專利名稱：：抗巖藻糖基-gm1的人單克隆抗體及使用抗巖藻糖基-gm1抗體的方法抗巖藻糖基-GMl的人單克隆抗體及使用抗巖藻糖基-GMl抗體的方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉參者本申請(qǐng)要求享有2005年12月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序號(hào)60/748,915的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
：巖藻糖基-GMl是一種鞘脂單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯，它由錨定細(xì)胞膜中的分子的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)成分和暴露于細(xì)胞表面的碳水化合物成分組成。碳水化合物抗原是在癌細(xì)胞表面上最豐富表達(dá)的抗原(FeiziT.(1985)Va^"314:53-7)。對(duì)于某些腫瘤類型，如小細(xì)胞肺癌(SCLC),最初對(duì)化學(xué)治療具有有效的反應(yīng)，但是之后迅速發(fā)生化療難治性復(fù)發(fā)。應(yīng)用新型免疫治療藥物的干預(yù)可以成功地克服抗藥性復(fù)發(fā)(JohnsonDH.(1995)Qmcw12Suppl3:S71-5)。已經(jīng)證明，有幾種碳水化合物抗原，如神經(jīng)節(jié)苷酯GD3和GD2,作為應(yīng)用MAb的被動(dòng)免疫治療的有效靶標(biāo)起作用(IrieRF和MortonDL.(1986)iWAS83:8694-8698;HoughtonAN等人.(1985)/WAS82:1242-1246)。在臨床試驗(yàn)中也已證明神經(jīng)節(jié)苷酯抗原是應(yīng)用疫苗的主動(dòng)免疫治療的有效把標(biāo)(KrugLM等人.(2004)C//mc"/Omcwiewwc/710:6094-6100;Dickler麗等人.(1999)C//mWC獻(xiàn)"We廳n:/z5:2773-2779;LivingstonPO等人.(1994)/C7/"(9wco/.12:1036-44)。實(shí)際上，已證明來自在用KLH偶聯(lián)的抗原接種后產(chǎn)生抗巖藻糖基-GMl抗體滴度的SCLC患者的血清與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，并且具有腫瘤特異性補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)。與抗巖藻糖基-GMl滴度相關(guān)的毒性是溫和的和短暫的，三名有限階段SCLC患者在18、24、30個(gè)月時(shí)沒有復(fù)發(fā)(Krug等人.，同上；Dickler等人，同上)。已顯示在高百分比的SCLC病例中有巖藻糖基-GMl表達(dá)，與其他神經(jīng)節(jié)苷酯抗原不同，巖藻糖基-GMl在正常組織中極少表達(dá)或者不表達(dá)(Nilsson等人.(1984)G(ycocow乂wgWe/1:43-9/Krug等人，同上;Brezicka等人.(1989)C""cwi^49:1300-5;Zhangyi等人(1997)/"〃Cer73:42-49;Brezicka等人.(2000)C匿w28:29-36;Fredman等人(1986)5/oc/z,w歷o//z^爿"a875:316-23;Brezicka等人(1991)APM/S99:797-802;Nilsson等人(1986)Omcwh46:1403-7)。在SCLC細(xì)胞系的培養(yǎng)基中，在異種移植的棵鼠的腫瘤提取物和血清中，以及在患有各期疾病的SCLC患者的血清中，已經(jīng)證明了巖藻糖基畫GMl的存在(Vangsted等人.(1991)Omcwiw51:2879-84;Vangsted等人(1994)Owcw!^e"/Vev18:221-9)。這些報(bào)道提供了巖藻糖基-GMl是可被免疫治療劑靶向的高度特異性腫瘤抗原的令人信服的證據(jù)。因此，需要識(shí)別巖藻糖基-GMl的藥劑以及使用這種藥劑的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供與巖藻糖基-GMl結(jié)合并且表現(xiàn)出許多所需特性的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。這些特性包括與巖藻糖基-GMl高親和力結(jié)合，以及與人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系DMS-79(人SCLCATCC#CRL-2049)結(jié)合。還提供了應(yīng)用本發(fā)明的抗體和組合物治療多種巖藻糖基-GMl介導(dǎo)的疾病的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體(a)與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合；且(b)與人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系DMS-79(人SCLCATCC#CRL-2049)結(jié)合。優(yōu)選地，該抗體為人抗體，但是在替代實(shí)施方案中，該抗體也可以是鼠抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與參比抗體交叉竟?fàn)幗Y(jié)合巖藻糖基-GMl，其中所述參比抗體(a)與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合；且(b)與人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系DMS-79(人SCLCATCC弁CRL-2049)結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在其它實(shí)施方案中，所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:IO的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含來源于人VH3-48基因或作為該基因的產(chǎn)物的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含來源于人VkL15基因或作為該基因的產(chǎn)物的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:13的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:19的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:25的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:31的輕4連可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:37的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:43的輕鏈可變區(qū)CDR3。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:14的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:20的重鏈可變區(qū)CDR2(c)包含SEQIDNO:26的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:32的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:38的輕鏈可變區(qū)CDR2(f)包含SEQIDNO:44的輕鏈可變區(qū)CDR3'另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:15的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:21的重鏈可變區(qū)CDR2(c)包含SEQIDNO:27的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:33的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:39的輕鏈可變區(qū)CDR2(f)包含SEQIDNO:45的輕鏈可變區(qū)CDR^另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:16的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:22的重鏈可變區(qū)CDR2(c)包含SEQIDNO:28的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:34的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:40的輕鏈可變區(qū)CDR2(f)包含SEQIDNO:46的輕鏈可變區(qū)CDR3,另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:17的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:23的重鏈可變區(qū)CDR2(c)包含SEQIDNO:29的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:35的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:41的輕鏈可變區(qū)CDR2(f)包含SEQIDNO:47的輕鏈可變區(qū)CDR3。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:18的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:24的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:30的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:36的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:42的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:48的輕鏈可變區(qū)CDR3。本發(fā)明其他優(yōu)選的抗體或其抗原結(jié)合部分包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的輕4連可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:IO的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:ll的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的抗體可以是，例如，如lgGl或IgG4同種型的全長(zhǎng)抗體?；蛘?，這些抗體可以是抗體片段，如Fab或Fab，2片段或單鏈抗體。本發(fā)明還提供一種免疫偶聯(lián)物，其包含與治療劑-如細(xì)胞毒素或放射性同位素-連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明還提供一種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。還提供包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子和藥物可接受的載體的組合物。以及包含這些核酸的表達(dá)載體，包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。而且，本發(fā)明提供一種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中該小鼠表達(dá)本發(fā)明的抗體，以及由這種小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防以表達(dá)巖藻糖基-GMl的胂瘤細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的疾病的方法，包括給受試者施用有效治療或預(yù)防該疾病的量的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。所述疾病可以是，例如，癌癥，例如肺癌(包i舌小細(xì)力包肺癌)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種應(yīng)用抗巖藻糖基-GMl抗體在體內(nèi)治療癌癥的方法。該抗巖藻糖基-GMl抗體可以是鼠、嵌合、人源化或人抗體?？梢杂帽景l(fā)明的方法治療的其它癌癥的例子包括肺癌(包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)、腎癌(例如腎細(xì)胞癌)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦瘤、慢性或急性白血病(包括急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、成人T細(xì)胞白血病(T-ALL)、慢性髓樣白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、淋巴瘤(例如何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、T細(xì)胞白血病/'淋巴瘤(ATLL)、中心母細(xì)胞/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(AILD)-樣T細(xì)胞淋巴瘤和HIV相關(guān)體腔淋巴瘤)、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥和其他B細(xì)胞淋巴瘤、鼻咽癌、骨癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、曱狀腺癌、曱狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實(shí)體瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、表皮狀癌、鱗狀細(xì)胞癌、環(huán)境誘發(fā)的癌癥(包括石棉誘發(fā)的癌癥，例如間皮瘤)，和所述癌癥的組合。通過下面的詳述和實(shí)施例，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的，該詳述和實(shí)施例不應(yīng)理解為限制性的。貫穿本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、Genbank項(xiàng)、專利和公布的專利申請(qǐng)的內(nèi)容均在此處特別引入作為參考。圖1A顯示5B1人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:49)和氨基酸序列(SEQIDNO:1)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:13)、CDR2(SEQIDNO:19)和CDR3(SEQIDNO:25)區(qū),并指出了V、D和J的種系來源。圖1B顯示5B1人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:55)和氨基酸序列(SEQIDNO:7)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:31)、CDR2(SEQIDNO:37)和CDR3(SEQIDNO:43)區(qū),并指出了V和J的種系來源。圖2A顯示5Bla人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:50)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:14)、CDR2(SEQIDNO:20)和CDR3(SEQIDNO:26)區(qū)，并指出了V、D和J的種系來源。圖2B顯示5Bla人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核香酸序列(SEQIDNO:56)和氨基酸序列(SEQIDNO:8)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:32)、CDR2(SEQIDNO:38)和CDR3(SEQIDNO:44)區(qū),并指出了V和J的種系來源。圖3A顯示7D4人單克隆抗體重《連可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:51)和氨基酸序列(SEQIDNO:3)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:15)、CDR2(SEQIDNO:21)和CDR3(SEQIDNO:27)區(qū),并指出了V、D和J的種系來源。圖3B顯示7D4人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:57)和氨基酸序列(SEQIDNO:9)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:33)、CDR2(SEQIDNO:39)和CDR3(SEQIDNO:45)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖4A顯示7E4人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:52)和氨基酸序列(SEQIDNO:4)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:16)、CDR2(SEQIDNO:22)和CDR3(SEQIDNO:28)區(qū)，并指出了V、D和J的種系來源。圖4B顯示7E4人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核普酸序列(SEQIDNO:58)和氨基酸序列(SEQIDNO:10)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:34)、CDR2(SEQIDNO:40)和CDR3(SEQIDNO:46)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖5A顯示13B8人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:53)和氨基酸序列(SEQIDNO:5)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:17)、CDR2(SEQIDNO:23)和CDR3(SEQIDNO:29)區(qū),并指出了V、D和J的種系來源。圖5B顯示13B8人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:59)和氨基酸序列(SEQIDNO:11)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:35)、CDR2(SEQIDNO:41)和CDR3(SEQIDNO:47)區(qū),并指出了V和J的種系來源。圖6A顯示18D5人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:54)和氨基酸序列(SEQIDNO:6)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:18)、CDR2(SEQIDNO:24)和CDR3(SEQIDNO:30)區(qū),并指出了V、D和J的種系來源。圖6B顯示18D5人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:60)和氨基酸序列(SEQIDNO:12)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:36)、CDR2(SEQIDNO:42)和CDR3(SEQIDNO:48)區(qū),并指出了V和J的種系來源。圖7顯示5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VH3-48氨基酸序列(SEQIDNO:61)的比對(duì)。圖8顯示5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VkLl5氨基酸序列(SEQIDNO:62)的比對(duì)。圖9A至C顯示ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明抗巖藻糖基-GMl的人單克隆抗體與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。圖IOA至C顯示全細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明抗巖藻糖基-GMl的人單克隆抗體與表達(dá)巖藻糖基-GM1的細(xì)胞特異性結(jié)合。圖11A至C顯示流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明(A和B)抗巖藻糖基-GMl人單克隆抗體與細(xì)胞系DMS79的細(xì)胞表面結(jié)合，并且(C)發(fā)現(xiàn)DMS79細(xì)胞在體內(nèi)繼續(xù)表達(dá)巖藻糖基-GMl(即在植入小鼠體內(nèi)后)。圖12A和圖12B顯示Hum-Zap內(nèi)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明抗巖藻糖基-GMl的人單克隆抗體可以內(nèi)化到巖藻糖基-GMl+細(xì)胞內(nèi)。圖13A和圖13B顯示補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果，證明人單克隆抗巖藻糖基-GMl抗體殺死表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞系(A)DMS79和(B)H畫4-II-E。圖14A和圖14B顯示抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果，證明人單克隆抗巖藻糖基-GMl抗體在不存在CD16阻斷的情況下殺死表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞系。圖15A至C顯示植入DMS79小細(xì)胞肺癌肺瘤細(xì)胞(巖藻糖基-GM1+)的個(gè)體SCID小鼠中隨時(shí)間變化的腫瘤體積。在腫瘤建立后，用以下治療劑之一處理小鼠五次(A)PBS(載體對(duì)照)；(B)每只小鼠30mg/kg的人IgGl(同種型對(duì)照)；(C)每只小鼠10mg/kg的抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體5Bl;(D)每只小鼠30mg/kg的抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體5Bl;(E)每只小鼠10mg/kg的抗巖藻糖基-GM1單克隆抗體7E4;(F)每只小鼠30mg/kg的抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體7E4。處理第一天的腫瘤體積大約為200mm3。圖16A和圖16B分別顯示圖15中所示小鼠的腫瘤體積的平均值和中值。圖17顯示圖15中所示小鼠的各組平均體重。發(fā)明詳述在一個(gè)方面，本發(fā)明總的涉及特異性結(jié)合巖藻糖基-GMl的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出一種或多種所需的功能性質(zhì)，例如與巖藻糖基-GMl的高親和力結(jié)合，和/或在體外或體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體來源于特定重鏈和輕鏈種系序列，和/或包含特定結(jié)構(gòu)特征，如包含特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本發(fā)明提供分離的抗體、制備該抗體的方法、含有該抗體的免疫偶聯(lián)物和雙特異性分子、和含有本發(fā)明的抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子的藥物組合物。本發(fā)明還涉及利用該抗體(例如)治療疾病如癌癥的方法。為了使本發(fā)明更容易理解，首先定義了一些術(shù)語。其他的定義在發(fā)明詳述內(nèi)容中說明。術(shù)語"免疫應(yīng)答"是指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的作用，該作用導(dǎo)致選擇性損傷、破壞或從人體中清除侵入的病原體、纟皮病原體感染的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞，或(在自身免疫或病理性炎癥的情況下)正常人細(xì)胞或組織。"信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑"是指在信號(hào)從一個(gè)細(xì)胞的一部分向一個(gè)細(xì)胞的另一部分傳送中起作用的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生化關(guān)系。本文使用的短語"細(xì)胞表面受體"包括，例如，能夠接收信號(hào)和跨過細(xì)胞質(zhì)膜傳播這種信號(hào)的分子和分子復(fù)合物。本發(fā)明的"細(xì)胞表面受體"的一個(gè)例子是巖藻糖基-GMl受體。本文提到的術(shù)語"抗體"包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即"抗原結(jié)合部分")或單鏈。"抗體"是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(在此縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域Cm、Ch2和Ch3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為V。和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域Cii且成。Vh和V^區(qū)可進(jìn)一步再分為高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，CDR散布在被稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更加保守的區(qū)域中。每個(gè)Vh和V^均由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，它們從氨基端向羧基端以如下順序排列FR1,CDR1，F(xiàn)R2,CDR2,FR3，CDR3,FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有可與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，該宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(C1q)。本文所用的術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡(jiǎn)稱為"抗體部分")是指保留與抗原(例如巖藻糖基-GMl)特異性結(jié)合的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已證明抗體的抗原結(jié)合功能可由全長(zhǎng)抗體的片段來行使。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"中所包括的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，即由Vl、Vh、CL和Cm結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab，)2片段，即包含在鉸鏈區(qū)處通過二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段；(iii)由VH和Cm結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等(1989)Nature341:544-546);和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)枸域Vl和Vh由單獨(dú)的基因編碼，^f旦是它們可以利用重組方法通過合成連接體連接在一起，該連接體使它們能夠制成一條蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對(duì)構(gòu)成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如Bird等(1988)Science242:423-426;和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這種單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)。