧化氫原子團去除劑)為3.5。提議抗氧化防御機制的降低以及活性氧和氮類別的增加是與年齡和坤申經(jīng)變性疾病相關(guān)的功能衰退的病因(HarmanD.Aging:totheorybasedonfreeradicalandradiationchemistry.(1956)JGerontol11:289-300;LeibovitzBE等人,Aspectsoffreeradicalreactionsinbiologicalsystems:aging(1980)JGerontol35:45-56;AmesBN等人,Oxidants,antioxidants,andthedegenerativediseasesofaging(1993)ProcNatlAcadSciUSA90:7915-7922)。越來越多的證據(jù)暗示，炎癥過程與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(SNC)的氧化性損傷有關(guān)。注射超氧化物歧化酶這種抗氧化酶減少了某些動物模型中的炎癥?？寡趸瘎┰黾用庖吖δ艿哪承﹨?shù)，當(dāng)它們"在體外"加入至分離的免疫細胞中時或當(dāng)它們作為補充物"在體內(nèi)"給予動物和人時(IanSN等人，Antioxidant,cytokines,andinfluenzainfectioninagedmiceandelderlyhumans(2000)JInfectDis182:S74—S80)?？赡艿牟艓字剖菍γ庖哒{(diào)節(jié)分子例如細胞因子的生產(chǎn)的抗氧化效應(yīng)。細胞因子響應(yīng)于腦損傷而被誘導(dǎo)，并且它們可以介導(dǎo)和抑制細胞損傷，從而促進恢復(fù)。許多臨床試驗報道了在具有腦損傷或梗死的患者的腦脊液(CSF)或死后大腦組織中細胞因子表達增加。證據(jù)表明，促炎細胞因子例如IL-1和TNF隨著年齡而增力口(LynchMA.Age-relatedimpairmentinlong-termpotentiationinhippocampus.Aroleforthecytokine,interleukin-1P(1998)ProgNeurobiol56:571-589;KnoblachSM等人，Earlyneuronalexpressionoftumornecrosisfactor-otafterexperimentalbraininjurycontributestoneurologicalimpairment.(1999)JNeuroimmunol95:115—125)。在Sp中發(fā)現(xiàn)的所有化合物中，C-Phyco具有最高的抗氧化活性，如在疏水系統(tǒng)中針對亞油酸曱酯的氧化所評估的(HirataT等人，Antioxidantactivitiesofphycocyanobi1inpreparedfromspirulinaplatensis(2000)JApplPhycol12:435-439)。在一項研究(GemmaC等人，Dietsenrichedinfoodswithhighantioxidantactivitytobereviewedage-induceddecreasesincerebellarP-adenergicfunctionandincreasesinpro-inflammatorycytokines.(2002)JNeurosci22;14:6114-6122)中，在14天期間用僅基于Sp的飲食喂養(yǎng)的344只老年Fischer大鼠，顯示出小腦中P-腎上腺素能受體功能的改善、促炎細胞因子的減少(通過TNF-a和TNF-P的mRNA水平的減少所證明的)和氧化性損傷的標記物丙二酰二醛(MDA)水平的減少。這些事件在用補充有等量黃瓜的飲食或具有低水平的0RAC(活性氧吸收能力)的食物喂養(yǎng)的大鼠中不發(fā)生。神經(jīng)保護效應(yīng)近期的、復(fù)雜的和有趣的研究顯示，口服施用C-Phyco(lOOmg/kg)在大鼠中阻止在大鼠海馬中由紅藻氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)性和行為，這暗示了對神經(jīng)元的保護效應(yīng)。該研究顯示，C-Phyco減少實驗性癲癇病狀，這暗示了在治療某些類型的癲癇中的可能治療參與。根據(jù)這些作者(RimbauV等人，ProtectiveeffectofC-phycocyaninagainstkainicacid—inducedneuronaldamageinrathippocampus(1999).NeuroscienceLetters;276:75-78),紅藻氨酸引起導(dǎo)致產(chǎn)生活性氧類別的興奮性神經(jīng)毒性。因此，他們假設(shè)C-Phyco在神經(jīng)元損害中的保護作用可能是由于自由基的消除及其抗氧化性質(zhì)。這項研究中令人感興趣的特征是發(fā)現(xiàn)口服施用C-Phyco穿過血腦屏障而對海馬發(fā)揮作用。這些發(fā)現(xiàn)和C-Phyco實質(zhì)上缺乏毒性暗示，這種光化學(xué)物質(zhì)可以用于治療神經(jīng)變性疾病，例如阿爾茨海默病和帕金森病，它們的特征在于由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元損害?？惯^敏效應(yīng)除了由其已詳細提及的抗氧化性質(zhì)介導(dǎo)的C-Phyco的抗炎性質(zhì)外，還已報道了C-Phyco對于誘導(dǎo)的過敏性炎癥應(yīng)答和對于分離的大鼠肥大細胞的組胺釋放具有抗炎作用(RemirezD等人，Roleofhistamineintheinhibitoryeffectsofphycocyanininexperimentalmodelsofallergicinflammatoryresponse(2002)MediatorsofInflammation,11:81-85)。在"體內(nèi)"實驗中，C-Phyco在用卵白蛋白(Ova)攻擊前1小時施用于先前有Ova致敏的小鼠的耳中。1小時后，評估耳中的MP0活性和水腫。C-Phyco顯著減少2種參數(shù)并抑制分離的大鼠腹膜肥大細胞的組胺釋放。C-Phyco的效應(yīng)是劑量依賴性的。增加的對于血漿蛋白質(zhì)血管通透性是其中肥大細胞起重要作用的過敏性炎癥反應(yīng)的特征之一，因為它們可以在大鼠和小鼠中分泌預(yù)先形成的血管活性介質(zhì)，主要是組胺和5-羥色胺(HalpernBN等人，Onthenatureofthechemicalmediatorsinvolvedinanaphylacticreactioninmice.(1963)BrJPharmacol20:389-398;0huchiK等人，Pharmacologicalanalysisofthevascularpermeabilityresponseintheanaphylacticphaseofallergicinflammationinrats(1985)EurJPharmacol117:337-345)。