專利名稱：藥物-聚合物的結(jié)合物的制作方法
藥物-聚合物的結(jié)合物相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用根據(jù)35U.S.C. § 119 (e)的規(guī)定本申請(qǐng)要求于2005年12月30日遞交的 美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)No.6(V755， 459的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此被引用作為 參考。
背景技術(shù)：
己經(jīng)研究了兩種主要的藥物遞送方法可以提高治療藥物分子的藥效學(xué)和 藥物動(dòng)力學(xué)特性。 一種是修飾藥物分子自身(例如，通過聚乙二醇化)而另一 種是改變藥物制劑(例如，通過使用脂質(zhì)體制劑)。在每種情況下，期望開發(fā) 一種能夠提供藥理學(xué)活性延長(zhǎng)、副作用降低、患者依從性提高和患者生命質(zhì)量 提高的藥物遞送機(jī)制。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于一治療多肽分子可以被偶聯(lián)至一聚合物分子以形成一具有增 強(qiáng)功效的單個(gè)藥物體(即，多肽-聚合物的結(jié)合物)的觀念。一方面，本發(fā)明的特征在于一種多肽-聚合物的結(jié)合物，其包括多肽部分、 聚環(huán)氧烷部分、將多肽部分與聚環(huán)氧烷部分連接的接頭(linker)、多肽部分和 該接頭間的第一聯(lián)接；以及聚環(huán)氧烷部分和該接頭間的第二聯(lián)接。多肽部分可 以含有人干擾素-a部分(g卩，保留干擾素-a活性的天然或修飾部分)和1-6(例如1-4)個(gè)在人干擾素-ci部分的N-末端的其它氨基酸殘基。實(shí)例包括 國(guó)Ser-Gly-IFN 、 -Gly-Ser-IFN 、 -Met畫Met-IFN 、 -Met-His-IFN 、 -Pro-IFN和 -Gly-Met-IFN，其中IFN是人干擾素-a 2b部分。干擾素-a部分可以在N-末端 包括一半胱氨酸殘基。多肽部分也可包括干擾素-P部分或粒細(xì)胞集落刺激因 子。聚環(huán)氧垸部分可以含有1-20,000 Cr"Q環(huán)氧垸重復(fù)單元。聚環(huán)氧垸部分的 實(shí)例包括含有5-10,000個(gè)重復(fù)單元的聚環(huán)氧乙烷部分，例如具有數(shù)均分子量 20,000道爾頓的聚環(huán)氧乙烷部分。接頭可以是CH^亞烴基、C廣C8雜亞烴基、CH^環(huán)亞烴基、C3-Cs雜環(huán)亞烴基、亞芳基、雜亞芳基、亞芳垸基(aralkylene) 或-Ar-X-(CH2)n-，其中Ar可以是亞芳基(例如亞苯基)或雜亞芳基，X可以 是O、 S或N(R)， R是H或C廣Cuj烷基，和n可以是l-10。第一聯(lián)接和第二 聯(lián)接的每個(gè)可以獨(dú)立地是羧酸酯、羰基、碳酸酯、酰胺、氨基甲酸鹽、尿素、 醚、硫基、磺?；喕酋；被?、亞氨基、羥基氨基、膦酸酯、或磷酸酯 基團(tuán)。是甲氧基封端的聚環(huán)氧乙垸部分。聚環(huán)氧烷部分指線性、分支或星形部分。其是飽和或不飽和的以及是取代 的或未取代的。聚環(huán)氧垸部分的實(shí)例包括聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷、聚環(huán)氧異 丙垸、聚環(huán)氧丁烷、及其共聚物。其它聚合物例如葡聚糖、聚乙烯醇、聚丙烯 酰胺或碳水化合物基的聚合物也可以用來代替聚環(huán)氧烷部分，只要其不是抗原 性的、有毒的或者引發(fā)免疫反應(yīng)。接頭從聚環(huán)氧垸部分伸出并促進(jìn)多肽部分偶聯(lián)至聚環(huán)氧烷部分。 多肽部分可以包括修飾的多肽藥物，只要其藥學(xué)活性中至少一些被保留。 該治療多肽部分的實(shí)例包括在N-末端含有一種或多種其它氨基酸殘基的修飾 多肽分子或在其一級(jí)蛋白序列中含有對(duì)其氨基酸殘基一個(gè)或多個(gè)取代的修飾 多肽分子。在酶促作用下通過切開多肽部分和接頭間的聯(lián)接或聚環(huán)氧垸部分和接頭 間的聯(lián)接可以在體內(nèi)釋放多肽部分(例如，通過水解)。涉及體內(nèi)切開聯(lián)接的 酶的實(shí)例包括氧化酶(例如，過氧化酶、胺氧化酶或脫氫酶)、還原酶(例如， 酮類還原酶)和水解酶(例如，蛋白酶、酯酶、硫酸酯酶或磷酸酯酶)。無需 從多肽-聚合物結(jié)合物上切下治療多肽部分，本發(fā)明的多肽-聚合物結(jié)合物也可 以在體內(nèi)是有效的。術(shù)語"垸基"指單價(jià)、飽和、線性或分支的、非芳香碳?xì)浠衔锊糠郑?如-CH3或-CH(CH3)2。術(shù)語"烯基"指含有至少一個(gè)雙鍵的線性或分支的碳?xì)?化合物部分，例如-CH-CH-CH3。術(shù)語"炔基"指含有至少一個(gè)三鍵的線性或上述藥物-聚合物的結(jié)合物的一個(gè)實(shí)例是 o，其中mPEG7分支的碳?xì)浠衔锊糠?，例?C^C-CH3。術(shù)語"環(huán)垸基"指飽和的、環(huán)狀的 碳?xì)浠衔锊糠?，例如環(huán)丙基。術(shù)語"環(huán)烯基"指含有至少一個(gè)環(huán)雙鍵的非芳 香的、環(huán)狀的碳?xì)浠衔锊糠?，例如環(huán)己烯基。術(shù)語"雜環(huán)烷基"指具有至少一個(gè)環(huán)上雜原子(例如N， O或S)的飽和環(huán)部分，例如4-四氫吡喃基。術(shù)語 "雜環(huán)烯基"指具有至少一個(gè)環(huán)上雜原子(例如N， O或S)和至少一個(gè)環(huán)雙鍵的非芳香的環(huán)部分，例如吡喃基。術(shù)語"芳基"指具有一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)的 碳?xì)浠衔锊糠帧７蓟糠值膶?shí)例包括苯基(Ph)、萘基、芘基、蒽基和菲基。 術(shù)語"雜芳基"指具有一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)的部分，其含有至少一個(gè)環(huán)上雜原子(例如，N， O或S)。雜芳基部分的實(shí)例包括呋喃基、芴基、吡咯基、噻吩基、 惡唑基(oxazolyl)、咪唑基、噻唑基、卩比啶基、嘧啶基、喹唑啉基、喹啉基、 異喹啉基和吲哚基。術(shù)語"亞烴基"指二價(jià)、飽和、線性或分支的非芳香碳?xì)?化合物部分，例如-CH2-。術(shù)語"雜亞烴基"指具有至少一個(gè)雜原子(例如，N， O或S)的亞烴基部分，例如-CH20CH2-。術(shù)語"環(huán)亞烴基"指二價(jià)、飽和環(huán) 的碳?xì)浠衔锊糠?，例如環(huán)亞己基。術(shù)語"雜環(huán)亞烴基"指具有至少一個(gè)環(huán)上 雜原子的二價(jià)、飽和的非芳香環(huán)部分，例如4-四氫亞吡喃基。術(shù)語"亞芳基" 指具有一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)的二價(jià)碳?xì)浠衔锊糠?。芳基部分的?shí)例包括亞苯基 和亞萘基。術(shù)語"雜亞芳基"指具有一個(gè)或多個(gè)含有至少一個(gè)環(huán)上雜原子的芳 香環(huán)的二價(jià)部分。雜亞芳基部分的實(shí)例包括亞呋喃基和亞吡咯基。術(shù)語"亞芳 烷基"指被芳基或雜芳基取代的二價(jià)垸基部分，其中一個(gè)電子位于垸基部分而 另一個(gè)電子位于芳基或雜芳基。亞芳烷基部分的實(shí)例包括亞芐基或吡啶亞甲 基。本文提及的垸基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基、 芳基、雜芳基、亞烴基、雜亞烴基、環(huán)亞烴基、雜環(huán)亞烴基、亞芳基、雜亞芳 基和亞芳烷基包括取代和不取代的部分。