專利名稱：抗骨膜素的抗體和含有該抗體的用于預(yù)防或治療骨膜素相關(guān)疾病的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
02本發(fā)明涉及針對具有抗細(xì)胞粘附作用的骨膜素(periostin) 的抗體，尤其是具有中和抗細(xì)胞粘附作用的能力的抗骨膜素抗體。更 詳細(xì)的是，在心力衰竭等骨膜素相關(guān)疾病的預(yù)防或治療或這些疾病的 診斷中有用的抗體，該抗體為識(shí)別在以心肥大組織為代表的組織重建 的間質(zhì)中特異表達(dá)的，具有抗細(xì)胞粘附作用的骨膜素的剪切變體 (splice variant)的抗骨膜素抗體。
背景技術(shù)：
在本發(fā)明中，所謂"具有抗細(xì)胞粘附活性"是具有剝離粘附 的細(xì)胞或使之脫離的作用。而且，所謂"不具有抗細(xì)胞粘附活性"是 不剝離粘附的細(xì)胞或不使之脫離，此時(shí)，細(xì)胞維持粘附狀態(tài)。通過在 培養(yǎng)板上培養(yǎng)心成纖維細(xì)胞等細(xì)胞使細(xì)胞粘附于培養(yǎng)板上后，添加檢 測用試樣進(jìn)行培養(yǎng)，通過清洗除去玻璃的細(xì)胞后，染色殘留的細(xì)胞， 確認(rèn)粘附的細(xì)胞的殘存狀態(tài)，從而可以評斷抗細(xì)胞粘附活性的有無。
21j而且，本發(fā)明中，作為具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素，優(yōu)選 可以列舉序列號l(大鼠骨膜素PN-1， 838個(gè)氨基酸)，序列號2(人骨 膜素PN-l, 836個(gè)氨基酸比大鼠骨膜素在N末端的信號序列少2個(gè) 氨基酸)，或者序列號8(小鼠骨膜素PN-1)的氨基酸序列構(gòu)成的骨膜 素。而且，作為具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素，還可以列舉由序列號 3(大鼠骨膜素的外顯子-17編碼的27個(gè)氨基酸)，序列號4(人骨膜素 的外顯子-17編碼的27個(gè)氨基酸)或序列號21(小鼠骨膜素的外顯子 -17編碼的27個(gè)氨基酸)所示的氨基酸序列的骨膜素。進(jìn)而，具有由 序列號22(人骨膜素的外顯子-17編碼的氨基酸序列的N末端起第1
位至第9位，9個(gè)氨基酸)，序列號23 (大鼠骨膜素的外顯子-17編碼 的氨基的序列的N末端起第l位至第9位，9個(gè)氨基酸)，或者序列 號24 (小鼠骨膜素的外顯子-17編碼的氨基酸序列的N末端起第1位至 第9位，9個(gè)氨基酸)所示的氨基酸序列的骨膜素。進(jìn)而還可以列舉具 有序列號34(人骨膜素的外顯子-17編碼的氨基酸序列的N末端起第1 位至第6位，6個(gè)氨基酸)所示的氨基酸序列的骨膜素。
22作為骨膜素的抗細(xì)胞粘附活性相關(guān)區(qū)域，可以列舉例如外顯 子-17的剪切部位。具體而言，可以列舉例如具有序列號1所示的氨 基酸序列的骨膜素的序列號3所示的氨基酸殘基部分(序列號1的 672-698位氨基酸)，具有序列號2所示的氨基酸序列的骨膜素的序列 號4所示的氨基酸殘基部分(序列號2的670-696位氨基酸)，具有序 列號8所示的氨基酸序列的骨膜素的序列號21所示的氨基酸殘基部分 (序列號8的672-698位氨基酸)。進(jìn)而，還可以列舉序列號22或序列 號23所示的氨基酸序列，以及序列號34(序列號22或序列號23所示 的氨基酸序列和序列號22或序列號23的N末端的第l位至第6位的 氨基酸殘基的氨基酸序列)。 、 NS-1-Ag4/1 (NS-1)、 P3-X63Ag8U.1 (P3U1) [Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81，l-7 (1978): 從ATCC獲得，ATCC號CRL-1597]、 P3-NS1-1-Ag4-1、 P3-X63Ag8 (P3)、 F0、 X63Ag8.653(X63. 653) 、 210, RCY3. Agl. 2. 