專利名稱：：紐蘭格林突變體及其篩選方法與應(yīng)用的制作方法紐蘭格林突變體及其篩選方法與應(yīng)用相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)是2005年12月2日提出的序列號(hào)為11/293,879的美國專利申請(qǐng)的部分延續(xù)并要求該專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，該專利申請(qǐng)通過引用而完整地合并于此。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明是主要涉及選擇性激活ErbB受體的紐蘭格林突變體。本發(fā)明提供了紐蘭格林突變體以及篩選與使用這些突變體的方法。發(fā)明背景包含EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4四個(gè)成員的表皮生長因子受體家族己被證明在包括細(xì)胞生長、分化和存活在內(nèi)的多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用。這些受體為蛋白酪氨酸激酶受體，由細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。多個(gè)受體配體己被發(fā)現(xiàn)，這些配體通過與受體結(jié)合而介導(dǎo)受體形成同源或異源二聚體。特定的受體組合導(dǎo)致不同方式的磷酸化、復(fù)雜的信號(hào)傳遞鏈和多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、凋亡防止以及對(duì)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、黏附和侵入的促進(jìn)。紐蘭格林-1是ErbB3和ErbB4受體的配體。超過15種不同的紐蘭格林-1異構(gòu)體已被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)其基本的表皮生長因子(EGF)類似區(qū)結(jié)構(gòu)的差異，紐蘭格林-1異構(gòu)體可被分為兩大類，即ct-類和卩-類。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)長度在50到64個(gè)氨基酸范圍的紐蘭格林-1的表皮生長因子類似區(qū)足以結(jié)合并激活這些受體。以前的研究表明紐蘭格林-l卩(NRG-1(3)能以高親和力直接與ErbB3和ErbB4結(jié)合。孤兒受體ErbB2具有預(yù)活化的構(gòu)象從而有利于同ErbB3或ErbB4形成異源二聚體，而且比ErbB3或ErbB4形成同源二聚體的親和力要高約100倍。異源二聚體受體在不同的細(xì)胞類型中起作用ErbB2/ErbB3在外周神經(jīng)系統(tǒng)而ErbB2/ErbB4在心臟中起作用。神經(jīng)發(fā)育中的研究顯示交感神經(jīng)系統(tǒng)的形成需要完整的NRG-1|3、ErbB2和ErbB3信號(hào)傳遞系統(tǒng)。靶向破壞NRG-1(3、ErbB2或ErbB4會(huì)引起心臟發(fā)育缺陷進(jìn)而而導(dǎo)致胚胎死亡。最近的研究也突顯了NRG-1(3、ErbB2和ErbB4在心血管發(fā)育以及成人正常心臟功能維持中的重要作用。NRG-1P己被證明能增強(qiáng)成人心肌細(xì)胞的肌小節(jié)的有序排列。在三種不同的心衰動(dòng)物模型中短期使用重組NRG-1(3EGF類似區(qū)能顯著改善或防止心肌功能的退化。更重要的是，NRG-ip顯著地延長了心衰動(dòng)物的生存時(shí)間。這些效果使NRG-1(3有望成為應(yīng)對(duì)多種普通疾病導(dǎo)致的心衰的廣譜治療劑或先導(dǎo)化合物。但是，仍然需要NRG-lj3與其受體復(fù)合物的詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息以設(shè)計(jì)用于治療的NRG-ip突變體。利用同源建模、分子動(dòng)力學(xué)模擬以及自由能計(jì)算的多種計(jì)算機(jī)分析被用來在原子水平揭示配體-蛋白和蛋白-蛋白相互作用。在基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)等廣泛的生物物理課題中預(yù)測純粹的配體-受體結(jié)合自由能是必要的。最近，一種新的計(jì)算機(jī)方法，分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法，被用來研究蛋白-蛋白相互作用。MM-PBSA法直接計(jì)算末態(tài)自由能以避免耗時(shí)的中間態(tài)模擬。這一方法結(jié)合了溶質(zhì)的分子動(dòng)力能量法和溶劑連續(xù)介質(zhì)法以及估算總自由能的普通模式分析法。計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描法也被用于研究蛋白-蛋白相互作用。發(fā)明概述在一種情況下，本發(fā)明提供了含有氨基酸序列如SEQIDNO:1所示肽段的紐蘭格林-ip的一種多肽突變體，其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l序列中不同的氨基酸，其中多肽突變體相對(duì)SEQIDNO:l肽段與ErbB3有更強(qiáng)的親和力；其中在第25位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;在第35位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或在第46位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y。在一些具體例子中，多肽突變體具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列，其中在第25位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;在第35位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或在第46位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y。在多肽突變體的一些例子中，在第25位殘基所述不同的氨基酸為A;在第35位殘基所述不同的氨基酸為A;和/或在第46位殘基所述不同的氨基酸為A。在某些例子中，多肽突變體相對(duì)SEQIDNO:l的多肽與ErbB4減弱或相近的結(jié)合親和力。在某些多肽突變體的例子中，在第25位殘基所述氨基酸為A。在某些多肽突變體的例子中，在第35位殘基所述氨基酸為A。在某些多肽突變體的例子中，在第46位殘基所述氨基酸為A。本發(fā)明還提供了包含SEQNO:1的1-52位氨基酸殘基的紐蘭格林-lp的多肽突變體，其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中的氨基酸不同的氨基酸，其中多肽突變體相對(duì)由SEQIDNO:l中的1-52位氨基酸殘基組成的多肽與ErbB3有增強(qiáng)的結(jié)合親和力，在第25位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;在第35位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或在第46位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y。在某些多肽突變體的例子中，在第25位殘基所述不同的氨基酸是A;在第35位殘基所述不同的氨基酸是A;和/或在第46位殘基所述不同的氨基酸是A。在一些例子中，多肽突變體與ErbB4結(jié)合的親和力與SEQIDNO:l中的l-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比有所減弱或相同。在一些例子中，多肽突變體第25位殘基為A。在一些例子中，多肽突變體第35位殘基為A。在一些例子中，多肽突變體第46位殘基為A。本發(fā)明還提供了一種寡核苷酸，其包含的核苷酸序列編碼的所述多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)的多肽或由SEQIDNO:l中的1-52位氨基酸殘基組成的多肽相比，與ErbB3有較強(qiáng)的結(jié)合親和力。本發(fā)明還提供了一種包含有效量的所述多肽突變體或編碼該多肽突變體的寡核苷酸和藥學(xué)上可接受的賦型劑的藥物合劑，所述多肽突變體與SEQIDNO:1對(duì)應(yīng)的多肽或由SEQIDNO:1中的1-52位氨基酸殘基組成的多肽相比有更強(qiáng)的ErbB3結(jié)合親和力。本發(fā)明還提供了一種包含該藥物合劑的試劑盒。在一些例子中，該試劑盒還包含用該藥物合劑通過激活ErbB2/ErbB3受體來預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病的說明書。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防、治療或延遲哺乳動(dòng)物精神分裂癥發(fā)展的方法，包括給需要這種預(yù)防、治療或延遲的哺乳動(dòng)物使用包含有效量所述藥物合劑的藥物制劑。在一些例子中，所述哺乳動(dòng)物是人另一種情況下，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO:l所示氨基酸序列的紐蘭格林-l卩的多肽突變體，其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中不同的氨基酸；其中多肽突變體相對(duì)于SEQIDNO:l多肽有較低的ErbB4結(jié)合親和力，其中在第3位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，多肽突變體具有SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，其中在第3位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在多肽突變體的一些例子中，在第3位殘基所述氨基酸是A。在一些例子中，多肽突變體相對(duì)于SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)的多肽有增強(qiáng)或減弱的ErbB3結(jié)合親和力。在多肽突變體的一些例子中，在第3位殘基所述不同的氨基酸是A。本發(fā)明還提供了包含SEQNO:l中l(wèi)-52位氨基酸殘基的紐蘭格林-ip的多肽突變體，其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸；其中多肽突變體相對(duì)于由SEQIDNO:l中1-52位氨基酸殘基組成的多肽有較弱的ErbB4結(jié)合親和力，其中在第3位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在多肽突變體的一些例子中，第3位殘基為A。在一些例子中，多肽突變體相對(duì)于由SEQIDNO:l的1-52位氨基酸殘基組成的多肽有較強(qiáng)或相同的ErbB3結(jié)合親和力。在多肽突變體的一些例子中，第3位殘基為A。本發(fā)明還提供了一種寡核苷酸，包含的核酸序列編碼的所述多肽突變體相對(duì)于SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)的多肽或由SEQIDNO:l中1-52位氨基酸殘基組成的多肽與ErbB4有較弱的結(jié)合親和力。本發(fā)明還提供了一種包含有效量的所述多肽突變體或編碼該多肽突變體的寡核苷酸和藥學(xué)上可接受的賦型劑的藥物合劑，所述多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)的多肽或由SEQIDNO:l中的1-52位氨基酸殘基組成的多肽相比有較弱的ErbB4結(jié)合親和力。本發(fā)明還提供了一種包含該藥物合劑的試劑盒。在一些例子中，該試劑盒還包含用該藥物合劑經(jīng)激活ErbB2/ErbB3來預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病的說明書。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防、治療或延遲哺乳動(dòng)物精神分裂癥發(fā)展的方法，包括給需要預(yù)防、治療或延遲的哺乳動(dòng)物含有有效量藥物合劑的藥物制劑。在一些例子中，哺乳動(dòng)物是人類。另一情況下，本發(fā)明提供了含有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的紐蘭格林-ip的多肽突變體，其中該多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，其中該多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)的多肽相比有增強(qiáng)的ErbB4結(jié)合親和力，而其中在第16位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;在第29位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y;在第31位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y;在第43位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;禾口/或在第47位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，該多肽突變體具有SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，且在第16位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;在第29位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y;在第31位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y;在第43位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或在第43位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在該多肽突變體的一些例子中，其第16位殘基為A;第29位殘基為A;第31位殘基為A;第43位殘基為A;或第47位殘基為A。在一些例子中，該多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽相比有較弱或相似的ErbB3結(jié)合親和力。在該多肽突變體的一些例子中，第31位殘基為A。在該多肽突變體的一些例子中，第43位殘基為A。在該多肽突變體的一些例子中，第47位殘基為A。本發(fā)明還提供了由SEQNO:l中1-52位氨基酸殘基構(gòu)成的紐蘭格林-ip的多肽突變體，其中該多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，其中該多肽突變體與由SEQNO:l的l-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比有增強(qiáng)的ErbB4結(jié)合親和力；其中在第16位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;在第29位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y;在第31位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y;在第31位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或在第16位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在該多肽突變體的一些例子中，第16位殘基為A;第29位殘基為A;第31位殘基為A;第43位殘基為A;和/或第47位殘基為A。在一些例子中，該多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)的多肽相比有減弱或相似的ErbB3結(jié)合親和力。在一些該多肽突變體的例子中，第31位殘基為A。在一些該多肽突變體的例子中，第43位殘基為A。在一些該多肽突變體的例子中，第47位殘基為A。本發(fā)明還提供了包含氨基酸序列SEQIDNO:1的紐蘭格林-1(3的多肽突變體，其中該多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸；其中該多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽相比有減弱的ErbB3結(jié)合親和力但有相似的ErbB4結(jié)合親和力，并且其中第33位殘基為A。本發(fā)明還提供了由SEQNO:l中1-52位氨基酸殘基構(gòu)成的紐蘭格林-1(3的多肽突變體，其中該多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸；其中該多肽突變體與由SEQNO:l中l(wèi)-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比有減弱的ErbB3結(jié)合親和力但有相似的ErbB4結(jié)合親和力，其中第33位殘基為A。本發(fā)明還提供了一種包含編碼所述多肽突變體的核酸序列的多核苷酸，該多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)的多肽或由SEQIDNO:l中1-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比有增強(qiáng)的ErbB4結(jié)合親和力。本發(fā)明還提供了一種包含有效量的所述多肽突變體或編碼該多肽突變體的寡核苷酸和藥學(xué)上可接受的賦型劑的藥物合劑，所述多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)的多肽或由SEQIDNO:l中的1-52位氨基酸殘基組成的多肽相比有增強(qiáng)的ErbB4結(jié)合親和力。本發(fā)明還提供了一種包含該藥物合劑的試劑盒。在一些例子中，該試劑盒還包含用該藥物合劑通過激活ErbB2/ErbB4受體來預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病的說明書。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防、治療或延遲個(gè)體病毒性心肌炎、擴(kuò)張性(充血性)心肌癥、心臟毒性、心衰、心肌梗死發(fā)展的方法，包括給需要這種預(yù)防、治療或延遲的個(gè)體含有效量的藥物合劑的藥物制劑。在一些例子中，所述哺乳動(dòng)物是人類。在另一種情況下，本發(fā)明提供了一種篩選有增強(qiáng)的ErbB3結(jié)合親和力的紐蘭格林-l(3突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建來建立紐蘭格林-lp或其片段、ErbB3以及紐蘭格林-1(3或其片段與ErbB3的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法來建立紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-l卩或其片段和ErbB3的部分總結(jié)合自由能(AGsub,wMtype);(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-lp或其片段的丙氮酸替換突變體和ErbB3的部分總結(jié)合自由能(AGsubtotalalaninesubstitutedvariant)，所述丙氨酸替換突變體中紐蘭格林-ip或其片段的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；(e)計(jì)算AAGsub固=AGsubt。ta,w,peAGsubtotalalaninesubstitutedvariant;以及(f)選擇使紐蘭格林-ip或其片段和ErbB3的復(fù)合物的AAG^t。w為正值的丙氨酸替換突變體；由此發(fā)現(xiàn)一個(gè)與ErbB3有增強(qiáng)的結(jié)合親和力的紐蘭格林-ip的多肽突變體。