環(huán)亞烴基、雜環(huán)亞烴基、亞芳基、雜 亞芳基和亞芳垸基的取代基的實(shí)例包括d Cu)烷基、C2 Cu)烯基、C2 C1() 炔基、C3 C8環(huán)烷基、C5 C8環(huán)烯基、d do垸氧基，芳基，芳氧基，雜 芳基，雜芳氧基，氨基、C, Cu)烷氨基、d C2o二烷氨基、芳氨基、二芳氨 基、羥氨基、垸氧基氨基、Q Cu)烷基磺酰胺，芳基磺酰胺，羥基，鹵素， 硫基、d Cu)垸硫基，芳硫基，腈，氮，酰基，酰氧基，羧基和羧酸酯。烷 基、亞烴基和雜亞烴基的取代基的實(shí)例包括除d do烷基以外的所有上述取代基。環(huán)亞烴基、雜環(huán)亞烴基、亞芳基、雜亞芳基也可以與環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、 芳基或雜芳基稠合。另一方面，本發(fā)明的特征在于一種多肽-聚合物的結(jié)合物，其包括多肽部 分、聚環(huán)氧垸部分、將多肽部分與聚環(huán)氧烷部分連接的接頭、多肽部分和該接 頭間的第一聯(lián)接；以及聚環(huán)氧烷部分和該接頭間的第二聯(lián)接。聚環(huán)氧垸部分可以含有1-20,000 CI-C8環(huán)氧烷重復(fù)單元。接頭可以是-Ar-X-(CH2)n-，其中Ar可以是亞芳基或雜亞芳基，X可以是O、 S或N(R)， R是H或C1^C10烷基，和n可以是l-10。第一聯(lián)接和第二聯(lián)接的每個(gè)可以獨(dú)立地是羧酸酯、羰基、碳酸酯、酰胺、氨基甲酸鹽、尿素、醚、硫基、磺?；?、亞磺?；?、氨基、亞氨基、羥基氨基、膦酸酯、或磷酸酯基團(tuán)。另一方面，本發(fā)明的特征在于通式(I)的化合物通式(I)中，mPEG是甲氧基封端的聚環(huán)氧乙烷部分；Rp R2， R3和R4之一 是CHO取代的d Cu)烷基；其它的Rp R2， R3和R4每個(gè)獨(dú)立地是H、 d Cu)烷基、C2 do烯基、C2 do炔基、C3 C2。環(huán)垸基、C3 C2Q環(huán)烯基、d C20雜環(huán)垸基、d C2。雜環(huán)烯基，芳基或雜芳基。通式(I)的化合物的子集是那些化合物，其中R2或R3是CHO取代的丙基或CHO取代的丁基。另一方面，本發(fā)明的特征在于包括干擾素-a部分(例如，人干擾素-ci2b 部分)和1-6個(gè)在干擾素-a部分的N-末端的其它氨基酸殘基的多肽。實(shí)例包 括Ser-Gly-IFN、 Gly國(guó)Ser畫IFN 、 Met畫Met-IFN 、 Met-His-IFN 、 Pro-IFN和 Gly-Met-IFN，其中IFN是人干擾素-a 2b部分。干擾素-a部分也可以是野生型 干擾素-a部分(例如，野生型人干擾素-a2b部分)。另一方面，本發(fā)明的特征在于治療諸如乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒 感染、和癌癥(例如，毛細(xì)胞白血病或卡波西氏肉瘤)之類的各種疾病的方法。 該方法包括給予需要的受試者有效量的一種或多種上述多肽-聚合物結(jié)合物。 術(shù)語"處理"或"治療"指給予具有上述提及的疾病、其癥狀、或者傾向于該病癥 的受試者施用一種或多種肽-聚合物結(jié)合物，其目的在于賦予治療效果，例如 治愈、減輕、改變、影響、改善或預(yù)防上述提及的疾病、其癥狀、或者該病癥的傾向。本發(fā)明還包括一藥物組合物，其含有有效量的至少一種上述提及的多肽-聚合物結(jié)合物和藥學(xué)可接受的載體。上述多肽-聚合物結(jié)合物包括化合物自身，以及如果可適用的話，包括其 鹽、前藥、和溶劑化物。例如，可以在陰離子和多肽-聚合物結(jié)合物上的正電 荷基團(tuán)(例如氨基)之間形成鹽。適宜的陰離子包括氯化物、溴化物、碘化物、 硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、三氟乙酸鹽和乙酸鹽。同樣， 也可以在陽離子和多肽-聚合物結(jié)合物上的負(fù)電荷基團(tuán)(例如羧酸酯)之間形 成鹽。適宜的陽離子包括鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子和銨離子，例如四 甲基銨離子。前藥的實(shí)例包括酯和其它藥學(xué)可接受衍生物，其在給藥于受試者 時(shí)，能夠提供活性多肽-聚合物的結(jié)合物。溶劑化物是指形成于活性多肽-聚合 物的結(jié)合物與藥學(xué)可接受的溶劑之間的一復(fù)合物。藥學(xué)可接受的溶劑的實(shí)例包 括水、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。一種用于治療各種上述提及的疾病的、含有一種或多種上述的多肽-聚合 物結(jié)合物的組合物，和該組合物在制造用于上述提及的治療的藥物中的應(yīng)用， 也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的細(xì)節(jié)將在下述說明中提出。發(fā)明的其它特 征，目的和優(yōu)點(diǎn)將從說明書和權(quán)利要求中顯而易見。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及多肽-聚合物結(jié)合物，其中治療多肽部分被連接至至少一種聚 合物分子。通過化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的合成方法可以制備多肽-聚合物結(jié)合物。例如， 可以將含有官能團(tuán)(例如，苯氨基)的接頭分子首先通過氨基甲酸酯聯(lián)接偶聯(lián)至含有羥端基的甲氧基封端的聚乙二醇(mPEG)聚合物上以形成一接頭-聚合 物結(jié)合物。隨后，在接頭-聚合物結(jié)合物上的另一端基轉(zhuǎn)變成醛基后，可將含 有另一官能團(tuán)(例如，氨基)的治療多肽分子(例如，人干擾素-a2b)偶聯(lián)至 上述接頭-聚合物結(jié)合物。為了偶聯(lián)接頭分子，mPEG聚合物可以用諸如琥珀 酰亞胺酯、"肖基苯酚、琥珀酰亞胺碳酸酯、三氟乙基磺酸單甲氧基(tresylate)、 馬來酰亞胺、乙烯基砜、碘代乙酰胺、生物素、磷脂或熒光素的基團(tuán)官能團(tuán)化。作為另一實(shí)例，治療多肽分子(例如，人干擾素-a2b)可以首先利用在其N-末端通過重組技術(shù)引入1-6個(gè)其它氨基酸殘基而被修飾。修飾的人干擾素-a 2b分子可以隨后被偶聯(lián)至一端含有接頭的甲氧基封端的聚乙二醇部分?？梢酝ㄟ^ 修飾接頭以形成適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)(例如，醛基)，然后將接頭上的該官能團(tuán)與修飾的人干擾素-Cl2b分子上的官能團(tuán)(例如，末端氨基)反應(yīng)而完成偶聯(lián)反應(yīng)。路線1上述路線1說明了制備一種上述多肽-聚合物結(jié)合物的實(shí)例。以4個(gè)化學(xué) 轉(zhuǎn)變將4-硝基苯酚1首先轉(zhuǎn)變成接頭分子2: (a)羥基與3-氯丙-l-醇的烷基化； (b)末端羥基氧化成醛基；(c)通過形成二甲基乙縮醛保護(hù)醛基；(d)將硝 基還原成氨基。然后通過使用N， N- 二琥珀酰亞胺基碳酸酯將甲氧基封端的 聚乙二醇(mPEG)聚合物偶聯(lián)至接頭分子2以產(chǎn)生接頭-聚合物的結(jié)合物3。 隨后除去接頭-聚合物的結(jié)合物3中的二甲基縮醛保護(hù)基團(tuán)以得到含有醛基的 接頭-聚合物的結(jié)合物4，其然后與修飾的人干擾素-a2b分子，Ser-Gly-IFN 偶聯(lián)以形成多肽-聚合物結(jié)合物5。上述合成路線使用的化學(xué)品可包括例如溶劑、反應(yīng)劑、催化劑、保護(hù)基團(tuán) 和去保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)劑。