已證實，肥大細胞還包含預(yù)先形成的細胞因子，尤其是例如TNF-a和血管通透因子/血管內(nèi)皮細胞生長因子，所述細胞因子可以在IgE依賴性反應(yīng)中分泌并且可以在過敏性炎癥反應(yīng)期間產(chǎn)生肥大細胞效應(yīng)物和免疫調(diào)節(jié)能力。在這種反應(yīng)中，來自肥大細胞的新近合成的脂質(zhì)介質(zhì)的參與也是重要的，所述脂質(zhì)介質(zhì)例如為前列腺素D2、白三烯(LTC4、LTD4、LTE4、LTB4)和血小板活化因子(PAF)、和活性氧類別(R0S)(WilliamsCM等人，Thediversepotentialeffectorandimmunoregulatoryrolesofmastcellsinallergicdiseases.(2000)JAllergyClinImmunol105:847-859;FantozziR等人，Mastcellandneutrophilinteractions:aroleforsuperoxideanionandhistamine.(1985)AgentsActions16:260-264)。C-Phyco在小鼠耳中在花生四烯酸誘導(dǎo)的炎癥測定法中減少前列腺素D2和LTB4的水平(RomayC等人，EffectsofphycocyaninextractonprostaglandinE2levelsinMouseearsinflammationtest.(2000)ArzneimForsch/DrugHead50:1106—1109;RomayC等人，PhycocyaninextractreducesleukotrienesB4levelsinarachidonicacid-inducedmouseearinflammationtest(1999)JPharPharmacol51:64卜642)。C-Phyco對于分離的大鼠肥大細胞組胺釋放的抑制效應(yīng)支持了這種事件在C-Phyco作為抗炎劑的作用機制中的貢獻。存在關(guān)于如下事實的證據(jù)ROS例如超氧陰離子、過氧化氫、羥基和過氧化氫基團可以起始花生四烯酸級聯(lián)、PAF合成或組胺釋放。已證實，ROS使肥大細胞脫粒，從而允許組胺、5-羥色胺、TNF-ot及其他炎癥介質(zhì)的釋放。C-Phyco能夠清除過氧化物、羥基和烷氧基(LissiEA等人,Kineticsofphycocyaninbi1ingroupsdestructionbyperoxylradicals.(2000)FreeRadicBiolMed28:1051-1055)。除了關(guān)于C-Phyco經(jīng)證實的抗氧化、抗炎和抗過敏性質(zhì)外，還已觀察到抗腫瘤性質(zhì)?？拱┬?yīng)Schwartz等人(SchwartzJ等人，Regressionofexperimentalhamstercancerbybetacaroteneandalgaeextracts.(1987)OralJMaxillofacSurg;45:510—515)研究了施用250jig螺旋藻提取物在由DMBA(7，12-二甲基苯并蒽)誘導(dǎo)的鱗狀細胞口腔癌中的作用，其他處理包括注射P-胡蘿卜素、角黃素和13順式視黃酸。所有處理在4周期間每周應(yīng)用2次。在處理結(jié)束時，在30%的用提取物處理的動物、20%的用p-胡蘿卜素處理的動物和15%的用角黃素處理的動物中存在腫瘤的完全消退。在剩余70%的用提取物處理的動物中存在部分腫瘤消退。在這項研究中令人感興趣的觀察結(jié)果是，藻類提取物比單獨的胡蘿卜素更有效，這暗示了連同藻類的幾種組分一起的協(xié)同效應(yīng)。在同一個團體的另一項研究(SchwartzJ等人，Algae-derivedphycocyaninisbothcytostaticandcytotoxictooralsquamouseel1carcinoma(humanorhamster)(1987).JDentHead66:160)中，他們證實源自藻類的C-Phyco具有針對鱗狀細胞癌(在人和倉鼠中)的抑制細胞和細胞毒性能力。在一項研究(LiuAND等人，InhibitoryeffectofphycocyaninfromSpirulinaplatensisonthegrowthofhumanleukemiaK562cells(2000)JApplPhycol12:125-130)中，來自鈍頂螺旋藻的C-Phyco抑制人白血病K562細胞系的生長。最初通過在半固體瓊脂培養(yǎng)中以20、40、80和169mg—的濃度跟蹤K562細胞的生長研究了C-Phyco的效應(yīng)。結(jié)果顯示，C-Phyco以劑量依賴性方式抑制K562白血病細胞的生長，在80和160mg'時觀察到統(tǒng)計學(xué)上顯著的抑制。C-Phyco的效應(yīng)還在還原染料XTT測定法中使用細胞生存力進行了研究。再一次地，C-Phyco以劑量依賴性方式抑制細胞生存力。C-Phyco的I"值是72.5mg—\基于DM含量分析的流式細胞術(shù)實驗揭示出，當(dāng)細胞與C-Phyco一起溫育6天時，K562細胞的積聚在G-l期中發(fā)生。在G-l期中細胞的最高百分比出現(xiàn)在40和80mg—'的C-Phyco濃度時。DNA片段化分析未顯示典型的凋亡步進模式，這表明在這種抑制中可能涉及不同的機制。先前的研究報道了C-Fico對于COX-2的選擇性抑制(ReddyCM等人，Selectiveinhibitionofciclooxygenase-2byC-phycocyanin，abi1iproteinfromSpirulinaplatensis(2000)BiochemBiophysResCommun3:599-603)，在這項研究中，并且基于這種性質(zhì)，該團體(Bobbi1iV.V等人,Phycocyanin-mediatedapoptosisinAK-5tumorcellsinvolvesdown-regulationofBcl-2andgenerationofROS.(2003)MolCancerTherapy2:1165-1170)研究了C-Phyco對于大鼠的組織細胞增生腫瘤細胞系的影響。與先前研究的結(jié)果不同，當(dāng)?shù)蛲霾唤閷?dǎo)抗腫瘤效應(yīng)時，C-Phyco誘導(dǎo)了AK-5細胞的程序性凋亡死亡；這種程序涉及胱天蛋白酶-3活化。由C-Phyco介導(dǎo)的凋亡死亡通過ROS的產(chǎn)生來誘導(dǎo)。凋亡抑制劑Bcl-2調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生。用Bcl-2基因轉(zhuǎn)染的AK-5細胞變得對于經(jīng)由C-Phyco誘導(dǎo)的死亡有抗性。Bcl-2的過表達抑制在用C-Phyco處理的AK-5細胞中的ROS產(chǎn)生，這證實在AK-5細胞中由C-Phyco誘導(dǎo)的凋亡通過調(diào)節(jié)自由基產(chǎn)生而被Bcl-2抑制。