本發(fā)明還提供了一種篩選選擇性地與ErbB3有增強(qiáng)結(jié)合親和力的紐蘭格林-l(3突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建建立紐蘭格林-lJ3或其片段、ErbB3、ErbB4、紐蘭格林-lp或其片段與ErbB3的復(fù)合物以及紐蘭格林-l(3或其片段與ErbB4的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法建立紐蘭格林-lp或其片段與ErbB3的復(fù)合物以及紐蘭格林-l(3或其片段與ErbB4的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性相關(guān)數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-l(3或其片段與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(△Gsubtotalwildtype);(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-ip或其片段的丙氨酸替換突變體與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsubt。talalaninesubstitutedvariant)，所述丙氨酸替換突變體中紐蘭格林-l卩或其片段的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；(e)計(jì)算AAGsubtotal=AGsubtotalwildtypeAGsubtotalalaninesubstitutedvariant;以及(f)選擇J吏紐蘭格林-lf3或其片段與ErbB3的復(fù)合物的AAGsubt。w為正值，同時(shí)使紐蘭格林-1(3或其片段與ErbB4的復(fù)合物的AAGsubt。w為負(fù)值或零左右的丙氨酸替換突變體；就此發(fā)現(xiàn)了一個(gè)選擇性地與ErbB3有增強(qiáng)的結(jié)合親和力的紐蘭格林-ip多肽突變體。在一些例子中，選擇的丙氨酸替換突變體使紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4的復(fù)合物的AAGsubt。ta,為負(fù)值，就此發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與ErbB3有增強(qiáng)的結(jié)合親和力而與ErbB4有減弱的結(jié)合親和力的紐蘭格林-l(3多肽突變體。在某些例子中，選擇的丙氨酸替換突變體使紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4的復(fù)合物的AAGsubtotal在零左右，就此發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與ErbB3有增強(qiáng)的結(jié)合親和力而與ErbB4結(jié)合親和力不變的紐蘭格林-lp多肽突變體。。另一種情況下，本發(fā)明提供了一種篩選與ErbB4結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-l(3突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建來建立紐蘭格林-ip或其片段、ErbB4以及紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法來建立紐蘭格林-1|3或其片段與ErbB4的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性方面的數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsubt。talwildtype);(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-l卩或其片段的丙氨酸替換突變體與ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsubt。walaninesubstitutedvariant乂，其中丙氨酸替換突變體是指紐蘭格林-1|3或其片段中的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；(e)計(jì)算AAGsub她,=AGsubt。talwildtype—△Gsubt。talalaninesubstitutedvaant;以及(f)選擇使紐蘭格林-1(3或其片段與ErbB4的復(fù)合物之AAG^t。w為正值的丙氨酸替換突變體；就此發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與ErbB4結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-ip的多肽突變體。本發(fā)明還提供了一種篩選選擇性的與ErbB4結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-l卩突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建來建立紐蘭格林-ip或其片段、ErbB3、ErbB4、紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3的復(fù)合物以及紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法來建立紐蘭格林-l(3或其片段與ErbB3的復(fù)合物以及紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性方面的數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-1(3或其片段與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsubt。ta^dtype);(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-l(3或其片段的丙氨酸替換突變體與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsubt。t^畫esubsti歐dvari加t)，其中丙氨酸替換突變體是指紐蘭格林-l卩或其片段中的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；(e)計(jì)算AAGsubtotal=△Gsubtotaiwildtype—△Gsubtotalalaninesubstitutedvariant;(f)選擇使紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4的復(fù)合物之A△Gsubtotal為正值，而紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3的復(fù)合物之AAGsubtotal為負(fù)值或零左右的丙氨酸替換突變體；就此發(fā)現(xiàn)了一個(gè)選擇性的與ErbB4結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-lp的多肽突變體。在一些例子中，選擇了使紐蘭格林-lp或其片段與ErbB3的復(fù)合物之AAG^t。w為負(fù)值的丙氨酸替換突變體，就此發(fā)現(xiàn)了與ErbB4的結(jié)合親和力增強(qiáng)而與ErbB3的結(jié)合親和力減弱的紐蘭格林-lp的多肽突變體。在一些例子中，選擇的丙氨酸替換突變體使紐蘭格林-1|3或其片段與ErbB3的復(fù)合物之AAG^t。w在零左右，就此發(fā)現(xiàn)了與ErbB4的結(jié)合親和力增強(qiáng)而與ErbB3的結(jié)合親和力不變的紐蘭格林-1(3的多肽突變體。本發(fā)明還提供了一種篩選與ErbB4結(jié)合親和力不變但與ErbB3結(jié)合親和力降低的紐蘭格林-l(3突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建來建立紐蘭格林-ip或其片段、ErbB3、ErbB4、紐蘭格林-1(3或其片段與ErbB3的復(fù)合物以及紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法來建立紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3的復(fù)合物以及紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性方面的數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3或EltB4的部分總結(jié)合自由能(AGsub她,w她ype);(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-ip或其片段的丙氨酸替換突變體與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGs油t。^alaninesubstituted，iant)，其中丙氨酸替換突變體是指紐蘭格林-l卩或其片段中的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；(e)計(jì)算AAGsubt。tal=△Gsubt。talwildtype—△Gsubtotalalaninesubstitutedvariant;(f)選擇使紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4的復(fù)合物之AAG^t。^在零左右，而紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3的復(fù)合物之AAGsubt。ta,為負(fù)值的丙氨酸替換突變體；就此發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與ErbB4結(jié)合親和力不變但與ErbB3結(jié)合親和力降低的紐蘭格林-l(3突變體。本發(fā)明還提供了用此處所描述的方法發(fā)現(xiàn)的一種紐蘭格林-1P的多肽突變體。圖片簡要說明本專利或申請(qǐng)文件含有至少一張彩色圖片。提出申請(qǐng)并付必要費(fèi)用后專利局可提供有彩色圖片的專利或?qū)＠暾?qǐng)公開文本復(fù)本。圖1顯示的是用于同源模建的(A)ErbB3和EGFR，以及(B)ErbB4和EFGR的一對(duì)一序列比對(duì)。序列中的"*"指相同的殘基；":"指保守性替換；"."指半保守性替換?？蚱饋淼牟糠直砻鹘Y(jié)構(gòu)上保守的區(qū)域。圖2顯示的是重疊于EGFR(紅色)X-射線晶體結(jié)構(gòu)上的受體(A)ErbB3(藍(lán)色)和(B)ErbB4(藍(lán)色)的Ca軌跡之精確的立體圖示。圖3顯示的是(A)NRG-lJ3/ErbB3和(B)NRG-l(VErbB4模型的條帶示意圖。復(fù)合物中的NRG-ip鏈為紅色。受體的I、II、III及IV結(jié)構(gòu)域分別顯示為藍(lán)色、綠色、橙色和灰色。接觸面的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)用圓圈標(biāo)出。本圖是用MOLSCRIPT程序生成。圖4顯示的是(A)最小化的NRG-1卩對(duì)應(yīng)物(藍(lán)色)與EGF(紅色)的Ca原子的最佳擬合疊加立體圖示和(B)這些蛋白的氨基酸序列比對(duì)。圖5顯示的是ErbB3(虛線)禾nErbB4(實(shí)線)與NRG-1卩復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)模擬過程中Cci原子的均方根偏差。圖6顯示的是ErbB3與NRG-1卩在三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的相互作用，(A)結(jié)合位點(diǎn)l的接觸面；(B)結(jié)合位點(diǎn)2的接觸面；(C)結(jié)合位點(diǎn)3的接觸面。僅顯示了相互作用的殘基的側(cè)鏈。點(diǎn)畫線表示氫鍵。圖7顯示的是ErbB4與NRG-ip在三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的相互作用情況，(A)結(jié)合位點(diǎn)l的接觸面；(B)結(jié)合位點(diǎn)2的接觸面；(C)結(jié)合位點(diǎn)3的接觸面。僅顯示了相互作用的殘基的側(cè)鏈。點(diǎn)畫線表示氫鍵。圖8顯示的是(A)對(duì)ErbB3與NRG-ip復(fù)合物進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬丙氨酸掃描突變實(shí)驗(yàn)的結(jié)合能變化情況；(B)對(duì)ErbB4與NRG-1(3復(fù)合物進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬丙氨酸掃描突變實(shí)驗(yàn)的結(jié)合能變化情況?！鳌鱃subtotal為負(fù)值時(shí)表示高度不利的替換。AAG^t。w為正值時(shí)表示該殘基適于丙氨酸突變。圖9顯示的是用紐蘭格林或其突變體(D43A)處理ErbB2&ErbB4以及ErbB2&ErbB3共表達(dá)的COS7細(xì)胞后AKT的磷酸化情況。圖中的Con表示紐蘭格林的濃度，P-AKT表示磷酸化的AKT。圖10顯示的是用紐蘭格林或其突變體(L3A)處理ErbB2&ErbB4以及ErbB2&ErbB3共表達(dá)的COS7細(xì)胞后AKT的磷酸化情況。GAPDH作為蛋白總量對(duì)照而顯示。圖11顯示的是用紐蘭格林或其雙突變體(8A47A)處理ErbB2&ErbB4以及ErbB2&ErbB3共表達(dá)的COS7細(xì)胞后AKT的磷酸化情況。GAPDH作為蛋白總量對(duì)照而顯示。發(fā)明詳述為了簡潔，而非限制，本發(fā)明的詳述分成下面幾個(gè)部分。A.定義除非另外定義，此處所使用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域里的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。此處所提到的所有專利、申請(qǐng)、公開的申請(qǐng)以及其他出版物均通過引用而整體合并于此。如果本部分所陳述的定義與通過引用合并于此的專利、申請(qǐng)、公開的申請(qǐng)以及其他出版物中陳述的定義相反或不一致時(shí)，則以本部分陳述的定義為準(zhǔn)。此處所用的"一個(gè)"或"某一個(gè)"的意思是"至少一個(gè)"或"一個(gè)或多個(gè)"。此處所用的"紐蘭格林"或"NRG"是指能結(jié)合并活化ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3異二聚體蛋白激酶的蛋白質(zhì)或多肽，比如所有的紐蘭格林異構(gòu)體、單獨(dú)的紐蘭格林EGF結(jié)構(gòu)域、紐蘭格林突變體、以及也能活化上述受體的任何類型的紐蘭格林樣基因產(chǎn)物。紐蘭格林也包括NRG-1、NRG-2、NRG-3禾nNRG-4。這些蛋白和多肽能活化上述ErbB受體并調(diào)節(jié)其生物反應(yīng)，例如，刺激乳腺癌細(xì)胞的分化以及乳蛋白的分泌；誘導(dǎo)神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為雪旺細(xì)胞(Schwanncell);剌激骨骼肌細(xì)胞中乙酰膽堿的合成；以及改善心肌細(xì)胞的存活與DNA合成。紐蘭格林還包括那些帶有保守性氨基酸替換而未顯著改變其生物活性的突變體。適宜的保守性氨基酸替換對(duì)那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是盡人皆知的并且可以在不改變最終所得分子的生物活性的情況下普遍實(shí)施。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，一般說來，對(duì)一個(gè)多肽的非必需區(qū)域的單個(gè)氨基酸進(jìn)行替換不會(huì)顯著改變其生物活性(參見，如Watson等所著的《基因的分子生物學(xué)》，第224頁，1987年第4版，Bejacmin/Cummings出版公司)。紐蘭格林蛋白包括紐蘭格林蛋白和多肽。紐蘭格林核酸包括紐蘭格林核酸以及紐蘭格林寡核苷酸。此處所用的"表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域"或"EGF樣結(jié)構(gòu)域"是指由紐蘭格林基因編碼的一個(gè)多肽結(jié)構(gòu)區(qū)域，該結(jié)構(gòu)域能結(jié)合并活化ErbB2、ErbB3、ErbB4或其組合，并與下列專利或出版物中所揭示的EGF受體-結(jié)合區(qū)有相似的結(jié)構(gòu)WO00/6400、Holmesetal.,Science,256:1205-1210(1992);美國專利號(hào)5,530,109和5,716,930;Hijazietal.，Nature,387:512-516(1997);Higashiyamaetal.，J.Biochem.,122:675-680(1997);以及WO97/09425。EGF樣結(jié)構(gòu)域可來源于NRG-l、NRG-2、NRG-3、或NRG-4。EGF樣結(jié)構(gòu)域可以是a或p亞型。此處所用的紐蘭格林的"功能性衍生物或片段"是指仍然充分保留了其抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性、或抗心肌梗死活性的紐蘭格林蛋白或其編碼核酸的衍生物或片段。正常情況下，這些衍生物或片段保留至少50%的抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性、或抗心肌梗死活性。更好的情況下，這些衍生物或片段保留至少60%、70%、80%、90%、禾卩100%的抗病毒性心肌炎、抗DCM、抗心臟毒性、或抗心肌梗死活性。此處所用的"erb"是指與骨髓成紅血細(xì)胞增多癥病毒(一種急性轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒)相關(guān)聯(lián)的兩個(gè)癌基因erbA和erbB。此處所用的"用于治療某種特定疾病的復(fù)合物的有效劑量"是指足以改善、或以某種方式減少與該疾病相關(guān)癥狀的劑量。只要有效，這一劑量可以作為單次劑量予以施用或根據(jù)某一療程規(guī)定予以施用。這一劑量也許能治愈疾病，但典型的情況下是用來改善疾病的癥狀。為了達(dá)到改善癥狀的預(yù)期效果有時(shí)需要重復(fù)用藥。此處所用的"治療"或"處理"是指可以使某一不適、機(jī)能失調(diào)或疾病的癥狀得以改善或向好的方向改變的任何處置方式。治療還包括將此處所述的復(fù)合物作為藥物應(yīng)用。此處所用的通過施用某一特定的藥物組分而使某種特定疾病的癥狀"改善"是指任何減輕，無論是永久的或暫時(shí)的、持續(xù)的或瞬時(shí)的減輕，只要這一減輕能歸因于或與關(guān)聯(lián)于該藥物組分的使用。此處所用的"經(jīng)重組方式生產(chǎn)"是指使用重組核酸方法進(jìn)行的生產(chǎn)，這依靠于眾所周知的分子生物學(xué)方法來表達(dá)克隆的核酸編碼的蛋白。當(dāng)指兩個(gè)核酸分子"互補(bǔ)"時(shí)，此處所用的"互補(bǔ)"是指兩個(gè)核苷酸序列能夠雜交，相反的核苷酸之間的錯(cuò)配在適宜的情況是少于25%、更適宜的情況是少于15%、更進(jìn)一步適宜的情況是少于5%、最適宜的情況是沒有錯(cuò)配。適宜的情況是兩個(gè)分子能在高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下進(jìn)行雜交。此處所用的用來測定錯(cuò)配百分比的"雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性"是指下列條件1)高嚴(yán)謹(jǐn)性O(shè).IXSSPE，0.1%SDS，65°C;2)中度嚴(yán)謹(jǐn)性0.2XSSPE，0.1%SDS，50°C(也稱為適度嚴(yán)謹(jǐn)性)；以及3)低嚴(yán)謹(jǐn)性O(shè).IXSSPE，0.1%SDS，50°C。應(yīng)該指出的是相應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性也可以通過使用不同的緩沖液、鹽和溫度而獲得。