上述方法在本文具體描述的步驟前或步驟后可另外包括 步驟，以為了最終允許合成多肽-聚合物結(jié)合物而添加或移除適宜的保護(hù)基團(tuán)。 另外，各種合成步驟可以改變的順序或次序進(jìn)行以得到目的多肽-聚合物結(jié)合 物。在合成適用的多肽-聚合物結(jié)合物中有用的合成化學(xué)轉(zhuǎn)變以及保護(hù)基團(tuán)方 法學(xué)(保護(hù)和去保護(hù))是本領(lǐng)域已知的并且包括例如，于下面所述的R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene禾口 RG.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed.， John Wiley和Sons (1991); L. Fieser禾口 M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley和Sons (1994); 以及L Paquette， ed., Encyclopedia of Reagents forOrganic Synthesis, John Wiley和Sons (1995)及其后續(xù)版本。因此合成的多肽-聚合物結(jié)合物可以進(jìn)一步通過諸如柱色譜或高壓液相色 譜的方法而被純化。本文提及的多肽-聚合物結(jié)合物可含有非芳香雙鍵和一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中 心。因此，其可以是外消旋物、消旋混合物、單對(duì)映體、單個(gè)非對(duì)映體、非對(duì) 映體混合物和反式或順式異構(gòu)形式。所有該異構(gòu)形式都被考慮。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種給予有效量的一種或多種上述多肽-聚合物結(jié) 合物用于治療各種疾病的方法。具體地，通過以賦予一受試者治療效果所需的 量來給予一種或多種上述的肽-聚合物結(jié)合物而治療疾病，所述的受試者具有 疾病、這種疾病的癥狀、或者傾向于這種疾病的病癥，其目的在于賦予治療效 果，例如治愈、減輕、改變、影響、改善或預(yù)防上述提及的疾病、其癥狀、或 者該病癥的傾向。該受試者可以由衛(wèi)生保健專業(yè)人士根據(jù)任何適當(dāng)?shù)脑\斷方法 的結(jié)果而鑒定。含有有效量的至少一種上述多肽-聚合物結(jié)合物以及藥學(xué)可接受載體的藥 物組合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，有效的劑量根據(jù)例如 多肽-聚合物結(jié)合物的水解速率、多肽-聚合物結(jié)合物中的治療多肽部分、聚合 物分子量、待治療的疾病類型、給藥途徑、賦形劑的使用以及與其它治療學(xué)上 的治療共同使用的可能性而變化。為了實(shí)踐本發(fā)明的方法，具有一種或多種上述提及多肽-聚合物結(jié)合物的 組合物可以非經(jīng)腸道、口服、鼻腔、直腸、局部或口腔給藥。本文使用的術(shù)語 "非經(jīng)腸道"指皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、 鞘內(nèi)、病灶內(nèi)、腹腔內(nèi)、氣管內(nèi)或顱內(nèi)注射以及任何適宜的注入技術(shù)。滅菌的可注射組合物可以是非毒性的非經(jīng)腸道可接受的稀釋劑或溶劑中 的溶液或懸液，例如l， 3-丁二醇的溶液?？梢允褂玫目山邮芙檩d體和溶劑是 甘露醇、水、Ringer's溶液以及等滲壓的氯化鈉溶液。另外，不揮發(fā)的油通常 被用作溶劑或懸浮介質(zhì)(例如，合成的單-或二-甘油酯)。脂肪酸(例如油酸) 及其甘油酯衍生物在制備注射劑時(shí)是有用的，其是作為天然藥物可接受的油， 例如橄欖油或蓖麻油，尤其是以其聚氧乙烯化形式。這些油溶液或懸液也可以 含有長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑，或者羧甲基纖維素或類似的分散劑。其它通常用 于制造藥學(xué)可接受固體、液體或其它劑型的通常使用的表面活性劑(例如Tweens或Spans或其它類似的乳化劑或生物利用度增強(qiáng)劑)也可以用于配制 的目的?？诜o藥的組合物可以是任何口服可接受的劑型，包括膠囊、片劑、乳液 和水懸液、分散劑和溶液。在片劑的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米 淀粉。通常也添加潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂)。對(duì)于膠囊形式的口服給藥，有用 的稀釋劑包括乳糖和干玉米淀粉。當(dāng)口服給予水懸液或乳液時(shí)，活性成分可以 懸浮或溶解到與乳化劑或懸浮劑結(jié)合的油相中。如果需要，可以加入某些甜味 劑、調(diào)味劑或著色劑。根據(jù)藥物配制領(lǐng)域公知的技術(shù)可以制備鼻用氣霧劑或吸入組合物。例如， 該組合物可以被制備成一在鹽中的溶液，其使用苯甲醇或其它適宜的防腐劑、 吸收促進(jìn)劑以增強(qiáng)生物利用度、碳氟化合物、和/或本領(lǐng)域已知的其它增溶劑 或分散劑。具有一種或多種上述多肽-聚合物結(jié)合物的組合物也可以以用于直 腸給藥的栓劑形式給予。藥學(xué)可接受載體通常與一種或多種上述提及的多肽-聚合物結(jié)合物一起使 用。藥物組合物中的載體必須是"可接受的"條件是其與組合物中的活性成分相 容(并優(yōu)選能穩(wěn)定該活性成分)并對(duì)待治療的受試者無害。可以應(yīng)用一種或多 種增溶劑作為用于遞送上述提及的化合物的藥學(xué)賦形劑。其它載體的實(shí)例包括 膠狀氧化硅、硬脂酸鎂、纖維素、十二烷基硫酸鈉和D&C黃色# 10。下面的實(shí)施例被認(rèn)為僅僅是說明性的并且不以任何方式限制公開文本的 其余內(nèi)容。不需要進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于本文的說明， 利用本發(fā)明至其最大限度。本文引用的所有文獻(xiàn)通過引用整體被引入本文。實(shí)施例1、制備mPEG醛A -D制備mPEG醛A:步驟A:制備3- (4-硝基苯氧基)丙-l-醇將3-氯丙-l-醇(160 g, 1.69 mol)加入到含有4-硝基苯酚(329 g, 2.37 mol)) 和KOH(151 g，2.70mol)的1.4L的1: 1的乙醇-水混合物的溶液中。將該混合A. R2 = CH2CH2CHO, R3 = HB. R2 = CH2CH2CH2CHO, R3 = HC. R2 = H, R3 = CH2CH2CHO13物加熱回流60h，冷卻至室溫，將其倒入到1N的NaOH水溶液(2.0L)中，并 用二氯甲烷(2 x 1.2 L)提取。合并有機(jī)提取物，用1N的NaOH水溶液(l.O L) 和用鹽水洗滌，用無水MgS04干燥并在真空中濃縮以得到作為黃色固體的3-(4-硝基苯氧基)丙-1-醇(273 g, 82%)。 !HNMR(400固z, CDC13) 5 8.16 (d, /= 9.2 Hz, 2 H), 6.94 (d, J= 9.2 Hz, 2 H), 4.20 (t, 6.0 Hz, 2 H), 3.87—3.83 (m， 2 H): 2.10—2.04 (m， 2 H), 1.87 (t,4.0 Hz， 1 H); 13C NMR (100 MHz， CDC13) S 163.9: 141.2, 125.8, 114.3, 65.8， 59.1, 31.7; GC—MS (m/z)以C9HuN04: 197.2計(jì)算，發(fā) 現(xiàn)197, 139, 123, 109。步驟B:制備3- (4-硝基苯氧基)丙醛在0°C下，超過30 min的時(shí)間，將NaBr (18.6 g, 181.2 mmol)和TEMPO (0.85 g, 5.4 mmol)和二氯甲垸(290 mL)的混合物加入到3~(4~石肖基苯氧基)丙 一1-醇(35.7 g, 181.2 mmol)的NaOCl (240 mL,按照水和13 wt% NaOCl水溶液的1: 1的混合物)冷溶液中。