由于其對腫瘤細胞的凋亡活性，C-Phyco以及COX-2的其他抑制劑可以用作可能的化學(xué)治療劑。關(guān)于C-Phyco的抗癌性質(zhì)的最近期的研究由Subhashini等人報道(JaguSubhashini等人，MolecularmechanismsinC-Phycocyanininducedapoptosisinhumanchronicmyeloidleukemiacellline—K562.(2004)BiochemPharmac68:453—462)，他們評估了高度純化的C-Phyco對于人慢性髓樣白血病細胞系K562的生長和增殖的影響。結(jié)果表明，用50|aMC-Phyco處理的K562細胞的增殖在48小時內(nèi)顯著減少(49%)。此外，電子顯微術(shù)和熒光研究揭示了凋亡特征例如細胞收縮、膜突起和核凝聚。用C-Phyco處理的細胞的基因組DNA電泳顯示出凋亡細胞的典型的片段化模式。在48小時期間使用25和50iaMC-Phyco的凋亡細胞的流式細胞術(shù)分析分別顯示出14.11和20.93%的在亞G0/G1期中的細胞。用C-Phyco處理K562細胞還導(dǎo)致細胞色素C釋放至胞質(zhì)溶膠中和多(ADP)核糖聚合酶(PARP)的破裂。這項研究還顯示出抗凋亡的Bcl-2的減少但沒有促凋亡的Bax的任何變化，因此Bcl-2/Bax比有利于凋亡。C-Phyco的效應(yīng)似乎由C-Phyco通過未知機制進入胞質(zhì)溶膠中來介導(dǎo)。本研究還證實，C-Phyco通過將細胞色素C從線粒體釋放到胞質(zhì)溶膠中、PARP的破裂和Bcl-2的減少而在K562中誘導(dǎo)凋亡。才艮才居一項曰本專利(DainipponInk&Chemicals,Inc.(DIC).Anti-t認oralagentscontainingphycobillin.(1983)JapanesePatentNot.58-65216)，口服施用C-Phyco增加了注射有肝胂瘤細胞的小鼠的存活。處理組中的淋巴細胞活性明顯高于對照組，這暗示免疫系統(tǒng)的某一程度的刺激。C-Phyco的其他性質(zhì)在不同研究中得到證實Cheng-Wu等人(Cheng-wuZ等人,TheeffectsofpolysaccharideandphycocyaninfromSpirulinaplatensisonperipheralbloodandhematopoieticsystemofbonemarrowinmice.(1994).BookofAbstracts.SecondAsiaPacificConferenceonAlgalBiotechnology;58)在關(guān)于多糖和C-Phyco在小鼠造血系統(tǒng)的外周血和骨髓中的影響的初步研究中證實C-Phyco具有高的促紅細胞生成素(EP0)樣活性。發(fā)明描述本發(fā)明描述了生物調(diào)節(jié)性藥物化合物用于促進、解放或恢復(fù)個體的受影響的能力的用途，以便達到已被疾病改變的功能穩(wěn)態(tài)平衡的恢復(fù)。該化合物在其制劑方面是獨創(chuàng)的，因為它由與天然起源的產(chǎn)物相組合的屬于千擾素家族的蛋白質(zhì)形成，所述天然起源的產(chǎn)物在本發(fā)明中已證實了其在治療自身免疫和過敏性疾病以及癌癥中的有效性。本發(fā)明提及的化合物由a干擾素(IFN-ct)(具體而言，重組IFNcc-2b)和C-藻藍蛋白組成，其可以包括在藥物組合中以用于與合適的賦形劑一起腸胃外或口服施用。上述藥物組合可以用作治療方法，通過在同一個個體中分開施用活性組分以用于單一治療。在實驗性自身免疫性腦炎(EAE)模型中的具體研究中，該組合的組分通過不同途徑施用；IFN-ct腹膜內(nèi)給予，和C-藻藍蛋白作為同一治療的一部分而口服提供。所述組分的通過不同途徑的分開施用，以及它們作為藥物制劑的一部分使用相同劑量通過單一途徑的施用沒有顯示出顯著差異。這證實，施用途徑?jīng)]有影響，并且所述組合也可以通過肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、鼻和鞘內(nèi)途徑進行施用。本發(fā)明的獨創(chuàng)性在于證實了IFN-a/C-Phyco藥物制劑及其分開的有效成分在誘導(dǎo)適應(yīng)性和天然調(diào)節(jié)T細胞中的作用。對于IFN-ot已提出了免疫系統(tǒng)的這種重要性質(zhì)，但在本發(fā)明中，除了關(guān)于IFN-oc證實了這點外，我們首次報道了C—藻藍蛋白對于調(diào)節(jié)T細胞的誘導(dǎo)，證實這2種組分在IFN-a/C-Phyco藥物化合物中的協(xié)同效應(yīng)。這支持了其在產(chǎn)生調(diào)節(jié)T細胞(rTc)數(shù)目或功能的減少的疾病中的用途，例如其中危象的發(fā)展被阻止的過敏性和自身免疫疾病，特別是在這些疾病的復(fù)發(fā)形式中。因此，通過本發(fā)明我們能夠同時恢復(fù)在過敏性和自身免疫疾病中由于免疫調(diào)節(jié)的喪失而被破壞的效應(yīng)物-調(diào)節(jié)劑平衡，同時干預(yù)這些疾病的發(fā)病機理的不同階段，其中在文獻中關(guān)于IFN-a和C-藻藍蛋白所描述的抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化性質(zhì)經(jīng)由這2種有效成分的組合而得到加強。另一方面，本發(fā)明證實了就它們的抗增殖、抗氧化和抗炎性質(zhì)以及它們的腫瘤細胞凋亡誘導(dǎo)能力而言，與獨立組分的活性相比較，IFN-ot/C-Phyco藥物制劑的協(xié)同效應(yīng)。在這種情況下，本發(fā)明的新穎性在于，關(guān)于它們在腫瘤細胞中的抗增殖和凋亡誘導(dǎo)性質(zhì)，所述藥物化合物顯示出具有比獨立組分明顯更高的抗癌作用。這由p53和稍后的p21這些蛋白質(zhì)的正調(diào)節(jié)而得到證明，所述p53和p21是維持細胞周期停滯在G2/M期和DNA損傷后的凋亡所必需的。此外，關(guān)于不同起源的腫瘤系的生長抑制，顯示了IFN-oc/C-Phyco化合物的統(tǒng)計上顯著的協(xié)同抗增殖和劑量依賴性效應(yīng)。C-Phyco的最廣泛研究的作用之一是其在體外和體內(nèi)測試中的抗氧4匕能力(RomayC等人，Antioxidantandanti—inflamraatorypropertiesofC-Phycocyaninfromblue-greenalgae(1998)InflammHead47(1):36-41)。C-Phyco能夠消除羥基和烷氧基，其清除劑活性與這些原子團的其他特異性消除劑相同。C-Phyco還抑制肝微粒體脂質(zhì)過氧化(HalliwellB.Howtocharacterizeabiologicalantioxidant.(1990)FreeradHeadComm;9:1-32)。