此處所用的"載體(或質(zhì)粒)"是指用來將異源DNA引入細(xì)胞并在其中進(jìn)行表達(dá)或復(fù)制的分離元件。選擇并使用這些媒介物對(duì)技術(shù)人員來說是非常熟悉的。一個(gè)表達(dá)載體包含能表達(dá)的DNA，通過可操作性連接將該DNA與調(diào)節(jié)性序列相連接，比如啟動(dòng)子區(qū)，這些調(diào)節(jié)區(qū)能影響DNA片段的表達(dá)。因此，一個(gè)表達(dá)載體是指一個(gè)重組的DNA或RNA構(gòu)建體，比如一個(gè)質(zhì)粒、一個(gè)噬菌體、一個(gè)重組病毒或其他載體當(dāng)將其引入某一適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞后可以表達(dá)克隆的DNA。對(duì)于該領(lǐng)域的技術(shù)人員而言他們都知道哪些載體是適宜的，包括那些能在真核細(xì)胞和/或原核細(xì)胞復(fù)制的載體以及那些保持游離形式或那些整合到宿主細(xì)胞基因組的載體。此處所用的"啟動(dòng)子區(qū)或啟動(dòng)子元件"是指某一DNA或RNA200680052155.3說明書第15/48頁片段，該片段能控制與其相連的DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子區(qū)包含特定的序列，該序列足以進(jìn)行RNA聚合酶的識(shí)別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子區(qū)的這一部分被稱為啟動(dòng)子。此外，啟動(dòng)子區(qū)還包含一些序列，這些序列能調(diào)節(jié)RNA聚合酶的識(shí)別、結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄起始活性。這些序列可以順式作用方式發(fā)揮作用或?qū)Ψ词阶饔靡蜃舆M(jìn)行應(yīng)答而發(fā)揮作用。取決于調(diào)控性質(zhì)，啟動(dòng)子可以是組成型的或調(diào)節(jié)型的。用于原核的典型的啟動(dòng)子包括噬菌體T7和T3啟動(dòng)子等等。此處所用的"可操作性連接或可運(yùn)作性連接"是指調(diào)節(jié)性和效應(yīng)性核苷酸序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止位點(diǎn)、以及其他的信號(hào)序列和DNA的功能關(guān)系。例如，將DNA可操作性連接至一個(gè)啟動(dòng)子是指該DNA與該啟動(dòng)子之間的物理上及功能上的關(guān)系，這樣該DNA的轉(zhuǎn)錄就是由某一個(gè)能特異性識(shí)別、結(jié)合并轉(zhuǎn)錄該DNA的RNA聚合酶從該啟動(dòng)子處起始轉(zhuǎn)錄。為了優(yōu)化表達(dá)和/或體外轉(zhuǎn)錄，有時(shí)需要去除、添加或改變克隆的5'端非翻譯區(qū)以消除多余的、潛在的不適當(dāng)?shù)目蛇x的翻譯起始(即開始)密碼子或其他無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平可能干擾或減少表達(dá)的序列。作為可選項(xiàng)，一致性的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(參見，例如Kozak，J.Biol.Chem.,266:19867-19870(1991))可以插入到起始密碼子的5'端從而有可能增強(qiáng)表達(dá)。是否需要進(jìn)行這些修改可以通過經(jīng)驗(yàn)而定。此處所說的"心肌梗死"是指嚴(yán)重而持續(xù)的缺血引起冠狀動(dòng)脈阻斷或血流中斷導(dǎo)致的部分心肌病灶性壞死。B.NRG-1(3突變體以及藥物合劑本發(fā)明提供NRG-1多肽突變體與編碼這些多肽突變體的多核苷酸以及藥物合劑?！獋€(gè)功能性人NRG-1片段具有如下氨基酸序列SerHisLeuValLysCysAlaGluLysGluLysThrPheCysValAsnGlyGlyGluCysPheMetValLysAspLeuSerAsnProSerArgTyrLeuCysLysCysProAsnGluPheThrGlyAspArgCysGinAsnTyrValMetAlaSerPheTyrLysAlaGluGluLeuTyrGin(SEQIDNO:1)對(duì)應(yīng)于人NRG-1第177-237位氨基酸。編碼該片段的人的核酸序列為agccatcttgtaaaatgtgcggagaaggagaaaactttctgtgtgaatggagggagtgcttcatggtgaaagacctttcaaacccctcgagatacttgtgcaagtgcccaaatgagtttactggtgatcgctgccaaaactacgtaatggcgagcttctacaaggcggaggagctgtaccag(SEQIDNO:2)本發(fā)明提供紐蘭格林1P突變體，其包含的氨基酸序列如SEQIDNO:1，以及與SEQIDNO:l相比在第3、8、16、25、29、31、33、35、43、46或47位殘基為不同的氨基酸的序列。在一些例子中，本發(fā)明的紐蘭格林IP突變體在SEQIDNO:l的第3、8、16、25、29、31、33、35、43、46或47位殘基有單個(gè)氨基酸替換。在一些例子中，本發(fā)明的紐蘭格林ie突變體在SEQIDNO:l的第3、8、16、25、29、31、33、35、43、46或47位殘基有多個(gè)氨基酸替換。在一些例子中，本發(fā)明的紐蘭格林ie突變體在SEQIDNO:l的第3、8、16、25、29、31、33、35、43、46或47位殘基有2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)氨基酸替換。—種情況下，本發(fā)明提供了紐蘭格林-ip的一種多肽突變體，紐蘭格林-lp的氨基酸序列顯示于SEQIDNO:1，其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中多肽突變體與SEQIDNO:l中的多肽相比，結(jié)合ErbB3的親和力更高；以及其中第25位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;第35位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或第46位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，多肽突變體所含的氨基酸序列同SEQIDNO:l所示，并且其中第25位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;第35位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或第46位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，多肽突變體第25位殘基為A;第35位殘基為A;和/或第46位殘基為A。在一些例子中，多肽突變體與ErbB4結(jié)合的親和力與SEQIDNO:l中的多肽相比有所減弱或相同。在一些例子中，多肽突變體第25位殘基為A。在一些例子中，多肽突變體第35位殘基為A。在一些例子中，多肽突變體第46位殘基為A。.本發(fā)明還提供了由SEQNO:l中的l-52位氨基酸殘基構(gòu)成的紐蘭格林-l卩的一種多肽突變體，其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中多肽突變體與SEQIDNO:l中的l-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比，結(jié)合ErbB3的親和力更高；以及其中第25位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;第35位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或第46位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，多肽突變體第25位殘基為A;第35位殘基為A;和/或第46位殘基為A。在一些例子中，多肽突變體與ErbB4結(jié)合的親和力與SEQIDNO:l中的l-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比有所減弱或相同。在一些例子中，多肽突變體第25位殘基為A。在一些例子中，多肽突變體第35位殘基為A。在一些例子中，多肽突變體第46位殘基為A。另一方面，本發(fā)明提供了紐蘭格林-1|3的一種多肽突變體，紐蘭格林-l(3的氨基酸序列顯示于SEQIDNO:1;其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中多肽突變體與SEQIDNO:l中的多肽相比，結(jié)合ErbB4的親和力有所減弱；以及其中第3位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，多肽突變體所含的氨基酸序列同SEQIDNO:l所示，并且其中第3位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，多肽突變體第3位殘基為A。在一些例子中，多肽突變體與ErbB3結(jié)合的親和力與SEQIDNO:l中的多肽相比有所增強(qiáng)或相同。在一些例子中，多肽突變體第3位殘基為A。本發(fā)明還提供了由SEQNO:1中的1-52位氨基酸殘基構(gòu)成的紐蘭格林-1|3的一種多肽突變體，其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中多肽突變體與SEQIDNO:l中的l-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比，結(jié)合ErbB4的親和力有所減弱；以及其中第3位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，多肽突變體第3位殘基為A。在一些例子中，多肽突變體與ErbB3結(jié)合的親和力與SEQIDNO:l中的多肽相比有所增強(qiáng)或相同。在一些例子中，多肽突變體第3位殘基為A。本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，其包含的核酸序列編碼此處所述的多肽突變體，該多肽突變體與SEQIDNO:l中的多肽相比、或與由SEQIDNO:l中的1-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比，其結(jié)合ErbB4的親和力有所減弱。本發(fā)明還提供了一種包含有效量的所述多肽突變體或編碼多肽突變體的多核苷酸和藥學(xué)上可接受的賦型劑的藥物合劑，該多肽突變體與SEQIDNO:l中的多肽或由SEQIDNO:l中的1-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比有減弱的ErbB4結(jié)合親和力。本發(fā)明還提供了一種由該藥物合劑構(gòu)成的試劑盒。在一些例子中，該試劑盒進(jìn)一步包含了使用該藥物合劑通過活化ErbB2/ErbB3來預(yù)防、治療或延遲個(gè)體所患疾病的指導(dǎo)說明。本發(fā)明提供了紐蘭格林-l卩的一種多肽突變體，紐蘭格林-ip的氨基酸序列顯示于SEQIDNO:1;其中該多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中該多肽突變體與SEQIDNO:l中的多肽相比，結(jié)合ErbB4的親和力有所增強(qiáng)；以及其中第16位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;第29位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y;第31位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y;第43位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或第47位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，該多肽突變體所含的氨基酸序列同SEQIDNO:l所示，并且其中第16位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;第29位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y;第31位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y;第43位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或第47位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，該多肽突變體第16位殘基為A;第29位殘基為A;第31位殘基為A;第43位殘基為A;或第47位殘基為A。在一些例子中，該多肽突變體與SEQIDNO:l中的多肽相比，結(jié)合ErbB3的親和力有所減弱或相同。在一些例子中，該多肽突變體第31位殘基為A。在一些例子中，該多肽突變體第43位殘基為A。在一些例子中，該多肽突變體第47位殘基為A。本發(fā)明還提供了由SEQNO:l中的1-52位氨基酸殘基構(gòu)成的紐蘭格林-ip的一種多肽突變體；其中該多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中該多肽突變體與由SEQN0:1中的l-52位氨基酸殘基構(gòu)成多肽相比，結(jié)合ErbB4的親和力有所增強(qiáng);以及其中第16位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;第29位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y;第31位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y;第43位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或第47位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，該多肽突變體第16位殘基為A;第29位殘基為A;第31位殘基為A;第43位殘基為A;和/或第47位殘基為A。在一些例子中，該多肽突變體與SEQIDNO:l中的多肽相比，結(jié)合ErbB3的親和力有所減弱或相同。在一些例子中，該多肽突變體第31位殘基為A。在一些例子中，該多肽突變體第43位殘基為A。在一些例子中，該多肽突變體第47位殘基為A。本發(fā)明還提供了紐蘭格林-ip的一種多肽突變體，紐蘭格林-IP的氨基酸序列顯示于SEQIDNO:1;其中該多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中該多肽突變體與SEQIDNO:l中的多肽相比，結(jié)合ErbB3的親和力有所減弱；但結(jié)合ErbB4的親和力與SEQIDNO:l中的多肽相比差不多；并且其中第33位殘基為A。本發(fā)明還提供了由SEQNO:l中的1-52位氨基酸殘基構(gòu)成的紐蘭格林-lp的一種多肽突變體；其中該多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中該多肽突變體與由SEQNO:l中的l-52位氨基酸殘基構(gòu)成多肽相比，結(jié)合ErbB3的親和力有所減弱；但結(jié)合ErbB4的親和力與由SEQNO:l中的1-52位氨基酸殘基構(gòu)成多肽相比差不多；以及其中第33位殘基為A。本發(fā)明中提到的多肽可用化學(xué)合成或重組的方法來生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成多肽的方法在該領(lǐng)域已是廣為人知。用重組的方法來合成多肽在該領(lǐng)域也是眾所周知并在此進(jìn)一步闡述。產(chǎn)生的多肽應(yīng)該用該領(lǐng)域公知的方法來檢測其結(jié)合受體的親和力以及活化受體的情況。本發(fā)明還提供了一種包含編碼此處所述任一多肽突變體的核酸序列的多核苷酸。與這些序列中任何一個(gè)互補(bǔ)的多核苷酸也包括在本發(fā)明之內(nèi)。多核苷酸可以是單鏈的(編碼鏈或反義鏈)或雙鏈的，并且可以是DNA(基因組、cDNA或合成物)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，這些HnRNA分子含有內(nèi)含子并且與某一DNA分子以一對(duì)一的方式相對(duì)應(yīng)；以及不含內(nèi)含子的mRNA分子。本發(fā)明中的某一多核苷酸可以含有額外的編碼或非編碼序列，但并非必須；某一多核苷酸可以與其他的分子和/或支持介質(zhì)相連，但并非必須。本發(fā)明中的這些多核苷酸可以用化學(xué)合成、重組方法、或PCR獲得。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)意識(shí)到，由于遺傳密碼的簡并性，存在多個(gè)核苷酸序列編碼此處提及的某一個(gè)多肽。由于密碼子使用的不同而引起的多核苷酸差異在本發(fā)明中作為特殊情況考慮。此處述及的多核苷酸可以克隆到載體上(比如表達(dá)載體)并轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞以生產(chǎn)多肽。選擇克隆載體時(shí)應(yīng)根據(jù)采用的宿主細(xì)胞的情況而變，好用的載體一般具有自我復(fù)制能力、含有某一特定的限制性內(nèi)切酶的單一靶點(diǎn)、和/或攜帶某種標(biāo)記基因能用于選擇含有該載體的克隆。適宜的例子包括質(zhì)粒及細(xì)菌病毒，如pUC18、pUC19、Bluescript(如pBSSK+)及其衍生物mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、Co正l、pCRl、RP4、噬菌體DNAs、以及穿梭載體比如pSA3和pAT28。這些以及許多其他的克隆載體可以從諸如BioRad、Strategen和Invitrogen等商家購買。表達(dá)載體通常是含有本發(fā)明中某一多核苷酸的可復(fù)制多核苷酸構(gòu)建物。一個(gè)表達(dá)載體必須能在宿主細(xì)胞中以游離基因或作為染色體DNA的一個(gè)整合部分進(jìn)行復(fù)制。適宜的表達(dá)載體包括(但并不局限于這些)質(zhì)粒、病毒載體包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、粘粒、以及PCT公告號(hào)為WO87/04462中提出的表達(dá)載體。載體一般可以包括(但并不局限于這些)一個(gè)或多個(gè)下列組件一個(gè)信號(hào)序列、一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因、適宜的轉(zhuǎn)錄控制元件(比如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止子)。對(duì)表達(dá)(即翻譯)而言，一個(gè)或多個(gè)翻譯控制元件通常也是需要的，比如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)和終止密碼子。含有目標(biāo)多核苷酸的載體可以采用很多種適宜方法中的任何一種將其引入宿主細(xì)胞，這些方法包括電穿孔、用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-右旋糖苷或其他物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)染、顯微放射槍轟擊、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、以及感染(例如當(dāng)載體是某種感染性材料比如痘病毒)。引入載體或多核苷酸方法的選擇常常取決于宿主細(xì)胞的特性。本發(fā)明還提供了含有此處提及的任何多核苷酸的宿主細(xì)胞。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的例子包括(但并不局限于此)COS、HeLa、和CHO。還可以參見PCT公告號(hào)為WO87/04462的專利。適宜的非哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括原核生物(比如E.coli或B.subtillis)以及酵母(比如S.cerevisae,S.pombe;或K.lactis)。