當(dāng)完成添加，混合物變成淡黃色并在0°C攪拌lh。分出生成的混合物后，有機(jī)層用水(300 mL)洗滌，用無水MgS04干燥并 在真空中濃縮以得到作為淡黃色液體的3- (4-硝基苯氧基)丙醛(31§,87%)。 !H NMR (400 MHz, CDC13) S 9.93 (s, 1 H), 8.24 (d, /= 9.2 Hz, 2 H)， 7.01 (d, / = 9.2 Hz, 2 H), 4.45 (t, J= 6.0 Hz， 2 H), 3.05 (t, /= 6.0 Hz, 2 H); GC—MS (m/z)以 C9H9N04: 195.2計(jì)算，發(fā)現(xiàn)195, 167, 139， 109, 93, 65。步驟C:制備3- (4-硝基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛將AMBERLITE lra~400 (CI)離子交換樹脂(30 g)加入到3-(4-硝基苯氧基) 丙醛的甲醇(300mL)溶液中。生成混合物在室溫?cái)嚢?6h并通過Celite過濾。 濾出物在真空濃縮以得到作為淡黃色固體的3- (4-硝基苯氧基)丙醛二甲基乙 縮醛(30 g, 80%)。 & NMR (400 MHz, CDC13) 5 8.17 (d, J= 9.2 Hz， 2 H), 6.94 (d, J= 9.2 Hz， 2 H)， 4.61 (t, J= 6.0 Hz, 1 H)， 4.13 (t， J= 6.4 Hz， 2 H)， 3.62 (s, 6 H)， 2.09—2.14 (m， 2 H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) S 163.8, 141.4, 125.8, 114.3， 101.6， 64.8, 53.3， 32.4; GC—MS (m/z)以CuH15N03: 241.2計(jì)算，發(fā)現(xiàn)241, 178， 152, 75。步驟D:制備3- (4-氨基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛將硼氫化鈉(15.0 g， 0.39 mol)加入到3- (4-硝基苯氧基)丙醛二甲基乙縮 醛(30.0g, 0.12mol)和氯化銅(I) (1.2 g， 12.4 mmol)的乙醇(500mL)冷溶液中。 于60°C加熱并攪拌混合物30 min，冷卻至室溫，用水(250 mL)稀釋，真空濃 縮以除去乙醇，并用甲基f-丁基醚或MTBE(3 x 150mL)提取。合并有機(jī)提取 物，用鹽水洗滌，用無水MgS04干燥并在真空中濃縮以得到粗殘留物。通過 使用40%乙酸乙酯-己垸作為洗脫劑在中性氧化鋁的柱色譜上純化粗殘留物以 得到作為深紫色液體的3《4-氨基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛(19.5 g, 75%)。 NMR (400 MHz, CDC13) 5 6.74 (d, >/= 8.8 Hz， 2 H), 6.66 (d, /= 8.8 Hz, 2 H)， 4.62 (t， /= 5.6 Hz, 1 H), 3.95 (t， /= 6.0 Hz, 2 H), 3.35 (s, 6 H), 2.01—2.06 (m， 2 H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) S 152.3， 139.1, 116.7， 115.6， 102.1, 64.5， 53.2, 32.8; GC—MS (m/z)以CnHnN03: 211.3計(jì)算，發(fā)現(xiàn)211,148,109,75。步驟E:制備mPEG醛A二甲基乙縮醛溫和加熱下將20 kDa線性mPEG"-OH (60.0 g， 3 mmol)溶解于300 mL干燥 的二氧六環(huán)中。溶液冷卻至室溫后，依次加入N,N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(5.0 g, 19.5 mmol)和4《二甲氨基)吡啶(2.5 g, 20.4 mmol)。反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?24h。然后向反應(yīng)混合物中加入3《4~氨基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛(15.0 g, 71.0 mmol)。在室溫又?jǐn)嚢柙摶旌衔?8h后，超過4h時(shí)間內(nèi)滴加MTBE (4.5 L)。 收集生成的白色沉淀并在真空干燥以產(chǎn)生59.5 g粗產(chǎn)物，其再次溶解于二氯甲 烷(250mL)。超過4小時(shí)時(shí)間內(nèi)滴加另一批MTBE(6.0L)。收集因此獲得的白 色沉淀并在真空干燥以得到作為白色粉末的mPEG醛A 二甲基乙縮醛(58.0 g， 97%)。 'H NMR (400 MHz, DMSO—d6) 5 9.54 (br, 1 H)， 7.35 (d, J = 8.8 Hz, 2 H)， 6.85 (d, /= 8.8 Hz， 2 H)， 4.56 (t, J= 5.6 Hz, 1 H)， 4.17 (t， 4.4 Hz, 2 H), 3.93 (t, 9.6 Hz, 2 H), 3.25 (s， 6 H)， 3.24 (s, 3 H)， 1.93-1.97 (m, 2 H)。步驟F:制備mPEG醛A將mPEG醛A 二甲基乙縮醛(55.0 g, 2.75 mmol)溶解于緩沖液(600 mL,檸 檬酸-HCl-NaCl, pH=2)。在室溫?cái)嚢柙撊芤?0h并用二氯甲垸(6 x 200 mL)提 取。合并有機(jī)提取物，用鹽水洗滌，用無水Na2S04干燥并在真空中濃縮至體積約350mL。然后在超過6h的時(shí)間內(nèi)滴加MTBE(6.0L)。收集生成的白色沉 淀并在真空干燥以得到作為白色粉末的mPEG醛A(52.0 g, 95%)。 ^ NMR (400 MHz, DMSOd6) 5 9.73 (s， 1 H)， 9.56 (br， 1 H)， 7.36 (d, J= 8.8 Hz， 2 H), 6.86 (d, /= 8.8 Hz， 2 H), 4.23 (t, 6.0 Hz, 2 H), 4.17 (t, /= 4.8 Hz, 2 H)， 3.32 (s, 3 H), 2.83-2.87(m，2H)。制備mPEG醛B:歩驟A:制備4- (4-硝基苯氧基)丁-l-醇室溫下，超過15min的時(shí)間內(nèi)，將/>~硝基氟苯(10.0 g, 70.7 mmol)緩慢加 入到l， 4-丁二醇(31.9 g, 354讓ol)和氫氧化鉀(5.0g， 89.1 mmol)的混合物。室 溫下攪拌混合物lh。然后將其倒入水中并用二氯甲垸提取。有機(jī)提取物用鹽 水洗滌，用無水MgS04干燥并在真空中濃縮以得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物從乙酸乙 酯-己烷重結(jié)晶以得到作為白色固體的4-(4-硝基苯氧基)丁-l-醇。& NMR (400 MHz, CDC13) S 8.22 (d, /= 8.8 Hz, 2 H)， 6.98 (d, /= 8.8 Hz， 2 H)， 4.14 (t, 6.0 Hz, 2 H), 3.80—3.75 (m, 2 H)， 2.00—1.94 (m, 2 H), 1.83—1.76 (m， 2 H), 1.65—1.48 (br, 1 H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) S 164.0, 141.4， 125.9, 114.4， 68.6, 62.3， 29.0， 25.5; GC-MS (m/z)以C10H13NO4: 211.2計(jì)算，發(fā)現(xiàn)211,139,123， 109, 73， 55。