這些抗體片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得，并用與完整抗體相同的方法對(duì)這些片段的實(shí)用性進(jìn)行篩選。本文使用的"分離的抗體"是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合的分離的抗體基本不含與除巖藻糖基-GMl以外的抗原特異性結(jié)合的抗體)。而且，分離的抗體可基本不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。本文使用的術(shù)語"人抗體，，包括具有如下可變區(qū)的抗體，在該可變區(qū)中，構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列。而且，如果該抗體含有恒定區(qū)，則該恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。但是，本文使用的術(shù)語"人抗體"不包括其中源自另一哺乳動(dòng)物種如小鼠的種系的CDR序列已被移植到人構(gòu)架序列上的抗體。術(shù)語"人單克隆抗體"是指表現(xiàn)單一結(jié)合特異性的抗體，其具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括與無限增殖化細(xì)胞融合的B細(xì)胞，該B細(xì)胞從具有含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)中獲得。本文使用的術(shù)語"重組人抗體"包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如(a)從對(duì)于人免疫球蛋白基因而言為轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤(下文進(jìn)一步描述)中分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞如轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，(c)乂人重組組合人抗體文庫(kù)中分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組人抗體具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。但是在某些實(shí)施方案中，這些重組人抗體可以經(jīng)歷體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的VH和Vt區(qū)的氨基酸序列盡管是源自人種系Vh和Vl序列并與之相關(guān)的序列，但可能不是在體內(nèi)天然存在于人抗體種系的所有組成成分(repertoire)中。本文使用的術(shù)語"同種型"是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如IgM或IgGl)。短語"識(shí)別抗原的抗體"和"抗原特異性抗體"在此與術(shù)語"與抗原特異性結(jié)合的抗體"可互換使用。術(shù)語"人抗體衍生物"是指人抗體的任何修飾形式，例如抗體和其它試劑或抗體的偶聯(lián)物。術(shù)語"人源化抗體"是指其中來源于另外一種哺乳動(dòng)物種如小鼠的種系的CDR序列已經(jīng)被移植到人構(gòu)架序列上的抗體。在人構(gòu)架序列內(nèi)也可以進(jìn)行其它的構(gòu)架區(qū)修飾。術(shù)語"嵌合抗體，，是指其中可變區(qū)序列來源于一個(gè)物種而恒定區(qū)序列來源于另一個(gè)物種的抗體，例如其中可變區(qū)序列來源于小鼠抗體而恒定區(qū)序列來源于人抗體的抗體。本文使用的術(shù)語"與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合"的抗體是指以lxlO^M或更低、更優(yōu)選5xl(rSM或更低、更優(yōu)選lxlO—SM或更低、更優(yōu)選5x10一M或更低的Kd與巖藻糖基-GM1結(jié)合的抗體。本文使用的術(shù)語"Kass。c"或"Ka"是指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而本文使用的術(shù)語"Kdis，，或"Kd"是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。本文使用的術(shù)語"KD，，是指解離常數(shù)，它是由Kd與Ka的比值獲得的(即Kd/Ka),并且表示為摩爾濃度(M)。抗體的Ko值可以用本領(lǐng)域建立的方法測(cè)定。測(cè)定抗體Ko的一種優(yōu)選方法是使用表面等離振子共振法，優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)，如8〖&(:0^@系統(tǒng)。本文使用的術(shù)語IgG抗體的"高親和力"是指抗體對(duì)于靶抗原的KD為l(rV[或更低、更優(yōu)選10一M或更低、甚至更優(yōu)選10—^M或更低。但是對(duì)于其他抗體同種型來說，"高親和力"結(jié)合可能不同。例如，對(duì)于IgM同種型來說，"高親和力"結(jié)合是指抗體具有10一M或更低、更優(yōu)選10—Sm或更低、甚至更優(yōu)選10一m或更低的kd。本文使用的術(shù)語"受試者"包括任何人或非人類動(dòng)物。術(shù)語"非人類動(dòng)物，，包括所有脊推動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類動(dòng)物、爬行類動(dòng)物等。本申請(qǐng)的各個(gè)方面在下面的章節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)描述。抗巖藻糖基-GMl抗體本發(fā)明的抗體的特征在于抗體的特定功能特征或特性。例如，這些抗體與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體以高親和力與巖藻糖基—GMl結(jié)合，例如Ko為lxlO々M或更低。本發(fā)明的抗巖藻糖基-GM1抗體優(yōu)選地顯示以下一個(gè)或多個(gè)特征(a)與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合；和(b)與人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系DMS-79(人SCLCATCC#CRL-2049)結(jié)合。優(yōu)選地，該抗體以5xl0-SM或更低的KD與巖藻糖基-GMl結(jié)合，以1x10-SM或更低的Kd與巖藻糖基-GMl結(jié)合，以5x10一M或更低的Kd與巖藻糖基-GM1結(jié)合，以介于1x1(TSM和1x1(T9:\1之間或更低的KD與巖藻糖基-GMl結(jié)合。評(píng)價(jià)抗體對(duì)巖藻糖基-GMl的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)在本領(lǐng)域中是公知的，包括，例如ELISA、Western印跡分析和RIA?？贵w的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如結(jié)合親和力)也可以通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(如ELISA、Scatchard和Biacore分析)來評(píng)價(jià)。單克隆抗體5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5本發(fā)明的優(yōu)選抗體包括如實(shí)施例1和2所述分離并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征的人單克隆抗體5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5。5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的VH氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:1、2、3、4、5和6中。5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的Vl氛基酸序列分別顯示在SEQIDNO:7、8、9、10、11和12中。因?yàn)檫@些抗體中的每一個(gè)都能夠與巖藻糖基-GMl結(jié)合，逸些Vh和Vl序列可以"混合并匹配"，從而產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗巖藻糖基-GM1結(jié)合分子。巖藻糖基-GMl與這些"混合并匹配的"抗體的結(jié)合可以用上文及實(shí)施例中所述的結(jié)合試驗(yàn)(例如ELISA)來檢測(cè)。優(yōu)選地，當(dāng)VH和Vt鏈混合并匹配時(shí)，來自特定VH/VL配對(duì)的VH序列被替換為結(jié)枸上相似的Vh序列。同樣，優(yōu)選地，來自特定VH/ViJ己對(duì)的VL序列祐:替換為結(jié)構(gòu)上相似的V^序列。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4、5和6的氨基酸序列的重《連可變區(qū)；和(b)包含選自SEQIDNO:7、8、9、10、11和12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與巖藻糖基-GMl、優(yōu)選巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。優(yōu)選的重鏈和輕鏈組合包括(a)包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:IO的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:1l的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明才是供包含5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3或其組合的抗體。5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的VhCDR1的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:13、14、15、16、17和18中。5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的VHCDR2的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:19、20、21、22、23和24中。5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的VhCDR3的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:25、26、27、28、29和30中。5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的VkCDR1的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:31、32、33、34、35和36中。5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的VKCDR2的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:37、38、39、40、41和42中。5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的VkCDR3的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:43、44、45、46、47和48中。CDR區(qū)用Kabat系統(tǒng)(Kabat,E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào)91-3242)勾畫出。因?yàn)檫@些抗體均能與巖藻糖基-GMl結(jié)合，并且抗原結(jié)合特異性主要是由CDR1、CDR2和CDR3區(qū)提供的，VHCDR1、CDR2和CDR3序列與VKCDRl、CDR2和CDR3序列可以"混合并匹配，，(即來自不同抗體的CDR可以混合并匹配，但是毎個(gè)抗體必須含有VhCDR1、CDR2和CDR3和VkCDR1、CDR2和CDR3),以產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗巖藻糖基-GMl結(jié)合分子。巖藻糖基-GMl與這些"混合并匹配的"抗體的結(jié)合可以用上文及實(shí)施例中所述的結(jié)合試驗(yàn)(例如ELISA、Biacore分析)檢測(cè)。優(yōu)選地，當(dāng)VhCDR序列混合并匹配時(shí)，來自特定Vh序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列。同樣，當(dāng)VkCDR序列混合并匹配時(shí)，來自特定Vk序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列優(yōu)選地被替換為結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，通過將一個(gè)或多個(gè)VH和/或VLCDR區(qū)序列替換為來自此處公開的單克隆抗體5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的CDR序列的結(jié)構(gòu)上相似的序列，可以產(chǎn)生新的Vh和Vl序列。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:13、14、15、16、17和18的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含選自SEQIDNO:19、20、21、22、23和24的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含選自SEQIDNO:25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含選自SEQIDNO:31、32、33、34、35和36的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含選自SEQIDNO:37、38、39、40、41和42的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含選自SEQIDNO:43、44、45、46、47和48的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3;其中該抗體與巖藻糖基-GMl、優(yōu)選與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:13的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:19的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:25的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:31的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:37的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:43的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:14的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:20的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:26的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:32的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:38的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:44的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:15的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:21的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:27的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:33的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:39的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:45的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:16的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:22的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:28的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:34的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:40的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:46的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:17的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:23的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:29的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:35的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:41的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:47的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:18的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:24的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:30的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:36的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:42的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:48的輕鏈可變區(qū)CDR3。本領(lǐng)域公知，不依賴于CDR1和/或CDR2域，單獨(dú)的CDR3域即可以決定抗體對(duì)于同源抗原的結(jié)合特異性，并且基于共同的CDR3序列可以預(yù)測(cè)性地產(chǎn)生具有相同結(jié)合特異性的多種抗體。參見，例如，Klimka等，S"'to/z,o/Omcw83(2):252-260(2000)(描述了僅使用鼠抗-CD30抗體Ki-4的重鏈可變域CDR3產(chǎn)生人源化抗-CD30抗體)；Beiboer等,J.編編.296:833-849(2000)(描述了僅使用親本鼠MOC-31抗-EGP-2抗體的重鏈CDR3序列產(chǎn)生重組上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗體)；Rader等，尸腦淑/.t/.S.A95:8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整聯(lián)蛋白o(hù)tvp3抗體LM609的重鏈和輕鏈可變CDR3域的一組人源化抗整聯(lián)蛋白0Cv(33抗體，其中每個(gè)成員抗體在CDR3域之外含有不同的序列，并且能夠與親本鼠抗體結(jié)合相同的表位，其親和力與親本鼠抗體一樣高或更高)；Barbas等，爿w.C/zew.5bc.116:2161-2162(1994)(公開了CDR3域?qū)乖Y(jié)合提供了最重要的貢獻(xiàn))；Barbas等，iVoc，胸/.爿cac/.Sc/.f/.W.92:2529-2533(1995)(描述了三種抗人胎盤DNA的Fab(SI-1、SI-40和SI-32)的重鏈CDR3序列向抗破傷風(fēng)類毒素Fab的重鏈上的移植，由此替換了存在的重鏈CDR3，并且證明單獨(dú)的CDR3提供結(jié)合特異性)；和Ditzel等，//附mw"o/.157:739-749(1996)(描述了移植研究，其中僅向單特異性IgG破傷風(fēng)類毒素結(jié)合Fabp313抗體的重鏈轉(zhuǎn)移親本多特異性FabLNA3的重鏈CDR3足以保留親本Fab的結(jié)合特異性)。上述每一參考文獻(xiàn)都全文引入作為參考。因此，在某些方面，本發(fā)明提供包含一個(gè)或多個(gè)來自非人抗體如小鼠或大鼠抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該單克隆抗體能夠與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，這些包含一個(gè)或多個(gè)來自非人抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的抗體與相應(yīng)的親本非人抗體(a)能夠竟?fàn)幗Y(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合相同的表位；和/或(d)具有類似的結(jié)合親和力。在其他方面，本發(fā)明提供包含一個(gè)或多個(gè)來自第一人抗體(如從非人動(dòng)物獲得的人抗體)的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該第一人抗體能夠與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合，并且其中來自該第一人抗體的CDR3域代替了缺乏對(duì)巖藻糖基-GM1的結(jié)合特異性的人抗體中的CDR3域，從而產(chǎn)生能夠與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合的第二人抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的包含一個(gè)或多個(gè)來自第一人抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的抗體與相應(yīng)的親本第一人抗體(a)能夠竟?fàn)幗Y(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合相同的表位；和/或(d)具有類似的結(jié)合親和力。具有特定種系序列的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含來源于人VH3-48基因或作為該基因的產(chǎn)物的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與巖藻糖基-GMl、優(yōu)選巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含來源于人VKL15基因或作為該基因的產(chǎn)物的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與巖藻糖基-GMl、優(yōu)選巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體(a)包含來源于人Vh3-48基因(該基因編碼SEQIDNO:61所示的氨基酸序列)或作為該基因的產(chǎn)物的重鏈可變區(qū)；(b)包含來源于人VkL15基因(該基因編碼SEQIDNO:62所示的氨基酸序列)或作為該基因的產(chǎn)物的輕鏈可變區(qū)；且(c)與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。分別具有Vh3-48和VkL15的VH和VK的抗體的例子是5Bl、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5。在本文中，如果一種人抗體的可變區(qū)是從使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)中獲得的，則該人抗體包含"來源于"特定種系序列或"作為其產(chǎn)物"的重鏈或輕鏈可變區(qū)。這樣的系統(tǒng)包括用目標(biāo)抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或者用目標(biāo)抗原篩查展示在噬菌體上的人免疫球蛋白基因文庫(kù)。"來源于"人種系免疫球蛋白序列或"作為其產(chǎn)物"的人抗體可以這樣鑒定將該人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，選擇在序列上最接近于該人抗體序列(即有最高％同一性)的人種系免疫球蛋白序列。"來源于"特定人種系免疫球蛋白序列或"作為其產(chǎn)物"的人抗體與該種系序列相比可能包含氨基酸差異，例如由于天然發(fā)生的體細(xì)胞突變或定點(diǎn)突變的有意引入而導(dǎo)致的氨基酸差異。但是，選擇的人抗體在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列通常至少90%相同，并且含有當(dāng)與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠種系序列)相比較時(shí)確認(rèn)該人抗體屬于人類抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體在氨基酸序列上與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列可以至少95%、或者甚至至少96%、97%、98%或99%相同。典型地，來源于特定人種系序列的人抗體顯示與該人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過10個(gè)氨基酸的差異。在某些情況中，該人抗體可能顯示與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過5個(gè)、或者甚至不超過4、3、2或1個(gè)氨基酸的差異。同源抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含的重鏈和輕鏈可變區(qū)含有與此處所述優(yōu)選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗體保留了本發(fā)明抗巖藻糖基-GM1抗體的所需功能特性。例如，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:1、2、3、4、5和6的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:7、8、9、10、11和12的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；并且該抗體表現(xiàn)出一種或多種以下性質(zhì)(c)該抗體以1x10:M或更低的Kd與巖藻糖基-GMl結(jié)合；(d)該抗體與人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系DMS-79(人SCLCATCC#CRL-2049)結(jié)合在另外一些實(shí)施方案中，Vh和/或Vl氛基酸序列可以與上述序列85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源。具有與上述序列的Vh和Vl區(qū)高度(即80%或更高)同源的Vh和Vl區(qū)的抗體可以如下荻得誘變(例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變)編碼SEQIDNO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的核酸分子，然后用此處所述的功能試驗(yàn)檢測(cè)編碼的被改變抗體所保留的功能(即以上(c)和(d)中所述的功能)。如本文使用的，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同源性等同于兩個(gè)序列之間的百分同一性?？紤]為了兩個(gè)序列之間進(jìn)行最佳比對(duì)所需要引入的空位的數(shù)目和每個(gè)空位的長(zhǎng)度后，兩個(gè)序列之間的百分同一性是這兩個(gè)序列共有的相同位點(diǎn)的目的函凄t(即％同源性=相同位點(diǎn)的彩目/位點(diǎn)的總數(shù)x100)。