本發(fā)明還提供了由此處提及的任何NRG-1多肽突變體或編碼這些多肽突變體的多核苷酸組成的藥物合劑以及一種在醫(yī)藥上可以接受的賦形劑或載體。此處所說的"醫(yī)藥上可以接受的賦形劑或載體"包括任何材料只要當(dāng)將其與某種活性成分合并時(shí)能保留該活性成分的生物學(xué)活性并且不與受者的免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)。實(shí)例包括，但并不局限于此，任何標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)用載體比如磷酸緩沖鹽溶液，水，乳劑如油/水乳劑，以及多種潤濕劑。優(yōu)選的噴射或注射用稀釋液是磷酸緩沖鹽或生理(0.9%)鹽水。包含這類載體的藥物合劑可以用已知的成熟的傳統(tǒng)方法來合成(參見，如由A.Gennaro編輯的由位于Easton，PA的Mack出版公司于1990年出版的第18版Remington'sPharmaceuticalScience;以及Mack出版公司2000年出版的第20版Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy)。典型的情況是，添加一定量的某一醫(yī)藥上可接受的鹽以便使合劑呈等滲狀態(tài)。這類載體的例子包括鹽水、林格液(Ringer'ssolution)以及葡萄糖液(dextrosesolution)。這些溶液的適宜的pH值為約5至約8，而更適宜的是約7至約7.5。更進(jìn)一步的載體包括緩釋制劑比如含有抗體的半透性固相疏水多聚物基質(zhì)，其基質(zhì)是呈一定形狀的顆粒物，比如膜狀、脂質(zhì)體或微粒形。對(duì)于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員而言，下列情況是顯而易見的，那就是根據(jù)用藥途徑以及多肽和多核苷酸施用濃度的不同某種載體可能更適宜。C.NRG-ip多肽突變體的篩選方法本發(fā)明還提供了NRG-1多肽突變體的篩選方法。例如，由于該配體和受體家族的高度同源性，因此NRG-l|3/ErbB3和NRG-l卩/ErbB4復(fù)合體的溶劑平衡模型可以用EGF/EGFR共結(jié)晶結(jié)構(gòu)作為起點(diǎn)來進(jìn)行構(gòu)建(參見Ogiso,H.etal.,CrystalStructureofthecomplexofhuamanepidermalgrowthfactorandreceptorextracellulardomains.Cell110,775-787(2002)，其內(nèi)容在此加以引用)。然后對(duì)NRG-l(3/ErbB3和NRG-1(3/ErbB4接觸面的原子相互作用進(jìn)行詳細(xì)的分析。MM-PBSA方法被用來計(jì)算ErbB3和ErbB4結(jié)合至NRG-1卩的自由能。此外，選擇結(jié)合位點(diǎn)的殘基進(jìn)行計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描突變來對(duì)闡釋兩個(gè)受體與NRG-ip的親和力。產(chǎn)生的NRG-l(3/ErbB3和NRG-l(3/ErbB4計(jì)算機(jī)模型應(yīng)有助于設(shè)計(jì)NRG-1卩突變體以使其選擇性結(jié)合ErbB4并且親和力有所增強(qiáng)，這樣可以改進(jìn)其治療特性。本發(fā)明提供了一種篩選與ErbB3結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-l(3突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建來建立紐蘭格林-1(3或其片段、ErbB3以及紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法來建立紐蘭格林-l(3或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性方面的數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-l(3或其片段與ErbB3的部分總結(jié)合自由能(AGsub磁w她ype);(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-1(3或其片段的丙氨酸替換突變體與ErbB3的部分總結(jié)合自由能(AGsubtotalalaninesubstitutedvariant乂，其中丙氨酸替換突變體是指紐蘭格林-1(3或其片段中的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；(e)計(jì)算AAGsub脆,=AGsubt。talWildtype—AGSubtotalalaninesubstitutedvariant;以及(f)選擇對(duì)紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物而言其AAG礎(chǔ)t。ta,為正值的丙氨酸替換突變體；這樣就意味著找到了一個(gè)與ErbB3結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-l(3的多肽突變體。本發(fā)明還提供了一種篩選與ErbB3選擇性結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-l卩突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建來建立紐蘭格林-ip或其片段、ErbB3、ErbB4、紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物以及紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法來建立紐蘭格林-l(3或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物以及紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性方面的數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsutotalwildtype);(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-ip或其片段的丙氨酸替換突變體與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsubtotalalaninesubstitutedvariant)，其中丙氨酸替換突變體是指紐蘭格林-1|3或其片段中的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；(e)計(jì)算AAGsub她^AGsub艦wildtypeAGsubtotalalaninesubstitutedvariant;以及(f)選擇對(duì)紐蘭格林-1|3或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物而言其AAG^t。t^為正值，同時(shí)對(duì)紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物而言其AAG^t。w為負(fù)值或接近零的丙氨酸替換突變體；這樣就意味著找到了一個(gè)與ErbB3選擇性結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-1|3的多肽突變體。在一些例子中，選擇的丙氨酸替換突變體對(duì)紐蘭格林-lp或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物而言其AAG^t^為負(fù)值，這種情況意味著找到的紐蘭格林-lp的多肽突變體與ErbB3的結(jié)合親和力增強(qiáng)而與ErbB4的結(jié)合親和力減弱。在一些例子中，選擇的丙氨酸替換突變體對(duì)紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物而言其AAG^t^接近零，這種情況意味著找到的紐蘭格林-ip的多肽突變體與ErbB3的結(jié)合親和力增強(qiáng)而與ErbB4的結(jié)合親和力不變。另一方面，本發(fā)明提供了一種篩選與ErbB4結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-l(3突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建來建立紐蘭格林-l卩或其片段、ErbB4以及紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法來建立紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性方面的數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsubt。ta,w她ype);(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-ip或其片段的丙氨酸替換突變體與ErbB4的部分總結(jié)合自由能(△Gsubtotalalaninesubstitutedvariant)，其中丙氨酸替換突變體是指紐蘭格林-ip或其片段中的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；(e)計(jì)算AAGsubt。ta^AGsubt。ta,wildtypeAGSubtotalalaninesubstitutedvariant^以及(f)選擇對(duì)紐蘭格林-i卩或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物而言其AAGsubt。w為正值的丙氨酸替換突變體；這樣就意味著找到了一個(gè)與ErbB4結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-l卩的多肽突變體。本發(fā)明還提供了一種篩選與ErbB4選擇性結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-l卩突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建來建立紐蘭格林-ip或其片段、ErbB3、ErbB4、紐蘭格林-lf3或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物以及紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法來建立紐蘭格林-ll3或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物以及紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性方面的數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-1(3或其片段與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsub福wM加e);(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-ip或其片段的丙氨酸替換突變體與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsubtotalalaninesubstituted，iant)，其中丙氨酸替換突變體是指紐蘭格林-l卩或其片段中的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；(e)計(jì)算AAGsubt。w-AG^t^wildtypeAGsubtotalalaninesubstitutedvariant;(f)選擇對(duì)紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物而言其AAG^t。w為正值，同時(shí)對(duì)紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物而言其AAG^t。w為負(fù)值或接近零的丙氨酸替換突變體；這樣就意味著找到了一個(gè)與ErbB4選擇性結(jié)合親和力增強(qiáng)的紐蘭格林-l卩的多肽突變體。在一些例子中，選擇的丙氨酸替換突變體對(duì)紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物而言其AAGsubt福為負(fù)值，這種情況意味著找到的紐蘭格林-lp的多肽突變體與ErbB4的結(jié)合親和力增強(qiáng)而與ErbB3的結(jié)合親和力減弱。在一些例子中，選擇的丙氨酸替換突變體對(duì)紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物而言其AAGsubt。tal接近零，這種情況意味著找到的紐蘭格林-1|3的多肽突變體與ErbB4的結(jié)合親和力增強(qiáng)而與ErbB3的結(jié)合親和力不變。本發(fā)明還提供了一種篩選與ErbB4結(jié)合親和力不變但與ErbB3結(jié)合親和力降低的紐蘭格林-l卩突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建來建立紐蘭格林-l卩或其片段、ErbB3、ErbB4、紐蘭格林-1|3或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物以及紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法來建立紐蘭格林-1(3或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物以及紐蘭格林-lp或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性方面的數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-1|3或其片段與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsub磁wildtype);(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-l卩或其片段的丙氨酸替換突變體與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsub編alaninesubstltutedvariant)，其中丙氨酸替換突變體是指紐蘭格林-1(3或其片段中的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；(e)計(jì)算AAG^t。^二AGsubtotalwildtypeAGsubtotalalaninesubstitutedvariant;(f)選擇對(duì)紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4形成的復(fù)合物而言其AAG^t。w接近零，同時(shí)對(duì)紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB3形成的復(fù)合物而言其AAG^t^為負(fù)值的丙氨酸替換突變體；這樣就意味著找到了一個(gè)與ErbB4選擇性結(jié)合親和力不變但與ErbB3結(jié)合親和力降低的紐蘭格林-ip突變體。本發(fā)明還提供了用此處所描述的方法鑒定而得的一種紐蘭格林-l卩的多肽突變體。D.NRG-ip突變體的使用方法本發(fā)明還提供了預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病發(fā)展的方法，包括將由此處所述的某種NRG-ip多肽突變體組成的藥物合劑給予個(gè)體，這些藥物合劑是通過活化ErbB2/ErbB3禾卩/或ErbB2/ErbB4受體來發(fā)揮作用?？梢灶A(yù)防、治療或延遲其發(fā)展的疾病包括發(fā)生于下列器官和系統(tǒng)的疾病骨、耳、眼、眼瞼、頭、頸、心臟、咽喉、下頜、顎骨、上頜、嘴、鼻、鼻咽部、口腔、胰腺、腮腺、腦下垂體、前列腺、視網(wǎng)膜、唾液腺、皮膚、肌肉、骨髓、甲狀腺、扁桃腺、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及造血系統(tǒng)。此處所用的"個(gè)體"一詞是指哺乳動(dòng)物，尤其是指人。哺乳動(dòng)物包括(但并不局限于此)家畜(比如牛、豬、綿羊、山羊)；運(yùn)動(dòng)性動(dòng)物；寵物(比如貓、狗、馬)；靈長類；小鼠和大鼠。在一些例子中，用于預(yù)防、治療或延遲某一疾病發(fā)展的紐蘭格林-1P突變體與ErbB2/ErbB3受體的的親和力有所增強(qiáng)。在一些例子中，紐蘭格林-l(3多肽突變體的組成氨基酸序列顯示于SEQIDNO:1;其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中多肽突變體與SEQIDNO:l中的多肽相比，結(jié)合ErbB3的親和力更高；以及其中第25位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;第35位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或第46位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，紐蘭格林-l卩多肽突變體由SEQIDNO:l中的第1-52位殘基構(gòu)成，其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中多肽突變體與SEQIDNO:l中的1-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比，結(jié)合ErbB3的親和力更高；以及其中第25位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;第35位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;禾口/或第46位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，多肽突變體第25位殘基為A;第35位殘基為A;和/或第46位殘基為A。可以通過優(yōu)先活化ErbB2/ErbB3受體而得以預(yù)防、治療或延遲其發(fā)展的疾病包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病(比如中樞神經(jīng)系統(tǒng)，外周神經(jīng)系統(tǒng))、精神分裂癥、骨髓疾病、膜疾病、神經(jīng)脫髓鞘疾病、錐體束外系統(tǒng)疾病。在一些例子中，神經(jīng)系統(tǒng)疾病是精神分裂癥。在一些例子中，用于預(yù)防、治療或延遲某一疾病發(fā)展的紐蘭格林-1P突變體與ErbB2/ErbB4受體的的親和力有所增強(qiáng)。在一些例子中，紐蘭格林-ip多肽突變體的組成氨基酸序列顯示于SEQIDNO:1;其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中多肽突變體與SEQIDNO:l中的多肽相比，結(jié)合ErbB4的親和力更高；以及其中第16位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;第29位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y;第31位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y;第434立殘基為以下的不同的氨基酸A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或第47位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，紐蘭格林-ip多肽突變體由SEQIDNO:l中的第1-52位殘基構(gòu)成，其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中多肽突變體與SEQIDNO:1中的l-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比，結(jié)合ErbB4的親和力更高；以及其中第16位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;第29位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y;第31位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y;第43位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或第47位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，該多肽突變體第16位殘基為A;第29位殘基為A;第31位殘基為A;或第47位殘基為A。