3 、 S194/5XXO. BU1 、 SKO-007、 GM15006TG-A12等，大鼠中可適當(dāng)使用Y3.Agl.2. 3等。作 為優(yōu)選的融合促進(jìn)劑，除了例如平均分子量為1000-6000的聚乙二醇 (PEG)之外還可以使用仙臺(tái)病毒。融合時(shí)的脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的 混合比率一般優(yōu)逸在10: 1-2: 1。計(jì)算的方 法進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。這樣獲得的本發(fā)明的單克隆抗體，特異性識(shí)別 具有序列號1或2所示的氨基酸序列，序列號3或4所示的氨基酸序 列，序列號34所示的氨基酸序列的骨膜素(PN-1)，序列號3或4所示 的氨基酸序列構(gòu)成的肽，或具有序列號34所示的氨基酸序列的肽。優(yōu) 選，本發(fā)明的單克隆抗體可以特異性識(shí)別并結(jié)合氨基酸序列 YTTKIITKVV(序列號26)構(gòu)成的肽，即人骨膜素外顯子-17肽鏈的氨基
酸序列(序列號4)中N末端的第1位的酪氨酸至第9位的纈氨酸的氨 基酸序列構(gòu)成的肽，和人骨膜素PN-1的氨基酸序列(序列號2)中N 末端的第669位的酪氨酸至第679位的纈氨酸的氨基酸序列構(gòu)成的肽。 即，可以特異性識(shí)別人骨膜素外顯子-17肽鏈的氨基酸序列(序列號4) 中N末端的蘇氨酸至第9位的纈氨酸的氨基酸序列部位(TTKIITKVV; 序列號22)或其一部分。更優(yōu)選的是，本發(fā)明的單克隆抗體可以特異 性結(jié)合人骨膜素外顯子-17肽鏈(序列號4)的N末端第-l位的酪氨酸 至第9位的纈氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV;序列號26)構(gòu)成的肽中， N末端第l位至第8-10位的氨基酸被取代為丙氨酸的肽。即，可以特 異性識(shí)別人骨膜素外顯子-17肽鏈的氨基酸序列(序列號4)或大鼠骨 膜素外顯子-17肽鏈的氨基酸序列(序列號3)的至少N末端第l位的蘇 氨酸至第6位的蘇氨酸的氨基酸序列部位(序列號34)或其一部分。進(jìn) 而，本發(fā)明的單克隆抗體具有抑制或阻礙人骨膜素-1蛋白質(zhì)的抗細(xì)胞 粘附作用，即中和人骨膜素-1蛋白質(zhì)的抗細(xì)胞粘附作用的活性。進(jìn)而， 可以抑制心衰竭時(shí)等引起的心臟擴(kuò)張，心臟肥大和心臟纖維化，改善 心臟機(jī)能。在1個(gè)方式中，本發(fā)明的抗體，抗體片段或衍生物可以用于 預(yù)防或治療與具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素相關(guān)的疾病。所謂與具有
附活性的骨膜素的基因的表達(dá)高，由該基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生增加 的疾病。而且是由于該基因或蛋白質(zhì)的增加而病情惡化的疾病。作為 這種與具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素相關(guān)的疾病，沒有特別的限制，
可以列舉心臟衰竭，心肌梗塞，心臟擴(kuò)張，心臟肥大，心纖維化，心 肌病，心肌炎，瓣膜癥，癌癥，動(dòng)脈瘤，動(dòng)脈硬化，中樞神經(jīng)變性疾 病，腎臟病，關(guān)節(jié)風(fēng)濕病，骨質(zhì)疏松癥，肺氣腫，肺高血壓癥，慢性 閉塞性肺疾病(COPD)，腎炎(急性和慢性)，胰腺炎(急性和慢性)，肝 炎(急性和慢性)，肝纖維癥或肺纖維癥。而且，作為可以使用本發(fā)明 的抗體的癌癥，并不限于此，可以列舉，例如乳癌，大腸癌，肺癌， 惡性黑色素瘤，骨癌，胰腺癌，胃癌，皮膚癌，子宮癌，卵巢癌，直 腸癌，結(jié)腸癌，子宮癌，卵管癌，食道癌，小腸癌，曱狀腺癌，副甲