兩個(gè)序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以如下面的非限制性實(shí)施例中所述用數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性可以用已經(jīng)整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4:11-17(1988))的算法來確定，其使用PAM120權(quán)重殘基表，空位長(zhǎng)度罰分為12,空位罰分為4。另外，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性也可以用已經(jīng)整合入GCG軟件包(可從www.gcg.com獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))的算法來確定，其使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣,16、14、12、10、8、6或4的空位^又重，和l、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度4又重。另外或者可替代地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步作為"查詢序列，，用于進(jìn)行公共數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，例如鑒定相關(guān)序列。這種檢索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版本)進(jìn)行。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，得分=50,字長(zhǎng)=3，以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對(duì)，可以采用如Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402所述的空位BLAST。當(dāng)采用BLAST和空位BLAST程序時(shí)，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。(參見www.ncbi.nlm.nih.gov。)具有保守修飾的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)包含基于本文所述優(yōu)選抗體(例如5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8或18D5)的特定氨基酸序列或其保守修飾，并且其中該抗體保留本發(fā)明抗巖藻糖基-GMl抗體的所需功能特性。因此，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕《連可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:25、26、27、28、29和30的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:43、44、45、46、47和48的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；并且該抗體表現(xiàn)出一種或多種以下性質(zhì)(c)與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合；和(d)該抗體與人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系DMS-79(人SCLCATCC#CRL-2049)結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:19、20、21、22、23和24的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:37、38、39、40、41和42的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDRl序列包含選自SEQIDNO:13、14、15、16、17和18的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQIDNO:31、32、33、34、35和36的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。本文使用的術(shù)語"保守序列修飾"是指不會(huì)顯著影響或改變含該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特性的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失。可以通過本領(lǐng)域^^知的標(biāo)準(zhǔn)4支術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，向本發(fā)明抗體中引入修飾。保守氨基酸置換是將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、(3-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，本發(fā)明抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被置換為來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以利用本文所述的功能測(cè)定檢測(cè)改變的抗體所保留的功能(即，以上(c)和(d)中所述的功能)。與本發(fā)明的抗巖藻糖基-GMl抗體結(jié)合相同表位的抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與本發(fā)明的任意巖藻糖基-GMl單克隆抗體結(jié)合巖藻糖基-GMl上的相同表位的抗體(即能夠與本發(fā)明的任意單克隆抗體交叉竟?fàn)幗Y(jié)合巖藻糖基-GMl的抗體)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于交叉竟?fàn)幯芯康膮⒈瓤贵w可以是單克隆抗體5BK具有分別如SEQIDNO:1和7所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體SBla(具有分別如SEQIDNO:2和8所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體7D4(具有分別如SEQIDNO:3和9所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體7E4(具有分別如SEQIDNO:4和10所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體13B8(具有分別如SEQIDNO:5和1l所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體18D5(具有分別如SEQIDNO:6和U所示的Vh和Vl序列)。這些交叉竟?fàn)幙贵w可以根據(jù)它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)巖藻糖基-GMl結(jié)合測(cè)定中與5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8或18D5交叉竟?fàn)幍哪芰龛b定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA測(cè)定或流式細(xì)胞分析來證明與本發(fā)明抗體的交叉竟?fàn)?。被測(cè)試抗體抑制(例如)5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8或18D5與巖藻糖基-GM1結(jié)合的能力證明，該測(cè)試抗體可以與5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8或18D5竟?fàn)幗Y(jié)合巖藻糖基-GM1，因此與5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8或18D5結(jié)合巖藻糖基-GM1上的相同表位。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8或18D5結(jié)合巖藻糖基-GMl上的相同表位的抗體是人單克隆抗體。這些人單克隆抗體可以如實(shí)施例所述制備和分離。工程化抗體和修飾的抗體本發(fā)明的抗體進(jìn)一步可以利用具有此處所公開的一種或多種VH和/或Vl序列的抗體作為起始材料來制備，以構(gòu)建一種修飾的抗體，個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)(即VH和/或VO例如一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)和/或一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基來工程改造抗體。另外或者可替代地，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來工程改造抗體，例如改變?cè)摽贵w的效應(yīng)功能?？梢赃M(jìn)行的一種類型的可變區(qū)工程改造是CDR移植?？贵w主要通過位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個(gè)原因，CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外的序列在各個(gè)抗體之間更加多樣化。由于CDIUf列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，因此通過構(gòu)建如下的表達(dá)載體能夠表達(dá)模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體該表達(dá)載體包含來自特定天然存在抗體的CDR序列，該CDR序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構(gòu)架序列上(參見，例如，Riechmann,L.等(1998)Nature332:323-327;Jones，P.等(1986)Nature321:522-525;Queen,C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033;Winter的美國(guó)專利5，225，539,和Queen等的美國(guó)專利5,530,101;5,585,089;5,693，762和6，180，370)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQIDNO:13、14、15、16、17和18,SEQIDNO:19、20、21、22、23和24，和SEQIDNO:25、26、27、28、29和30的氨基酸序列，并且包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQIDNO:31、32、33、34、35和36,SEQIDNO:37、38、39、40、41和42，和SEQIDNO:43、44、45、46、47和48的氨基酸序列。因此，這些抗體含有單克隆抗體5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8或18D5的Vh和V^CDR序列，但是可能含有與這些抗體不同的構(gòu)架序列。這些構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫(kù)或發(fā)表的參考文獻(xiàn)中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在以下資源中發(fā)現(xiàn)"VBase，，人種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)(可從因斗爭(zhēng)網(wǎng)上www.mrc畫cpe.cam.ac.uk/vbase獲《尋)，以及Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出片反號(hào)91-3242;Tomlinson，I.M.等(1992)"TheRepertoireofHumanGermlineVhSequencesRevealsaboutFiftyGroupsofVhSegmentswithDifferentHypervariableLoops"J.Mol.Biol.227:776畫798;和Cox，J.P.L.等(1994)"ADirectoryofHumanGerm-lineVhSegmentsRevealsaStrongBiasintheirUsage"Eur.J.Immunol.24:827-836;其內(nèi)容均引入本文作為參考。作為另一個(gè)例子，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)。例如，在HCo7HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的下列重鏈種系序列可以根據(jù)如下Genbank登錄號(hào)獲得1-69(NG_0010109,NT024637和BC070333)、3-33(NG_0010109和NT—024637)和3-7(NG—0010109和NT—024637)。作為另一個(gè)例子，在HCo12HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的以下重鏈種系序列可以根據(jù)如下Genbank登錄號(hào)獲得1-69(NG_0010109、NT—024637和BC070333)、5-51(NG—0010109和NT024637)、4-34(NG—0010109和NT—024637)、3-30.3()和3曙23(AJ楊678)。用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選構(gòu)架序列在結(jié)構(gòu)上類似于由所選擇的本發(fā)明抗體使用的構(gòu)架序列，例如，類似于本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體使用的Vh3-48構(gòu)架序列(SEQIDNO:61)和/或VkL15構(gòu)架序列(SEQIDNO:62)。VhCDR1、CDR2和CDR3序列和VkCDR1、CDR2和CDR3序列可以被移植到與該構(gòu)架序列的來源種系免疫球蛋白基因中發(fā)現(xiàn)的構(gòu)架區(qū)具有相同序列的構(gòu)架區(qū)上，或者CDR序列可以被移植到與該種系序列相比含有一個(gè)或多個(gè)突變的構(gòu)架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些情況中，將構(gòu)架區(qū)內(nèi)的殘基進(jìn)行突變對(duì)于保持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力是有利的(參見，例如，Queen等的美國(guó)專利5,530，101;5,585,089;5，693，762和6，180，370)。另一種類型的可變區(qū)修飾是突變VH和/或VtcCDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，從而改善目標(biāo)抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和力)?？梢赃M(jìn)行定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變以引入突變，對(duì)抗體結(jié)合的影響，或者其他感興趣的功能特性，可以用此處所述和實(shí)施例中提供的體外或體內(nèi)試驗(yàn)來評(píng)價(jià)。優(yōu)選引入(如上文所述的)保守修飾。這些突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但是優(yōu)選置換。而且，一4殳改變CDR區(qū)內(nèi)的不超過1、2、3、4或5個(gè)殘基。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的重鏈可變區(qū)含有(a)VHCDR1區(qū)，其包含選自SEQIDNO:13、14、15、16、17和18的氨基酸序列，或與SEQIDNO:13、14、15、16、17和18相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2區(qū)，其包含選自SEQIDNO:19、20、21、22、23和24的氨基酸序列，或與SEQIDNO:19、20、21、22、23和24相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VhCDR3區(qū)，其包含選自SEQIDNO:25、26、27、28、29和30的氨基酸序列，或與SEQIDNO:25、26、27、28、29和30相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(c!)VkCDR1區(qū)，其包含選自SEQIDNO:31、32、33、34、35和36的氨基酸序列，或與SEQIDNO:31、32、33、34、35和36相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VKCDR2區(qū)，其包含選自SEQIDNO:37、38、39、40、41和42的氨基酸序列，或與SEQIDNO:37、38、39、40、41和42相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VKCDR3區(qū)，其包含選自SEQIDNO:43、44、45、46、47和48的氨基酸序列，或與SEQIDNO:43、44、45、46、47和48相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。本發(fā)明的工程化抗體包括例如為了改善抗體特性而對(duì)其vh和/或VK內(nèi)的構(gòu)架殘基進(jìn)行了修飾的抗體。進(jìn)行這樣的構(gòu)架修飾一般是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架殘基"回復(fù)突變"為相應(yīng)的種系序列。更特別地，經(jīng)歷體細(xì)胞突變的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的構(gòu)架殘基。通過比較抗體構(gòu)架序列與衍生該抗體的種系序列，可以鑒定這些殘基。例如，對(duì)于7E4，vh的氨基酸殘基弁11(FR1內(nèi))是絲氨酸，而在相應(yīng)的VH3-48種系序列中該殘基為亮氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，可以通過(例如)定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，將該體細(xì)胞突變"回復(fù)突變"為種系序列(例如，7E4的Vh的FR1的殘基弁11可以從絲氨酸"回復(fù)突變"為亮氨酸)。另一個(gè)例子是，對(duì)于5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5，VH的氨基酸殘基#16(FR1內(nèi))是谷氨酸，而在相應(yīng)的vh3-48種系序列中該殘基為甘氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的vh的殘基弁16從谷氨酸"回復(fù)突變"為甘氨酸。這樣"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5，VH的氨基酸殘基#23(FR1內(nèi))是纈氨酸，而在相應(yīng)的VH3-48種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的Vh的殘基#23從纈氨酸"回復(fù)突變"為丙氨酸。這樣"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于7D4，vh的氨基酸殘基弁24(FR1內(nèi))是纈氨酸，而在相應(yīng)的VH3-48種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將7D4的vh的殘基弁24從纈氨酸"回復(fù)突變"為丙氨酸。這樣"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于13B8，vh的氨基酸殘基弁29(FR1內(nèi))是亮氨酸，而在相應(yīng)的VH3-48種系序列中該殘基為苯丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將13B8的vh的殘基弁29從亮氨酸"回復(fù)突變"為苯丙氨酸。這樣"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于7D4、13B8和18D5，VH的氨基酸殘基弁48(FR2內(nèi))是異亮氨酸，而在相應(yīng)的VH3-48種系序列中該殘基為纈氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將7D4、13B8和18D5的Vh的殘基#48(FR2內(nèi)的殘基#13)從異亮氨酸"回復(fù)突變"為纈氨酸。這樣"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于7D4和18D5，Vn的氨基酸殘基弁84(FR3內(nèi))是絲氨酸，而在相應(yīng)的VH3-48種系序列中該殘基為天冬酰胺。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將7D4和18D5的Vh的殘基#84(FR3內(nèi)的殘基弁18)從絲氨酸"回復(fù)突變"為天冬酰胺。這樣"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明中。另一種類型的構(gòu)架修飾涉及對(duì)構(gòu)架區(qū)內(nèi)、乃至一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基進(jìn)行突變，以除去T細(xì)胞表位，從而降低該抗體的潛在的免疫原性。該方法也被稱為"脫免疫"，在Carr等的公布號(hào)為20030153043的美國(guó)專利中詳細(xì)記載。除了在構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行的修飾以外，或者作為它的替代方案，也可以將本發(fā)明的抗體工程改造為在Fc區(qū)內(nèi)包括修飾，一4殳是為了改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補(bǔ)體固定、Fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，也可以將本發(fā)明的抗體化學(xué)修飾(例如一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分可以連接到該抗體上)，或者修飾改變其糖基化，以改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性。這些實(shí)施方案均在下文詳細(xì)描述。Fc區(qū)中殘基的編號(hào)是Kabat的EU指數(shù)的編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾CH1的鉸鏈區(qū)，使該鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目改變，例如增加或減少。該方法在Bodmer等的美國(guó)專利No.5，677，425號(hào)中詳細(xì)記載。改變CH1鉸鏈區(qū)中半胱氨酸的數(shù)目是為了(例如)促進(jìn)輕鏈和重鏈的裝配，或提高或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一實(shí)施方案中，對(duì)抗體的Fc鉸鏈區(qū)進(jìn)行突變，以降低該抗體的生物半衰期。更具體地，向Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，使得該抗體與葡萄球菌蛋白A(SpA)的結(jié)合比天然Fc-鉸鏈結(jié)構(gòu)域與SpA的結(jié)合減弱。該方法在Ward等的美國(guó)專利No.6，165，745號(hào)中詳細(xì)記載。在另一實(shí)施方案中，修飾抗體以提高其生物半衰期。可以使用各種方法。例如，如Ward的美國(guó)專利No.6,277，375所述，可以引入一個(gè)或多個(gè)如下突變T252L、T254S、T256F?；蛘?，如Presta等的美國(guó)專利No.5，869，046和6，121，022所述，為了4是高生物半衰期，該抗體可以在CH1或CL區(qū)內(nèi)進(jìn)行改變，使之含有來自IgGFc區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)環(huán)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位。在其他一些實(shí)施方案中，通過將至少一個(gè)氨基酸殘基置換為不同的氨基酸殘基來改變Fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320、322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體對(duì)效應(yīng)配體的親和力改變，但是保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。其親和力被改變的效應(yīng)配體可以是，例如，F(xiàn)c受體或補(bǔ)體的Cl成分。該方法在Winter等的美國(guó)專利No,5,624，821和5，648，260中更詳細(xì)地描述。在另外一個(gè)實(shí)施例中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體的Clq結(jié)合改變和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)降低或消除。該方法在Idusogie等的美國(guó)專利No.6,194，551中更詳細(xì)地描述。在另外一個(gè)實(shí)施例中，改變氨基酸位點(diǎn)231和239中的一個(gè)或多個(gè)氨基S臾殘基，從而改變?cè)摽贵w固定補(bǔ)體的能力。該方法在Bodmer等的PCT公布WO94/29351中進(jìn)一步描述。在另外一個(gè)實(shí)施例中，為了提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對(duì)Fcy受體的親和力，通過在下列位點(diǎn)處修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸來修飾Fc區(qū)238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。該方法在Presta的PCT公布WO00/42072中進(jìn)一步描述。而且，人IgGl上對(duì)于FcyRI、FcyRH、FcyRIII和FcRn的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)作圖，并且已經(jīng)描述了具有改善的結(jié)合的變體(參見，Shields,R丄.等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。位點(diǎn)256、290、298、333、334和339處的特定突變顯示改善了與FcYRIII的結(jié)合。另外，下列組合突變體顯示改善了與FcyRIII的結(jié)合T256A/S298A，S298A/E333A,S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。在另一實(shí)施方案中，改變抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化的抗體(即該抗體缺乏糖基化)。例如，為了提高抗體對(duì)抗原的親和力，可以改變糖基化。這樣的碳水化合物修飾可以通過(例如)改變抗體序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。例如，可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，使一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)構(gòu)架糖基化位點(diǎn)消失，從而消除該位點(diǎn)處的糖基化。這種無糖基化可以提高抗體對(duì)抗原的親和力。這種方法在Co等的美國(guó)專利No.5，714，350和6,350,861中更詳細(xì)地描述。另外或者可替代地，可以制備糖基化類型改變的抗體，如巖藻糖基殘基數(shù)目減少的低巖藻糖基化抗體，或等分GlcNac結(jié)構(gòu)增多的抗體。已經(jīng)證明這種改變的糖基化模式提高了抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可以通過(例如)在具有改變的糖基化機(jī)制的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體來實(shí)現(xiàn)。