在一些例子中，用于預(yù)防、治療或延遲某一疾病發(fā)展的紐蘭格林-1P突變體與SEQIDNO:l中的多肽相比或SEQIDNO:l中的第1-52位殘基構(gòu)成的多肽相比，其結(jié)合ErbB2/ErbB4受體的的親和力差不多，但結(jié)合ErbB3受體的的親和力有所降低。在一些伊ij子中，多肽突變體的組成氨基酸序列顯示于SEQIDNO:1;其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中多肽突變體與SEQIDNO"中的多肽相比，結(jié)合ErbB3的親和力更弱但結(jié)合ErbB4的親和力差不多；以及其中第33位殘基為A。在一些例子中，用于預(yù)防、治療或延遲某一疾病發(fā)展的紐蘭格林-13突變體與ErbB2/ErbB4受體的的親和力有所降低。在一些例子中，紐蘭格林-ip多肽突變體的組成氨基酸序列顯示于SEQIDNO:1;其中多肽突變4本含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中多肽突變體與SEQIDNO:l中的多肽相比，結(jié)合ErbB4的親和力更弱；以及其中第3位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，紐蘭格林-ip多肽突變體由SEQIDNO:l中的第l-52位殘基構(gòu)成，其中多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l中序列相比不同的氨基酸；其中多肽突變體與SEQIDNO:l中的1-52位氨基酸殘基構(gòu)成的多肽相比，結(jié)合ErbB4的親和力更高；以及其中第3位殘基為以下的不同的氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。在一些例子中，多肽突變體第16位殘基為A?？梢酝ㄟ^優(yōu)先活化ErbB2/ErbB4受體而得以預(yù)防、治療或延遲其發(fā)展的疾病包括(但并不局限于這些)心衰、心肌梗死、擴(kuò)大性心肌癥、以及心肌炎(如，病毒性心肌炎)、心臟毒性。此處所提及的紐蘭格林-1e突變體或編碼紐蘭格林-13多肽突變體的核酸的劑型、劑量與給藥途徑，尤其是以藥物合劑的形式，可以按照本領(lǐng)域己知的方法來決定(參見，Mack出版公司1997年4月出版的AlfonsoR.Gennaro編著的Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy;TherapeuticPeptidesandProteins:Formulation,Processing,andDeliverySystems,Banga1999;Taylor&Francis公司2000年出版的Hovgaard禾卩Frkjr編著的PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins,ElsevierScience1998年出版的Lasic禾口Papahadjopoulos編著的MedicalApplicationsofLiposomes,Hogrefe&Huber1998年出版的Jain編著的TextbookofGeneTherapy,LandesBioscience1999年出版的Seth編著的第15巻Adenoviruses:BasicBiologytoGeneTherapy,HumanaPress1999年出版的Wu-Pong禾口Rojanasakul編著的BiopharmaceuticalDrugDesignandDevelopment,紐約的Springer-Verlag1999年出版的Dole等編著的第28巻TherapeuticAngiogenesis:FromBasicSciencetotheClinic)。此處所提及的紐蘭格林-lP突變體或編碼紐蘭格林-lP多肽突變體的核酸可以做成口服、直腸給藥、局部用藥、吸入、口腔用藥(例如舌下)、注射(如皮下注射、肌肉注射、皮內(nèi)注射、靜脈注射)、透皮給藥或其他任何適宜的用藥途徑給藥。對(duì)于任何給定的病例的最佳給藥途徑將取決于病情的性質(zhì)及嚴(yán)重程度以及所使用的特定的NRG-ip多肽突變體或編碼該多肽突變體的核酸的性質(zhì)。此處所提及的紐蘭格林-lP突變體或編碼多肽突變體的核酸可以單獨(dú)給藥。作為可選項(xiàng)而且更偏向于這樣做，是將紐蘭格林-13突變體或編碼多肽突變體的核酸與某種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑共同給藥。任何適宜的醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑均可用于當(dāng)前的方法(參見，如Mack出版公司1997年4月出版的AlfonsoR.Gennaro編著的Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy)。編碼NRG-1P多肽突變體的核酸可以是裸DNA、復(fù)合DNA、cDNA、質(zhì)粒DNA、RNA或與其他作為基因傳遞系統(tǒng)組分形成混合物的形式使用。在另一種具體情況下，編碼紐蘭格林-lP多肽突變體的核酸包含在某種病毒載體中。任何適宜于基因治療的病毒載體都可使用。例如，腺病毒載體(美國專利號(hào)5,869,305)、猿病毒載體(美國專利號(hào)5,962,274)、條件復(fù)制型人免疫缺陷病毒載體(美國專利號(hào)5,888,767)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、SV40、單純皰疹病毒復(fù)制子載體和痘病毒載體都可以使用。此外，還可以用非病毒載體系統(tǒng)比如脂質(zhì)體來傳遞基因，其中脂質(zhì)可以保護(hù)DNA或其他生物材料在凝結(jié)過程中避免氧化。按照本發(fā)明，此處所提及的紐蘭格林-lP多肽突變體或編碼某一多肽突變體的核酸，可以單獨(dú)或與其它制劑、載體或賦形劑聯(lián)合以任何適宜的給藥途徑而制成，比如，腔內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、皮內(nèi)注射、口服或局部給藥。所用方法可以使用易于注射的劑量配方，比如以單位劑量的形式、安瓿、或多劑量形式，并添加保護(hù)劑。其劑型可以采用諸如懸液、溶液、或與油性或水性載體形成的乳液，并且還可以含有劑型制劑比如懸浮、穩(wěn)定、和/或分散劑。作為可選項(xiàng)，其活性組分可以是粉末形式，在使用前用某種適宜的載體、無菌無熱原水或別的溶劑將其溶解。本發(fā)明中的局部給藥可以采用泡沫、凝膠、面霜、藥膏、透皮片或糨糊等劑型。本發(fā)明可以使用的醫(yī)藥上可以接受的合劑與給藥方法包括(但并不局限于這些)美國專利號(hào)為5，736，154、6,197,801Bl、5,741,511、5,886,039、5,941,868、6,258,374Bl和5,686,102這些專利中所述。用于治療或預(yù)防的治療劑量的大小將隨著病情的嚴(yán)重程度以及給藥途徑而不同。所用劑量以及劑量頻率也將隨年齡、體重、病情與病人對(duì)藥物的反應(yīng)而不同。應(yīng)該指出的是主治醫(yī)師應(yīng)知道由于毒性或副作用而怎樣以及何時(shí)終止、中斷、或調(diào)整治療到一個(gè)較低的劑量。反之，主治醫(yī)師還應(yīng)該知道如果臨床反應(yīng)不夠時(shí)(排除毒性副作用)怎樣以及何時(shí)調(diào)整治療到一個(gè)較高的水平。任何適宜的給藥途徑都可使用。劑型包括片劑、塊劑、印劑、分散劑型、懸浮劑型、溶液、膠囊、膜片等等。參見，《雷明頓制藥學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences)。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，紐蘭格林-13多肽突變體或編碼某一多肽突變體的核酸，可以單獨(dú)或與其它制劑一起與某種藥物載體或賦形劑比如P-環(huán)式糊精和2-羥基-丙基-P-環(huán)式糊精按照傳統(tǒng)的藥物復(fù)合技術(shù)直接混和形成活性制劑。載體可以采用多種形式制備以滿足局部或注射給藥。在制備注射劑型合劑時(shí)，比如靜脈注射或灌注，可以采用相似的制藥介質(zhì)水、甘油、油、緩沖液、糖、保護(hù)劑、脂質(zhì)體以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的其他介質(zhì)等等。這類注射合劑的例子包括(但并不局限于這些)5%(重量/體積，w/V)葡萄糖、生理鹽水或其它溶液。單獨(dú)或與其它制劑一起的紐蘭格林-lP多肽突變體或編碼某一多肽突變體的核酸的施用總劑量可為約lml到約2000ml，以靜脈注射液形式存放于瓶中。稀釋液的體積可以根據(jù)使用總劑量而變。本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明的治療方案優(yōu)化的試劑盒。這類試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)容器，其中含有醫(yī)藥上可接受的形式的有效劑量的單獨(dú)的紐蘭格林-1P多肽突變體或編碼某一多肽突變體的核酸或與其它制劑的混合物。優(yōu)選的藥物劑型是與無菌鹽水、葡萄糖液、或緩沖液、或其它醫(yī)藥上可接受的無菌溶液混合。作為可選項(xiàng)，藥物合劑可以是凍干或干燥品，在這種情況下，試劑盒相應(yīng)的進(jìn)一步含有一個(gè)裝有醫(yī)藥上可接受的無菌溶液，以用來將藥物合劑重新溶解形成溶液而用于注射。醫(yī)藥上可接受的溶液是生理鹽水和葡萄糖溶液。在另一種具體情況下，本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步包含針頭和注射器，優(yōu)選以無菌形式包裝，用于注射藥物合劑；和/或酒精墊。由醫(yī)師或病人注射藥物合劑的說明書也包含其中。E.實(shí)施例下述實(shí)施例僅僅是用來舉例說明的，而不是用來限制本發(fā)明的范圍。例l.選擇性活化某一ErbB受體的NRG-1P突變體的篩選方法1.構(gòu)建蛋白的3D模型從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank)獲得人EGF與受體胞外結(jié)構(gòu)域的x-射線晶體結(jié)構(gòu)(PDB記錄號(hào)為1IVO)以及紐蘭格林-a(NRG-a)表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域的NMR結(jié)構(gòu)(PDB記錄號(hào)為1HAF)。從Swiss_Prot/TrEMBL數(shù)據(jù)庫獲取ErbB3(ERB3HUMAN)、ErbB4(ERB4—HUMAN)、和NRG-1P(NRG1JHUMAN)的氨基酸序列。所有模型都是用InsightII軟件(AccelrysCorporation,SanDiego，CA)的同源模建產(chǎn)生的。紐蘭格林-a的NMR座標(biāo)被用來模建紐蘭格林-l卩(NRG-l(3177-229)的初始結(jié)構(gòu)。靶序列ErbB3和ErbB4與模板序列EGFR之間的配對(duì)序列比對(duì)分別進(jìn)行。半胱氨酸殘基之間的二硫鍵位置根據(jù)靶序列中對(duì)齊的半胱氨酸殘基以及模板序列中相應(yīng)二硫鍵的位置來確定。允許序列中插入缺口以獲得最佳比對(duì)結(jié)果，長度獨(dú)立的缺口罰點(diǎn)為6。ErbB3和ErbB4與EGFR的序列的最后比對(duì)結(jié)果顯示于圖1。結(jié)構(gòu)上相似的區(qū)域是自動(dòng)選取的并用于構(gòu)建模型的框架結(jié)構(gòu)。如果兩個(gè)對(duì)齊的殘基相同，則模板側(cè)鏈的幾何構(gòu)型就原樣移植到靶序列。不然，則用靶序列中的相應(yīng)殘基通過CVCp鍵比對(duì)來置換模板序列中的相應(yīng)側(cè)鏈。缺口區(qū)是通過對(duì)蛋白數(shù)據(jù)庫篩選以及內(nèi)部數(shù)據(jù)庫的搜尋適宜片段而產(chǎn)生的。最終的環(huán)形構(gòu)象是從具有最低的均方根(RMS)值(耙序列與適宜片段之間在幾何結(jié)構(gòu)上是相兼容的)的前10個(gè)結(jié)構(gòu)中選擇一個(gè)。用Sybyl中的Bi(3polymer模塊將某些缺失的原子添加到每一個(gè)模型中的不完整側(cè)鏈以保證氫和原子電荷的恰當(dāng)分配。隨后用PROCHECK和Profiles-3D對(duì)這一初始模型進(jìn)行評(píng)價(jià)以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牧Ⅲw-化學(xué)性質(zhì)以及蛋白結(jié)構(gòu)。通過Profiles-3D來評(píng)價(jià)模型時(shí)，序列中每一個(gè)殘基都會(huì)測定出一個(gè)自相容值(S)。ErbB3、ErbB4和NRG-1P的初始模型各自構(gòu)建好以后，可以通過與EGF/EGFR復(fù)合物的疊加來構(gòu)建NRG-lP/ErbB3和NRG-1ErbB4復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。所獲得的結(jié)構(gòu)可以用Sybyl軟件包中的琥珀力場的能量最小化來進(jìn)行優(yōu)化。在精細(xì)化過程的初始階段先將所有模型殘基的骨架碳原子固定以防止骨架發(fā)生劇烈變形。在隨后的循環(huán)中用于模型的約束數(shù)值逐步減小。使用下述參數(shù)來達(dá)到最小化Kollman-聯(lián)合-原子力場以及聯(lián)合原子電荷、距離依賴的電介常數(shù)為4.0R、未結(jié)合計(jì)算的截取值為9.5A、耦合梯度最小化直至能量均方根(RMS)梯度小于0.05kcal/morA。精細(xì)化過的結(jié)構(gòu)然后進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。2.通過對(duì)NRG-1P與相應(yīng)受體形成的復(fù)合物用分子動(dòng)力學(xué)模擬來估計(jì)配體結(jié)合效率幾種分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬方法比如AMBER7.0模擬軟件包和Parm99力場被用于蛋白復(fù)合物和突變體結(jié)構(gòu)的獨(dú)立模擬。從與任何蛋白原子相距至少10A處用TIP3P水分子箱體進(jìn)行延伸來對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行溶劑化。NRG-1ErbB3結(jié)構(gòu)用100X96X83A的7976TIP3P水分子箱體進(jìn)行溶劑化，而NRG-1P/ErbB4的結(jié)構(gòu)用104X102X87A的8075TIP3P水分子箱體進(jìn)行溶劑化。添加一定數(shù)量的帶相反電荷的離子來中和該系統(tǒng)。Ewald顆粒網(wǎng)孔法(PME)被用來計(jì)算長距離靜電相互作用。所有的MD運(yùn)行都是用相同的步驟。首先，用最速下降法對(duì)溶劑復(fù)合物進(jìn)行200步最小化，接著通過耦合梯度來去除范德瓦爾斯(vanderWaals)接觸。然后，對(duì)完整的蛋白-配體-水復(fù)合物進(jìn)行500步再次最小化。松弛結(jié)構(gòu)隨后進(jìn)行MD模擬。每一個(gè)系統(tǒng)在15皮秒內(nèi)、中間有3次間隔從0K逐漸加熱至300K，然后在300K平衡25皮秒，接下來進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，這樣NRG-1P/ErbB3的總的模擬時(shí)間為1100皮秒，而NRG-lP/ErbB4的總的模擬時(shí)間為900皮秒。未結(jié)合的截取值設(shè)定為8.0A而未結(jié)合配對(duì)每25步就進(jìn)行更新。SHAKE方法被用來對(duì)所有含有氫原子的共價(jià)鍵進(jìn)行約束。通過應(yīng)用Berendsen算法將每一次模擬耦合至一個(gè)大氣壓下的300K的熱浴。溫度和壓力耦合參數(shù)分別設(shè)置為0.2皮秒和0.5皮秒。分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算的整合時(shí)間步驟為2飛秒。在能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)，在所有方向應(yīng)用周期邊界條件。MD模擬是在上海藥物研究所(ShanghaiInstituteofMateriaMedica)的SGIOrigin3800計(jì)算機(jī)上運(yùn)行的。模擬分析主要關(guān)注于產(chǎn)生階段。骨架均方根偏離(RMSDs)的計(jì)算是以初始結(jié)構(gòu)作為參照以1皮秒的間隔軌道而進(jìn)行的。每一個(gè)殘基的均方根波動(dòng)都同樣地的計(jì)算。受體與配體之間的結(jié)合相互作用是在完整模型基礎(chǔ)上用LIGPLOT程序來進(jìn)行分析。3.用MM-PBSA方法來計(jì)算NRG-1P與相應(yīng)受體形成復(fù)合物的自由能來自動(dòng)力學(xué)軌道的坐標(biāo)每4皮秒應(yīng)用一次(400皮秒處理100張快照)，用AMBER7.0程序?qū)ζ渲忻恳粋€(gè)進(jìn)行MM-PBSA計(jì)算。對(duì)模擬過程中采集的每一張快照，用方程(1)計(jì)算其配體-蛋白結(jié)合自由會(huì)g(AGbinding):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>其中Gc。mplex、AGpr。tein和AG,igand分別是復(fù)合物、蛋白和配體的自由能。方程式(1)中每一個(gè)自由能項(xiàng)是用其對(duì)應(yīng)物(蛋白、配體及其復(fù)合物)的氣相(Egas)的絕對(duì)自由能、溶劑化自由能(AGs。lvati。n)和熵(TAS)用方程式(2)計(jì)算而來<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>Egas是內(nèi)部張力能(Eint)、范德瓦爾斯能(Evdw)和靜電能(Eeleetrostatic)的總和(方程式3)。Eint是與共價(jià)鍵振動(dòng)和共價(jià)鍵角度、以及單鍵扭轉(zhuǎn)角旋轉(zhuǎn)相關(guān)的能量(方程式4)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>溶劑化自由能，AGs。lvati。n，大致是用連續(xù)統(tǒng)一體表征溶劑時(shí)的極化(GPB)和非極化(G加叩ob)能的和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>溶劑化自由能中的極化能(GPB)部分是用DELPHI程序來計(jì)算的，計(jì)算時(shí)用PARSE原子半徑以及標(biāo)準(zhǔn)的Parm94規(guī)定的氨基酸所帶的電荷。使用的格柵尺寸為0.5A。內(nèi)部溶質(zhì)及外部水電介質(zhì)常數(shù)分別設(shè)置為1和80。每一個(gè)GpB計(jì)算時(shí)重復(fù)IOOO次以獲得更好的數(shù)據(jù)集中效果。非極化能(G,p。&)部分是用一個(gè)簡單方程來進(jìn)行估計(jì)的Gn。np。lar=YXSASA+bkcal/mol。SASA是溶劑可接近表面積，可以用MSMS算法進(jìn)行估計(jì)，估計(jì)時(shí)用1.4A探針半徑。表面張力均衡性常數(shù)Y以及點(diǎn)狀溶質(zhì)的非極化溶劑自由能b分別設(shè)置為0.00542kcalmol—1A和0.092kcalmol隱1。對(duì)于大系統(tǒng)而言，熵的計(jì)算是一個(gè)極度耗時(shí)的過程。在本發(fā)明中，僅僅估計(jì)AGs。^i。n(而不涉及-TAS)以評(píng)估突變對(duì)結(jié)合自由能的影響。4.