C-Phyco在腫瘤細胞中的抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗增殖效應(yīng)和凋亡誘導(dǎo)能力被視為主要由其有效的抗氧化活性所介導(dǎo)。這可以解釋C-Phyco的抗癌作用，因為大多數(shù)腫瘤性轉(zhuǎn)化過程具有慢性炎性組分和表現(xiàn)出顯著的氧化應(yīng)激的其他要素。這些是對于理解細胞周期和凋亡機制的調(diào)節(jié)在贅生物的生長和發(fā)展中為何重要的關(guān)鍵方面。這些信號傳導(dǎo)點讓位于導(dǎo)致程序性細胞死亡的途徑的激活，如果細胞損傷未修復(fù)(PietenpolJA，StewartZA.Cellcyclecheckpointsignaling:cellcyclearrestversusapoptosis.(2002)Toxicology181-182:475-481)。IFN-a對于腫瘤細胞的抗增殖和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)是非常眾所周知的。它們產(chǎn)生Gl期的延長，進入S期的速度降低并減緩S和G2期(Balkwi11F等人，InterferonaffectsbothGlandS+G2incellsstimulatedfromquiescencetogrowth.(1978)Nature274:798-800)。在正常細胞以及腫瘤細胞中經(jīng)由IFN-ot的細胞周期延長的累積效果導(dǎo)致白纟田月包'於積、細月包體積增力口和凋亡(0tsukiT等人，Humanmyelomacellapoptosisinducedbyinterferon-a.(1998)BRJHAEMATOL103:518-529)。腫瘤細胞在控制細胞周期的進展的一種或多種蛋白質(zhì)中顯現(xiàn)出改變，在它們中可以發(fā)現(xiàn)由IFN調(diào)節(jié)的原癌基因例如bcl2(KoshijiM等人，Apoptosisofcolorectaladenocarcinoma(COL0201)bytumornecrosisfactor-alphaand/orinterferon-gammaresultingfromdown-regulationofBe1-2expression.(1998)CIinExpImmunol111:211-218)。在本發(fā)明的一個具體例子中，在當(dāng)受IFN-ot/C-Phyco組合刺激時bcl2對肺瘤細胞的負調(diào)節(jié)中證實了協(xié)同和劑量依賴性效應(yīng)。關(guān)于凋亡誘導(dǎo)的途徑之一涉及Fas與FasL的結(jié)合，這導(dǎo)致包含F(xiàn)ADD死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的募集和胱天蛋白酶例如胱天蛋白酶-8的后續(xù)活化。IFN-a正調(diào)節(jié)Fas的表達，并因此可以通過由Fas介導(dǎo)的凋亡途徑而起作用，如在本發(fā)明的另一個具體例子中所證實的，在所述另一個具體例子中也顯示了IFN-ot/C-Phyco藥物化合物在腫瘤細胞中產(chǎn)生Fas表達的正向和顯著的調(diào)節(jié)。COX-2是眾所周知的抗凋亡分子，并且已報道C-Phyco是C0X-2的選擇性抑制劑，從而促進胂瘤細胞的程序性細胞死亡(ReddyCM等人，Selectiveinhibitionofciclooxygenase-2byC-Phycocyanin，tobiliproteinfromSpirulinaplatensis(2000)BiochemBiophysHeadCommun3:599-603)。在本發(fā)明中，我們也證實IFN-ot/C-Phyco化合物以劑量依賴性方式顯著減少COX-2的表達水平，使得這成為可以解釋所述組合對于腫瘤細胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的可能機制。由Subhashini等人進行的研究(JaguSubhashini等人，MolecularmechanismsinC-Phycocyanininducedapoptosisinhumanchronicmyeloidleukemiacellline-K562.(2004)BiochemPharmac68:453-462)顯示，C-Phyco通過將細胞色素-C從線粒體釋放到胞質(zhì)溶膠中和bc卜2的減少而在K562細胞系中誘導(dǎo)凋亡。在本發(fā)明中，我們顯示，與其分開的組分相比較，在細胞色素-c表達的誘導(dǎo)水平方面，上述藥物化合物具有正協(xié)同效應(yīng)，從而將這視為關(guān)于由這種化合物產(chǎn)生的腫瘤細胞凋亡誘導(dǎo)的機制。在臨床實踐中，已證實IFN-oc與激素、化學(xué)療法和/或IL-2的組合對于許多類型的腫瘤可以增加患者的應(yīng)答并延長存活，然而，它們在治療方法中的整合受到其分別的毒性的限制。因此，我們提出在本發(fā)明中描述的藥物化合物的用途，因為除了具有這2種組分在其抗增殖、細胞毒性和抗氧化作用方面以及在腫瘤細胞中謙導(dǎo)凋亡方面的協(xié)同效應(yīng)(從而證明臨床結(jié)果正確)外，還存在關(guān)于C-Phyco的無害性和缺乏毒性的大量證據(jù)。附圖描述圖1:在具有多發(fā)性硬化癥(MS)的患者中，經(jīng)由RT-PCR分析的，分開的治療以及IFN-oc/C-Phyco組合對于天然調(diào)節(jié)T細胞(A和B)和適應(yīng)性調(diào)節(jié)T細胞(C和D)的標記基因表達的影響。圖2:在具有多發(fā)性硬化癥的患者中IFN-ot/C-Phyco組合對于CD25/Foxp3關(guān)系的影響。圖3:A)在來自用分開的有效成分以及用IFN-ot/C-Phyco組合進行處理的外周血的單核細胞中，CD4+CD25+表達的流式細胞術(shù)。B)分開的有效成分以及IFN-ot/C-Phyco組合的CD4+CD25+和CD4+CD25高細月包的i秀導(dǎo)效應(yīng)。圖4:在具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中，經(jīng)由RT-PCR分析的，分開的治療以及IFN-oc/C-Phyco組合對于天然調(diào)節(jié)T細胞(A和B)和適應(yīng)性調(diào)節(jié)T細胞(C和D)的基因標記表達的影響。圖5:在具有支氣管哮喘的患者中，經(jīng)由RT-PCR分析的，分開的治療以及IFN-ot/C-Phyco組合對于天然調(diào)節(jié)T細胞(A和B)和適應(yīng)性調(diào)節(jié)T細胞(C和D)的基因標記表達的影響。圖6:在HeLa細胞系中，IFN-ot/C-Phyco組合對于抑制增殖的劑量應(yīng)答效應(yīng)。圖7:A)在K562細胞系中，IFN-ot/C-Phyco組合以及分開的有效成分對于C0X-2和Bcl-2基因的表達的影響。