具有改變的糖基化機(jī)制的細(xì)胞在本領(lǐng)域中已有描述，能夠用作宿主細(xì)胞，在其中表達(dá)本發(fā)明的重組抗體，從而產(chǎn)生糖基化改變的抗體。例如，細(xì)胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)UT8(a(l,6)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因)，因此在Ms704、Ms705和Ms709細(xì)胞系中表達(dá)的抗體在它們的碳水化合物中缺乏巖藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8:細(xì)胞系的產(chǎn)生是通過使用兩種替代載體定向破壞CHO/DG44細(xì)胞中的FUT8基因(參見Yamane等的美國(guó)專利申請(qǐng)No.20040110704和Yamane-Ohnuki等.(2004)BiotechnolBioeng87:614-22)。另一個(gè)例子是，Hanai等的EP1，176,195描述了具有功能破壞的FUT8基因的細(xì)胞系，F(xiàn)UT8基因編碼巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，由于減少或消除了oc(l，6)鍵相關(guān)的酶，在這種細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為低巖藻糖基化。Hanai等也描述了用于向結(jié)合抗體Fc區(qū)的N-乙酰葡萄糖胺上添加巖藻糖的酶活性低或不具有酶活性的細(xì)胞系，例如大鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/0(ATCCCRL1662)。Presta的PCT公布WO03/035835記載了一種變異CHO細(xì)胞系，Lecl3細(xì)胞，其將巖藻糖連接到Asn(297)-連接的碳水化合物上的能力降低，也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體為低巖藻糖基化(參見，Shields,R丄.等(2001)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等的PCT公布WO99/54342記栽了表達(dá)糖蛋白修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如(3(1,4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII))的工程化細(xì)胞系，因此該工程化細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為等分GlcNac結(jié)構(gòu)增加，導(dǎo)致抗體的ADCC活性提高(參見，Umana等(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。此外，抗體的巖藻糖殘基可以用巖藻糖苷酶切下。例如，巖藻糖苷酶oc-L-巖藻糖苷酶從抗體上除去巖藻糖殘基(Tarentino，A丄,等.(1975)Biochem.14:5516-23)。本發(fā)明涉及的對(duì)此處所述抗體的另一種修飾是PEG化。例如，為了提高抗體的生物(例如血清)半衰期，可以將該抗體PEG化。為了PEG化一種抗體，一般在使一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)與抗體或抗體片段連接的條件下，將該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物反應(yīng)。優(yōu)選地，通過與反應(yīng)性PEG分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行PEG化。本文使用的術(shù)語"聚乙二醇，，包括用來衍生化其他蛋白質(zhì)的任何PEG形式，如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，將要PEG化的抗體是一種非糖基化的抗體。將蛋白質(zhì)PEG化的方法在本領(lǐng)域中公知，并且可以用于本發(fā)明的抗體。參見，例如，Nishimura等的EP0154316和Ishikawa等的EP0401384?？贵w工程化方法如上所述，能夠利用具有此處公開的Vh和Vk序列的抗巖藻糖基-GMl抗體，通過修飾VH和/或VK序列或與之連接的恒定區(qū)，產(chǎn)生新的抗巖藻糖基-GMl抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，利用本發(fā)明的抗巖藻糖基-GMl抗體(例如5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8或18D5)的結(jié)構(gòu)特征，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗巖藻糖基-GMl抗體，該結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗巖藻糖基-GMl抗體保留本發(fā)明抗體的至少一種功能特性，如與巖藻糖基-GMl結(jié)合。如上所述，例如，5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8或18D5的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)或其突變可以與已知的構(gòu)架區(qū)和/或其他CDR重組組合，從而產(chǎn)生另外的重組工程化的本發(fā)明的抗巖藻糖基-GMl抗體。其他修飾類型包括以上部分所述的修飾。用于工程化方法的起始材料是此處提供的一種或多種VH和/或VK序列，或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)。為了產(chǎn)生工程化抗體，不一定必須實(shí)際制備(即表達(dá)為蛋白質(zhì))具有此處提供的一種或多種VH和/或VK序列，或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的抗體。而是用該序列中所含的信息作為起始材料，產(chǎn)生由原始序列衍生的"第二代"序列，然后制備該"第二代"序列，并將其表達(dá)為蛋白質(zhì)。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗巖藻糖基-GMl抗體的方法，包4舌(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:13、14、15、16、17和18的CDR1序列、選自SEQIDNO:19、20、21、22、23和24的CDR2序列、和/或選自SEQIDNO:25、26、27、28、29和30的CDR3序列；和/或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:31、32、33、34、35和36的CDR1序列、選自SEQIDNO:37、38、39、40、41和42的CDR2序列、和/或選自SEQIDNO:43、44、45、46、47和48的CDR3序歹lh(b)改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，從而產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；和(c)將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備和表達(dá)所述改變的抗體序列。優(yōu)選地，由改變的抗體序列編碼的抗體保留此處所述抗巖藻糖基-GMl抗體的一種、一些或全部功能特性，該功能特性包括但不限于(a)該抗體以1x1(TM或更低的Kd與巖藻糖基-GMl結(jié)合；(b)與人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系DMS-79(人SCLCATCC#CRL-2049)結(jié)合。改變的抗體的功能特性可以用本領(lǐng)域中使用的和/或此處所述的(如實(shí)施例中所述的)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(例如流式細(xì)胞術(shù)、結(jié)合測(cè)定)來評(píng)價(jià)。在本發(fā)明抗體的工程化方法的某些實(shí)施方案中，可以沿全部或部分抗巖藻糖基-GMl抗體編碼序列隨機(jī)或選擇性引入突變，并可以針對(duì)結(jié)合活性和/或如此處所迷的其他功能特性，篩選獲得的修飾的抗巖藻糖基-GMl抗體。突變方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述。例如，Short的PCT公布WO02/092780記載了利用飽和誘變、合成連接裝配或它們的組合產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。另夕卜，Lazar等的PCT公布WO03/074679也記載了利用計(jì)算篩選方法優(yōu)化抗體的生理化學(xué)性質(zhì)的方法。編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。該核酸可以存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存在。當(dāng)通過包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本領(lǐng)域公知的其他方法與其他細(xì)胞成分或其他污染物(例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì))分離純化時(shí)，核酸是"分離的"或"基本上純的"。參見，F(xiàn).A簡(jiǎn)bel等ed.(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork。本發(fā)明的核酸可以是，例如DNA或RNA,并且可以含有或者可以不含內(nèi)含子序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸是cDNA分子。本發(fā)明的核酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得。對(duì)于雜交瘤(例如，由如下文進(jìn)一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤)表達(dá)的抗體，編碼由雜交瘤制備的抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)獲得。對(duì)于從免疫球蛋白基因文庫(kù)中獲得的抗體(例如使用噬菌體展示技術(shù))，可以從文庫(kù)中回收編碼該抗體的核酸。本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是編碼5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8或18D5卓克隆抗體的Vh和Vl序列的核酸分子。編碼5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的Vh序列的DNA序列分別在SEQIDNO:49、50、51、52、53和54中示出。編碼5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的Vl序列的DNA序列分別在SEQIDNO:55、56、57、58、59和60中示出。一旦獲得編碼Vh和VL區(qū)段的DNA片段，即可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這些DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，將編碼Vt或VH的DNA片段與編碼另外一種蛋白質(zhì)如抗體恒定區(qū)或柔性連接體的另一個(gè)DNA片段有效連接。如本文使用的術(shù)語"有效連接"意思是兩個(gè)DNA片段連接在一起，使得這兩個(gè)DNA片段編碼的氨基酸序列保持符合閱讀框。通過將編碼vh的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VH區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例^口，Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologiclInterest:第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào)91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但是最優(yōu)選的是IgGl或IgG4恒定區(qū)。對(duì)于Fab片段重鏈基因，編碼Vh的DNA可以與只編碼重鏈CH1恒定區(qū)的另外一種DNA分子有效連接。通過將編碼V!^的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼vl區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例^口,Kabat,E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologiclInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào)91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是K或M亙定區(qū)，但最優(yōu)選的是K恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼VH和VL的DNA片段與編碼柔性連接體例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另外一個(gè)片段有效連接，使得Vh和VL序列可以表達(dá)為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，其Vt和VH區(qū)通過該柔性連接體連接(參見，例如Bird等(1988)Science242:423-426;Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;McCafferty等(1990)Nature348:552-554)。本發(fā)明的單克隆抗體的產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體(mAb)能夠通過多種技術(shù)制備，包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature256:495所述的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。雖然優(yōu)選體細(xì)胞雜交技術(shù)，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化。用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動(dòng)物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。用小鼠產(chǎn)生雜交瘤是一種完善建立的程序。免疫程序和分離用于融合的被免疫脾細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合程序也是公知的。本發(fā)明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述制備的鼠單克隆抗體的序列來制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標(biāo)鼠雜交瘤中獲得，并且使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將其工程改造為含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)上(參見，例如，Cabilly等的美國(guó)專利No.4，816，567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠CDR區(qū)插入人構(gòu)架內(nèi)(參見，例如，Winter的美國(guó)專利No.5,225,539，和Queen等的美國(guó)專利No.5,530,101;5,585,089;5，693，762和6,180，370)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體。這種抗巖藻糖基-GM1人單克隆抗體能用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在此分別被稱作HuMab小鼠和KM小鼠tm的小鼠，并且在此通稱為"人Ig小鼠'，。HuMab小鼠⑧(Medarex，Inc.)包含編碼未重排的人重鏈(ja和y)和K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使內(nèi)源p和K鏈基因座失活的定向突變(參見，例如，Lonberg等(1994)Nature368(6474):856-859)。因此，該小鼠表現(xiàn)為小鼠IgM或K表達(dá)降低，并且響應(yīng)于免疫，導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，從而產(chǎn)生高親和力人IgGK單克隆抗體(Lonberg，N.等(1994),同上；綜述見Lonberg,N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101;Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13:65-93，和Harding,F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764:536-546)。HuMab小鼠的制備和使用，以及該小鼠攜帶的基因組修飾，在下面的文獻(xiàn)中詳細(xì)描述Taylor,L.等(1992)NucleicAcidsResearch20:6287-6295;Chen，J.等(l993)InternationalImmunology5:647-656;Tuaillon等(l993)Proc.Natl.Acad.SciUSA90:3720-3724;Choi等(1993)NatureGenetics4:117-123;Chen,J.等(1993)EMBOJ.12:821-830;Tuaillon等(l994)J.Immunol.152:2912-2920;Taylor,L.等(1994)InternationalImmunology6:579-591;和Fishwild,D.等(1996)NatureBiotechnology14:845-851,這些文獻(xiàn)的內(nèi)容全文引入本文作為參考。進(jìn)一步參見，Lonberg和Kay的美國(guó)專利No.5,545，806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5，789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5,874,299;和5，770，429;和Surani等的美國(guó)專利No.5,545,807;Lonberg和Kay的PCT公布號(hào)WO92/03918，WO93/12227,WO94/25585，WO97/13852,WO98/24884和WO99/45962;和Ko謹(jǐn)n等的PCT/^布號(hào)WO01/14424。在另一實(shí)施方案中，可以用轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。這種小鼠在此被稱為"KM小鼠TM"，在Ishida等的PCT公布WO02/43478中詳細(xì)描述。再者，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗巖藻糖基-GMl抗體。例如，可以使用一種被稱作Xenomouse(Abgenix,Inc.)的替代轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，這種小鼠在例如Kucherlapati等的美國(guó)專利No.5，939，598;6,075,181;6，114，598;6，150，584和6,162，963中描述。而且，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗巖藻糖基-GMl抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，其被稱作"TC小鼠，，；這種小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中描述。此外，本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛(Kuroiwa等(2002)NatureBiotechnology20:889-894)，其能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗巖藻糖基-GMl抗體。本發(fā)明的人單克隆抗體也可以使用用于篩查人免疫球蛋白基因文庫(kù)的噬菌體展示方法制備。這種用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。參見，例如，Ladner等的美國(guó)專利No.5，223,409;5,403,484;和5,571,698;Dower等的美國(guó)專利No.5,427,908和5,580,717;McCafferty等的美國(guó)專利No.5，969,108和6，172，197;和Griffiths等的美國(guó)專利No.5,885,793;6，521，404;6,544,731;6,555,313;6,582，915和6,593，081。本發(fā)明的人單克隆抗體也可以用SCID小鼠制備，該SCID小鼠中重構(gòu)了人免疫細(xì)胞，因此在免疫時(shí)能夠產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。這種小鼠在例如Wilson等的美國(guó)專利No.5，476,996和5，698，767中描述。人Ig小鼠的免疫當(dāng)使用人Ig小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體時(shí)，可以根據(jù)Lonberg,N.等(1994)Nature368(6474):856-859;Fishwild,D.等(1996)NatureBiotechnology14:845-851;和PCT公布WO98/24884和WO01/14424所述，用純化的或富集的巖藻糖基-GMl抗原和/或重組巖藻糖基-GMl或巖藻糖基-GMl融合蛋白的制品免疫該小鼠。優(yōu)選地，第一次輸注時(shí)小鼠為6-16周齡。例如，可以使用純化的或重組的巖藻糖基-GMl抗原的制劑(5-50jng)腹膜內(nèi)免疫人Ig小鼠。產(chǎn)生抗巖藻糖基-GMl完全人單克隆抗體的詳細(xì)程序在下面的實(shí)施例1中描述。應(yīng)用各種抗原積累的經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)最初使用弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(IP)免疫，接著隔周用弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫(最多共六次)時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生應(yīng)答。但是，發(fā)現(xiàn)弗氏佐劑之外的佐劑也是有效的。另外，發(fā)現(xiàn)在沒有佐劑時(shí)，全細(xì)胞具有高度免疫原性。在免疫方案進(jìn)程中用眼眶后取血獲得的血漿樣品監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答?？梢酝ㄟ^ELISA篩選血漿(如下所述)，用具有足夠抗巖藻糖基-GMl人免疫球蛋白效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。用抗原對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)加強(qiáng)免疫，3天后處死小鼠并且取出脾臟。預(yù)期每次免疫可能需要進(jìn)行2-3次融合。每一種抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCol2抹都使用。另外，HCo7和HCol2轉(zhuǎn)基因可以雜交，產(chǎn)生具有兩種不同人重鏈轉(zhuǎn)基因的一種小鼠(HCo7/HCo12)?？商娲鼗蛘吡硗?，如實(shí)施例l所述，可以使用KM小鼠tm抹。產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤的制備為了制備產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的小鼠中分離脾細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞，并且與合適的無限增殖化細(xì)胞系(例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系)融合。根據(jù)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選得到的雜交瘤。例如，可以使用50。/qPEG,將來自被免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與六分之一數(shù)量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL1580)融合。或者，可以應(yīng)用基于電場(chǎng)的電融合法，應(yīng)用CytoPulse大腔室細(xì)胞融合電穿孔儀(CytoPulseSciences,Inc.,GlenBurnie，MD),將被免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液融合。將細(xì)胞以大約2x105的密度接種于平底微量滴定板中，接著在DMEM高濃度葡萄糖培養(yǎng)基中孵育一周，該培養(yǎng)基含有L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉(Mediatech,Inc.，Hemdon,VA)，并且還含有20。/。胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)、18%P388DI條件基質(zhì)、5%Origen雜交瘤克隆因子(BioVeris，Gaithersburg，VA)、4mML-谷氨酰胺、5mMHEPES、0.055mM(3-巰基乙醇、50單位/ml青霉素、5011^/1111鏈霉素和^次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)介質(zhì)(Sigma;HAT在融合24小時(shí)后加入)。一周后，在用HT替換了HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過ELISA根據(jù)人單克隆IgM和IgG抗體篩選各孔。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長(zhǎng)，通常在10-14天之后可以觀察培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，如果對(duì)于人IgG仍然是陽性，則可以通過有限稀釋將單克隆抗體至少亞克隆兩次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。為了純化人單克隆抗體，選擇的雜交瘤可以在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長(zhǎng)。過濾上清液，濃縮，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N丄)進(jìn)行親和層析。洗脫下來的IgG可以通過凝膠電泳和高效液相色譜法檢查以確保純度。將緩沖溶液換成PBS,用1.43的消光系數(shù)根據(jù)OD280確定濃度?？蓪慰寺】贵w分成等份并且在-80。C下保存。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的制備利用(例如)本領(lǐng)域〃^知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如，Morrison,S.(1985)science229:1202),也能在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，使用表達(dá)目標(biāo)抗體的雜交瘤進(jìn)行PCR擴(kuò)增或cDNA克隆)，獲得編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA,并將該DNA插入到表達(dá)載體中，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列有效連接。