計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描突變的分析計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描法被用來估計(jì)NRG-1e不同的突變體分別與ErbB3和ErbB4的相對(duì)結(jié)合親和力。有兩種方法用來計(jì)算不同的多肽突變體的相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度。在第一種方法中，復(fù)合體、蛋白以及多肽的結(jié)構(gòu)是從復(fù)合體軌跡的同一張快照中提取的。丙氨酸突變體結(jié)構(gòu)是通過改變野生型的軌跡的坐標(biāo)而產(chǎn)生的。這一方法包括剔除原子并將突變殘基在Cy處截短而用氫原子代替。因此突變殘基的拓?fù)湮臋n中所有參數(shù)均用丙氨酸殘基的參數(shù)替換。400皮秒內(nèi)采集100張快照(每4皮秒1張快照)用于能量計(jì)算。相對(duì)結(jié)合自由能是野生型和丙氨酸突變型的自由能之差。在第二種計(jì)算相對(duì)結(jié)合自由能的方法中，我們是對(duì)NRG-13丙氨酸突變多肽分別與ErbB3和ErbB4復(fù)合體進(jìn)行幾次獨(dú)立的動(dòng)力學(xué)模擬。然后是用400皮秒內(nèi)采集的100張快照(每4皮秒1張快照)來計(jì)算能量值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果l.模建結(jié)果及其評(píng)價(jià)ErbB3和ErbB4的3D模型是通過同源模建而生成的，同源模建時(shí)以人表皮生長因子(EGF)與EGF受體(EGFR)胞外段形成的復(fù)合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)。用FASTA和BLAST對(duì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索得到幾個(gè)與ErbB3和ErbB4同源的結(jié)構(gòu)。在EGFR家族內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)未結(jié)合配體的ErbB3(PDB記錄號(hào)為1M6B)、失活的EGFR與EGF形成的復(fù)合物(PDB記錄號(hào)為1NQ1)、結(jié)合有HerceptinFab的ErbB2(PDB記錄號(hào)為1N8Z)以及EGF/EGFR(PDB記錄號(hào)為1IV0)在同源蛋白中與ErbB3和ErbB4的序列一致性更高。ErbB2是EGFR家族中一個(gè)不同尋常的受體，至今未發(fā)現(xiàn)其高親和力配體。未結(jié)合配體的ErbB3與NRG-l卩/ErbB3復(fù)合物中的受體具有完全相同的序列。為了專注于配體/受體相互作用，故選擇EGF/EGFR復(fù)合物的結(jié)構(gòu)作為結(jié)構(gòu)模建的模板?；贓GF受體家族成員的內(nèi)部序列保守性與一致性，其胞外段可以分為四個(gè)結(jié)構(gòu)域(I至IV)。其中結(jié)構(gòu)域n與iv富含半胱氨酸，分別含有24個(gè)和21個(gè)半胱氨酸。在EGFR晶體結(jié)構(gòu)中，結(jié)構(gòu)域IV的大部分(513-619殘基)在結(jié)構(gòu)上呈無序狀。因此，我們?cè)谕茨＝〞r(shí)將結(jié)構(gòu)域IV的這一區(qū)域排除在外。ErbB3(8-511殘基)和ErbB4(25-533殘基)的序列與EGFR(3-512)分別有44%和48%的一致性。而且，另外40%的殘基都是保守性替換，這樣ErbB3和ErbB4與EGFR的總體序列相似性都約為80%，如圖1所示。即使是同一個(gè)蛋白的不同區(qū)域間其模型的精確性也會(huì)有顯著的不同通常是高保守性區(qū)域的模建結(jié)果比可變的環(huán)狀區(qū)或表面殘基的模建結(jié)果更可靠。從ErbB3和ErbB4推斷出總數(shù)分別為7個(gè)和4個(gè)結(jié)構(gòu)保守區(qū)(SCRs)，這些區(qū)域構(gòu)成了整體序列的主要片段(圖1)。序列余下部分稱為結(jié)構(gòu)可變區(qū)(SVRs)，其坐標(biāo)是通過用上面所講述的方法對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索而產(chǎn)生。圖2顯示的是與EGFR受體的X-射線晶體結(jié)構(gòu)疊加的兩個(gè)精制模型的立體圖示。顯然的是模板蛋白的整體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)依然保持，而在可變區(qū)存在某些顯著的局部構(gòu)象改變。精制模型與其模板的"骨架的均方根偏離(RMSDs)是較小的，對(duì)ErbB3而言為0.55A，對(duì)ErbB4而言為0.39A,這表明其結(jié)構(gòu)上的高度相似性，正如其序列的高度同源性所預(yù)期。這個(gè)受體家族的幾個(gè)關(guān)鍵殘基，比如EGFG中的Leu69、Leu98、Val350、Asp355和Phe357是與EGF中的殘基有疏水相互作用，這些殘基在ErbB3和ErbB4中也是保守的。在EGFR結(jié)構(gòu)域I的第39、63、85、和122位以及結(jié)構(gòu)域m的第343、379、404和435位有一堆甘氨酸殘基。這些殘基在ErbB3和ErbB4模型的相應(yīng)構(gòu)象中也是保守性的保留下來了。如同EGFR，ErbB3和ErbB4的I和III結(jié)構(gòu)域都是由6個(gè)P-螺旋轉(zhuǎn)折組成，在每一個(gè)末端由一個(gè)螺旋和一個(gè)二硫鍵封帽。在ErbB3和ErbB4的I和III結(jié)構(gòu)域中的第4個(gè)和第5個(gè)P-螺旋轉(zhuǎn)折之間還插入有保守的色氨酸(在ErbB3中是Trp176、Trp492;在ErbB4中是Trpl98、Trp513)。這些受體的結(jié)構(gòu)域II與EGFR的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域有一個(gè)相似的折疊，是幾個(gè)由相似的二硫鍵連接的小模塊構(gòu)成。然后用PROCHEK中的Ramachandran作圖結(jié)構(gòu)確認(rèn)測試對(duì)這些模型進(jìn)行評(píng)估。Ramachandran作圖分析某一蛋白的骨架的phi(O)、psi(V|/)扭轉(zhuǎn)角并計(jì)算"優(yōu)選"、"允許"、"可以允許"、"不接受"區(qū)的百分比作為該蛋白結(jié)構(gòu)的質(zhì)量評(píng)估。ErbB3和ErbB4模型相應(yīng)數(shù)值概括于下面的表1。ErbB3和ErbB4模型的優(yōu)選區(qū)和允許區(qū)的殘基總計(jì)分別為96.2%和97.5%。除了對(duì)模型進(jìn)行立體化學(xué)評(píng)估外，我們還用Profiles-3D分析來檢測側(cè)鏈折疊的質(zhì)量從而進(jìn)一步對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。ErbB3和ErbB4的總體質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為230.51/257.48和216/256.56。其中分母是指根據(jù)已知結(jié)構(gòu)對(duì)這一長度的某一蛋白的預(yù)期分?jǐn)?shù)。為了比較，分?jǐn)?shù)為115.87/257.48和115.45/256.56或更低，則表明其結(jié)構(gòu)是幾乎肯定不正確的。成功確認(rèn)后，ErbB3和ErbB4結(jié)構(gòu)的質(zhì)量表明可以進(jìn)行下一步研究。表1.對(duì)ErbB3和ErbB4的3D模型用PROCHEK程序進(jìn)行Ramachandran作圖計(jì)算結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>NRG-1|3(177_229)的同源模型是從NRG-a的結(jié)構(gòu)(PDB記錄號(hào)為1HAF)進(jìn)行同源模建而得，兩者總體序列的一致性為80%。為方便起見，我們選擇對(duì)這一NRG-(x結(jié)構(gòu)域的殘基依次編號(hào)為1-63。在NRG-a的溶液結(jié)構(gòu)中，其C-末端殘基51-63呈無序和柔性狀態(tài)。更有序的區(qū)域(1-50殘基)被認(rèn)為是其結(jié)合細(xì)胞受體所需的最小亞單位。因此，按照方法中所描述，構(gòu)建了一個(gè)由1-52位殘基構(gòu)成的截短的NRG-ip模型。該模型包含一個(gè)N-末端亞結(jié)構(gòu)域，含有一個(gè)居于中心的三鏈p片層、一個(gè)螺旋區(qū)、以及位于c-末端亞結(jié)構(gòu)域的一個(gè)短的p片層。NRG-ip由三個(gè)二硫鍵來穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)Cys6-Cys20、Cysl4-Cys34和Cys36-Cys45。2.NRG-ip與受體結(jié)合的模建NRG-l(3/ErbB3和NRG-l(3/ErbB4復(fù)合物的最終的3D模型顯示于圖3。在每一個(gè)復(fù)合物中，受體的結(jié)構(gòu)域I、II和III排列成C形，而NRG-1卩被包容于結(jié)構(gòu)域I和III之間，其方式類似于EGF與EGFR的結(jié)合(圖3)。這與以前的生化結(jié)果是一致的，以前的生化結(jié)果認(rèn)為ErbB3的結(jié)構(gòu)域I和III參與NRG-1卩的結(jié)合。結(jié)合親和力研究表明ErbB3和ErbB4受體上的結(jié)合決定基團(tuán)是非常相似的，盡管兩者在整體序列上有較大差異。突變研究也顯示對(duì)于配體-受體結(jié)合而言，NRG-ip的N-和C-末端都很重要。在折疊好的蛋白中，這兩個(gè)區(qū)域在距離上相距甚遠(yuǎn)，這也支持在配體-受體相互作用時(shí)有多個(gè)區(qū)域起作用。那些介于兩個(gè)區(qū)域之間的殘基，尤其是那些在NRG-ip和EGF之間保守的殘基，可能通過維持兩個(gè)區(qū)域之間的適當(dāng)距離以及方向而純粹起結(jié)構(gòu)性作用。未結(jié)合配體的ErbB3的X射線結(jié)構(gòu)顯示當(dāng)結(jié)構(gòu)域II和IV相互影響時(shí)，結(jié)構(gòu)域I和III之間的配體結(jié)合位點(diǎn)的尺寸是配體尺寸的2倍。結(jié)構(gòu)域II和IV的接觸看來是限制了結(jié)構(gòu)域I和III結(jié)合受體的相對(duì)方向。因此，某一配體僅僅與結(jié)構(gòu)域i(或結(jié)構(gòu)域in)接觸的話將能結(jié)合受體但不能誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域重排，而結(jié)構(gòu)域重排對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)而言看來是必需的。基于這些結(jié)果，我們可以推斷對(duì)于信號(hào)傳導(dǎo)來說至少需要兩個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)。比較NRG-1卩和EGF的結(jié)構(gòu)顯示出高度的結(jié)構(gòu)相似性(圖4)。排除N-末端區(qū)(Serl-Lys5)、無序的Q-環(huán)(Lys24-Ser30)禾卩C-末端區(qū)(Met50-Ser52)后，NRG-1(3的Ca原子和EGF的Ca原子能很好地對(duì)齊，其RMSD為約1.3A。相對(duì)于EGF的序列，NRG-1卩有一個(gè)三殘基的插入。然而，用EGF的21-30殘基替換NRG-ip的21-33殘基對(duì)紐蘭格林受體結(jié)合或其刺激受體磷酸化的能力沒有影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示NRG-1(3中的三殘基(28-30殘基)插入對(duì)其功能的重要性是極小的，盡管在那一區(qū)域的結(jié)構(gòu)上有顯著的差異。因此，NRG-ip中突出環(huán)的方向不會(huì)影響NRG-1(3與受體結(jié)合的模建。3.分子動(dòng)力學(xué)模擬受體-配體復(fù)合物的行為是通過分子動(dòng)力學(xué)模擬來進(jìn)行研究的，以解釋蛋白柔性和構(gòu)象改變。NRG-l(3/ErbB3和NRG-l|3/ErbB4的起始模型分別進(jìn)行1.1納秒和0.9納秒的MD模擬。Ca原子從其起始位置(1=0皮秒)的均方根偏離(RMSDs)被用來測量其穩(wěn)定性并獲得其可能的結(jié)構(gòu)起伏方面的一些信息。NRG-l卩/ErbB3和NRG-l卩/ErbB4復(fù)合物Ca原子的RMSDs的時(shí)間進(jìn)程顯示于圖5。從圖中可以看出，在第1個(gè)100皮秒內(nèi)，所有殘基的RMSDs均有一個(gè)急速上升，然后趨于平坦。然而，這些RMSD曲線的幅度在數(shù)據(jù)采集期間并未繼續(xù)增加，這說明NRG-l|3/ErbB3和NRG-l卩/ErbB4的結(jié)構(gòu)在這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。在NRG-l卩/ErbB3和NRG-l(3/ErbB4復(fù)合物的整個(gè)模擬過程中，平均RMSDs小于3.0A。尤其是，ErbB4與配體NRG-ip的模擬軌跡表現(xiàn)出很好的平衡，在最后的400皮秒內(nèi)其平均RMSD為2.6A。NRG-1(3結(jié)合ErbB3的結(jié)構(gòu)在最后400皮秒內(nèi)地模擬過程中顯示出較高的RMSD，其平均值為3.7A。這提示NRG-ip結(jié)合結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性。這一趨勢在殘基RMS起伏分析中也是顯而易見的。ErbB3的殘基在NRG-1(3結(jié)合結(jié)構(gòu)起伏中與其平均位置的起伏要大于ErbB4復(fù)合物中殘基。將所有軌跡的平均結(jié)構(gòu)與其相應(yīng)的起始結(jié)構(gòu)疊加就可以顯示出發(fā)生較大構(gòu)象改變的區(qū)域。NRG-ip/ErbB3結(jié)構(gòu)中表現(xiàn)出最大偏離的殘基(殘基243-256)在NRG-l(3/ErbB4復(fù)合物中同樣存在(殘基265-278)，但偏離程度更大。這些殘基是(3-發(fā)夾環(huán)的一部分，在ErbB3的X射線結(jié)構(gòu)中這一部分從結(jié)構(gòu)域II突出有約20A。這個(gè)J3-發(fā)夾環(huán)在EGFR家族中是高度保守的，并且不僅在結(jié)構(gòu)域II和IV之間的分子內(nèi)接觸中發(fā)揮明顯作用，而且在受體-受體相互作用中也發(fā)揮明顯的作用。我們的1:1截短模型中缺失了結(jié)構(gòu)域II和IV之間的相互作用以及受體-受體接觸可能導(dǎo)致這一區(qū)域的較高的目808。但是總體分析顯示模建的結(jié)構(gòu)在模擬過程中保持了穩(wěn)定而沒有顯著的結(jié)構(gòu)改變。4.受體-配體相互作用配體-受體相互作用在每一個(gè)受體上都是由3個(gè)位點(diǎn)組成的，如同EGF/EGFR之間的相互作用的3個(gè)位點(diǎn)，即位于受體結(jié)構(gòu)域I中的位點(diǎn)1以及結(jié)構(gòu)域III中的位點(diǎn)2和3(圖3)。NRG-1卩的25-35殘基以及Leu3與位點(diǎn)1相互作用。NRG-ip的10-19殘基以及Arg44與位點(diǎn)2相互作用。Tyr48附近的C-末端區(qū)與位點(diǎn)3相互作用。配體的這些殘基形成多種靜電、疏水、以及氫鍵與受體相互作用。從配體與受體之間的氫鍵軌跡分析發(fā)現(xiàn)，NRG-ip/ErbB3和NRG-ip/ErbB4的側(cè)鏈殘基之間的氫鍵介導(dǎo)了少數(shù)關(guān)鍵性相互作用。這些氫鍵及其距離列于表2。從表2可以看出，關(guān)鍵性的相互作用包含NRG-1(3的Arg44殘基和Tyr48殘基(在EGF是Arg41和Arg45)與受體的作用是保留下來的。NRG-ip的Arg44側(cè)鏈分別與ErbB3的Asp352側(cè)鏈和ErbB4的Asp376側(cè)鏈形成氫鍵。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)也支持這一結(jié)果，即用丙氨酸替換Arg44后，NRG-1P與ErbB3和ErbB4的結(jié)合力顯著降低。表2.配體與受體殘基側(cè)鏈之間的氫鍵氫鍵配對(duì)NRG-1(3ErbB3殘基組別殘基組別距離(A)Asn47ND2Tyr405OH2.93Tyr48OHAsn379ND23.12Tyr48OHAsn3790D13.10Arg44NH2Asp352OD22.61Arg44NH1Asp3520D12.67Asn47ND2Asp3430D12.90Arg31NH2Glul31OE22.75Arg31NH1Glul310E12.92Asn38ND2Asn250D13,25NRG-ipErbB4殘基組別殘基組別距離(A)Glu390E2Lys438NZ2,87Tyr48OHAsn4030D12.73Arg44NH2Asp3760D13.04Arg44NH1Asp3760D13.12Ser27OGAspl500D13.59Asn28ND2Tyrl48OH3,16Lys35NZSer40OG2,82Asp43OD2Lys35NZ2.81除了氫鍵之外，NRG-lj3與ErbB3和ErbB4的位點(diǎn)1、2禾口3的接觸面之間還存在廣泛的疏水相互作用。在NRG-l卩/ErbB3復(fù)合物中，ErbB3的位點(diǎn)1中的Val147、Leu48、Met72以及Leul02側(cè)鏈與NRG-1(3中的Leu3、Val23和Leu33發(fā)生疏水相互作用(圖6A)。ErbB3的位點(diǎn)2中的Trp354側(cè)鏈與NRG-1卩中的Phel3和Tyr32發(fā)生疏水相互作用(圖6B)。此夕卜，Arg44(NRG-l(3)的長鏈脂肪部分還與Trp354(ErbB3)側(cè)鏈有范德瓦爾斯作用。ErbB3的位點(diǎn)3中的Tyr405、Phe409和Ile413側(cè)鏈與NRG-ip的Tyr48附近的殘基形成疏水作用網(wǎng)絡(luò)(圖6C)。在NRG-l|3/ErbB4復(fù)合物中也存在相似的疏水相互作用。作為這些相互作用的結(jié)果，在NRG-1(3和ErbB4的接觸面形成了3個(gè)疏水相互作用網(wǎng)絡(luò)。NRG-1卩的Leu3、Val23和Leu33殘基的側(cè)鏈與ErbB4的位點(diǎn)1中的Leu36、Leu91和Leul21發(fā)生范德瓦爾斯作用(圖7A)。NRG-1卩的Phel3、Val15以及Tyr48附近的殘基的側(cè)鏈分別與ErbB4的位點(diǎn)2和位點(diǎn)3也有相似的相互作用(圖7B和7C)。從精制模型中推測的相互作用與存在ErbB3或ErbB4的情況下NRG-lf3突變研究結(jié)果是相符的。上述的NRG-lp與受體的結(jié)合分析為我們提供了關(guān)于ErbB3和ErBbB4與NRG-1(3相互作用的機(jī)制方面的大量信息。這反過來又有助于我們通過計(jì)算機(jī)突變方法對(duì)NRG-ip結(jié)合受體及其穩(wěn)定性的相互作用組分的理解以及進(jìn)一步優(yōu)化。5.用MM-PBSA方法對(duì)NRG-lp進(jìn)行計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描突變?yōu)榱藴y定相互作用界面處每一個(gè)殘基對(duì)配體-受體結(jié)合的貢獻(xiàn)大小并鑒定出配體中那些通過突變而有可能增強(qiáng)其結(jié)合親和力的殘基，對(duì)NRG-ip進(jìn)行計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描突變，并用MM-PBSA方法對(duì)突變配體結(jié)合受體的結(jié)合自由能進(jìn)行計(jì)算。為了減少計(jì)算時(shí)間，本研究中未計(jì)算結(jié)合自由能中的熵的貢獻(xiàn)(TAS)。當(dāng)計(jì)算野生型和突變型的結(jié)合自由能的差異時(shí)，熵的貢獻(xiàn)被認(rèn)為可以忽略不計(jì)。這一假定看來是合理的，如同Massova和Kollman計(jì)算來自人p53及其突變體的一個(gè)12-殘基多肽的TAS所證明的情況一樣。