歩驟B:制備4- (4-硝基苯氧基)丁醛使用步驟8中所述的制備111 ￡0醛八的方法從4- (4-硝基苯氧基)丁-l-醇以81%的產(chǎn)率獲得作為白色固體的4- (4-硝基苯氧基)丁醛。iHNMR(400 MHz, CDC13) S 9.86 (s， 1 H), 8.17 (d, /= 8.8 Hz， 2 H)， 6.94 ((!， /= 8.8 Hz， 2 H)， 4.12 (t， 《/= 6.0 Hz, 2 H), 2.71 (t, /= 6.0 Hz， 2 H), 2.18 (m, 2 H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) S 200.3， 162,8， 140.5, 124.9， 113.5, 66.7， 39.3， 20.7; GC—MS (m/z) 以C10H NO4: 209.2計(jì)算，發(fā)現(xiàn)209， 139, 123, 109， 71。步驟C:制備4- (4-硝基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛使用步驟<:中所述的制備111 ￡0醛八的方法從4- (4-硝基苯氧基)丁醛 以82%的產(chǎn)率獲得作為淡黃色固體的4- (4-硝基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛。'H NMR (400 MHz, CDC13) 5 8.19 (d, /= 8.8 Hz, 2 H), 6.96 (d， /= 8.8 Hz, 2 H)， 4.62 (t, 5.6 Hz, 1 H)， 4.10 (t, J= 5.6 Hz, 2 H), 3.37 (s, 6 H), 1.90—1.93 (m, 2 H), 1.85-1.81 (m, 2 H); 13C NMR(勵(lì)MHz， CDC13) 5 163.9， 141.3, 125.8， 114.3， 104.0， 68.3, 52.9， 28.9， 24.1; GC—MS (m/z)以C12H17N05: 255.3計(jì)算，發(fā)現(xiàn)255， 224, 192, 117， 75。步驟D:制備4- (4-氨基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛將4- (4-硝基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛(4.0g， 15.7mmol)溶解于甲醇(40 mL)中，并在10%鈀碳(0.4 g)存在下在室溫氫化16h。通過Celite過濾混合物 后，真空濃縮濾出物以得到粗殘留物，其通過使用50%乙酸乙酯-己垸作為洗 脫劑在中性氧化鋁的柱色譜上被純化以得到作為深紫色液體的4- (4-氨基苯氧 基)丁醛二甲基乙縮醛(2.5 g, 70%)。 & NMR (400 MHz, CDC13) 5 6.70 (d, /= 8.8 Hz， 2 H)， 6.57 (d， /= 8.8 Hz， 2 H), 4.40 (t， /= 5.6 Hz， 1 H), 3.85 (t， J= 5.6 Hz， 2 H), 3.30 (s, 6 H)， 1.78—1.73 (m, 4 H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 5 151.6, 139.9, 115.9, 115.3， 104.0, 67.8, 52.4， 28.8， 24.3; GC—MS (m/z)以C12H19N03: 225.3計(jì) 算，發(fā)現(xiàn)225, 194, 162， 109， 85。歩驟E:制備mPEG醛B二甲基乙縮醛使用步驟E中所述的制備mPEG醛A的方法從20 kDa線性mPEG-OH和 4-(4-氨基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛以93。/。的產(chǎn)率獲得作為白色粉末的mPEG 醛B 二甲基乙縮醛。！HNMR (400 MHz, DMSO~4) 5 9.53 (br， 1 H) 7.35 ((!， / = 8.8 Hz， 2 H), 6.84 (d, /= 8.8 Hz， 2 H), 4.40 (t, /= 5.6 Hz， 1 H)， 4.17 (t, /= 4.4 Hz, 2 H), 3.91 (t， 《/= 9.6 Hz, 2 H)， 3.24 (s, 3 H), 3.23 (s, 6 H)， 1.71—1.63 (m， 4 H)。步驟F:制備mPEG醛B使用步驟F中所述的制備mPEG醛A的方法從mPEG醛B 二甲基乙縮醛 以87%的產(chǎn)率獲得作為白色粉末的mPEG醛B HNMR (400 MHz， DMSO~4) S 9.71 (s， 1 H), 9.54 (br， 1 H), 7.34 (d， /= 8.8 Hz, 2 H), 6.83 (d, 8.8 Hz, 2 H), 4.17 (t, /= 4.8 Hz, 2 H)， 3.91 (t， /= 6.0 Hz， 2 H)， 3.24 (s, 3 H) , 2.60~2.56 (m, 2 H), 1.97—1.93 (m,2H)。制備mPEG醛C:步驟A:制備3- (3-硝基苯氧基)丙-1-醇使用步驟A中所述的制備mPEG醛A的方法從3-硝基苯酚和3-氯-l-醇以 93%的產(chǎn)率獲得作為淡黃色液體的3- (3-硝基苯氧基)丙-l-醇。'HNMR(400 MHz, CDC13) S 7.85 (d， /= 8.0 Hz, 1 H)， 7.78 (s, 1 H), 7.46 (t, /= 8.0 Hz, 1 H), 7.26 (d, / = 8.0 Hz， 1 H), 4.23 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 3.92 (t， / = 6.0 Hz, 2 H), 2.16—2.09 (m, 2 H); l3C NMR (100 MHz, CDC13) 5 159.3， 149.1, 129.9， 121.5, 115.7, 108.7, 65.7, 59.6,31.7。步驟B:制備3- (3-硝基苯氧基)丙醛使用步驟8中所述的制備111 ￡0醛八的方法從3- (3-硝基苯氧基)丙-l-醇以78%的產(chǎn)率獲得作為淡黃色液體的3-(3-硝基苯氧基)丙醛。1HNMR(400 MHz, CDC13) S 9.90 (s, 1 H)， 7.85 (d， >/= 8.0 Hz， 1 H)， 7.75 (s, 1 H), 7.45 (d， J = 8.0 Hz, 1 H), 7.26~7.22 (m, 1 H)， 4.40 (t， /= 6.0 Hz, 2 H)， 2.99 (t， /= 6.0 Hz， 2 H); 13C NMR (100 MHz， CDC13) S 199.1， 158.9, 149.1， 130.0， 121.5, 116.1, 108.7, 62.0, 42.8; GC—MS (m/z)以C9H9N04: 195.2計(jì)算，發(fā)現(xiàn)195, 167， 139， 93, 65。步驟C:制備3- (3-氨基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛使用步驟C中所述的制備mPEG醛A的方法和步驟D中所述的制備mPEG 醛B的方法從3- (3-硝基苯氧基)丙醛以45%的產(chǎn)率獲得作為深紫色液體的 3- (3-氨基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛。'HNMR(400MHz,CDCl3)5 7.04(t，J =8.0 Hz， 1 H), 6.33—6.24 (m, 2 H)， 6.24 (s, 1 H), 4.62 (t, /= 5.6 Hz， 1 H), 4.23 (t, 7= 4.4 Hz, 2 H)， 3.61 (br， 2 H), 3.36 (s, 6 H), 2.08—2.03 (m， 2 H); 13C NMR (100 MHz， CDC13) 5 159.9, 147.6, 130.0， 107.9, 104.5， 102.1， 101.6， 63.6, 53.3, 32.8; GC-MS (m/z)以C H17N03: 211.2計(jì)算，發(fā)現(xiàn)211, 196， 164, 148, 109, 75。