在上下文中，術(shù)語"有效連接，，意思是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)該抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相匹配的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到分別的載體中，或者，更通常地，將兩個(gè)基因插入到同一表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法將抗體基因插入到表達(dá)載體中(例如，抗體基因片段上的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)與載體連接，或者如果不存在限制性位點(diǎn)的活，則平端連接)。通過插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得Vh區(qū)段與栽體中的CH區(qū)段有效連接，而VK區(qū)段與載體中的CL區(qū)段有效連接，可以利用本文描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)產(chǎn)生任意抗體同種型的全長(zhǎng)抗體基因。另外，或者可替代地，重組表達(dá)載體能編碼有利于宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信號(hào)肽?？蓪⒖贵w鏈基因克隆到載體中，使得信號(hào)肽與該抗體鏈基因的氨基末端符合閱讀框地連接。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即，來自非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的信號(hào)肽)。除了抗體鏈基因以外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還帶有控制該抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他表達(dá)控制元件(例如，多腺苷酸化信號(hào))。這樣的調(diào)節(jié)序列例如在Goeddel(GeneExpressionTechnology.MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990))中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)的病毒元件，例如來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子?；蛘呖梢允褂梅遣《菊{(diào)節(jié)序列，例如泛蛋白啟動(dòng)子或(3-珠蛋白啟動(dòng)子。另外，調(diào)節(jié)元件也可由來自不同來源的序列組成，如SRoc啟動(dòng)子系統(tǒng)，其含有來自SV40早期啟動(dòng)子的序列和人1型T細(xì)胞白血病病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(Takebe,Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列以外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶另外的序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因有利于篩選載體已經(jīng)導(dǎo)入其中的宿主細(xì)胞(參見，例如，Axel等的美國(guó)專利No.4,399,216,4,634，665和5,179,017)。例如，選擇性標(biāo)記基因一般給已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞帶來抗藥性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主細(xì)胞中，用于氨曱喋呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選擇)。為了表達(dá)輕鏈和重鏈，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"的各種形式包括常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中的各種技術(shù)，例如，電穿孔、磷酸鉤沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。雖然在理論上可以在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選在真核細(xì)胞中，最優(yōu)選在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體，因?yàn)檫@樣的真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比原核細(xì)胞更可能組裝和分泌正確折疊并且具有免疫活性的抗體。據(jù)報(bào)道，抗體基因的原核表達(dá)無法高產(chǎn)率地產(chǎn)生活性抗體(Boss,M.A.和Wood,C.R.(1985)ImmunologyToday6:12-13)。用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO細(xì)胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中描述的dhfr-CHO細(xì)胞，和DHFR選擇性標(biāo)記一起4吏用，例如，如R.J.Kaufman禾口P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621所述)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS纟田胞和SP2纟田胞。特別地，用于NSO骨髓瘤細(xì)胞的另一種優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是WO87/04462、WO89/01036和EP338，841公開的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)足以使抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一段時(shí)間，或更優(yōu)選地，培養(yǎng)足以使抗體分泌到宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的一段時(shí)間，而產(chǎn)生抗體?？蓱?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收抗體?？贵w與抗原結(jié)合的表征通過(例如)標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測(cè)本發(fā)明抗體與巖藻糖基-GM1的結(jié)合。簡(jiǎn)要地說，用0.25^g/ml的純化巖藻糖基-GMl在PBS中的溶液包被微量滴定板，然后用PBS中的5。/。牛血清白蛋白封閉。向各個(gè)孔中加入抗體的稀釋液(例如，來自巖藻糖基-GMl免疫小鼠的血漿的稀釋液)，并且在37。C下孵育l-2小時(shí)。用PBS/Tween洗滌培養(yǎng)板，之后和與堿性磷酸酶偶聯(lián)的第二試劑(例如，對(duì)于人抗體，為山羊抗人IgGFc特異性多克隆試劑)一起在37。C下孵育1小時(shí)。洗滌后，培養(yǎng)板用pNPP底物(lmg/ml)顯色，并且在OD405-650下分析。優(yōu)選地，用顯示最高效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。如上所述的EUSA分析也可以用來篩選表現(xiàn)出與巖藻糖基-GMl免疫原有陽性反應(yīng)性的雜交瘤。將與巖藻糖基-GMl高親合力結(jié)合的雜交瘤進(jìn)行亞克隆，并且進(jìn)一步表征。從每個(gè)雜交瘤中選擇保留母細(xì)胞反應(yīng)性的一個(gè)克隆(通過ELISA)，制備5-10小瓶細(xì)胞庫(kù)，保存在-14(TC下，用于抗體純化。為了純化抗巖藻糖基-GMl抗體，選擇的雜交瘤在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長(zhǎng)。過濾上清液并且濃縮，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway，NJ)進(jìn)行親和層析。通過凝膠電泳和高效液相色譜檢查洗脫的IgG以確保純度。將緩沖溶液換成PBS,并且使用1.43的消光系數(shù)根據(jù)OD28o確定濃度。將單克隆抗體分成等份并且在-8(TC下保存。為了確定選擇的抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體是否與獨(dú)特表位結(jié)合，可以使用商售試劑(Pierce,Rockford，IL)將每種抗體生物素化?？梢允褂萌缟纤龅膸r藻糖基-GMl包被的ELISA板，應(yīng)用未標(biāo)記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體進(jìn)行竟?fàn)幯芯??？梢允褂面溍箍股锼?石成性磷酸酶探針檢測(cè)生物素化mAb的結(jié)合。為了確定被純化的抗體的同種型，可以用對(duì)特定同種型抗體具有特異性的試劑進(jìn)行同種型ELISA。例如，為了確定人單克隆抗體的同種型，在4°C下用1lag/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔過夜。用1。/oBSA封閉之后，平板與1lag/ml或更少的待試單克隆抗體或純化的同種型對(duì)照物在環(huán)境溫度下反應(yīng)l-2小時(shí)。這些孔然后與人IgGl或人IgM特異性堿性磷酸酶偶聯(lián)的探針反應(yīng)。如上所述使平板顯色并且分析。可以通過Western印跡法進(jìn)一步檢測(cè)抗巖藻糖基-GMl人IgG與巖藻糖基-GMl抗原的反應(yīng)性。簡(jiǎn)要地說，制備巖藻糖基-GMl并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用10%胎牛血清封閉，并用待測(cè)單克隆抗體探查。人IgG的結(jié)合可以用抗人IgG堿性磷酸酶檢測(cè)，并用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.,St.Louis,Mo.)顯色。免疫偶聯(lián)物另一方面，本發(fā)明涉及與諸如細(xì)胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素等治療性部分偶聯(lián)的抗巖藻糖基-GMl抗體或其片段。這些偶聯(lián)物在此被稱為"免疫偶聯(lián)物"。包含一種或多種細(xì)胞毒素的免疫偶聯(lián)物被稱作"免疫毒素"。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑包括對(duì)細(xì)胞有害(例如殺傷細(xì)胞)的任何試劑。實(shí)例包括紫杉醇、細(xì)胞+〉弛素B、短桿菌肽D、溴化乙咬、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似物或同系物。治療劑還包括，例如抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴喚(decarbazine))，烷化劑(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺合鉑(II)(DDP)順鉑)，氨茴霉素類(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素D(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC)),和抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新^威和長(zhǎng)春^威)。能與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的治療性細(xì)胞毒素的其他優(yōu)選例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它們的》f生物。刺孢霉素抗體偶聯(lián)物的一個(gè)例子是可作為商品購(gòu)得的(Mylotarg;Wyeth-Ayerst)。治療性細(xì)胞毒素的例子可見，例如，美國(guó)專利6548530和6281354和美國(guó)專利申請(qǐng)US2003/0064984、US2003/0073852和US2003/0050331。可以利用本領(lǐng)域使用的連接體技術(shù)將細(xì)胞毒素與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)。已經(jīng)用于將細(xì)胞毒素與抗體偶聯(lián)的連接體類型的實(shí)例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的連接體。可以選擇，例如，在溶酶體區(qū)室內(nèi)易被低pH切割或易被蛋白酶切割的連接體，該蛋白酶例如是在肺瘤組織中優(yōu)先表達(dá)的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)。關(guān)于細(xì)胞毒素的類型、用于偶聯(lián)治療劑與抗體的連接體和方法的進(jìn)一步討論，參見Saito，G.等(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55:199-215;Trail,P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52:328-337;Payne,G.(2003)CancerCell3:207-212;Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer2:750陽763;Pastan，I.和Kreitman，R,J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091;Senter，P.D.和Springer,C.J.(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。本發(fā)明的抗體也可以與放射性同位素偶聯(lián)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性i文射性藥物，也被稱作放射性免疫偶聯(lián)物。能夠與診斷或治療性使用的抗體偶聯(lián)的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、銦111、釔9()和镥177。制備放射性免疫偶聯(lián)物的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。放射性免疫偶聯(lián)物的例子可以作為商品獲得，包括ZevalinTM(IDECPharmaceuticals)和BexxarTM(CorixaPharmaceuticals),并且能夠利用類似的方法使用本發(fā)明的抗體制備放射性免疫偶聯(lián)物。本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物可用于改變特定的生物學(xué)反應(yīng)，且藥物部分不應(yīng)理解為局限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)包括，例如具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或干擾素-y;或生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)物，如淋巴因子、白介素-1("IL-l")、白介素-2("IL-2")、白介素-6("IL-6")、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子("GM-CSF，，)、粒細(xì)胞集落刺激因子("G-CSF")或其他生長(zhǎng)因子。將這種治療性部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是眾所周知的，參見，例如，Arnon等，"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy",inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985);Hellst誦等，"AntibodiesForDrugDelivery",inControlledDrugDelivery(2ndEd.),Robinson等(ed.)，pp.623-53(MarcelDekker，Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",inMonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等(ed.),pp.475-506(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等(ed.)，pp.303-16(AcademicPress1985)，和Thorpe等,"ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates,"Immunol.Rev.，62:119-58(1982)。雙特異性分子另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的抗巖藻糖基-GMl抗體或其片段的雙特異性分子。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以被衍生化或連接到另一個(gè)功能性分子上，如另一個(gè)肽或蛋白質(zhì)(例如另一個(gè)抗體或受體的配體)上，從而生成可與至少兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)或靶分子結(jié)合的雙特異性分子。本發(fā)明的抗體實(shí)際上可以被衍生化或連接到一個(gè)以上的其他功能性分子上，^v而生成可與兩個(gè)以上不同結(jié)合位點(diǎn)和/或靶分子結(jié)合的多特異性分子；這樣的多特異性分子也包括在本文使用的術(shù)語"雙特異性分子"內(nèi)。為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子，本發(fā)明的抗體可與一個(gè)或多個(gè)其他結(jié)合分子如其他抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物功能性連接(如通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)結(jié)合等)，從而得到雙特異性分子。因此，本發(fā)明包括雙特異性分子，其具有至少一種對(duì)于巖藻糖基-GMl的第一結(jié)合特異性和對(duì)于第二種目標(biāo)表位的第二結(jié)合特異性。在本發(fā)明一個(gè)特定實(shí)施方案中，第二種目標(biāo)表位是Fc受體，如人FcyRI(CD64)或人Fcoc受體(CD89)。因此，本發(fā)明包括既能與表達(dá)FcyR或FcaR的效應(yīng)細(xì)胞(如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞(PMN》結(jié)合，又能與表達(dá)巖藻糖基-GMl的靶細(xì)胞結(jié)合的雙特異性分子。這些雙特異性分子將表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞導(dǎo)向于效應(yīng)細(xì)胞，并且觸發(fā)Fc受體介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性，如表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞的吞噬作用、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、細(xì)胞因子釋放、或超氧陰離子的產(chǎn)生。在其中雙特異性分子是多特異性分子的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，除抗-Fc結(jié)合特異性和抗巖藻糖基-GMl結(jié)合特異性之外，該分子還可包括第三結(jié)合特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該第三結(jié)合特異性是抗增強(qiáng)因子(EF)部分，例如與參與細(xì)胞毒性活性的表面蛋白質(zhì)結(jié)合因而增強(qiáng)針對(duì)靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答的分子。"抗增強(qiáng)因子部分"可以是與諸如抗原或受體等特定分子結(jié)合，從而導(dǎo)致結(jié)合決定簇對(duì)Fc受體或靶細(xì)胞抗原的作用增強(qiáng)的抗體、功能性抗體片段或配體。"抗增強(qiáng)因子部分，，可與Fc受體或靶細(xì)胞抗原結(jié)合。或者，抗增強(qiáng)因子部分可以與一種實(shí)體結(jié)合，該實(shí)體不同于第一和第二結(jié)合特異性所結(jié)合的實(shí)體。例如，抗增強(qiáng)因子部分可與細(xì)胞毒性T細(xì)胞結(jié)合(如經(jīng)由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫細(xì)胞，該細(xì)胞導(dǎo)致針對(duì)靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答增強(qiáng))。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含至少一個(gè)抗體或其抗體片段作為結(jié)合特異性，包括(例如)Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv或單鏈Fv。該抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或任何其最小片段，如Fv或單鏈構(gòu)建體，如Ladner等的美國(guó)專利No.4,946,778所述，該專利的內(nèi)容引入本文作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于Fcy受體的結(jié)合特異性由單克隆抗體提供，該單克隆抗體的結(jié)合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻斷。本文使用的術(shù)語"IgG受體"是指位于染色體l上的8個(gè)Y-鏈基因的任意一個(gè)。這些基因編碼總共I2個(gè)跨膜或可溶性受體同種型，這些同種型分為3個(gè)Fcrt體類別FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRI11(CD16)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)cy受體是人高親和力FcyRI。人FcYRI是72kDa的分子，對(duì)單體IgG表現(xiàn)出高親和力(108-109M")。某些優(yōu)選抗-Fcy單克隆抗體的制備和表征由Fanger等在PCT申請(qǐng)WO88/00052和美國(guó)專利號(hào)4，954，617中描述，在此處將其內(nèi)容整體引入作為參考。這些抗體在與受體的FcY結(jié)合位點(diǎn)不同的位點(diǎn)處與FcyRI、FcyRII或FcyRIII的表位結(jié)合，因而，其結(jié)合基本不被生理學(xué)水平的IgG阻斷?？捎糜诒景l(fā)明中的特定抗-FcyRI抗體為mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。產(chǎn)生mAb32的雜交瘤可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，ATCC保藏號(hào)為HB9469。在另外一些實(shí)施方案中，抗-FcY受體抗體是單克隆抗體22的人源化形式(H22)。H22抗體的產(chǎn)生和表征在Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol155(10):4996-5002和PCT公布WO94/10332中描述。產(chǎn)生H22抗體的細(xì)胞系以HA022CL1的名稱保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CRL11177。在另外一些優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)Fc受體的結(jié)合特異性由可與人IgA受體如Fc-(x受體(FcotRI(CD89))結(jié)合的抗體提供，該結(jié)合優(yōu)選地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術(shù)語"IgA受體"包括位于染色體19上的一個(gè)oc-基因的基因產(chǎn)物(FcaRI)。已知該基因編碼幾個(gè)55-110kDa的可變剪接跨膜同種型。FcaRI(CD89)在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜酸性和嗜中性粒細(xì)胞上組成型表達(dá)，但不在非效應(yīng)細(xì)胞群體上組成型表達(dá)。FcocRI對(duì)IgAl和IgA2兩者均具有中等親和力(約5x107M")，在暴露于諸如G-CSF或GM-CSF的細(xì)胞因子后該親和力增加(Morton,H.C.等(1996)CriticalReviewsinImmunology16:423-440)。已描述了4種FcaRI-特異性單克隆抗體，它們被確定為A3、A59、A62和A77,它們?cè)贗gA配體結(jié)合域之外與FcocRI結(jié)合(Monteiro,R.C.等(1992)J.Immunol.148:1764)。FcaRI和Fc7RI是用于本發(fā)明的雙特異性分子的優(yōu)選觸發(fā)受體，因?yàn)樗鼈?l)主要表達(dá)于諸如單核細(xì)胞、PMN、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞上；(2)高水平表達(dá)(如每個(gè)細(xì)胞表達(dá)5，000-100,000個(gè))；(3)是細(xì)胞毒性(如ADCC、吞噬作用)的介質(zhì)；(4)介導(dǎo)導(dǎo)向于它們的抗原(包括自身抗原)的增強(qiáng)的抗原呈遞。盡管優(yōu)選人單克隆抗體，但是可以在本發(fā)明的雙特異性分子中使用的其他抗體有鼠、嵌合和人源化單克隆抗體。可通過應(yīng)用本領(lǐng)域中公知的方法偶聯(lián)組成結(jié)合特異性，如抗-FcR和抗巖藻糖基-GMl結(jié)合特異性，以此制備本發(fā)明的雙特異性分子。例如，雙特異性分子的每一種結(jié)合特異性可單獨(dú)生成，然后彼此偶聯(lián)。當(dāng)結(jié)合特異性是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，可以使用多種偶聯(lián)劑或交聯(lián)劑進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。交聯(lián)劑的例子包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰-硫代乙酸鹽(SATA)、5，5，-二硫代二(2-硝基苯曱酸)(DTNB)、鄰亞苯基雙馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸鹽(SPDP)和磺基琥珀酰亞氨基4-(N-馬來酰亞氨基曱基)環(huán)己基-l-羧酸鹽(sulfo-SMCC)(參見，例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160:1686;Liu,MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其他方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78，118-132、Bren臓等(1985)Science229:81-83和Glennie等(1987)J.Immunol.139:2367-2375所描述的方法。優(yōu)選的偶聯(lián)劑為SATA和sulfo-SMCC，兩者均可從PierceChemicalCo.(Rockford，IL)獲得。當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時(shí)，它們可通過兩個(gè)重鏈的C-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合而偶聯(lián)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)鉸鏈區(qū)進(jìn)行修飾以使其在偶聯(lián)前含有奇數(shù)個(gè)，優(yōu)選l個(gè)巰基殘基?？商娲?，兩種結(jié)合特異性可在同一載體中編碼，并在相同的宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配。當(dāng)雙特異性分子是mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab，)2或配體xFab融合蛋白時(shí)，該方法是特別有用的。