B)在K562細胞系中，IFN-cc/C-Phyco組合對于C0X-2和Bcl-2基因表達的時間依賴性影響。圖8:在K562細胞系中，IFN-ot/C-Phyco組合以及分開的有效成分對于Fas基因表達的影響。圖9:分開的有效成分以及IFN-ot/C-Phyco組合對于細胞色素-C蛋白質(zhì)表達的影響。圖10:在HepG2細胞中，通過ELISA定量的，IFN-a/C-Phyco組合以及分開的有效成分對于蛋白質(zhì)p53(A)和p21(B)水平的影響。圖11:在HepG2細胞系中，通過ELISA定量的，關(guān)于蛋白質(zhì)p53(A)和p21(B)水平的IFN-a/C-Phyco組合的動力學(xué)。實施例實施例1:在EAE模型中，IFN-oc/C-Phyco組合及其分開的有效成分的療效。在EAE的生物模型中測試IFN-a/C-Phyco組合以評估其療效在第0和6天時，具有130g的平均體重的雌性Lewis大鼠用5mg在PBS中的豚鼠脊髓勻漿物(50%)和弗氏完全佐劑(50%)進行皮下免疫。該治療方案在第一次免疫接種后IO天開始，經(jīng)由通過腹膜內(nèi)途徑使用IFN-oc/C-Phyco組合(200ng/kg/天-740ng/kg/天)，分開的有效成分IFN-a(200ng/kg/天)和C-Phyco(200ng/kg/天)，以及安慰劑(PBS)。通過根據(jù)下列臨床指數(shù)評估疾病的臨床發(fā)展來監(jiān)控10天0:無改變；1:尾部完全癱瘓；2:后肢之一癱瘓；3:側(cè)后半完全癱瘓；4:側(cè)后半完全癱瘓和側(cè)前半癱瘓；5:死亡。重量減輕和膀胱或直腸括約肌失禁也是在動物中該疾病的臨床征兆，并且通過對上述臨床指數(shù)加0.5來進行評估。第一次免疫接種40天后，使動物麻醉并殺死，對每只動物的腦和脊髓進行處理(在10%福爾馬林中固定，用H&E和LuxolBlue進行染色)以用于組織病理學(xué)分析。所考慮的組織病理學(xué)標準是血管周的炎性浸潤物的數(shù)目和大小、脫髓鞘損傷、神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)凋亡和星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性。所有觀察不知情地進行。如表1中所示，IFN-ot/C-Phyco組合使實驗動物免于被誘導(dǎo)發(fā)展出EAE，因為這些動物中只有50%發(fā)展出最弱形式的該疾病并且其余的不生病。這在其中該疾病的發(fā)病率為100%的其余組(用分開的有效成分和安慰劑處理的組)中并非如此。用IFN-ct/C-Phyco組合處理的組的臨床指數(shù)的平均值為0.37±0.47，用分開的有效成分處理的組的臨床指數(shù)平均值對于IFN-oc為1.37±1.7和對于C-Phyco為1.5±1.6，并且用安慰劑處理的組的臨床指數(shù)平均值為1.7±1.4。每組使用8只大鼠，并根據(jù)NewmanKeuls的多重比較檢驗進行比較，使用p<0.001。表1.在被誘導(dǎo)形成EAE的大鼠中，IFN-ot/C-Phyco組合以及其分開的有效成分的臨床療效。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>如在表2中觀察到的，來自不同組的動物的腦和脊髓的病理解剖學(xué)研究結(jié)果證實，盡管星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性是相同的，但血管周的炎性浸潤物的數(shù)目和大小在用藥物化合物治療處理的組中比在接受安慰劑的組中更小(p=0.028，獨立樣本T檢驗)。表2.在被誘導(dǎo)形成EAE的大鼠的腦和脊髓中，IFN-ot/C-Phyco組合以及其分開的有效成分對于血管周的炎性浸潤物的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>這個實驗證實，IFN-cc/C-Phyco組合使動物免于發(fā)展出更嚴重臨床形式的該疾病。實施例2:使用不同施用途徑的IFN-oc/C-Phyco組合的療效為了評估在對于組分使用不同施用途徑時，IFN-oc/C-Phyco組合的效應(yīng)，在第0和6天時，具有130g的平均體重的雌性Lewis大鼠用5mg在PBS中的豚鼠脊髓勻漿物(50%)和弗氏完全佐劑(50%)進行皮下免疫。該治療方案在第一次免疫接種后IO天如下開始組I:腹膜內(nèi)施用的IFN-a/C-Phyco組合(200ng/kg/天-7400mg/kg/天)，組II:其中IFN-a腹膜內(nèi)施用(200ng/kg/天)和C-Phyco通過胃插管法口服施用(7400iag/kg/天)的IFN-a/C-Phyco組合，和組III:安慰劑。這種治療方案進行10天。如先前實施例中所述的進行臨床評估。結(jié)果顯示于表3中。腹膜內(nèi)或者分別通過腹膜內(nèi)/口服途徑的IFN-a/C-Phyco組合使實驗動物免于被誘導(dǎo)發(fā)展出EAE。在這2種情況下，與其中100%的動物生病的安慰劑組相比較，只有40%的動物發(fā)展出該疾病。用IFN-a/C-Phyco組合腹膜內(nèi)處理的組的平均臨床指數(shù)為0.37±0.17，和關(guān)于用IFN-ot/C-Phyco組合口服處理的組平均臨床指數(shù)為0.35±0.11，和關(guān)于安慰劑組平均臨床指數(shù)為1.7±1.4。每組使用8只大鼠。組間比較是統(tǒng)計上顯著的，p<0.001。使用NewmanKeuls的多重比較檢驗。表3.在被誘導(dǎo)發(fā)展出EAE的大鼠中，通過不同施用途徑的IFN-ct/C-Phyco組合的臨床療效。<table>complextableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>實施例3:在MS患者的單核細胞中，關(guān)于IFN-ot/C-Phyco組合以及其分開的有效成分對于天然和適應(yīng)性rTc的謙導(dǎo)效應(yīng)的評估。為了評估在MS患者中IFN-oc/C-Phyco組合以及其分開的有效成分對于rTc的誘導(dǎo)效應(yīng)，從具有通過核磁共振(NMR)臨床確定的復(fù)發(fā)-緩解型MS(RRMS)的10位患者和10位對照(外觀健康的個體)中抽取20ml夕卜周血,通過Ficol1梯度(Serotec-Biochem，Berlin，Germany)分離單核細胞，并將它們分成4個實驗組(在RPMI1640培養(yǎng)基中3xl06細胞/組)，所述組如下進4亍處理A)僅細胞，B)細胞+5iuMIFN-a2b，C)細胞+20jiiMC-Phyco,D)細胞+5pMIFN-a2b/20juMC-Phyco,在37。C和5%C02下4小時。其后，洗滌細胞并且通過Tri-reagent法進行總RNA提取(ChomczynskiP.TOreagentforthesaU-stepsimultaneousisolationofRM，DMandproteinsfromcellandtissuesamples.