因此，僅僅用AGsubt。ta,(而不涉及-TAS)作為估計(jì)AGtoding的標(biāo)準(zhǔn)。表3列出了NRG-1卩及其突變體與ErbB3和ErbB4的所有能量參數(shù)以及部分總結(jié)合自由能。從表3可以看出，分子間范德瓦爾斯相互作用和非極性溶劑化提供了結(jié)合的驅(qū)動(dòng)力。兩種復(fù)合物形成時(shí)導(dǎo)致強(qiáng)烈的有利的靜電相互作用(Eek)，由于溶劑化自由能(GpB)的極性部分的不利貢獻(xiàn)而產(chǎn)生相反的效果。在幾次另外的研究中也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果。NRG-ip/ErbB3和NRG-l(3/ErbB4的總的靜電貢獻(xiàn)(Eelc+GPB)分別為110.2kcalmol"和112.5kcalmol",因此不利于復(fù)合物的形成，也與上面引述的相關(guān)研究相符。表3.用MM-PBSA對(duì)NRG-ip與ErbB受體的自由能計(jì)算結(jié)果aNRG-lp/ErbB3ErbB3NRG-lpDeltab貢獻(xiàn)平均值°標(biāo)準(zhǔn)差d平均值e標(biāo)準(zhǔn)差d平均值°標(biāo)準(zhǔn)差d平均值e標(biāo)準(zhǔn)差d標(biāo)準(zhǔn)差dEelc-16753.91112.6414940.46102,75-1361.1522.58-452.3025.80Evdw-2006.9432.49-1739.6031.19-123.3310.46-144.027.29Eint10831.8063.579798.0560.271033.7520.770.000.00Egas-7929.04133.98-6882.00123.65-450.7325.50-596.3125.25Gnonpolar143.011.19132.171.0119,130.18-8,280.44GpB-7440,22101.09-6863,6188.32-1139.1218.86562.5225.27Gsol-7297.21100.53-6731.4487,93-1120.0018,84554.2325.12Gsubt。tai-15226.2566.86-13613.4565.36-1570.7218.19-42.087.21-TASNDNDNDNDNDNDNDNDNRG-l卩/ErbB4ErbB4NRG-1(3Deltab貢獻(xiàn)平均值°標(biāo)準(zhǔn)差d平均值e標(biāo)準(zhǔn)差d平均值e標(biāo)準(zhǔn)差d平均值e標(biāo)準(zhǔn)差d標(biāo)準(zhǔn)差dEelc-16888.0594.37-15171.7466.74-1343.0433.13-373.2727.41Evdw-2068.1931.77-1815.7629.10-119.7410.70-132.696.88E,nt10794.9261.489749,4656.821045,4619.440.000.00Egas-8161.32117.81-7238.04卯.27-417.3243.40-505.9726.96Gnonpolar138.411.45126.651.2419.440.41-7.680.52GPB-7327.2294.47-6658.6767.14-1153.3336.53485.7725.23Gsol-7188.8293.77-6532.0266,67-1134.8936.22478,0925.09Gsubt。tal68.76-13770.0663,84-1552.2020.79-27.8810.09-TASNDNDNDNDNDNDNDNDa所有數(shù)值的單位為kcalmo1—1b貢獻(xiàn)(復(fù)合物)-貢獻(xiàn)(受體)-貢獻(xiàn)(配體)e400張快照的平均值d平均值的標(biāo)準(zhǔn)差基于對(duì)配體-受體相互作用進(jìn)行的分子動(dòng)力學(xué)模擬，我們鑒定出了NRG-1(3中負(fù)責(zé)與受體殘基結(jié)合的關(guān)鍵殘基。表4列出了NRG-1(3總共52個(gè)殘基中參與結(jié)合ErbB3和ErbB4的20個(gè)殘基的計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描突變分析的結(jié)果。AAG^t。w(AGwildtype-AGmutan》為正值或負(fù)值分別提示有利或不利的替換。圖8是這些數(shù)據(jù)的圖形化顯示。圖8中的結(jié)果表明NRG-1(3的幾個(gè)丙氨酸突變體顯著地降低了配體與ErbB3和ErbB4相互作用的能量，尤其是在第44、48和50位的突變。這可以從結(jié)構(gòu)上來進(jìn)行解釋。殘基Arg44和Tyr48與受體的極性殘基形成氫鍵(見圖6和7)，這可以通過結(jié)合自由能(AAE^項(xiàng)，見補(bǔ)充材料表1和表2)的靜電相互作用部分的貢獻(xiàn)反映出來。Arg44Ala禾BTyr48Ala突變消除了配體和受體之間的重要?dú)滏I。Tyr48Ala和Met50Ala突變弓1起配體和受體之間的有利的范德瓦爾斯相互作用的明顯丟失(AAEvdw項(xiàng)，見補(bǔ)充材料表1和表2)。表4.NRG-1(3與ErbB3和ErbB4復(fù)合物進(jìn)行計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描突變的結(jié)果(Z/\Gsubtotal=AGwiidtype_^Gmutant)NRG-ipNRG-l|3/ErbB3RG-l|3/ErbB4中的位置AAGsubt。ta,(kcal/mol)AAGsubt她,(kcal/mol)His2AlaLeu3AlaPhel3AlaVall5AlaAsnl6AlaVal23AlaAsp25AlaArg31AlaTyr32Ala-0.10±0.54-1.14±1.24-1.06±0.76-0.78±0.86-0.78土0.85-0.50±1.602.26土0.66-5.90±1.140.32+0.570.13±1.90-0.87土1.19-0,25±0.卯-1.19±0.631.90±2.94-1.53±1.00-2.20±3.71-1.83土4.21-0.34+0.01Leu33Ala-3,31±0.38-0.32±1.27Lys35Ala1.13±0.93-0.00±2.09Asn38Ala0,59±0.761.31±0.89Glu39Ala0.75±2,09-0.51±2.67Phe楊la1.59±2.121.08±3.50Arg44Ala-5.43±4.79-5.30土2.77Gln46Ala3.57±2.69-1.01±1.62Asn47Ala-0.07±2.222.03土1.72Tyr48Ala-2.99±2.45-3.05±2.40Met50Ala-3.45±0.54-1.92±1.45Ser52Ala-0,21±1.770.49±2.25為了獲得每一個(gè)丙氨酸突變效果的進(jìn)一步信息，丙氨酸突變后分子間范德瓦爾斯和靜電相互作用的改變加上溶劑化自由能顯示于圖8中。在大多數(shù)情況下，分子間靜電能量的變化與溶劑化自由能的變化是反向關(guān)聯(lián)的。因此，重要的是根據(jù)其貢獻(xiàn)的共同靜電原點(diǎn)將AAE^和AAGpB合并在一起。從圖8中可以看出，與其他的自由能組分的改變相比，AAEn—。M是非常小的。AAEvdw絕大多數(shù)情況下都是負(fù)值，這提示丙氨酸突變降低了結(jié)合界面的范德瓦爾斯作用。另一方面，AAE^和AAGpB合并項(xiàng)在大多數(shù)丙氨酸突變是有利的。一個(gè)例外是Arg44替換，這時(shí)范德瓦爾斯和靜電AAGpb)相互作用均有損失。NRG-1J3的帶正電荷的Arg44與ErbB3的帶負(fù)電荷的Asp352和ErbB4的帶負(fù)電荷的Asp376之間的分子間相互作用在野生型復(fù)合物中是極為有利的。相似的結(jié)果在Arg31Ala替換的NRG-1P與ErbB3的相互作用中亦存在(圖8A)，但與ErbB4的相互作用中就不存在(圖8B)。NRG-1(3/ErbB3結(jié)構(gòu)顯示Arg31側(cè)鏈與ErbB3的Glul31側(cè)鏈形成2個(gè)氫鍵(見表2)。因此，Arg31突變體缺失了氫鍵相互作用。但是，NRG-ip的Arg31并不與ErbB4受體形成氫鍵(表2)。6.從NRG-ipArg31Ala和Asn47Ala突變體獨(dú)立軌跡對(duì)AAEbinding進(jìn)行比較研究假定丙氨酸突變不會(huì)引起NRG-1卩/ErbB3禾卩NRG-l(3/ErbB4復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)上的大的構(gòu)象改變，為了驗(yàn)證這一假定的有效性，對(duì)NRG-1(3的Arg31Ala和Asn47Ala突變體與ErbB3和ErbB4復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。突變體復(fù)合物軌跡的平均結(jié)構(gòu)與起始模型之間的Ca原子的rmsd是較小的，在1.9A和2.1A之間起伏。根據(jù)突變體復(fù)合物的新的軌跡對(duì)AE^t。w值進(jìn)行了重新計(jì)算，計(jì)算結(jié)果列于表5中，可以看出與野生型復(fù)合物的修改軌跡計(jì)算而得點(diǎn)結(jié)果幾乎是完全相同的。兩種方法計(jì)算的AE^t。^值的差異小于1kcalmor1(表5)。這提示在單個(gè)丙氨酸突變后，NRG-1(3/ErbB3禾DNRG-1(3/ErbB4的整體構(gòu)象不會(huì)發(fā)生劇烈的改變。表5.用野生型修改軌跡以及NRG-l卩的Arg31Ala和Asn47Ala突變體<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>用計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描突變實(shí)驗(yàn)計(jì)算野生型修改軌跡計(jì)算nrg-ie突變體獨(dú)立軌跡7.紐蘭格林及其突變體的受體結(jié)合親和力及信號(hào)傳導(dǎo)能力的比較研究為了研究紐蘭格林及其突變體的受體結(jié)合親和力，使用了ErbB2&ErbB3或ErbB2&ErbB4共表達(dá)的COS7細(xì)胞。細(xì)胞生長至80%滿度。下午，在細(xì)胞生長至80%滿度后，將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基。24小時(shí)后，收集細(xì)胞用于受體結(jié)合親和力實(shí)驗(yàn)。相似的，為了研究紐蘭格林及其突變體的信號(hào)傳導(dǎo)能力，使用了ErbB2&ErbB3或ErbB2&ErbB4共表達(dá)的COS7細(xì)胞。細(xì)胞生長至80%滿度。下午，在細(xì)胞生長至80%滿度后，將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基。24小時(shí)后，將不同濃度的紐蘭格林及其突變體加入到含有細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板的獨(dú)立孔中。IO分鐘后，加入上樣緩沖液裂解細(xì)胞。然后將收集的樣品加入獨(dú)立的孔中進(jìn)行凝膠電泳以及免疫印跡分析。紐蘭格林(指紐蘭格林1P2的第177-237氨基酸片段)和紐蘭格林突變體L3A和D43A(分別指紐蘭格林片段的第3位和第43位氨基酸被丙氨酸替換)的結(jié)果顯示于表6、表7、圖9和圖10。表6和表7中的數(shù)據(jù)表明L3A和D43A與紐蘭格林對(duì)ErbB2&ErbB3共表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合親和力差不多(如果EC50或KD值越高，則受體結(jié)合親和力越低)，而D43A對(duì)ErbB2&ErbB4共表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合親和力比紐蘭格林要高(表6)，L3AX寸ErbB2&ErbB4共表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合親和力則比紐蘭格林要低(表7)。相似的，圖9和圖10顯示L3A和D43A結(jié)合ErbB2&ErbB4共表達(dá)細(xì)胞后誘導(dǎo)的AKT磷酸化要比紐蘭格林誘導(dǎo)的多，但在ErbB2&ErbB3共表達(dá)細(xì)胞中這兩個(gè)突變體誘導(dǎo)的AKT磷酸化要比紐蘭格林誘導(dǎo)的低。這些結(jié)果表明L3A和D43A結(jié)合能強(qiáng)烈的活化ErbB2&ErbB4共表達(dá)細(xì)胞的AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑，但在ErbB2&ErbB3共表達(dá)細(xì)胞中僅能引起較少的活化。這些結(jié)果具有重要意義，由于心臟細(xì)胞主要表達(dá)ErbB2&ErbB4，因此諸如D43A和L3A這樣的突變體能夠用于治療心血管疾病而同時(shí)減少紐蘭格林結(jié)合其他表達(dá)ErbB2&ErbB3細(xì)胞而引起的副作用。表6.紐蘭格林及D43A突變體分別與表達(dá)ErbB2&ErbB3和ErbB2&ErbB4的COS7細(xì)胞的受體結(jié)合親和力比較<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>EC50是將50%的結(jié)合至受體復(fù)合物的放射性標(biāo)記的配體競爭下來的配體濃度。表7.紐蘭格林及L3A突變體分別與表達(dá)ErbB2&ErbB3和ErbB2&ErbB4的COS7細(xì)胞的受體結(jié)合親和力比較<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>KD等于([配體]X[受體])/[配體受體復(fù)合物]，它反映的是配體從受體上解離下來的速率。[配體]代表配體的濃度。構(gòu)建了紐蘭格林雙突變體8A47A(紐蘭格林片段的第8位和第47位氨基酸同時(shí)被丙氨酸替換)。用上面所述的同樣的方法來研究紐蘭格林及其雙突變體的信號(hào)傳導(dǎo)能力。紐蘭格林(紐蘭格林1P2的第177-237氨基酸片段)以及紐蘭格林雙突變體8A47A(紐蘭格林片段的第8位和第47位氨基酸同時(shí)被丙氨酸替換)的結(jié)果顯示于圖11。圖11表明8A47A結(jié)合ErbB2&ErbB4共表達(dá)細(xì)胞后誘導(dǎo)的AKT磷酸化要比紐蘭格林誘導(dǎo)的多，但在ErbB2&ErbB3共表達(dá)細(xì)胞中其誘導(dǎo)的AKT磷酸化與紐蘭格林誘導(dǎo)差不多。這一結(jié)果非常重要，由于心臟細(xì)胞主要表達(dá)ErbB2&ErbB4，因此8A47A能夠用于治療心血管疾病而同時(shí)維持了紐蘭格林結(jié)合其他表達(dá)ErbB2&ErbB3細(xì)胞而引起的副作用。結(jié)論同源模建、分子動(dòng)力學(xué)和自由能計(jì)算方法被用于研究NRG-le與其受體ErbB3和ErbB4之間的相互作用。用分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬研究了NRG-1P與ErbB3和ErbB4的結(jié)合特征。配體與受體的結(jié)合自由能是用MM-PBSA方法來計(jì)算的。MD模擬表明與EGF結(jié)合其受體相比，在NRG-IP結(jié)構(gòu)上重要的一些殘基比如Leu33、Arg44、Tyr48和Met50等與受體結(jié)合的殘基被保留下來。對(duì)配體和受體結(jié)合自由能的計(jì)算有助于解析NRG-1P與受體結(jié)合親和力的起源。而且，使用了計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描方法來對(duì)接觸面的每一個(gè)殘基對(duì)結(jié)合親和力的貢獻(xiàn)進(jìn)行作圖，并通過檢測結(jié)合位點(diǎn)的單個(gè)殘基的功能來確認(rèn)構(gòu)建的配體-受體復(fù)合物模型的有效性。計(jì)算機(jī)丙氨酸掃描結(jié)果鑒定出來幾個(gè)重要的相互作用殘基配對(duì)，例如在NRG-IP與ErbB3和ErbB4結(jié)合中，顯示出與實(shí)驗(yàn)突變結(jié)果的很好一致性。這提示NRG-13/ErbB3和NRG-1P/ErbB4復(fù)合物目前的結(jié)構(gòu)模型是可靠的并且可以用于選擇預(yù)期的NRG-1P突變體，這些突變體能夠選擇性結(jié)合受體并且結(jié)合親和力增強(qiáng)，同時(shí)可以用于發(fā)現(xiàn)治療心衰的新的治療物，紐蘭格林突變體L3A和D43A極大支持這一觀念。上述例子僅僅是用來舉例說明的，而不是用來限制本發(fā)明的范圍。對(duì)上面所述進(jìn)行更改是可能的。因?yàn)閷?duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說對(duì)上面描述的例子進(jìn)行修改或更改是顯而易見的，此處特意指出本發(fā)明的保護(hù)范圍僅受所附屬的權(quán)利要求限定。權(quán)利要求1.包含SEQIDNO1所示氨基酸序列的紐蘭格林-1β多肽突變體，所述多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO1序列不同的氨基酸，所述多肽突變體與SEQIDNO1多肽相比有增強(qiáng)的ErbB3結(jié)合親和力，而且其中在第25位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或在第35位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；或在第46位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y。2.權(quán)利要求l中的多肽突變體，所述多肽突變體由SEQIDNO:l所示氨基酸序列組成，而且其中在第25位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;或在第35位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、L、N、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;或在第46位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y。3.權(quán)利要求l中的多肽突變體，其中在第25位殘基所述不同的氨基酸是A;在第35位殘基所述不同的氨基酸是A;或在第46位殘基所述不同的氨基酸是A。4.權(quán)利要求2中的多肽突變體，其中在第25位殘基所述不同的氨基酸是A;在第35位殘基所述不同的氨基酸是A;或在第46位殘基所述不同的氨基酸是A。5.權(quán)利要求1中的多肽突變體，所述多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽相比有減弱的或相近的ErbB4結(jié)合親和力。6.權(quán)利要求5中的多肽突變體，在第25位殘基所述不同的氨基酸是A。7.權(quán)利要求5中的多肽突變體，在第35位殘基所述不同的氨基酸是A。8.權(quán)利要求5中的多肽突變體，在第46位殘基所述不同的氨基酸是A。9.一種包含編碼權(quán)利要求l中多肽突變體的核酸序列的多核苷酸。10.—種藥物組合物，包含有效劑量的權(quán)利要求1中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑。11.一種藥物組合物，包含有效劑量的權(quán)利要求5中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑。12.—種藥物組合物，包含有效劑量的權(quán)利要求9中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑。13.—種試劑盒，包含權(quán)利要求10中的藥物組合物和用該藥物組合物經(jīng)激活ErbB2/ErbB3受體預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病的說明書。14.一種試劑盒，包含權(quán)利要求ll中的藥物組合物和用該藥物組合物經(jīng)激活ErbB2/ErbB3受體預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病的說明書。15.—種預(yù)防、治療或延遲哺乳動(dòng)物精神分裂癥發(fā)展的方法，包括對(duì)需要預(yù)防、治療或延遲的動(dòng)物施用包含有效量的權(quán)利要求1中的多肽突變體和制藥中可接受的賦型劑的藥物組合物。