本發(fā)明的雙特異性分子可以是包含一個(gè)單鏈抗體和一個(gè)結(jié)合決定簇的單鏈分子，或包含兩個(gè)結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以包含至少兩個(gè)單鏈分子。制備雙特異性分子的方法例如在美國(guó)專利5,260,203、美國(guó)專利5，455，030、美國(guó)專利4，881，175、美國(guó)專利5,132,405、美國(guó)專利5，091，513、美國(guó)專利5,476,786、美國(guó)專利5,013,653、美國(guó)專利5,258,498和美國(guó)專利5,482，858中描述。雙特異性分子與其特異性靶標(biāo)的結(jié)合可通過例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、FACS分析、生物測(cè)定(如生長(zhǎng)抑制)或Western印跡分析來證實(shí)。這些試驗(yàn)中的每一個(gè)通常通過應(yīng)用對(duì)目標(biāo)復(fù)合物具有特異性的標(biāo)記試劑(如抗體)來檢測(cè)特定目標(biāo)蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的存在。例如，可以利用識(shí)別和特異性結(jié)合抗體-FcR復(fù)合物的酶聯(lián)抗體或抗體片段來檢測(cè)FcR-抗體復(fù)合物?；蛘?，這些復(fù)合物可利用多種其他免疫分析中的任一種來檢測(cè)。例如，可對(duì)抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記并且在放射免疫測(cè)定(RIA)中使用(參見，例如，Weintraub，B.，PrinciplesofRadioimmunoassays,SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques,TheEndocrineSociety,1986年3月,引入本文作為參考)?？梢酝ㄟ^諸如使用Y計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器的手段或者通過放射自顯影方法檢測(cè)放射性同位素。藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥物可接受的載體配制在一起的一種或組合的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。這樣的組合物可以包含一種或組合的(例如兩種或多種不同的)本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以含有結(jié)合靶抗原上的不同表位或具有互補(bǔ)活性的抗體(或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子)組合。本發(fā)明的藥物組合物也可以在聯(lián)合治療中施用，即與其他藥劑聯(lián)用。例如，聯(lián)合治療可包括本發(fā)明的抗巖藻糖基-GMl抗體聯(lián)合至少一種其他的抗炎劑或免疫抑制劑?？稍诼?lián)合治療中使用的治療劑的例子在下面本發(fā)明抗體的應(yīng)用一節(jié)中更詳細(xì)地描述。本文使用的"藥物可接受的載體"包括生理學(xué)相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，該載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(如通過注射或輸注)。根據(jù)施用途徑，可將活性化合物即抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子包裹于一種材料中，以保護(hù)該化合物免受可使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種藥物可接受的鹽。"藥物期望的毒理學(xué)作用的鹽(參見如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm,Sci.66:1-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和;威加成鹽。酸加成鹽包括那些由諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等無毒性無機(jī)酸衍生的鹽，以及由諸如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等無毒性有機(jī)酸衍生的鹽。堿加成鹽包括那些由諸如鈉、鉀、鎂、鈣等堿土金屬衍生的鹽，以及由諸如N，N，-二千基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒性有機(jī)胺衍生的鹽。本發(fā)明的藥物組合物也可含有藥物可接受的抗氧化劑。藥物可接受的抗氧化劑的例子包括(l)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、；克酸氫鈉、焦亞-克酸鈉，亞》危酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等?？捎糜诒景l(fā)明藥物組合物中的適當(dāng)?shù)乃曰蚍撬暂d體的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?，植物油如橄欖油，和注射用有機(jī)酯如油酸乙酯。例如通過應(yīng)用包被材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑，能夠維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。這些組合物還可含有佐劑，如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上述的滅菌程序或通過包含諸如對(duì)羥基苯曱酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑確保防止存在微生物。也可能需要在組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉等。另外，通過包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長(zhǎng)的吸收。藥物可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于即時(shí)配制無菌注射液或分散液的無菌粉末劑。這些用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。除了任何與活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑范圍外，包括其在本發(fā)明的藥物組合物中的應(yīng)用。還可以向組合物中摻入補(bǔ)充的活性化合物。治療性組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下是穩(wěn)定的。可以將組合物配制成溶液、孩￡乳狀液、脂質(zhì)體或其他適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)。例如，通過使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在4艮多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長(zhǎng)的吸收。通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據(jù)需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和上面所列其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對(duì)于用于制備無菌注射液的無菌粉末劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，由其預(yù)先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末?？梢耘c載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量根據(jù)所治療的受試者和特定給藥方式而不同?？梢耘c載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以100%計(jì)，這個(gè)量的范圍是大約0.01%至大約99%的活性成分，優(yōu)選大約0.1%至大約70%，最優(yōu)選大約1%至大約30%的活性成分，與藥物可接受的載體相組合。調(diào)節(jié)劑量方案，以提供最佳的期望的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單一大劑量，可以隨時(shí)間施用幾次分開的劑量，或者才艮據(jù)治療狀況的緊急情況所需，可以按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易給藥并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續(xù)單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算該預(yù)定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產(chǎn)生所需的治療效果。對(duì)本發(fā)明劑量單位形式的具體說明限定于且直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特特性和要達(dá)到的特定治療效果，和(b)本領(lǐng)域中固有的對(duì)于配制這種用于治療個(gè)體敏感性的活性化合物的限制。對(duì)于抗體的給藥而言，劑量范圍為約0.0001至100mg/kg,更通常為0.01至25mg/kg受者體重。例如，劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重，或在1國(guó)10mg/kg范圍內(nèi)。一個(gè)示例性的治療方案需要每周給藥一次、每?jī)芍芤淮?、每三周一次、每四周一次、每月一次、?月一次、或每3-6月一次。本發(fā)明的抗巖藻糖基-GM1抗體的優(yōu)選劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)給予1mg/kg體重或3mg/kg體重，該抗體使用如下劑量方案之一給藥(i)每4周一次，共6次，然后每3個(gè)月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg體重一次，然后每3周1mg/kg體重。在一些方法中，同時(shí)施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在該情況中，每種抗體的給藥劑量落在所述范圍內(nèi)?？贵w通常在有必要時(shí)多次給藥。單次給藥之間的間隔可以是，例如，每周、每月、每三個(gè)月或每年。間隔也可以是不定期的，例如通過測(cè)定患者中抗耙抗原的抗體的血液水平來確定。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量以達(dá)到約l-1000iag/ml的血漿抗體濃度，在一些方法中為約25-300jag/ml?？商娲?，抗體也可以作為持續(xù)釋放制劑來給藥，在此情況中需要頻率較低的給藥。劑量和頻率根據(jù)抗體在患者中的半衰期而不同。通常，人抗體表現(xiàn)出最長(zhǎng)的半衰期，之后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和頻率根據(jù)處理是預(yù)防性的還是治療性的而不同。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)以較不頻繁的間隔給予相對(duì)較低的劑量。有些患者在余生中持續(xù)接受處理。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要以較短的間隔給予較高的劑量，直到疾病的進(jìn)展減輕或停止，優(yōu)選直到患者表現(xiàn)為疾病癥狀部分或完全改善。之后，可以以預(yù)防性方案給患者給藥。本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以改變，以獲得可有效實(shí)現(xiàn)對(duì)特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應(yīng)，而對(duì)患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括應(yīng)用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時(shí)間，應(yīng)用的特定化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時(shí)間，與應(yīng)用的特定組合物聯(lián)合應(yīng)用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和病史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的類似因素。本發(fā)明的抗巖藻糖基-GMl抗體的"治療有效劑量"優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重性降低，疾病無癥狀期的頻率和持續(xù)時(shí)間增加，或者防止因疾病痛苦而引起的損傷或失能。例如，對(duì)于腫瘤的治療而言，相對(duì)于未接受治療的受試者，"治療有效劑量"優(yōu)選地將細(xì)胞生長(zhǎng)或腫瘤生長(zhǎng)抑制至少約20%，更優(yōu)選至少約40%，更優(yōu)選至少約60%,更優(yōu)選至少約80%?；衔镆种品瘟錾L(zhǎng)的能力可以在預(yù)測(cè)對(duì)人類腫瘤的療效的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)價(jià)?；蛘撸部梢酝ㄟ^檢查化合物抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力來評(píng)價(jià)該組合物的這種性能，這種抑制可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的試驗(yàn)在體外測(cè)定。治療有效量的治療性化合物能夠減小肝瘤大小，或者以其他方式緩解受試者的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)如下因素確定這種量，如受試者的大小、受試者癥狀的嚴(yán)重性和選擇的特定組合物或給藥途徑。本發(fā)明的組合物可以利用本領(lǐng)域7>知的一種或多種方法通過一種或多種給藥途徑給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，給藥途徑和/或方式根據(jù)期望的結(jié)果而不同。本發(fā)明抗體的優(yōu)選給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外給藥途徑，例如注射或輸注。本文使用的短語"腸胃外給藥"是指除腸和局部給藥以外的給藥模式，通常是注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、嚢內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、嚢下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注?；蛘?，本發(fā)明的抗體也可以通過非腸胃外途徑給藥，如局部、表皮或粘膜途徑給藥，例如，鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部給藥?；钚曰衔锟梢耘c保護(hù)化合物不被快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠嚢遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法受專利保護(hù)或者通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。參見，例如，SustainedandcontrolledReleaseDrugDeliverySystems,J,R.Robinson,ed.,MarcelDekker，Inc.,NewYork,1978。治療性組合物可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在美國(guó)專利No.5,399,163;5,383,851;5,312,335;5,064,413;4，941，880;4，790，824;或4,596，556中公開的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的公知的植入物和模塊的例子包括美國(guó)專利No.4，487，603,該專利公開了用于以受控速率分散藥物的可植入微量輸注泵；美國(guó)專利No.4,486,194，該專利公開了用于通過皮膚給藥的治療裝置；美國(guó)專利No.4，447，233,該專利公開了用于以精確的輸注速率遞送藥物的醫(yī)用輸注泵；美國(guó)專利No.4,447,224,該專利7>開了用于連續(xù)遞送藥物的變流可植入輸注裝置；美國(guó)專利No.4,439,196，該專利公開了具有多腔區(qū)室的滲透藥物遞送系統(tǒng)和美國(guó)專利No.4，475，196,該專利公開了一種滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專利引入本文作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知許多其他這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和才莫塊。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體可配制為確保在體內(nèi)正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療性化合物能夠跨過BBB(如果需要時(shí))，可將它們配制在如脂質(zhì)體中。至于制備脂質(zhì)體的方法，參見，例如，美國(guó)專利4，522，811;5,374,548;和5,399，331。脂質(zhì)體包含可被選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)入特定細(xì)胞或器官內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)部分，從而增強(qiáng)定向藥物遞送(參見，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。定向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，Low等的美國(guó)專利5，416,016);甘露糖脊(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBSLett.357:140;M.Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180);表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134);p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090);也參見K.Kei麵en;M丄.Laukka羅(1994)FEBSLett.346:123;J.J.Killion;I丄Fidler(1994)Immunomethods4:273。本發(fā)明的應(yīng)用和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的抗體、抗體組合物和方法具有與診斷和治療巖藻糖基-GMl介導(dǎo)的疾病有關(guān)的許多體外和體內(nèi)診斷和治療應(yīng)用。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人抗體。例如，這些分子可以施用于在體外或離體培養(yǎng)的細(xì)胞，或者(例如)在體內(nèi)施用于人類受試者，以治療、預(yù)防以及診斷多種疾病。本文使用的術(shù)語"受試者"包括人和非人動(dòng)物。非人動(dòng)物包括所有脊推動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲類動(dòng)物和爬行類動(dòng)物。優(yōu)選的受試者包括患有由巖藻糖基-GMl活性介導(dǎo)的疾病或者患有符合巖藻糖基-GMl介導(dǎo)的活性的疾病的人類患者。這些方法特別適合治療患有與異常巖藻糖基-GMl表達(dá)或巖藻糖基-GMl含量增多有關(guān)的疾病的人類患者。當(dāng)抗巖藻糖基-GMl抗體與另外一種藥物一起給藥時(shí)，這兩種藥物可以相繼或同時(shí)給藥。鑒于本發(fā)明的抗體與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合，本發(fā)明的抗體可以用來特異性檢測(cè)細(xì)胞表面上巖藻糖基-GMl的表達(dá)，而且可以用來通過免疫親和純化方法純化巖藻糖基-GMl。本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測(cè)樣品中巖藻糖基-GMl抗原的存在或測(cè)定巖藻糖基-GMl抗原的量的方法，包括在允許抗體或其部分與巖藻糖基-GM1之間形成復(fù)合物的條件下使樣品和對(duì)照樣品接觸可與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。然后檢測(cè)復(fù)合物的形成，其中樣品與對(duì)照樣品之間復(fù)合物形成的差異指示樣品中巖藻糖基-GMl抗原的存在。巖藻糖基-GM1在小細(xì)胞肺癌中表達(dá)，但是在正常肺或其它組織中檢測(cè)不到(Nilsson等人.(1984)G/_ycoco">gafeJ7:43-9;Krug等人，C7/"Owe"AmM,仰何-7M)。抗巖藻糖基-GMl抗體可以單獨(dú)用來抑制癌性胂瘤的生長(zhǎng)?；蛘?，抗巖藻糖基-GMl抗體也可以與其他免疫原性劑、標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療或其他抗體一起4吏用。已證明抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體介導(dǎo)針對(duì)巖藻糖基-GMl陽性細(xì)胞系的強(qiáng)CDC(LivingstonPO等人.(1994)/C7/"(9"co/.12:1036-44;Brezicka等人(2000)Qwcer/w羅wo/7w應(yīng)wc^er49:235-42)。進(jìn)一步地，已報(bào)道巖藻糖基-GMl特異性單克隆抗體誘導(dǎo)的補(bǔ)體活化與細(xì)胞抑制藥物聯(lián)合，導(dǎo)致對(duì)表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞系的協(xié)同細(xì)胞毒性作用(Brezicka和Einbeigi(2001)rwwowAo/22:97-103)。最后，已才艮道抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體抑制棵鼠中表達(dá)巖藻糖基-GMl的腫瘤細(xì)胞的移植(Brezicka等人.(1991)/"〃C"wcer49:911-8)。這些數(shù)據(jù)支持開發(fā)抗巖藻糖基-GMl的全人單克隆抗體作為單獨(dú)地或與化療藥聯(lián)合治療SCLC的免疫治療劑。其生長(zhǎng)可以用本發(fā)明的抗體抑制的優(yōu)選癌癥包括一般對(duì)免疫治療有應(yīng)答的癌癥?？芍委煹膬?yōu)選癌癥的非限制性例子包括肺癌(包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)?？梢杂帽景l(fā)明的方法治療的其他癌癥的例子包括結(jié)腸癌(包括小腸癌)、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤(例如轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤)、急性髓樣白血病、腎癌、膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌、腎癌(包括腎細(xì)胞癌)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦瘤、慢性或急性白血病(包括急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、成人T細(xì)胞白血病(T-ALL)、慢性髓樣白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、淋巴瘤(例如何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、中心母細(xì)胞/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(AILD)-樣T細(xì)胞淋巴瘤和HIV相關(guān)體腔淋巴瘤)、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭　⒖úㄎ魅饬?、多發(fā)性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥和其他B細(xì)胞淋巴瘤、鼻咽癌、骨癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、曱狀腺癌、曱狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實(shí)體瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、表皮狀癌、鱗狀細(xì)胞癌、環(huán)境誘發(fā)的癌癥(包括石棉誘發(fā)的癌癥，例如間皮瘤)，和所述癌癥的組合。此外，鑒于巖藻糖基-GMl在多種腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，本發(fā)明的人抗體、抗體組合物和方法能夠用來治療患有致腫瘤疾病的患者，所述疾病例如是以存在表達(dá)巖藻糖基-GMl的腫瘤細(xì)胞為特征的疾病，包括，例如肺癌(包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)"包肺癌)、結(jié)腸癌(包括小腸癌)、黑素瘤(例如轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤)、急性髓樣白血病、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、巢癌和前列腺癌。其他致腫瘤疾病患者的例子包括患有以下疾病的患者腎癌(例如腎細(xì)胞癌)、膠質(zhì)母細(xì)月包瘤、腦瘤、慢性或急性白血病(包括急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、成人T細(xì)胞白血病(T-ALL)、慢性髓樣白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、淋巴瘤(例如何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、中心母細(xì)胞/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病(AILD)-樣T細(xì)胞淋巴瘤和HIV相關(guān)體腔淋巴瘤)、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥和其他B細(xì)胞淋巴瘤、鼻咽癌、骨癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實(shí)體瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、表皮狀癌、鱗狀細(xì)胞癌、環(huán)境誘發(fā)的癌癥(包括石棉誘發(fā)的癌癥，例如間皮瘤)，和所述癌癥的組合。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括給受試者施用治療有效量的抗巖藻糖基-GMl抗體或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選地，該抗體是人抗巖藻糖基-GMl抗體(如本文所述的任何人抗巖藻糖基-GMl抗體)。另外或者可替代地，該抗體可以是嵌合或人源化抗巖藻糖基-GMl抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(例如人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)可以用來檢測(cè)巖藻糖基-GMl的水平或在其膜表面上含有巖藻糖基-GMl的細(xì)胞的水平，然后可以將該水平與特定疾病癥狀相關(guān)聯(lián)。或者，這些抗體可以用來抑制或阻斷巖藻糖基-GMl功能，又可以將此功能與特定疾病癥狀的預(yù)防或好轉(zhuǎn)相關(guān)聯(lián)，由此使巖藻糖基-GMl作為疾病的介質(zhì)。