(1993)BioTechniques，15，532-537)。使用lpg總RNA/實驗組來進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)(KitRT-PCRcorePerkinElmer)。RT反應(yīng)在20|i1總體積中進行，隨后將其分成各10|Li1的2個PCR反應(yīng)。反應(yīng)的引物用于擴增天然和適應(yīng)性rTc的標記。通過使用國立生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)的數(shù)據(jù)庫的序列作為參考來設(shè)計所使用的寡核苷酸；它們闡述如下CD25:第618-637位的20個堿基對(bp)的Oligo5'-序列。第1053-1072位的20bp的Oligo3'-序列，它們擴增出登記號為NM—000417的序列的454bp條帶；Foxp3:第482-501位的20bp的Oligo5'-序列。第762-781位的20bp的01igo3'-序列，它們擴增出登記號為NM-014009的序列的299bp條帶；IL-10:第358-377位的20bp的Oligo5'-序列。第687-709位的22bp的01igo3'-序列，它們擴增出登記號為NM-000572的序列的351bp條帶；TGF-P:第1209-1227位的19bp的Oligo5'-序列。第1564-1582位的19bp的Oligo3'-序列，它們擴增出登記號為NM-000660的序列的373bp條帶；GAPDH:第386-403位的18bp的Oligo5'-序列。第561-580位的20bp的01igo3'-序列，它們擴增出登記號為NNL002046的序列的164bp條帶。GAPDH用作組成型表達的基因，以對使用MolecularAnalysis軟件從其中走樣了PCR產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠的光密度測定法獲得的相對值進行標準化。結(jié)果表示為用GAPDH標準化的RM相對值的平均值或中值(根據(jù)變量的分布)；使與僅具有細胞的對照組相比較而言的3個處理實驗組的平均值或中值進行比較，并且計算患者和對照中相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)p值。如圖1A、B、C和D中所示，存在由它們的標記增加所表現(xiàn)的rTc誘導(dǎo)效應(yīng)，所述標記在細胞用分開的有效成分和用組合進行處理時進行檢測，這證實了在用IFN-oc/C-Phyco組合進行處理后統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異，其中的值對于CD25(A)為p=0.023(成對t檢驗)，對于Foxp3(B)為p-O.037(成對t檢驗)，對于IL-10(C)為p=0.015(成對t檢驗)，和對于TGF-P(D)為p=0.025(Wilcoxon)。這顯示，在患者和對照中，IFN-oc/C-Phyco組合關(guān)于rTc誘導(dǎo)存在協(xié)同效應(yīng)。用IFN-a/C-Phyco組合處理的細胞除了顯示出關(guān)于CD25和Foxp3基因的統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加外，它們還顯示出關(guān)于CD25/Foxp3關(guān)系的線性正相關(guān)，這是統(tǒng)計上顯著的，其中值為p=0.022，這表明它們是調(diào)節(jié)T細胞而不是活化的T細胞(參見圖2)。CD4+CD25+細胞的誘導(dǎo)還通過流式細胞術(shù)(FACS)在來自RRMS患者和對照的外周血的單核細胞中得到證實。對于這些實驗，105細胞/孔在96孔細胞培養(yǎng)平板(COSTAR)中以一式兩份/實驗組的方式進行溫育。實驗組包括A)僅細胞，B)細胞+5mMIFN-a2b,C)細胞+20|jMC-Phyco，D)細胞+5jnMIFN-a2b/20ijMC-Phyco。細胞在37。C和5。/。c02下處理72小時。其后，洗滌細胞并與抗-CD4-PE(Serotec)和抗-CD25-Cy5(Serotec)抗體一起溫育，并隨后在FACS上進行讀數(shù)。結(jié)果顯示了在患者和對照中由分開的組分引起的對于CD4+CD25+和CD4+CD25*細胞的誘導(dǎo)效應(yīng)，并且關(guān)于IFN-ot/C-Phyco組合這更加高(本發(fā)明中呈現(xiàn)的結(jié)果代表了3位患者和3位對照)。IFN-oc/C-Phyco組合的誘導(dǎo)效應(yīng)達到了可能的生物學(xué)最大值(圖3A和3B)。實施例4:在具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的單核細胞中，關(guān)于IFN-oc/C-Phyco組合以及其分開的有效成分對于天然和適應(yīng)性rTc的誘導(dǎo)效應(yīng)的評估。關(guān)于對rTc的標記基因的影響的評估，操作與上文部分中描述的相同，使用6位患者和6位對照。結(jié)果如在RT-PCR部分中所述的進行表示。如圖4中所示，當(dāng)細胞用分開的有效成分或用組合進行處理時，存在由其標記增加所表現(xiàn)的rTc的誘導(dǎo)效應(yīng)。在所有情況下都觀察到誘導(dǎo)效應(yīng)，顯示出在用IFN-ct/C-Phyco組合進行處理中的統(tǒng)計學(xué)顯著性，其中的值對于CD25(A)為p=0.016(成對t)，對于Foxp3(B)為p=0.029(成對t)，對于IL-10(C)為p=0.034(成對t)，和對于TGF-MD)為p=0.028(Wilcoxon)。盡管用分開的有效成分處理的細胞顯示出rTc誘導(dǎo)效應(yīng)，但對于所評估的任何基因來說差異不是統(tǒng)計上顯著的，而在患者以及對照中始終觀察到IFN-oc/C-Phyco組合的協(xié)同效應(yīng)。實施例5:在具有支氣管哮喘的患者的單核細胞中，關(guān)于IFN-ot/C-Phyco組合以及分開的有效成分對于天然和適應(yīng)性rTc的誘導(dǎo)效應(yīng)的評估。實驗變化形式是上文描述的那些，以及RT-PCR操作和數(shù)據(jù)處理。研究6位患者和6位對照。結(jié)果顯示出在患者和對照中天然和誘導(dǎo)的rTc的誘導(dǎo)效應(yīng)，這對于用IFN-a/C-Phyco組合進行處理的細胞是統(tǒng)計學(xué)上顯著的，其中值對于CD25為p=0.012(成對t檢驗)，對于Foxp3為p=0.009(成對t檢驗)，對于IL-10為p=0.037(成對t檢驗)，和對于TGF-p為p=0.021(Wilcoxon)(圖5)。實施例6:I在腫瘤細胞系中，關(guān)于FN-oc/C-Phyco組合以及其分開的有效成分的抗腫瘤效應(yīng)的評估。