步驟D:制備mPEG醛C二甲基乙縮醛使用步驟E中所述的制備mPEG醛A的方法從20 kDa線性mPEG-OH和 3-(3-氨基苯氧基)丙醛二甲基乙縮醛以95y。的產(chǎn)率獲得作為白色粉末的mPEG醛C 二甲基乙縮醛。NMR (400 MHz, DMS0^6) 5 9.72 (br, 1 H), 7.17—7.13 (m, 2 H), 7.01 (d， /= 8.0 Hz, 1 H), 6.85 (d, 8.0 Hz, 1 H), 4.95 (t, /= 5.6 Hz, 1 H)， 4.53 (t， 4.8 Hz， 2 H), 3.95 (t， /= 9.6 Hz, 2 H)， 3.26 (s, 3 H)， 3.24 (s, 6 H)， 2.00—1.95 (m，2H)。步驟E:制備mPEG醛C使用步驟F中所述的制備mPEG醛A的方法從mPEG醛C 二甲基乙縮醛 以95%的產(chǎn)率獲得作為白色粉末的mPEG醛C。 & NMR (400 MHz， DMSO-^) S 9.72 (s, 1 H)， 9.69 (br， 1 H), 7.20 - 7.13 (m, 2 H), 7.01 (d, 8.0 Hz, 1 H), 6.55 (d, /= 8.0 Hz, 1 H), 4.244.07 (m, 4 H), 3.24 (s, 3 H), 2.87 (t, /= 8.0 Hz， 2 H)。制備mPEG醛D:步驟A:制備4- (3-硝基苯氧基)丁-l-醇使用步驟A中所述的制備mPEG醛A的方法從3-硝基苯酚和2-[(4-氯丁 基)氧基]四氫吡喃以81%的產(chǎn)率獲得4- (3-硝基苯氧基)丁-l-醇，隨后在乙 醇中與濃硫酸回流反應(yīng)0.5h。 &NMR (400 MHz, CDC13) S 7.79 (d， /= 8.0 Hz, 1 H)， 7,71 (s， 1 H), 7.41 (t, J= 8.0 Hz, 1 H)， 7.26—7.19 (m, 1 H), 4.08 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 3.73 (t, /= 6.4 Hz， 2 H), 1.96~1.90 (m, 2 H)， 1.89—1.71 (m, 2 H);GC-MS (m/z)以C10H13NO4: 211.2計(jì)算，發(fā)現(xiàn)211, 139， 123， 109， 93, 73, 55。步驟B:制備4- (3-硝基苯氧基)丁醛使用步驟8中所述的制備!11 ￡0醛八的方法從4- (3-硝基苯氧基)丁-l-醇以78%的產(chǎn)率獲得4-(3-硝基苯氧基)丁醛。& NMR (400 MHz, CDC13) S 9.86 (s, 1 H), 7.82 (d, /= 8.0 Hz, 1 H), 7.71 (s, 1 H), 7.42 (t, 8.0 Hz， 1 H), 7.22—7.19 (m, 1 H)， 4.09 (t， /= 6.0 Hz， 2 H)， 2.70 (t, /= 7.0 Hz， 2 H), 2.20—2.14 (m, 2 H)。步驟C:制備4- (3-氨基苯氧基)丁酸二甲基乙縮醛依次使用步驟C中所述的制備mPEG醛A的方法和步驟D中所述的制備 mPEG醛B的方法從4- (3-硝基苯氧基)丁醛以52%的產(chǎn)率獲得4- (3-氨基苯 氧基)丁醛二甲基乙縮醛。！H NMR (400 MHz, CDC13) S 7.10~7.04 (m, 1 H),6.94~6.33 (m, 3 H), 4.43 (t, /= 5.6 Hz, 1 H), 3.92 (t, J= 6.4 Hz, 2 H)， 3.34 (s， 6 H) 1.82-1.78 (m， 4 H); 13C NMR (100 MHz， CDC13) 5 160.1, 164.5， 130.1，跳3, 105.3, 104.3, 102.1， 67.3， 52.8, 29.1, 24.5; GC—MS (m/z)以C12H19N03: 225.3計(jì) 算，發(fā)現(xiàn)225， 194, 164， 109,85。歩驟D:制備mPEG醛D二甲基乙縮醛使用歩驟E中所述的制備mPEG醛A的方法從20 kDa線性mPEG-OH和 4-(3-氨基苯氧基)丁醛二甲基乙縮醛以90。/。的產(chǎn)率獲得作為白色粉末的mPEG 醛D 二甲基乙縮醛。'H NMR (400 MHz, DMS0^6) S 9.71 (br, 1 H), 7.16—7.12 (m， 2 H)， 7.01 (d, 8,8 Hz, 1 H)， 6.54 (d， 《/= 8.8 Hz, 1 H), 4.95 (t, /= 5.6 Hz, 1 H)， 4.20 (t， /= 4.8 Hz, 2 H)， 3.92 (t, J= 6.0 Hz， 2 H)， 3.25 (s， 6 H)， 3.24 (s， 3 H)， 1.71—1.64 (m, 4 H)。步驟E:制備mPEG醛D使用步驟F中所述的制備mPEG醛A的方法從mPEG醛D 二甲基乙縮醛 以95%的產(chǎn)率獲得作為白色粉末的mPEG醛D。 iH NMR (400 MHz, DMSO~4) S 9.72 (s, 1 H)， 9.70 (br， 1 H), 7.16~7.13 (m, 2 H), 7.01 (d, 8.8 Hz, 1 H), 6.53 (d， /= 8.8 Hz, 1 H)， 4.20 (t， ■/= 4.4 Hz, 2 H)， 3.92 (t， /= 6.0 Hz， 2 H)， 3.24 (s， 3 H)， 2.74—2.61 (m, 2 H), 1.98—1.91 (m, 2 H)。實(shí)施例2、制備Ser-Gly-IFN使用人基因組DNA作為模板利用PCR方法克隆修飾的重組人干擾素 ^x2b，艮卩Ser-Gly-IFN?；谌烁蓴_素~01215的側(cè)翼序歹U(GenBank登陸號(hào)弁 NMJ)00605)合成寡核苷酸。得到的PCR產(chǎn)物亞克隆到pGEM-T載體 (Promega)。通過pGEM-T克隆再次PCR擴(kuò)增IFN變體并隨后利用Ndel/BamHI 作為克隆位點(diǎn)亞克隆到蛋白表達(dá)載體pET-24a (Novagen)， 一種T7 RNA聚合 酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)載體。然后將載體pET-24a轉(zhuǎn)化到五.co" BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (Stratagene)株系。通過于卡那霉素(50嗎/mL)和氯霉素(50 pg/mL) 存在下保持轉(zhuǎn)化的co" BL21~CodonPlus (DE 3卜RIL來篩選高表達(dá)克隆。使用極品肉湯培養(yǎng)基(BD, 200 mL)在一個(gè)1000 mL的燒瓶中繁殖BL21—CodonPlus (DE 3)~RIL和Ser-Gly-IFN基因。燒瓶在37°C以230rpm搖 蕩16h。在5L發(fā)酵罐(Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison， NJ)中 進(jìn)行分批和補(bǔ)料-分批發(fā)酵。分批發(fā)酵使用150 mL過夜預(yù)培養(yǎng)的接種物和3 L 帶有卡那霉素(50 |ig/mL)、氯霉素(50ug/mL)、 0.4%丙三醇和0.5% (v/v)痕量 元素(IO g/L的FeS04 *7H20， 2.25 g/L的ZnS04 '71120， 1 g/L的CuS04 '5{120， 0.5 g/L的MnS04 H20， 0.3 g/L的H3B03, 2 g/L的CaCl2 2H20, 0.1 g/L的 (NH4)6Mo7024,0.84 g/L EDTA， 50 ml/L HC1)的極品肉湯培養(yǎng)基。溶解的氧氣濃 度控制在35%而通過加入5N的NaOH水溶液將pH保持在7.2。