這可以如下實(shí)現(xiàn)在允許抗體和巖藻糖基-GMl之間形成復(fù)合體的條件下將實(shí)驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品與抗巖藻糖基-GMl抗體相接觸。檢測(cè)在抗體和巖藻糖基-GMl之間形成的任何復(fù)合體，并在實(shí)驗(yàn)樣品和對(duì)照中進(jìn)行比較。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，在開始時(shí)可以檢測(cè)本發(fā)明的抗體(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)與體外治療或診斷應(yīng)用相關(guān)的結(jié)合活性。例如，可以利用以下實(shí)施例中所述的流式細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的抗體(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子、免疫偶聯(lián)物和組合物)在巖藻糖基-GMl相關(guān)疾病的治療和診斷中具有另外的應(yīng)用。例如，人單克隆抗體、多特異性或雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物可以用來在體內(nèi)或體外引起一種或多種以下生物學(xué)活性抑制表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或殺死該細(xì)胞；在人效應(yīng)細(xì)胞的存在下介導(dǎo)表達(dá)巖藻糖基-GM1的細(xì)胞的吞噬作用或ADCC;或者阻斷巖藻糖基-GMl配體與巖藻糖基-GMl的結(jié)合。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，在體內(nèi)應(yīng)用抗體(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)治療、預(yù)防或診斷多種巖藻糖基-GMl相關(guān)疾病。巖藻糖基-GMl相關(guān)疾病的例子尤其包括肺癌(包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)。在體內(nèi)和體外施用本發(fā)明的抗體組合物(例如人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物)的適宜途徑在本領(lǐng)域中公知，并且可以由本領(lǐng)域4支術(shù)人員選才奪。例如，抗體組合物可以通過注射(例如靜脈內(nèi)或皮下)給藥。使用的分子的適宜劑量將取決于受試者的年齡和體重以及抗體組合物的濃度和/或配方。如前所述，本發(fā)明的人抗巖藻糖基-GMl抗體可以與一種或多種其他治療劑例如細(xì)胞毒劑、放射性毒劑或免疫抑制劑共同給藥?？贵w可以與治療劑連接(作為免疫復(fù)合物)，或者可以與治療劑分開給藥。對(duì)于后者(分開給藥)，抗體可以在治療劑之前、之后或同時(shí)給藥，也可以與其他已知治療如抗癌治療例如》文射治療共同應(yīng)用。這些治療劑尤其包括抗腫瘤劑，如多柔比星(阿霉素)、順鉑、硫酸博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺、羥基脲，它們本身僅在對(duì)患者具有毒性或亞毒性的水平時(shí)才有效。順鉑以1OOmg/劑的劑量靜脈內(nèi)給藥，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的劑量靜脈內(nèi)給藥，每21天1次。本發(fā)明的人抗巖藻糖基-GMl抗體或其抗原結(jié)合片段與化療劑的共同給藥提供了兩種抗癌劑，它們通過不同的對(duì)人腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的機(jī)制起作用。這種共同給藥能夠解決由于發(fā)展耐藥性或腫瘤細(xì)胞抗原性改變(這將使它們對(duì)抗體沒有反應(yīng)性)引起的問題。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將化合物與抗體連接，可以利用本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物將該化合物(例如治療劑、標(biāo)記物、細(xì)胞毒素、放射毒素、免疫抑制劑等)耙向至具有巖藻糖基-GMl細(xì)胞表面受體的細(xì)胞。例如，抗巖藻糖基-GMl抗體可以與美國(guó)專利No.6，281,354和6，548，530、美國(guó)專利z>開Nos.20030050331、20030064984、20030073852和20040087497所述或WO03/022806(所述文獻(xiàn)全文引入本文作為參考)公開的任一種毒素化合物偶聯(lián)。因此，本發(fā)明也提供用于離體或在體內(nèi)定位表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞(例如應(yīng)用可4全測(cè)標(biāo)記物，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)的方法?；蛘撸庖吲悸?lián)物通過將細(xì)胞毒素或放射毒素靶向至巖藻糖基-GMl，也可以用來殺傷具有巖藻糖基-GMl細(xì)胞表面受體的細(xì)胞。草巴標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞，例如與本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)連接的效應(yīng)細(xì)胞，也可以用作治療劑。用于靶向的效應(yīng)細(xì)胞可以是人白細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞。其他細(xì)胞包括嗜酸性細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和其他帶有IgG或IgA受體的細(xì)胞。需要時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞可以從將要治療的受試者中獲得。靶標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞可以作為細(xì)胞在生理學(xué)可接受的溶液中的懸浮液施用。施用的細(xì)胞數(shù)可以是108-109個(gè)的數(shù)量級(jí)，但是根據(jù)治療目的而不同。通常，該量足以獲得在靶細(xì)胞處例如在表達(dá)巖藻糖基-GMl的腫瘤細(xì)胞處的局部化，以及通過例如吞噬作用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的殺傷。施用途徑也可以不同。應(yīng)用靶標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞的治療可以與其他清除靶細(xì)胞的^支術(shù)一起進(jìn)行。例如，使用本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)和/或帶有這些組合物的效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤治療可以與化學(xué)治療一起使用。另外，可以應(yīng)用聯(lián)合免疫治療將兩種不同的細(xì)胞毒性效應(yīng)群體導(dǎo)向至肺瘤細(xì)胞排斥。例如，與抗Fc-yRI或抗CD3連接的抗巖藻糖基-GMl抗體可以與IgG或IgA受體特異性結(jié)合劑一起使用。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子也可以用來調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞上的FcyR或FcyR水平，例如通過對(duì)細(xì)胞表面上的受體加帽(capping)以及將其清除。抗-Fc受體抗體的混合物也可以用于該目的。具有補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)(如來自IgGl、-2或-3或IgM的補(bǔ)體結(jié)合部分)的本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物)，也可以在補(bǔ)體的存在下使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明的結(jié)合劑和適宜的效應(yīng)細(xì)胞離體處理含有靶細(xì)胞的細(xì)胞群體能夠通過加入補(bǔ)體或含有補(bǔ)體的血清來實(shí)現(xiàn)。補(bǔ)體蛋白的結(jié)合能夠改善用本發(fā)明的結(jié)合劑包被的靶細(xì)胞的吞噬作用。在另一實(shí)施方案中，用本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)包被的靶細(xì)胞也能夠被補(bǔ)體裂解。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物不激活補(bǔ)體。本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物)也可以與補(bǔ)體一起施用。因此，含有人抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補(bǔ)體的組合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些組合物是有利的，因?yàn)檠a(bǔ)體與人抗體、多特異性或雙特異性分子緊密接近。或者，本發(fā)明的人抗體、多特異性或雙特異性分子和補(bǔ)體或血清也可以分開施用。因此，可以給用本發(fā)明的抗體組合物治療的患者(在本發(fā)明的人抗體給藥之前、同時(shí)或之后)另外施用另一種治療劑，如細(xì)胞毒劑或放射性毒劑，該治療劑可以增強(qiáng)或增加人抗體的治療效果。在另外一些實(shí)施方案中，可以另外用調(diào)節(jié)(例如增強(qiáng)或抑制)Fcy或Fcy受體的表達(dá)或活性的藥物治療受試者，例如用細(xì)胞因子治療受試者。在用多特異性分子治療過程中施用的優(yōu)選細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、千擾素-y(IFN-y)和腫瘤壞死因子(TNF)。本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可以用來導(dǎo)向表達(dá)FcyR或巖藻糖基-GMl的細(xì)胞，例如標(biāo)記這些細(xì)胞。對(duì)于這種應(yīng)用，可以將結(jié)合劑與能夠被檢測(cè)到的分子連接。因此，本發(fā)明提供離體或在體外定位表達(dá)Fc受體如FcyR或巖藻糖基-GMl的細(xì)胞的方法?？蓹z測(cè)標(biāo)記物可以是，例如》文射性同位素、焚光化合物、酶或酶輔因子。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括藥盒，所述藥盒包括本發(fā)明的抗體組合物(例如人抗體、多特異性或雙特異性分子，或免疫偶聯(lián)物)和使用說明。該藥盒可以進(jìn)一步包括至少一種另外的試劑如免疫抑制劑、細(xì)胞毒性劑或放射性毒劑或一種或多種另外的本發(fā)明的人抗體(例如，具有補(bǔ)充活性的人抗體，它所結(jié)合的巖藻糖基-GMl抗原上的表位與第一人抗體不同)。藥盒一般包括說明藥盒內(nèi)容物預(yù)期用途的標(biāo)簽。術(shù)語"標(biāo)簽，，包括附加在試劑盒上或試劑盒提供的或以其他方式隨試劑盒提供的任何書面的或記錄的材料。本發(fā)明進(jìn)一步通過下面的實(shí)施例進(jìn)行闡述，不應(yīng)將這些實(shí)施例理解為進(jìn)一步的限制。全部附圖和在本申請(qǐng)中引用的全部參考文獻(xiàn)、專利和公開專利申請(qǐng)的內(nèi)容均引入本文作為參考。實(shí)施例實(shí)施例l:抗巖藻糖基-GMl人單克隆抗體的產(chǎn)生抗原免疫方案4吏用明尼蘇達(dá)沙門氏菌(Sa/mowe〃"M/"w&yoto)吸附的巖藻糖基-GMl(NorthwestBiotherapeutics，Inc.)作為抗原。轉(zhuǎn)泉因HuMab和KM小鼠，用表達(dá)人抗體基因的HuMab轉(zhuǎn)基因小鼠的HCo7、HCo12、HCo7+HCol2林和轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染色體小鼠的KM林制備抗巖藻糖基-GMl的完全人單克隆抗體。在這些小鼠抹的每一個(gè)中，已經(jīng)如Chen等(1993)EMBOJ.12:81l-820所述將內(nèi)源小鼠K輕鏈基因純合地破壞,并且已經(jīng)如PCT公布WO01/09187的實(shí)施例1所述將內(nèi)源小鼠重鏈基因純合地破壞。這些小鼠抹均攜帶如Fishwild等(1996)NatureBiotechnology14:845-851所述的人k輕鏈轉(zhuǎn)基因KCo5。HCo7抹帶有如美國(guó)專利Nos.5，770，429、5,545,806、5，625，825和5，545，807所述的HCo7人重鏈轉(zhuǎn)基因。HCol2抹帶有如WO01/09187的實(shí)施例2或WO01/14424的實(shí)施例2中所述的HCol2人重鏈轉(zhuǎn)基因。HCo7+HCol2林帶有HCo7和HCol2重鏈轉(zhuǎn)基因。KM抹含有如PCT公布WO02/43478所述的SC20轉(zhuǎn)染色體。所有這些抹在本文中都被稱為HuMAb小鼠。HuMab和KM的免疫為了產(chǎn)生抗巖藻糖基-GMl的完全人單克隆抗體，用通過凍干吸附到酸處理的明尼蘇達(dá)沙門氏菌表面上的巖藻糖基-GMl(NorthwestBiotherapeutics，Inc.)免疫HuMab小鼠和KM小鼠，。HuMab小鼠的一般性免疫方案在Lonberg，N.等(1994)Nature368(6474):856-859;Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology14:845國(guó)851和PCT公開WO98/24884中描述。在第一次輸注抗原時(shí)小鼠為6-16周齡。轉(zhuǎn)基因小鼠用在完全弗氏佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(IP)或皮下(Sc)免疫兩次，然后用在不完全弗氏佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫2-4周(最多總共8次免疫)。通過對(duì)眼眶后采血獲得的血清進(jìn)行ELISA(如下文所述)來監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答。用具有足夠的抗巖藻糖基-GMl人免疫球蛋白效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。用抗原經(jīng)靜脈內(nèi)對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3天和2天后處死小鼠，并耳又出脾臟。產(chǎn)生抗巖藻糖基-GMl抗體的HuMab或KM小鼠tm的選擇為了選擇產(chǎn)生可與巖藻糖基-GMl結(jié)合的抗體的HuMab或KM小鼠tm，通過如Fishwild,D.等(1996)所述的ELISA來檢測(cè)來自被免疫小鼠的血清。簡(jiǎn)要地說，將從巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)染細(xì)胞系(NorthwestBiothempeutics，Inc.)或從牛腦(Matreya,Inc)中純化的天然巖藻糖基-GMl以lmg/ml溶解在甲醇中，并通過在室溫下風(fēng)干l-2小時(shí)，以50|^1/孔的量被動(dòng)吸附在聚丙烯微量滴定板上。類似地，準(zhǔn)備用相關(guān)對(duì)照抗原如GM1包被的板，作為用于交叉反應(yīng)性抗體的反篩選板(counterscreen)。然后用250jul/孔的溶于PBS中的1%卯白蛋白在室溫下封閉測(cè)定板l小時(shí)。將來自巖藻糖基-GMl免疫的小鼠的血漿稀釋液加入各孔中，在環(huán)境溫度下孵育l-2小時(shí)。用PBS洗板，然后與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗人IgGFc或山羊抗人IgMFc多克隆抗體在室溫下孵育1小時(shí)。洗滌后，測(cè)定板用TMB底物顯色，并用分光光度計(jì)在OD450nm處分析。用顯示最高抗巖藻糖基-GMl抗體效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。如下文所述進(jìn)行融合，并通過ELISA檢測(cè)雜交瘤上清液的抗巖藻糖基-GM1活性。產(chǎn)生抗巖藻糖基-GMl人單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生從HuMAb⑧小鼠和/或KM小鼠TM中分離脾細(xì)胞，并使用基于PEG的標(biāo)準(zhǔn)程序或基于電場(chǎng)的電融合法使用CytoPulse大腔室細(xì)胞融合電穿孔儀(CytoPulseSciences,Inc.,GlenBurnie,MD)將其與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合。然后根據(jù)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選獲得的雜交瘤。使用50%PEG(Sigma)將來自被免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與1/4數(shù)量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCCCRL1580)或SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCCCRL1581)融合。將細(xì)胞以約1x105/孔的密度接種于平底微量滴定板上，然后在選擇性培養(yǎng)基中孵育大約兩周，該選擇性培養(yǎng)基在加有5mMHEPES、O力55mMp-巰基乙醇、50mg/ml慶大霉素和lxHAT(Sigma;CRLP-7185)的DMEM(Mediatech，CRL10013,含有高濃度葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉)中含有10%胎牛血清、10%P388D1(ATCC,CRLTIB-63)條件基質(zhì)、3-5%origen(IGEN)。一至兩周之后，在用HT替換了HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過ELISA(如上所述)針對(duì)人抗巖藻糖基-GMlIgG和IgM抗體篩選各個(gè)孔。進(jìn)一步通過FACS(如下所述)檢測(cè)在ELISA測(cè)定篩選中具有特異性結(jié)合活性的雜交瘤與吸附到哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的巖藻糖基-GMl的特異性結(jié)合。通過有限稀釋將根據(jù)ELISA和FACS顯示最高特異性結(jié)合的雜交瘤亞克隆至少兩次。然后在體外培養(yǎng)得到的穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量的單克隆抗體。重復(fù)ELISA篩選，以-驗(yàn)證亞克隆的活性。將在ELISA中顯示最高活性的亞克隆放大到產(chǎn)生足夠多的條件培養(yǎng)基(一般為1L)，用于純化單克隆抗巖藻糖基-GMl，供進(jìn)一步表征。選擇雜交瘤克隆5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8、13B8a和18D5進(jìn)一步分析。實(shí)施例2:人單克隆抗體5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5的結(jié)構(gòu)表征利用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)分別從5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5雜交瘤中獲得編碼5B1、5Bla、7D4、7E4、13B8和18D5單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA序列，并利用標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。5B1的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖1A和SEQIDNO:49和1中。5B1的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖1B和SEQIDNO:55和7中。5B1重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，5B1重鏈應(yīng)用了來自人種系VH3-48的VH區(qū)段、來自人種系l-l的D區(qū)段和來自人種系JH6b的JH區(qū)段。5B1VH序列與種系VH3-48序列的比對(duì)顯示在圖7中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)5B1VH序列的進(jìn)一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖1A和7以及SEQIDN0:13、19和25所示。5B1輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，5B1輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKL15的VL區(qū)段和來自人種系JK4的JK區(qū)4殳。5B1VL序列與種系VKL15序列的比對(duì)顯示于圖8中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)5B1VL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖1B和8以及SEQIDNO:31、37和43所示。5Bla的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2A和SEQIDNO:50和2中。5Bla的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2B和SEQIDNO:56和8中。5B1a重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，5Bla重鏈應(yīng)用了來自人種系VH3-48的VH區(qū)段和來自人種系1-1的D區(qū)|殳和來自人種系JH6b的JH區(qū)辜殳。5B1aVH序列與種系VH3-48序列的比對(duì)顯示于圖7中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)5B1aVH序列的進(jìn)一步分^f勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖2A和7以及SEQIDNO:14、20和26所示。5Bla輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，5Bla輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKL15的VL區(qū)段和來自人種系JK4的JK區(qū)段。5BlaVL序列與種系VKL15序列的比對(duì)顯示于圖8中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)5BlaVL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖2B和8以及SEQIDNO:32、38和44所示。7D4的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖3A和SEQIDNO:51和3中。7D4的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖3B和SEQIDNO:57和9中。7D4重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，7D4重鏈應(yīng)用了來自人種系VH3-48的VH區(qū)段、來自人種系l-l的D區(qū)段和來自人種系JH6b的JH區(qū)段。7D4VH序列與種系VH3-48序列的比對(duì)顯示于圖7中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)7D4VH序列的進(jìn)一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖3A和7以及SEQIDNO:15、21和27所示。7D4輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，7D4輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKL15的VL區(qū)段和來自人種系JK4的JK區(qū),殳。7D4VL序列與種系VKL15序列的比對(duì)顯示于圖8中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)7D4VL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖3B和8以及SEQIDNO:33、39和45所示。7E4的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖4A和SEQIDNO:52和4中。7E4的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖4B和SEQIDNO:58和9中。7E4重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，7E4重鏈應(yīng)用了來自人種系VH3-48的VH區(qū)4殳、來自人種系l-l的D區(qū)段和來自人種系JH6b的JH區(qū)段。7E4VH序列與種系VH3-48序列的比對(duì)顯示于圖7中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)7E4VH序列的進(jìn)一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖4A和7以及SEQIDNO:16、22和28所示。7E4輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，7E4輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKL15的VL區(qū)段和來自人種系JK4的JK區(qū)#殳。7E4VL序列與種系VKL15序列的比對(duì)顯示于圖8中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)7E4VL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖4B和8以及SEQIDNO:34、40和46所示。13B8的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖5A和SEQIDNO:53和5中。13B8的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖5B和SEQIDNO:59和11中。13B8重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，13B8重鏈應(yīng)用了來自人種系VH3-48的VH區(qū)段、來自人種系1-1的D區(qū)段和來自人種系JH6b的JH區(qū)段。13B8VH序列與種系VH3-48序列的比對(duì)顯示于圖7中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)13B8VH序列的進(jìn)一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖5A和7以及SEQIDNO:11、17和23所示。13B8輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，13B8輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKL15的VL區(qū)段和來自人種系JK4的JK區(qū),爻。13B8VL序列與種系VKL15序列的比對(duì)顯示于圖8中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)13B8VL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖5B和8以及SEQIDNO:35、41和47所示。18D5的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖6A和SEQIDNO:54和6中。18D5的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖6B和SEQIDNO:60和12中。