狀腺癌，副腎癌，前列腺癌，膀胱癌和腎癌，特別合適的可以列舉乳 癌，大腸癌，肺癌和惡性黑色素瘤。本發(fā)明的藥物組合物的給藥量，在可以在治療中使用時(shí)，對 于治療有效的給藥量可以被確定，給藥量根據(jù)給藥對象的年齡，體重， 癥狀的程度和給藥途徑等而不同，根據(jù)各個(gè)情況來決定。通常，通過 口服給藥時(shí)，成人每日的給藥量約為0. 1-1000mg，可以分成1-數(shù)次給
藥。在持續(xù)靜脈給藥中，可以在0. OlMg/kg/min-1. Qug/kg/min的范 圍內(nèi)給藥，理想的是在0. 025 n g/kg/min-0. 1 ji g/kg/min的范圍內(nèi)給藥。
50以下，使用實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)而具體的說明，當(dāng)本發(fā) 明并不限于這些實(shí)施例。 實(shí)施例通過排除法進(jìn)行的骨膜素的檢索
1-1心衰竭病狀模型大鼠的制備和左心室試樣的摘取
從6周大時(shí)開始用含有8%的食鹽的高含鹽食品銅養(yǎng)雄性Dahl食
鹽感受性大鼠(Dahl-S)(清水實(shí)驗(yàn)材料)，心臟肥大期(ll周)和心衰竭
期(14周)時(shí)各摘取三只的左心室。511-2 mRNA的制備
使用ISOGEN(Nippon gene社)按照說明書中記栽的方法從約 500mg上述左心室中制備總RNA 。 接著，用 Fast Track 2. OKit(Invitrogen公司)從放入了心臟肥大期，心衰竭期的各3只的 總RM約400 pg中，按照說明書記載的方法純化mRM,分別回收了 約3 |a g的mRNA。大鼠骨膜素cDNA的克隆
大鼠骨膜素cDNA的分離，使用基于SF014的堿基序列設(shè)計(jì)的引 物(1)5' -GTTCATTGAAGGTGGCGATGGTC-3'(序列號15)， (2) 5，
-GAGATAAAATCCCTGCATGGTCCT-3，(序列號16)，對由插入于入gtll載 體中的大鼠主動(dòng)脈cDNA文庫(Clontech公司)制備的約4000個(gè)克隆 的10個(gè)峻菌體亞庫(subpool )(總計(jì)約4萬個(gè)克隆)，進(jìn)^f亍PCR篩選， 獲得了 3個(gè)陽性亞庫。對于通過上述PCR對其中的1個(gè)亞庫進(jìn)行擴(kuò)增 獲得的片段，用AlkPhos Direct (Amersham Pharmacia 乂〉司)，采用 經(jīng)堿性磷酸酶標(biāo)識(shí)的探針通過雜交進(jìn)行篩選，獲得了 l個(gè)陽性克隆大 鼠骨膜素#1。將該插入片段整合于pBluescriptII(Stragene公司)的 EcoRI位點(diǎn)，按照制造例1-5的方法測定全堿基序列。于是，使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech公司)， 按照說明書中記載的方法，以大鼠主動(dòng)脈cDNA為模板，使用上述引物 (2)5， -GAGATAAAATCCCTGCATGGTCCT-3，(序列號16)和基于大鼠骨膜 素#1的堿基序列設(shè)計(jì)的引物(3) 5， -CACGGTCGATGACATGGACAACACC-3， (序列號17),進(jìn)行5， -RACE反應(yīng)。將獲得的PCR產(chǎn)物TA克隆到 Invitrogen公司的PCR II栽體中，命名為大鼠骨膜素5， RACE#1。 按照制造例1-5的方法測定堿基序列。Myc-His-大鼠骨膜素融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體的構(gòu)建 制備在由制造例2獲得的大鼠骨膜素基因的編碼區(qū)域翻譯的蛋 白質(zhì)的羧基末端上具有Myc表位和6個(gè)組氨酸標(biāo)記，具有CMV啟動(dòng)子 的表達(dá)載體。桿狀病毒用表達(dá)載體的構(gòu)建
用限制性酶Sacl和Pmel消化制造例3中獲得的質(zhì)粒pcDNA4/