IFN-a/C-Phyco組合以及其獨立組分的抗腫瘤活性通過在腫瘤細胞中評估抗增殖和細胞毒性活性以及凋亡的誘導(dǎo)來表現(xiàn)。對于IFN-a/C-Phyco組合以及其分開的有效成分的抗增殖和細胞毒性活性的評估，在體外使用幾種人肺瘤細胞系HeLa(人宮頸癌)、HepG2(人肝癌)、A375(人黑素瘤)、HL60(人早幼粒細胞白血病)、K562(人紅白血病)、PBMC(來自外周血的單核細胞)。細胞在96孑L平板(Costar)中進行培養(yǎng)，對于腫瘤細胞系為總共2000細胞/孔，和對于BPMC為20，000細胞/孔。如Mosmann等人所述的(MosmannT.Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays.(1983)JIMMUNOLMETHODS65:55-63)并進行修改，通過溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四峻銪(MTT;SigmaChemicalCo.,StLouis，MO,USA)觀'J定法來評估細胞增殖的抑制。在對于每種細胞系合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所評估的每種細胞系以達到上文提及的細胞總量，其中添加100jal/孔并使它們在37。C和5。/。C02下溫育24小時。這之后，一式兩份地將該培養(yǎng)基替換為包含不同處理的另一種培養(yǎng)基A)僅細胞，B)細胞+5pMIFNot-2b，C)細月包+20mMC-Phyco，d)細胞+5jjMIFNot-2b/20pMC-Phyco。使經(jīng)處理的細胞在相同條件下再溫育48小時。其后，添加MTT并且在平板閱讀器(Multiscan，Titertek)中于540nm處閱讀可溶性產(chǎn)物。結(jié)果顯示于表4中。它們表示為與僅具有細胞的對照相比較，細胞增殖的抑制的％。對于所有腫瘤細胞系觀察到細胞增殖的抑制，并且對于BPMC較少。與分開的有效成分相比較，在細胞增殖的抑制方面還檢測到IFN-oc/C-Phyco組合的協(xié)同效應(yīng)。這種效應(yīng)對于HeLa細胞系和A375更大。圖6顯示了在HeLa細胞系中IFN-ct/C-Phyco組合對于增殖抑制的影響的劑量依賴性。表4.在腫瘤細胞系中，IFN-ct/C-Phyco組合以及其分開的有效成分的抗增殖活性的評估。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>還通過經(jīng)由RT-PCR所分析的它們對于C0X-2和Bc卜2基因表達的影響和經(jīng)由Western印跡所分析的它們對于細胞色素-c蛋白質(zhì)表達的影響，評估了IFN-a/C-Phyco組合以及其分開的有效成分對于凋亡的誘導(dǎo)活性。為了進行RT-PCR，使用PerkinElmerKit。在每種情況下，從提取自K562細胞系的lyg總RNA/實驗變量開始。RT反應(yīng)在20|i1總體積中進行，隨后將其分成各10ja1的2個PCR反應(yīng)。GAPDH用作組成型表達的基因，以對使用MolecularAnalysis軟件從其中走樣了PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠的光密度測定法獲得的相對值進行標準化。IFN-a/C-Phyco組合的效應(yīng)通過COX-2和Bcl-2基因的表達來進行評估，對于其將105細胞/實驗變量培養(yǎng)8小時，使用在RPMI1640培養(yǎng)基/10%不含補體的胎牛血清中的下述成分A)僅細胞，B)細胞十5iuMIFNot-2b，C)細胞+20jaMC-Phyco,D)細胞+5juMIFNa-2b/20]LiMC-Phyco。結(jié)果顯示出分開的有效成分的抑制效應(yīng)以及IFN-oc/C-Phyco組合的協(xié)同抑制效應(yīng)，這是統(tǒng)計上顯著的，其中值對于C0X-2基因的表達為p=0.011(AN0VA，僅細胞對IFN-oc/C-Phyco組合)，和對于Bc卜2基因為p=0.009(AN0VA，僅細胞對IFN-a/C-Phyco組合)，所述C0X-2和Bcl-2基因是眾所周知的抗凋亡分子(圖7A)。此外，證實了在K562細胞系中IFN-a/C-Phyco組合對于抑制C0X-2和Bcl-2基因的時間依賴性效應(yīng)(圖7B)。用于誘導(dǎo)凋亡的途徑之一涉及Fas與FasL的結(jié)合。Fas可以由IFN-a正調(diào)節(jié)(GordonM,MarleySB,LewisJL等人，Thetreatmentwithinterferon-alphapreferentiallyreducesthecapacityforamplificationofthegranulocyte-macrophageprogenitors(CFU-GM)frompatientswithchronicmyeloidleukemiabutsparesnormalCFU-GM.(1998)JClinInvest102:710-715)，這個事件促進由Fas介導(dǎo)的凋亡(SelleriCMJ，PaneF，LucianoL等人，F(xiàn)as-mediatedmodulationofbcr/ablinchronicmyeloidleukemiaresultsindifferentialeffectsonapoptosis(1998)Blood92:981-989)，在本發(fā)明中研究了與單獨的IFN-oc相比較，IFN-ot/C-Phyco組合是否具有Fas的正調(diào)節(jié)效應(yīng)。所執(zhí)行的實驗變化形式在先前實施例中得到闡述。K562細胞系的105細胞/實驗變化形式用不同處理培養(yǎng)4小時，并且如先前部分中所述通過RT-PCR測量Fas的表達水平。結(jié)果顯示于圖8中，其中觀察到IFN-a對于Fas基因的統(tǒng)計學(xué)上顯著的刺激效應(yīng)，其中值為p=0.042(AN0VA，僅細胞對IFN-oc)。C-Phyco同樣正調(diào)節(jié)Fas，但差異不是統(tǒng)計學(xué)上顯著的，并且在這種細胞系中觀察到IFN-oc/C-Phyco組合對于Fas的協(xié)同正調(diào)節(jié)效應(yīng)，其中值為p=0.009(ANOVA，僅細胞對IFN-oc/C-Phyco組合)。蛋白質(zhì)印跡用于評估IFN-ct/C-Phyco組合在蛋白質(zhì)水平上對于細胞色素-c表達的影響(ChandraJ等人，Proteasoraainhibitorsinduceapoptosisinglucocorticoid-resistantchroniclymphocyticleukemialymphocytes.(1998)Blood92:4220)。將來自如上所述進行處理的K562細胞的5ug蛋白質(zhì)/實驗變量培養(yǎng)24小時，并且在15%丙烯酰胺凝膠中通過SDS-PAGE電泳進行分離。隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，其中借助于抗細胞色素-c鼠單克隆抗體來檢測該特定的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示于圖9中，其中觀察到IFN-oc/C-Phyco組合具有誘導(dǎo)性協(xié)同效應(yīng)，對細胞色素-c表達具有統(tǒng)計學(xué)上顯著的AN0VA(僅細胞對IFN-a/C-Phyco組合)p-0.006,從而使得這可能為在K562細胞中由IFN-a/C-Phyco組合所誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)的介質(zhì)。p53和p21蛋白質(zhì)是維持細胞周期停滯在G2/M期以及DNA損傷后的凋亡所必需的。ELISA用于檢測p53和p21蛋白質(zhì)的表達(用于p53的MolecularRocheBiochemical,Germany,和用于p21的Calbiochem，Cambridge,MA，USA)。細胞用30ngIFNa-2b/50jaMC-Phyco組合或者獨立組分進行處理，以上述濃度(對于圖7A中顯示的實驗)和持續(xù)6、12、24和48小時(對于圖7B中顯示的實驗)進行處理。將具有相同量的蛋白質(zhì)的樣品與生物素化的特異性抗體一起添加至用抗p53或抗p21單克隆抗體包被的96孔板中。在室溫下溫育2小時后，添加鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶綴合物。在450nm處測量吸光度，并且通過已知濃度的2種蛋白質(zhì)的標準曲線的外推法來確定濃度。在本發(fā)明中顯示了在人肝癌系HepG2中通過ELISA檢測的，與其獨立組分相比較，IFN-a/C-Phyco組合的統(tǒng)計學(xué)上顯著的協(xié)同效應(yīng)，其中關(guān)于p53蛋白的誘導(dǎo)的p-O.026和關(guān)于p21蛋白的表達水平的p-0.041(AN0VA，僅細胞對IFN-oc/C-Phyco組合)(圖10)。在6小時處理后用IFN-ot/C-Phyco組合進行處理的細胞中的p53蛋白質(zhì)水平(圖11A)為僅有細胞時的4倍，并且它們在用該組合進行處理12小時后保持上調(diào)。這些結(jié)果暗示，p53蛋白質(zhì)表達的增加在HepG2細胞的凋亡中可能具有重要作用。凋亡誘導(dǎo)已與靶基因的負調(diào)節(jié)相關(guān)，所述把基因位于涉及p53的信號傳導(dǎo)級聯(lián)的下游，如編碼p21蛋白的基因的情形。在本發(fā)明中顯示了IFN-a/C-Phyco組合對于p21蛋白質(zhì)表達的正調(diào)節(jié)的時間依賴性效應(yīng)。這種增加在用IFN-oc/C-Phyco組合處理細胞12小時后發(fā)生(圖IIB)。用該組合處理12小時的HepG2細胞使p21蛋白的表達增加至4倍。p53的表達峰值(6小時)早于p21蛋白的表達峰值(12小時)，這暗示對于通過用IFN-a/C-Phyco組合處理細胞而i秀導(dǎo)的凋亡，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制中執(zhí)行的p53的可能作用超過p21。權(quán)利要求1.藥物化合物，其特征在于，它包含干擾素家族的蛋白質(zhì)和天然膽色素，其用于治療自身免疫疾病、過敏反應(yīng)和癌癥。2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物化合物，其特征在于，所述干擾素是IFNa-2b，其通過重組方法獲得或者通過聚乙二醇化或與其他蛋白質(zhì)相結(jié)合來進行修飾。3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的藥物化合物，其特征在于，所述天然膽色素是C-藻藍蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求l、2和3的藥物化合物，其特征在于，它是通過腸胃外和口服途徑使用的制劑。5.根據(jù)權(quán)利要求l、2和3的藥物化合物，其特征在于，它的活性成分可以作為治療方法或作為藥物組合物在同一個個體中分開施用。6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其特征在于，所述組合物的兩種組分作為同一治療方法的部分在同一個個體中通過不同途徑使用。7.根據(jù)權(quán)利要求5和6的藥物組合物，其特征在于，IFNa-2b通過腸胃外途徑施用和C-藻藍蛋白通過口服途徑施用。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的藥物化合物或組合物的用途，其中它可以通過肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、鼻和鞘內(nèi)途徑施用。9.根據(jù)前述權(quán)利要求的藥物化合物的用途，其中所述自身免疫疾病是多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或經(jīng)歷天然和/或適應(yīng)性調(diào)節(jié)T細胞的數(shù)目或功能性的減少的其他疾病。10.根據(jù)前述權(quán)利要求的藥物化合物的用途，用于防止這些疾病以復(fù)發(fā)形式復(fù)發(fā)。11.根據(jù)前述權(quán)利要求的藥物化合物的用途，其中所述過敏性疾病是支氣管哮喘或經(jīng)歷天然和/或適應(yīng)性調(diào)節(jié)T細胞的數(shù)目或功能性的減少的其他疾病。12.根據(jù)前述權(quán)利要求的藥物化合物的用途，其中由于其活性組分在抗增殖、細胞毒性和腫瘤細胞凋亡方面的協(xié)同效應(yīng)，因而其在不同起源的惡性肺瘤中的應(yīng)用是合理的。全文摘要本發(fā)明涉及干擾素α和C-藻藍蛋白的組合(IFN-α/C-Phyco)，其用于獲得用于治療自身免疫疾病、過敏反應(yīng)和癌癥的藥物制劑。在本發(fā)明中顯示的與調(diào)節(jié)T細胞的誘導(dǎo)效應(yīng)相關(guān)的抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗增殖和抗腫瘤效應(yīng)證明了將IFN-α/C-Phyco組合用于所述疾病是正確的。文檔編號A61K38/21GK101355958SQ200680049148公開日2009年1月28日申請日期2006年10月30日優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日發(fā)明者C·M·瓦倫祖埃拉希爾維亞,D·加西亞德爾巴爾科埃雷拉,E·潘頓阿里亞斯,G·E·紀廉涅托,G·彭頓羅爾,M·塞萬提斯利亞諾斯,P·A·洛佩斯紹拉申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心