16.權(quán)利要求15中的方法，所述哺乳動(dòng)物是人。17.包含SEQIDNO:l所示氨基酸序列的紐蘭格林-l卩多肽突變體，所述多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，所述多肽突變體與SEQIDNO:l多肽相比有增強(qiáng)的ErbB4結(jié)合親和力；而且其中在第16位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;在第31位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y;或在第47位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。18.權(quán)利要求17中的多肽突變體，所述多肽突變體由SEQIDNO:1所示氨基酸序列構(gòu)成，且在第16位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y;在第31位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y;或在第47位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。19.權(quán)利要求17中的多肽突變體，基酸是A。20.權(quán)利要求18中的多肽突變體，基酸是A。其中在第16位殘基所述不同的氨其中在第16位殘基所述不同的氨21.權(quán)利要求17中的多肽突變體，其中在第31位殘基所述不同的氨基酸是A。22.權(quán)利要求18中的多肽突變體，其中在第31位殘基所述不同的氨基酸是A。23.權(quán)利要求17中的多肽突變體，其中在第47位殘基所述不同的氨基酸是A。24.權(quán)利要求18中的多肽突變體，其中在第47位殘基所述不同的氨基酸是A。25.權(quán)利要求23中的多肽突變體進(jìn)一步含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，其中在第8位殘基所述不同的氨基酸是A。26.權(quán)利要求24中的多肽突變體進(jìn)一步含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，其中在第8位殘基所述不同的氨基酸是A。27.權(quán)利要求25中的多肽突變體，所述多肽突變體比SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽在ErbB2/ErbB4表達(dá)的細(xì)胞中誘導(dǎo)更多的Akt磷酸化。28.權(quán)利要求26中的多肽突變體，所述多肽突變體比SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽在ErbB2/ErbB4表達(dá)的細(xì)胞中誘導(dǎo)更多的Akt磷酸化。29.權(quán)利要求17中的多肽突變體，所述多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽相比有減弱的或相近的ErbB3結(jié)合親和力。30.—種包含編碼權(quán)利要求17中的多肽突變體的核酸序列的多核苷酸。31.—種藥物組合物，它包含有效量的權(quán)利要求17中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑。32.—種藥物組合物，它包含有效量的權(quán)利要求29中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑。33.—種藥物組合物，它包含有效量的權(quán)利要求30中的多核苷酸和制藥中可接受的賦形劑。34.—種試劑盒，包含權(quán)利要求31中的藥物組合物和使用該藥物組合物經(jīng)激活ErbB2/ErbB4受體預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病的說明書。35.—種試劑盒，包含權(quán)利要求32中的藥物組合物和使用該藥物組合物經(jīng)激活ErbB2/ErbB4受體預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病的說明書。36.—種預(yù)防、治療或延遲哺乳動(dòng)物病毒性心肌炎、擴(kuò)張性(充血性)心肌癥、心臟毒性或心肌梗死發(fā)展的方法，包括對(duì)需要這種預(yù)防、治療或延遲的哺乳動(dòng)物使用包含有效量的權(quán)利要求17中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑的藥物組合物。37.權(quán)利要求36中的方法，所述哺乳動(dòng)物是人。38.—種篩選對(duì)ErbB3有選擇性增強(qiáng)的結(jié)合親和力的紐蘭格林-ip多肽突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建來建立紐蘭格林-l(3或其片段、ErbB3、ErbB4、紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3的復(fù)合物、以及紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法來建立紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3的復(fù)合物、以及紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性方面的數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(△GSubtotalwildtype);(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-l卩或其片段的丙氨酸替換突變體與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(AGsubt。,aninesubstituted腿ant)，其中丙氨酸替換突變體是指紐蘭格林-l卩或其片段的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；(e)計(jì)算AAGsubtotal=AGsubtotalwildtvt)e—AGs^subtotal—n^subtotalwildtype^subtotalalaninesubstitutedvariant^(f)選擇使紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB3的復(fù)合物之AAG^t。ta,為正值、而使紐蘭格林-l(3或其片段與ErbB4的復(fù)合物之AAGsubtotal為負(fù)值或零左右的丙氨酸替換突變體；就此發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與ErbB3有選擇性增強(qiáng)的結(jié)合親和力的紐蘭格林-l卩多肽突變體。39.用權(quán)利要求38中的方法發(fā)現(xiàn)的紐蘭格林-lJ3多肽突變體。40.—種篩選與ErbB4有選擇性增強(qiáng)的結(jié)合親和力的紐蘭格林-l(3多肽突變體的方法，該方法包括(a)通過同源模建來建立紐蘭格林-ip或其片段、ErbB3、ErbB4、紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3的復(fù)合物、以及紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)；(b)用分子動(dòng)力學(xué)模擬法來建立紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3的復(fù)合物、以及以及紐蘭格林-l卩或其片段與ErbB4的復(fù)合物在溶液中的構(gòu)象變化及穩(wěn)定性方面的數(shù)據(jù)；(c)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-ip或其片段與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由能(△Gsubtotalwildtype)5(d)用分子力學(xué)泊松玻爾茲曼表面積(MM-PBSA)法來計(jì)算紐蘭格林-ip或其片段的丙氨酸替換突變體與ErbB3或ErbB4的部分總結(jié)合自由目g(AGsub她lalaninesubstitutedvariant)，其中丙氨酸替換突變體是指紐蘭格林-1(3或其片段中的一個(gè)氨基酸被丙氨酸替換；wildtypeAGsubtotalalaninesubstitutedvari肌t，(f)選擇使紐蘭格林-ip或其片段與ErbB4的復(fù)合物之AAGsub她,為正值、而使紐蘭格林-l(3或其片段與ErbB3的復(fù)合物之AAGsubt。tal為負(fù)值或零左右的丙氨酸替換突變體；就此發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與ErbB4有選擇性增強(qiáng)的結(jié)合親和力的紐蘭格林-l卩多肽突變體。41.用權(quán)利要求40中的方法發(fā)現(xiàn)的紐蘭格林-l(3多肽突變體。42.—種包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列的紐蘭格林-lp多肽突變體，所述多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，所述多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽相比有增強(qiáng)的ErbB2/ErbB4結(jié)合親和力，而且其中在第43位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。43.權(quán)利要求42中的多肽突變體，所述多肽突變體由SEQIDNO:1所示氨基酸序列組成，而且其中在第43位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。44.權(quán)利要求42中的多肽突變體，其中在第43位殘基所述不同的氨基酸是A。45.權(quán)利要求43中的多肽突變體，其中在第43位殘基所述不同的氨基酸是A。46.權(quán)利要求44中的多肽突變體，其中所述多肽突變體比SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽在ErbB2/ErbB4表達(dá)的細(xì)胞中誘導(dǎo)更多的Akt磷酸化。47.權(quán)利要求45中的多肽突變體，其中所述多肽突變體比SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽在ErbB2/ErbB4表達(dá)的細(xì)胞中誘導(dǎo)更多的Akt磷酸化。48.權(quán)利要求42中的多肽突變體進(jìn)一步含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，其中在第8位殘基所述不同的氨基酸是A。49.權(quán)利要求43中的多肽突變體進(jìn)一步含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，其中在第8位殘基所述不同的氨基酸是A。50.權(quán)利要求48中的多肽突變體進(jìn)一步含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，其中其中在第47位殘基所述不同的氨基酸是A。51.權(quán)利要求49中的多肽突變體進(jìn)一步含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，其中在第47位殘基所述不同的氨基酸是A。52.權(quán)利要求42中的多肽突變體進(jìn)一步含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，其中在第47位殘基所述不同的氨基酸是A。53.權(quán)利要求43中的多肽突變體進(jìn)一步含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，其中在第47位殘基所述不同的氨基酸是A。54.權(quán)利要求42中的多肽突變體，所述多肽突變體比SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽有減弱的或相近的ErbB2/ErbB3結(jié)合親和力。55.權(quán)利要求54中的多肽突變體，其中在第43位殘基所述不同的氨基酸是A。56.—種包含編碼權(quán)利要求42中的多肽突變體的核酸序列的多核苷酸。57.—種藥物組合物，它包含有效量的權(quán)利要求42中的多肽突變體和制藥中可接受的賦型劑。58.—種藥物組合物，它包含有效量的權(quán)利要求43中的多肽突變體和制藥中可接受的賦型劑。59.—種藥物組合物，它包含有效量的權(quán)利要求56中的多核苷酸和制藥中可接受的賦型劑。60.—種試劑盒，它包含權(quán)利要求57中的藥物組合物以及用該藥物組合物經(jīng)激活ErbB2/ErbB4受體來預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病的說明書。61.—種試劑盒，它包含權(quán)利要求58中的藥物組合物以及用該藥物組合物經(jīng)激活ErbB2/ErbB4來預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病的說明書。62.—種預(yù)防、治療或延遲哺乳動(dòng)物精神分裂癥發(fā)展的方法，包括給需要這種預(yù)防、治療或延遲的哺乳動(dòng)物施用包含有效量的權(quán)利要求42中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑的藥物組合物。63.權(quán)利要求62中的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。64.—種預(yù)防、治療或延遲哺乳動(dòng)物病毒性心肌炎、擴(kuò)張性(充血性)心肌癥、心臟毒性或心肌梗死或心血管疾病發(fā)展的方法，包括給需要這種預(yù)防、治療或延遲的哺乳動(dòng)物施用含有效量的權(quán)利要求42中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑的藥物組合物。65.權(quán)利要求64中的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。66.包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列的紐蘭格林-l(3多肽突變體，所述多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，所述多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)的多肽相比有減弱的ErbB2/ErbB4受體結(jié)合親和力，而其中在第3位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。67.權(quán)利要求66中的多肽突變體，所述多肽突變體由SEQIDNO:1的氨基酸序列構(gòu)成，而且其中在第3位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。68.權(quán)利要求66中的多肽突變體，其中在第3位殘基所述不同的氨基酸是A。69.權(quán)利要求67中的多肽突變體，其中在第3位殘基所述不同的氨基酸是A。70.權(quán)利要求68中的多肽突變體，所述多肽突變體比SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽在ErbB2/ErbB4表達(dá)的細(xì)胞中誘導(dǎo)更多的Akt磷酸化。71.權(quán)利要求69中的多肽突變體，所述多肽突變體比SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽在ErbB2/ErbB4表達(dá)的細(xì)胞中誘導(dǎo)更多的Akt磷酸化。72.權(quán)利要求66中的多肽突變體，所述多肽突變體比SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽有增強(qiáng)的或相近的ErbB2/ErbB3結(jié)合親和力。73.權(quán)利要求72中的多肽突變體，其中在第3位殘基所述不同的氨基酸是A。74.—種包含編碼權(quán)利要求66中的多肽突變體的核酸序列的多核苷酸。75.—種藥物組合物，它包含有效劑量的權(quán)利要求66中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑。76.—種藥物組合物，它包含有效劑量的權(quán)利要求67中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑。77.—種藥物組合物，它包含有效劑量的權(quán)利要求74中的多核苷酸和制藥中可接受的賦形劑。78.—種試劑盒，它包含權(quán)利要求75中的藥物組合物以及使用該藥物組合物經(jīng)激活ErbB2/ErbB3受體來預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病的說明書。79.—種試劑盒，它包含權(quán)利要求76中的藥物組合物以及使用該藥物組合物經(jīng)激活ErbB2/ErbB3受體來預(yù)防、治療或延遲個(gè)體疾病的說明書。80.—種預(yù)防、治療或延遲哺乳動(dòng)物精神分裂癥發(fā)展的方法，包括給需要這種預(yù)防、治療或延遲的哺乳動(dòng)物施用包含有效量的權(quán)利要求66中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑的藥物組合物。81.權(quán)利要求80中的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。82.—種預(yù)防、治療或延遲哺乳動(dòng)物病毒性心肌炎、擴(kuò)張性(充血性)心肌癥、心臟毒性、心血管疾病或心肌梗死發(fā)展的方法，包括給需要這種預(yù)防、治療或延遲的哺乳動(dòng)物施用包含有效量的權(quán)利要求66中的多肽突變體和制藥中可接受的賦形劑的藥物組合物。83.權(quán)利要求82中的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。84.包含SEQIDNO:1所示序列的紐蘭格林-1|3多肽突變體，所述多肽突變體含有一個(gè)與SEQIDNO:l不同的氨基酸，所述多肽突變體與SEQIDNO:l對(duì)應(yīng)多肽相比有增強(qiáng)的ErbB3結(jié)合親和力，而且其中在第8位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或在第43位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或在第47位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。85.權(quán)利要求84中的多肽突變體，所述多肽突變體由SEQIDNO:1所示氨基酸序列構(gòu)成，而其中在第8位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或在第43位殘基所述不同的氨基酸是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;和/或在第47位殘基所述不同的氨基酸是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y。全文摘要本發(fā)明提供紐蘭格林1-β(neuregulin-1β，NRG-1β)的多肽突變體，這些突變體增強(qiáng)或減弱了與ErbB3和/或ErbB4的結(jié)合親和力。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生和篩選NRG-1β多肽突變體的方法以及用NRG-1β多肽突變體治療疾病的方法。文檔編號(hào)A61P25/00GK101336251SQ200680052155公開日2008年12月31日申請(qǐng)日期2006年12月4日優(yōu)先權(quán)日2005年12月2日發(fā)明者周明東申請(qǐng)人:上海澤生科技開發(fā)有限公司