制備含有600 g/L葡萄糖和20 g/L的MgS04 7H20的供料溶液。當(dāng)pH升高至高于設(shè)置點(diǎn) 的數(shù)值，加入適當(dāng)體積的供料溶液以提高培養(yǎng)物肉湯中的葡萄糖濃度。通過加 入IPTG至終濃度ImM誘導(dǎo)Ser-Gly-IFN基因的表達(dá)并在培育3h后收集培養(yǎng) 物肉湯。用大約比例1:10 (濕重g/mL)的TEN緩沖液(50 mM Tris-HCl (pH 8.0)， lmMEDTA， 100 mM NaCl)重懸浮收集的細(xì)胞團(tuán)，并利用微射流機(jī)破碎，然 后于lO，OOOrpm離心20min。用TEN緩沖液沖洗含有包涵體(IB)的團(tuán)粒2 次并按上述離心。然后在150 mL的4 M鹽酸胍(GuHCl)水溶液中懸浮含IB 的團(tuán)粒并在20,000 rpm離心15min。然后在50 mL的6 M GuHCl溶液中溶解 該IB。 GuHCl溶解的材料然后在20,000 rpm離心20min。通過在1.5 L新制備 的重折疊緩沖液(100mMTris-HCl(pH8.0)， 0.5ML-精氨酸，2mMEDTA)中 稀釋變性的IB開始重折疊，該緩沖液只在加入時(shí)攪拌。允許重折疊反應(yīng)混合 物在不攪拌下混合48h。用20 mM Tris緩沖液(帶有2 mM EDTA和0.1M尿素， pH 7.0)透析重折疊的重組人干擾素^0C2b(即，Ser-Gly-IFN)用于Q~Sepharose 柱色譜進(jìn)一步純化。將重折疊后的重組人蛋白Ser-Gly-IFN上樣到Q~Sepharose柱(GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA)。柱被預(yù)平衡并用20 mM Tris-HCl緩沖液 (pH 7.0)沖洗。產(chǎn)物用20 mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)和200 mM NaCl的混合 物洗脫。含有Ser"Gly-IFN的流分基于其吸收在280 nm收集。通過蛋白檢測(cè) 試劑盒利用Bradford方法(Pierce, Rockford, IL)確定Ser-Gly-IFN的濃度。實(shí)施例3、 mPEG醛A和Ser-Gly-IFN的結(jié)合包括mPEG醛A和Ser~Gly-IFN的代表性多肽-聚合物結(jié)合物按下述制備 將上述實(shí)施例2中制備的Q~Sepharose純化的Ser~Gly-IFN (1 mg)與 mPEG醛A—起處理。最終的反應(yīng)混合物含有50mM磷酸鈉(pH6.0)， 5 mM 硼氫化氰鈉(Aldrich, Milwaukee, WI)和lOmg的mPEG醛A。然后在室、溫i咅 育該混合物20h以形成作為主要產(chǎn)物的單-PEG化的Ser^ly-IFN，然后用SP XL Sepharose色譜(GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA)純化其。具體i也， 用20 mM乙酸鈉(pH 5.4)預(yù)平衡和沖洗SP柱。然后用含有20 mM乙酸鈉(pH 5.4)和60 mM NaCl的緩沖液洗脫單-PEG化的Ser-Gly-IFN。未反應(yīng)的IFN(即 Ser-Gly-IFN)通過含有20 mM乙酸鈉(pH 5.4)和200 mM NaCl的緩沖液洗脫。 通過12%的十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠的凝膠電泳分析被洗脫流分并且 通過考馬斯亮藍(lán)染色R-250和銀染檢測(cè)該信號(hào)?；谄浔Ａ魰r(shí)間和在280 nm 的吸收收集含單-PEG化的Ser-Gly-IFN的流分。通過蛋白檢測(cè)試劑盒利用 Bradford方法(Pierce， Rockford， IL)確定單-PEG化的Ser-Gly-IFN的濃度。單 -PEG化的Ser-Gly-IFN的分離產(chǎn)率是30% 40%。實(shí)施例4、單-PEG化的Ser-Glv-IFN的物理特性和生物學(xué)特性利用Ser~Gly-IFN和單-PEG化的Ser-Gly-IFN的胰蛋白酶的肽圖譜確定 上述PEG化反應(yīng)的專一性。真空干燥100嗎每種化合物的樣品并在60 pL的 8 M尿素/0.4 M NH4HC03溶液中重組成。用還原劑和吲哚乙酸處理后，用來 自Promega的胰蛋白酶(測(cè)序級(jí))消化該溶液。收集進(jìn)樣并注射到C18 HPLC 柱。利用在0.1% TFA-H20中含有0-70%乙腈的75-min梯度洗脫劑分離生成 的胰蛋白酶肽。來自Ser"Gly-IFN和單-PEG化的Ser-Gly-IFN樣品中的肽流 分通過其在214nrn的吸收率檢測(cè)并手工收集，用Speed-Vac系統(tǒng)干燥，以及 進(jìn)行MALDI-TOF分析。來自兩種樣品的數(shù)據(jù)比較顯示PEG化反應(yīng)的主要位 點(diǎn)發(fā)生在Ser-Gly-IFN的N-末端。在被水泡性口炎病毒(VSV)攻擊的牛腎上皮細(xì)胞(MDBK)中檢測(cè)單-PEG 化的SeM31y-IFN和其他修飾的人IFN-ot2b變體的單-PEG化產(chǎn)物(即單-PEG 化畫Gly-Ser畫IFN,畫Met畫Met畫IFN,誦Met-His誦IFN, -Pro畫IFN禾口國(guó)Gly國(guó)Met畫IFN)的抗病 毒活性。通過向檢測(cè)中加入四唑鹽WST-1然后從存活細(xì)胞酶的甲暨的形成確 定感染細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。對(duì)每種濃度利用三重復(fù)數(shù)據(jù)值進(jìn)行CPE生物檢測(cè)?；谔峁?0%細(xì)胞保護(hù)(EC5Q，即50%細(xì)胞病變效應(yīng))的濃度計(jì)算所有這些單-PEG化修飾的人IFN"(X2b化合物的特異性抗病毒活性。CPE抗病毒 生物檢測(cè)的結(jié)果以IU/mg單位使用Roferor^作為參考標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告。結(jié)果顯示單 -PEG化的Ser-Gly-IFN的CPE生物活性是2.0 x 1(f而其它單-PEG化的人 IFN-0C2b變體的CPE生物活性在8.3 x io6 2.9 x 107 IU/mg的范圍內(nèi)。其它實(shí)施方式本說明書中公開的所有特征可以以任何結(jié)合來組合。本說明書中公開的每 種特征可以被用于相同、等效或類似目的的替代特征所代替。因此，除非另有 說明，公開的每種特征僅僅是通用的等效或類似特征系列的實(shí)例。從上述說明中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易地確定本發(fā)明的必要特征，并且 可以對(duì)發(fā)明進(jìn)行各種改變和修改以使其適用于各種用途和條件而不背離其精 神和范圍。因此，其它實(shí)施方式也在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種多肽-聚合物的結(jié)合物，包括多肽部分；聚環(huán)氧烷部分；將多肽部分與聚環(huán)氧烷部分連接的接頭；多肽部分和接頭間的第一聯(lián)接；以及聚環(huán)氧烷部分和接頭間的第二聯(lián)接；其中多肽部分含有人干擾素-α部分和在人干擾素-α部分的N-末端的1-6個(gè)其它氨基酸殘基；聚環(huán)氧烷部分含有1-20,000 C1-C8環(huán)氧烷重復(fù)單元；接頭是C1-C8亞烴基、C1-C8雜亞烴基、C3-C8環(huán)亞烴基、C3-C8雜環(huán)亞烴基、亞芳基、雜亞芳基、亞芳烷基或-Ar-X-(CH2)n-，其中Ar是亞芳基或雜亞芳基，X是O、S或N(R)，R是H或C1-C10烷基，和n是1-10；和第一聯(lián)接和第二聯(lián)接的每個(gè)可以獨(dú)立地是羧酸酯、羰基、碳酸酯、酰胺、氨基甲酸鹽、尿素、醚、硫基、磺酰基、亞磺?