18D5重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，18D5重鏈應(yīng)用了來自人種系VH3-48的VH區(qū)段、來自人種系1-1的D區(qū)段和來自人種系JH6b的JH區(qū)段。18D5VH序列與種系VH3-48序列的比對(duì)顯示于圖7中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)18D5VH序列的進(jìn)一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖6A和7以及SEQIDNO:18、24和30所示。18D5輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，18D5輕鏈應(yīng)用了來自人種系VKL15的VL區(qū)段和來自人種系JK4的JK區(qū)段。18D5VL序列與種系VKL15序列的比對(duì)顯示于圖8中。利用KabatCDR區(qū)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)18D5VL序列的進(jìn)一步分析勾畫出了輕《連CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖6B和8以及SEQIDNO:36、42和48所示。實(shí)施例3:摻雜有巖藻糖基-GMl的細(xì)胞的制備制備含有包埋在質(zhì)膜中的巖藻糖基-GM1的細(xì)胞用于結(jié)合測(cè)定中。將純化的巖藻糖基-GMl溶解在玻璃管中的氯仿甲醇的l:l混合物中，并在氮?dú)庀抡舭l(fā)至干。向干巖藻糖基-GMl中加入不含Ca或Mg的PBS,使得抗原的濃度為200jug/ml;通過渦旋5分鐘然后超聲處理5分鐘產(chǎn)生乳液。以2xl0S田胞/ml的密度在PBS中制備靶細(xì)胞(一般是HEK293(人腎，ATCC#CRL-1573)或Daudi(人伯基特淋巴瘤，ATCC#CCL-213))懸液。將等體積的巖藻糖基-GMl乳液和細(xì)胞懸液混合為IOO嗎抗原/l(^細(xì)胞/ml的終濃度。細(xì)胞與抗原于37。C孵育15分鐘，以使巖藻糖基-GMl插入到膜內(nèi)，然后在室溫下在整個(gè)過程中不時(shí)混合下孵育30分鐘。以1000rpm離心細(xì)胞10分鐘。棄去上清液，將"摻雜的"細(xì)胞以4xl(^細(xì)胞/ml的密度重懸浮在FACS緩沖液(不含Ca或Mg的PBS+1%人血清+2%PBS+2mMEDTA)中。類似地，制^t參雜有相關(guān)抗原如GM1或不含抗原的對(duì)照細(xì)胞。實(shí)施例4:抗巖藻糖基-GMl人單克隆抗體的結(jié)合特異性和結(jié)合動(dòng)力學(xué)的表征通過ELISA測(cè)定的結(jié)合特異性通過ELISA,利用重組抗原和摻雜的細(xì)胞，檢測(cè)純化的單克隆人抗巖藻糖基-GMl抗體與純化的巖藻糖基-GMl的特異性結(jié)合。所有步驟都在水上進(jìn)行。將來自ELISA陽性雜交瘤培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基與抗原或細(xì)胞在"V，，底板中混合，并孵育1小時(shí)。洗滌細(xì)胞，用HRP偶聯(lián)的小鼠抗人IgGFc第二抗體檢測(cè)結(jié)合的抗體。洗滌后，用顯色底物使板顯色，離心沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移到平底微量滴定測(cè)定板中，用于利用分光光度計(jì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示在圖9(抗原ELISA)和圖IO(全細(xì)胞ELISA)中?？箮r藻糖基-GMl抗體顯示與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的結(jié)合特異性通過流式細(xì)胞分析，利用天然表達(dá)的巖藻糖基-GM1陽性細(xì)胞系如H-4-II-E(大鼠肝細(xì)胞瘤ATCC弁CRL-1548)或DMS-79(人SCLCATCC弁CRL-2049)檢測(cè)巖藻糖基-GMl人單克隆抗體的特異性。所有染色步驟都在冰上進(jìn)行?？箮r藻糖基-GMl人單克隆抗體的結(jié)合如下評(píng)價(jià)將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與濃度為10pg/ml的抗巖藻糖基-GM1人單克隆抗體一起孵育。洗滌細(xì)胞，用FITC標(biāo)記的抗人IgG抗體檢測(cè)結(jié)合。用FACScan流式細(xì)胞4義(BectonDickinson,SanJose，CA)進(jìn)行流式細(xì)月包分析。結(jié)果顯示在圖11中。抗巖藻糖基-GMl人單克隆抗體與H-4-II-E和DMS-79細(xì)胞系結(jié)合。該數(shù)據(jù)證明了抗巖藻糖基-GMl人單克隆抗體對(duì)巖藻糖基-GMl的特異性。實(shí)施例5:抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體的內(nèi)化使用Hum-Zap內(nèi)化試驗(yàn)檢測(cè)了抗巖藻糖基-GMlHuMAb向表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞系中內(nèi)化的能力。Hum-Zap試驗(yàn)通過第二抗體的結(jié)合檢測(cè)第一人抗體的內(nèi)化，該第二抗體對(duì)偶聯(lián)到毒素肥皂草毒蛋白(saporin)上的人IgG具有親和性。將表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞系(H-4-II-E或DMS-79)懸浮在培養(yǎng)基中，并且以7500個(gè)細(xì)胞/孔的密度加到微量滴定細(xì)胞培養(yǎng)板中。在培養(yǎng)基中制備待測(cè)抗體和同種型對(duì)照的系列稀釋液，并且在冰上與2:1摩爾過量的肥皂草毒蛋白偶聯(lián)的第二抗體(Hum-Zap,AdvancedTargetingSystems,SanDiego,CA，IT-22-25)混合1小時(shí)。然后將抗體+肥皂草毒蛋白偶聯(lián)物混合物與細(xì)胞混合，并且在37。C下孵育48-72小時(shí)。添加MTS(Promega)檢測(cè)細(xì)胞存活力。再孵育4小時(shí)后讀取OD,吸光度與內(nèi)化成反比。結(jié)果顯示在圖12中。該數(shù)據(jù)證明人抗巖藻糖基-GMl抗體可以內(nèi)化到表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞系中。實(shí)施例6:抗巖藻糖基-GMl抗體的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用靶細(xì)胞，即"摻雜的，，或天然表達(dá)的細(xì)胞系，懸浮在CDC緩沖液(RPMI1640)中至密度為10VmL。將人補(bǔ)體(HC)在細(xì)胞系生長(zhǎng)培養(yǎng)基中l(wèi):3稀釋。制備待測(cè)抗體和同種型對(duì)照的系列稀釋液。將細(xì)胞、補(bǔ)體和抗體在微量滴定測(cè)定板中等體積混合，于37。C孵育2小時(shí)。向每孔中添加Alamar藍(lán)，將板于37。C再孵育21小時(shí)。利用530nm吸收/590nm發(fā)射譜用熒光讀板儀讀板，細(xì)胞存活力與熒光單位成比例。結(jié)果顯示在圖13中。人和小鼠對(duì)照抗體表現(xiàn)出對(duì)DMS79和H4-II-E細(xì)胞的強(qiáng)烈的、劑量依賴的CDC活性。同種型對(duì)照抗體顯示沒有顯著的細(xì)胞毒性。對(duì)巖藻糖基-GMl陰性細(xì)胞系如Ramos和ARH77的CDC活性可以忽略。實(shí)施例7:抗巖藻糖基-GMl抗體的ADCC活性的評(píng)價(jià)在該實(shí)施例中，利用熒光細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)了抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體在效應(yīng)細(xì)胞存在下通過抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)殺傷表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞系的能力。利用DelfiaSystem(Perkin-Elmer)檢測(cè)ADCC活性。簡(jiǎn)要地說，通過用200u/mlIL-2過夜刺激由人外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞，并且重懸浮為2x107/ml。將靶細(xì)胞稀釋為106/1111,通過孵育20分鐘裝載熒光增強(qiáng)配體(BATDA),并稀釋為2x1()7細(xì)胞/ml。將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞以100:l的比例在微量滴定測(cè)定板中混合，并且與待測(cè)抗體和同種型對(duì)照的系列稀釋液混合。將板在37。C下孵育1小時(shí)，離心沉淀細(xì)胞，取出20ial上清液，并與Eu溶液(Perkin-Elmer)混合。用Fusion讀板器(Perkin-Elmer)測(cè)量與Eu混合的釋放的配體發(fā)出的哭光，熒光與細(xì)胞裂解成比例。分別用于背景裂解和完全裂解的含有效應(yīng)細(xì)胞而不含抗體的測(cè)定孔和含有去污劑對(duì)照的測(cè)定孔允許計(jì)算抗體特異性裂解。結(jié)果顯示在圖14中。該數(shù)據(jù)證明抗巖藻糖基-GMl抗體對(duì)在細(xì)胞表面上表達(dá)巖藻糖基-GMl的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。實(shí)施例8:肺癌的免疫組化研究使用小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的臨床活檢組織通過免疫組化研究檢測(cè)抗巖藻糖基-GMlHuMAb7E4識(shí)別巖藻糖基-GMl的能力。對(duì)于免疫組化研究，由小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的臨床活檢組織制備5mm的冷凍切片(ArdaisInc，USA)。干燥30分鐘后，將切片用甲醇固定(在室溫下10分鐘)并且風(fēng)干5分鐘。用PBS漂洗玻片，然后與PBS中的10。/。正常山羊血清預(yù)孵育20分鐘，隨后與10mg/ml在含10%正常山羊血清的PBS中的生物素化7E4在室溫下孵育30分鐘。用PBS洗滌玻片三次，然后與鏈霉抗生物素-FITC(DAKO)在室溫下孵育30分鐘。再用PBS洗滌玻片，與山羊抗FITCHRP偶聯(lián)物(DAKO)在室溫下孵育30分鐘。用PBS洗滌玻片三次。用二氨基聯(lián)苯胺(Sigma)作為HRP底物，導(dǎo)致7E4結(jié)合陽性的組織的棕色染色。用蒸餾水洗滌后，將玻片用蘇木精復(fù)染l分鐘，以顯示組織結(jié)構(gòu)。然后在流動(dòng)的蒸餾水中洗滌玻片IO秒種，并在甘油凝膠(DAKO)中固定。臨床活檢組織免疫組化染色顯示SCLC和NSCLC切片均為陽性染色。只有惡性腫瘤細(xì)胞在每種情況中均為陽性，相鄰的正常肺組織未被染色。肺癌的總體分布率為5/13的檢測(cè)樣品(2/6的SCLC和3/7的NSCLC)。7E4與正常肺組織結(jié)合的免疫組化結(jié)果為陰性。實(shí)施例9:非巖藻糖基化HuMAb的產(chǎn)生已經(jīng)證明巖藻糖基殘基數(shù)目減少的抗體可提高抗體的ADCC能力。在本實(shí)施例中，產(chǎn)生了缺少巖藻糖基殘基的抗巖藻糖基-GMlHuMAb。用表達(dá)抗巖藻糖基-GMlHuMAb重鏈和輕鏈的載體對(duì)缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT8的CHO細(xì)胞系Ms704-PF(Biowa,Inc.,Princeton,NJ)進(jìn)行電穿孔。通過在含有6mML-谷氨酰胺和500jug/mlG418(Invitrogen，Carlsbad,CA)的Ex國(guó)Cell325-PFCHO培養(yǎng)基(JRHBiosciences,Lenexa，KS)中生長(zhǎng)篩選耐藥性克隆。通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定根據(jù)IgG的表達(dá)來篩選克隆。實(shí)施例10:抗巖藻糖基-GM1人單克隆抗體的體內(nèi)效能將DMS79小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(巖藻糖基-GM1+)皮下植入到雄性SCID小鼠中(5x106細(xì)胞/鼠)，持續(xù)足以允許腫瘤形成的時(shí)間(約8天)。在植入后第8天，進(jìn)行腫瘤測(cè)量，并基于平均腫瘤體積(約200mm3)將小鼠隨才幾分入6個(gè)組中，每組8只小鼠，以進(jìn)行隨后的抗體治療。在植入后第8、11、15、18和22天，小鼠按照以下分組進(jìn)行腹膜內(nèi)(i.p.)注射(A)PBS(載體對(duì)照)；(B)每只小鼠30mg/kg的人IgGl(同種型對(duì)照)；(C)每只小鼠10mg/kg的抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體5B1;(D)每只小鼠30mg/kg的抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體5Bl;(E)每只小鼠10mg/kg的抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體7E^(F)每只小鼠30mg/kg的抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體7E4。這些實(shí)驗(yàn)中使用的單克隆抗體組合物具有低水平的內(nèi)毒素，并且沒有顯著聚集。使用電子精確的卡尺，在三個(gè)維度(高度x寬度x長(zhǎng)度)上測(cè)量肺瘤，并計(jì)算腫瘤體積。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中(61天)每周測(cè)量胂瘤兩次。當(dāng)胂瘤達(dá)到指定腫瘤終點(diǎn)時(shí)(特定腫瘤體積如1500mn^和/或當(dāng)小鼠顯示不適的體征或者超過大約15%的體重減輕時(shí))對(duì)小鼠實(shí)施安樂死。為了檢測(cè)抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體是否延遲肺瘤生長(zhǎng)，監(jiān)測(cè)胂瘤達(dá)到IOOOmn^體積時(shí)的天數(shù)。與載體和同種型對(duì)照相比，7E4和5B1抗巖藻糖基-GM1單克隆抗體都顯著延遲腫瘤生長(zhǎng)(見表l)。抗體效能看來是劑量依賴性的，30mg/kg治療組在各種情況下都顯示較大的應(yīng)答。而且，用30mg/kg7E4抗體治療的小鼠中的胂瘤體積從沒有達(dá)到1000mm3,在第61天研究結(jié)束時(shí)的平均腫瘤體積為600mm3。表l.<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>為了檢測(cè)DMS79細(xì)胞在體內(nèi)是否繼續(xù)表達(dá)巖藻糖基-GM1，在植入之前和從未治療的腫瘤回收DMS79細(xì)胞之后通過FACS分析了單克隆抗體7E4和5B1與DMS79細(xì)胞的結(jié)合。在植入DMS79細(xì)胞之前和之后結(jié)合的抗體證明在體內(nèi)維持巖藻糖基-GMl表達(dá)水平(圖11C)。圖15A顯示所有對(duì)照小鼠(A組和B組)除了一只以外都在第61天之前達(dá)到腫瘤終點(diǎn)。圖15B顯示用10mg/kg抗巖藻糖基-GMl5B1抗體處理的組(C組)有兩只小鼠達(dá)到腫瘤終點(diǎn)，有六只小鼠的胂瘤體積為大約600mm3至1000mm3，而用30mg/kg抗巖藻糖基-GMl5B1抗體處理的組(D組)中的8只小鼠在第61天都沒有達(dá)到肺瘤終點(diǎn)(體積為IOOOmn^或更小)。圖15C顯示用10mg/kg抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體7E4處理的組(E組)中的8只小鼠到第61天時(shí)都沒有達(dá)到腫瘤終點(diǎn)(體積約為1200mm3或更小，一只小鼠沒有肺瘤)。圖15C還顯示用30mg/kg抗巖藻糖基-GMl單克隆抗體7E4處理的組(F組)中的8只小鼠到第61天時(shí)都沒有達(dá)到腫瘤終點(diǎn)(體積約為800mn^或更小，兩只小鼠沒有肺瘤)。圖16顯示在第61天測(cè)量的腫瘤體積的(A)平均值和(B)中值?？贵w效能看來是劑量依賴性的，在每種情況下30mg/kg治療組比對(duì)照組顯示更大的應(yīng)答。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>本研究表明，在鼠腫瘤模型中，抗巖藻糖基-GMl抗體治療以劑量依賴的方式起作用，并且對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有比載體和同種型對(duì)照顯著更強(qiáng)的作用?？箮r藻糖基-GM1抗體治療也不會(huì)導(dǎo)致小鼠的體重減輕或者導(dǎo)致任何其他明顯的副作用，表明這些抗體是安全的并且是良好耐受的(圖17)。實(shí)際上，抗巖藻糖基-GMl抗體在第32天時(shí)顯示81。/()至90。/o的腫瘤生長(zhǎng)抑制百分比(TGI。/。)(表2)。另外，用30mg/kg劑量的抗體7E4治療導(dǎo)致25%的小鼠不含腫瘤。本發(fā)明的范圍不受本文所述的具體實(shí)施方案所限制。實(shí)際上，根據(jù)以上描述和附圖，除了本文所述的以外，對(duì)本公開內(nèi)容的各種修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員也是顯而易見的。這些修改落在所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。因此，同的完整范圍所限定，序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>權(quán)利要求1.一種分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體(a)與巖藻糖基-GM1特異性結(jié)合；且(b)與人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系DMS-79(人SCLCATCC#CRL-2049)結(jié)合。2.權(quán)利要求l的抗體，其為IgGl或IgG4同種型的全長(zhǎng)抗體。3.權(quán)利要求l的抗體，其為抗體片段或單鏈抗體。4.一種分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體與參比抗體交叉竟?fàn)幗Y(jié)合巖藻糖基-GMl,其中所述參比抗體包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4、5和6的氨基酸序列的人重4連可變區(qū)；和(b)包含選自SEQIDNO:7、8、9、10、11和12的氨基酸序列的人輕《連可變區(qū)。5.權(quán)利要求4的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:l的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列。6.權(quán)利要求4的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。7.權(quán)利要求4的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列。8.權(quán)利要求4的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:IO的氨基酸序列。9.權(quán)利要求4的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:ll的氨基酸序列。10.權(quán)利要求4的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。11.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含來源于人VH3-48基因或作為該基因的產(chǎn)物的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。12.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含來源于人VKL15基因或作為該基因的產(chǎn)物的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與巖藻糖基-GMl特異性結(jié)合。13.權(quán)利要求12的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其進(jìn)一步包含來源于人Vh3-48基因或作為該基因的產(chǎn)物的重鏈可變區(qū)。14.權(quán)利要求l的抗體，其包含(a)包含SEQIDNO:13的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:19的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:25的重鏈可變區(qū)CDR3:(d)包含SEQIDNO:31的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:37的輕鏈可變區(qū)CDR2;禾(f)包含SEQIDNO:43的輕鏈可變區(qū)CDR3,15.權(quán)利要求l的抗體，其包含(a)包含SEQIDNO:14的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:20的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:26的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:32的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:38的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:44的輕鏈可變區(qū)CDR3。16.權(quán)利要求l的抗體，其包含(a)包含SEQIDNO:15的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:21的重鏈可變區(qū)CDR2:(c)包含SEQIDNO:27的重鏈可變區(qū)CDR3:(d)包含SEQIDNO:33的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:39的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:45的輕鏈可變區(qū)CDR3,17.權(quán)利要求l的抗體，其包含(a)包含SEQIDNO:16的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:22的重鏈可變區(qū)CDR2:(c)包含SEQIDNO:28的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:34的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:40的輕鏈可變區(qū)CDR2;禾(f)包含SEQIDNO:46的輕鏈可變區(qū)CDR3。18.權(quán)利要求l的抗體，其包含(a)包含SEQIDNO:17的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:23的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:29的重鏈可變區(qū)CDR3:(d)包含SEQIDNO:35的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:41的輕鏈可變區(qū)CDR2;禾(f)包含SEQIDNO:47的輕鏈可變區(qū)CDR3,19.權(quán)利要求l的抗體，其包含(a)包含SEQIDNO:18的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:24的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:30的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:36的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:42的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:48的輕鏈可變區(qū)CDR3。20.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含:(a)包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。21.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含:(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。22.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含:(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。23.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:IO的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。24.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。25.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。26.—種組合物，其含有權(quán)利要求l的抗體或其抗原結(jié)合部分，和藥物可接受的載體。27.—種免疫偶聯(lián)物，其包含與治療劑連接的權(quán)利要求l的抗體或其抗原結(jié)合部分。28.—種組合物，其含有權(quán)利要求27的免疫偶聯(lián)物和藥物可接受的載體。29.權(quán)利要求27的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是細(xì)胞毒素。30.—種組合物，其含有權(quán)利要求29的免疫偶聯(lián)物和藥物可接受的載體。31.權(quán)利要求27的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是放射性同位素。32.—種組合物，其含有權(quán)利要求31的免疫偶聯(lián)物和藥物可接受的載體。33.—種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求l的抗體或其抗原結(jié)合部分。34.—種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求33的核酸分子。35.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求34的表達(dá)載體。36.—種制備抗巖藻糖基-GMl抗體的方法，包括在權(quán)利要求35的宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體，并且從該宿主細(xì)胞中分離該抗體。37.—種治療或預(yù)防以表達(dá)巖藻糖基-GMl的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的疾病的方法，包括給受試者施用治療或預(yù)防該疾病有效量的權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述疾病是癌癥。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述癌癥是肺癌。全文摘要本發(fā)明提供以高親和力特異性結(jié)合巖藻糖基-GM1的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。還提供了編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和表達(dá)本發(fā)明的抗體的方法。還提供了包含本發(fā)明的抗體的免疫偶聯(lián)物、雙特異性分子和藥物組合物。本發(fā)明還提供了檢測(cè)巖藻糖基-GM1的方法，以及使用抗巖藻糖基-GM1抗體治療包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的方法。文檔編號(hào)A61K39/395GK101356195SQ200680050725公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2006年12月8日優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日發(fā)明者A·威特,C·A·維斯蒂卡,E·H·霍爾梅斯,J·M·卡爾達(dá)勒利,P·布拉姆斯申請(qǐng)人:米德列斯公司