；被?、亞氨基、羥基氨基、膦酸酯、或磷酸酯基團(tuán)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的結(jié)合物，其中所述人干擾素-a部分是人干擾素-Q2b部分。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)合物，其中所述多肽部分是-Ser-Gly-IFN，其 中IFN是人干擾素-ct2b部分。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)合物，其中所述聚環(huán)氧垸部分是含有5-10,000 個(gè)重復(fù)單元的聚環(huán)氧乙垸部分。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的結(jié)合物，其中所述聚環(huán)氧乙垸部分具有數(shù)均分 子量20,000道爾頓。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)合物，其中所述接頭是-Ar-X-(CH2)r。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合物，其中所述Ar是亞苯基。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的結(jié)合物，其中所述X是O。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的結(jié)合物，其中所述n是3。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合物，其中所述第一聯(lián)接是氨基而第二聯(lián)接是氯基甲酸酯基。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的結(jié)合物，其中所述結(jié)合物是<formula>formula see original document page 3</formula>，其中mPEG是甲氧基封端的聚環(huán)氧乙垸部分。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中所述聚環(huán)氧垸部分是含有5-10,000 個(gè)重復(fù)單元的聚環(huán)氧乙烷部分。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的結(jié)合物，其中所述聚環(huán)氧乙垸部分具有數(shù)均 分子量20,000道爾頓。
14、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中所述接頭是-Ar-X-(CH2)n-。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的結(jié)合物，其中所述Ar是亞苯基。
16、 根據(jù)權(quán)利要求15所述的結(jié)合物，其中所述X是O。
17、 根據(jù)權(quán)利要求16所述的結(jié)合物，其中所述n是3。
18、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中所述第一聯(lián)接是氨基而第二聯(lián)接 是氨基甲酸酯基。
19、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中所述人干擾素-a部分具有在N-末端的半胱氨酸殘基。
20、 一種多肽-聚合物的結(jié)合物，包括 多肽部分；聚環(huán)氧垸部分；將多肽部分與聚環(huán)氧烷部分連接的接頭； 多肽部分和接頭間的第一聯(lián)接；以及 聚環(huán)氧垸部分和接頭間的第二聯(lián)接；其中聚環(huán)氧烷部分含有1-20,000 CH^環(huán)氧烷重復(fù)單元；接頭是 -Ar-X-(CH2)n-，其中Ar是亞芳基或雜亞芳基，X是O、 S或N(R)， R是H或 CH^烷基，和n是1-10;和第一聯(lián)接和第二聯(lián)接的每個(gè)可以獨(dú)立地是羧酸酯、 羰基、碳酸酯、酰胺、氨基甲酸鹽、尿素、醚、硫基、磺酰基、亞磺酰基、氨 基、亞氨基、羥基氨基、膦酸酯、或磷酸酯基團(tuán)。
21、 根據(jù)權(quán)利要求20所述的結(jié)合物，其中所述Ar是亞苯基。
22、 根據(jù)權(quán)利要求21所述的結(jié)合物，其中所述X是O。
23、 根據(jù)權(quán)利要求22所述的結(jié)合物，其中所述n是3。
24、 根據(jù)權(quán)利要求20所述的結(jié)合物，其中所述多肽部分含有人干擾素-a部分和在人干擾素-a部分的N-末端的1-6個(gè)其它氨基酸殘基。
25、 根據(jù)權(quán)利要求20所述的結(jié)合物，其中所述多肽部分含有干擾素-3部分或粒細(xì)胞集落刺激因子。
26、 一種通式(I)的化合物其中mPEG是甲氧基封端的聚環(huán)氧乙垸部分；R2， R3和R4之一是CHO取代的C, Cu)烷基；以及 其它的Rp R2， R3和R4的每個(gè)獨(dú)立地是H、 d Cu)烷基、C2 do烯基、C2 d。炔基、C3 C加環(huán)烷基、C3 C20環(huán)烯基、C! C20雜環(huán)烷基、C, C20烯基，芳基或雜芳基。
27、 根據(jù)權(quán)利要求26所述的化合物，其中所述mPEG含有5-10,000個(gè)重復(fù)單元。
28、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的化合物，其中所述mPEG具有數(shù)均分子量 20,000道爾頓。
29、 根據(jù)權(quán)利要求26所述的化合物，其中所述R2是CHO取代的丙基或 CHO取代的丁基。
30、 根據(jù)權(quán)利要求26所述的化合物，其中所述R3是CHO取代的丙基或 CHO取代的丁基。
31、 一種多肽，其包括干擾素-a部分和在干擾素-ci部分的N-末端的1-6個(gè)其它氮基酸殘基。
32、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的多肽，其中所述干擾素-a部分是人干擾素-a部分。
33、 根據(jù)權(quán)利要求32所述的多肽，其中所述人千擾素-a部分是人干擾素 -a2b部分。
34、 根據(jù)權(quán)利要求33所述的多肽，其中所述人干擾素-a部分具有在N-末端的半胱氨酸殘基。
35、 根據(jù)權(quán)利要求34所述的多肽，其中所述人干擾素-a部分是野生型干擾素-a部分。
36、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的多肽，其中所述多肽是Ser-Gly-IFN、 Gly隱Ser-IFN、 Met-Met-IFN、 Met-His-IFN、 Pro-IFN或Gly畫Met-IFN，其中IFN是人干擾素-Cl2b部分。
37、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的多肽，其中所述干擾素-a部分是野生型干擾 素-a部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多肽-聚合物的結(jié)合物，其包括多肽部分、聚環(huán)氧烷部分、將多肽部分與聚環(huán)氧烷部分連接的接頭、多肽部分和接頭間的第一聯(lián)接、以及聚環(huán)氧烷部分和接頭間的第二聯(lián)接。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101405024SQ200680053048
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者勞倫斯·I·吳, 布賴恩·T·吳, 沈立明, 鄧克立, 高國(guó)席 申請(qǐng)人:藥華醫(yī)藥股份有限公司