Myc-His/大鼠骨膜素，切出肽片段大鼠PN-1/Myc-His。用連接試劑盒 (寶酒造(林))將其連接到用限制性酶Sacl和Kpnl(鈍化)消化 pFastBacHTc(Invitrogen公司)獲得的載體片段上，將獲得的表達(dá)載 體命名為pFastBac/大鼠PN-1/Myc-His。用制造例1-5中記載的方法 確認(rèn)插入部分的堿基序列。重組桿狀病毒的制備和培養(yǎng)
用制造例5獲得的pFastBac/大鼠PN-1/Myc-His轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH10BAC細(xì)胞，制備重組桿狀病毒。對于獲得的桿狀病毒，通過電泳 和PCR確認(rèn)目的片段插入。大鼠骨膜素蛋白質(zhì)的純化
將2000mL制造例5中獲得的培養(yǎng)上清提供給經(jīng)平衡化緩沖液 (50mM醋酸鈉緩沖液pH6. 0 0. 1M氯化鈉)平衡化的瓊脂糖Fast Flow 10mL bed,獲得的通過級分作為瓊脂糖通過級分。用平衡化緩沖液清洗至280nm處的吸光度達(dá)到0附近(約 lOOmL)，形成瓊脂糖洗脫分級。,飼養(yǎng)2-3周。首先，回收維持在對數(shù)增殖期的 單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤No. 1和No. 3，在除去上清的沉淀餾分的細(xì)胞 中添加不含F(xiàn)CS的RPMI培養(yǎng)基，制備細(xì)胞數(shù)為1 x 10'個(gè)/ml的細(xì)胞液。 將該細(xì)胞液注入于二苯哌酮前給藥了的BALB/c小鼠的腹腔中，3周后 用注射器從腹部回收從后項(xiàng)漏出的腹水。用孔徑為0.22jjmcJ)濾膜過 濾收集的腹水，用蛋白質(zhì)G-瓊脂糖柱(Millipore， 11511324)，通過親 合層析過濾，按照常規(guī)方法純化濾液，制備兩種抗人外顯子-17單克 隆抗體。
實(shí)施例10與實(shí)施例2—樣，將上述人心成纖維細(xì)胞(大日本制藥社 制，目錄號CS-ABI-5118)以6. 4 x 1(T個(gè)/100n 1接種于96孔板上， 培養(yǎng)一夜后，將培養(yǎng)液更換為添加了 10|ag/ml的環(huán)己酰亞胺 (cycloheximide)的 10%FBS 添加 CSC 培養(yǎng)基(Cell System Corporation制)，于37。C培養(yǎng)1小時(shí)。然后，用預(yù)先加熱到37T的 CSC培養(yǎng)基(無血清)清洗細(xì)胞2遍，將按照實(shí)施例制備的人骨膜素-l 蛋白質(zhì)添加到CSC培養(yǎng)基(無血清)中，使終濃度達(dá)到l|Lig/ml。使用 具有細(xì)胞粘附促進(jìn)作用的纖連蛋白作為陽性對照，使用不具有細(xì)胞粘 附促進(jìn)作用的BSA(牛血清白蛋白)作為陰性對照。于37。C培養(yǎng)3.5小 時(shí)后的顯微鏡觀察中，添加了人骨膜素蛋白質(zhì)的組細(xì)胞完全剝離，用 PBS(-)清洗2次后，用10%中性緩沖福爾馬林液固定細(xì)胞30分鐘。然 后，用PBS(-)清洗3次后，用甲基紫染色30分鐘。然后，用550nm 的讀板儀(BIO-RAD，Model 680 MICRO讀板儀)測定細(xì)胞的染色度(圖 10)。其結(jié)果是，作為對照的纖連蛋白和BSA給藥組和無添加組中沒有 發(fā)現(xiàn)抗細(xì)胞粘附作用，而添加人PN-1蛋白質(zhì)的組中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞的剝
離，由此清楚了 PN-1具有抗細(xì)胞粘附作用。 實(shí)施例1106體外研究抗人外顯子-17單克隆抗體的中和活性
與實(shí)施例3—樣，將上述人心成纖維細(xì)胞以6.4xl(T個(gè)/100ial 接種于96孔板上，培養(yǎng)一夜后，將培養(yǎng)液更換為添加了 10jag/ml的 環(huán)己酰亞胺(cycloheximide)的10。/。FBS添加CSC培養(yǎng)基，于37。C培養(yǎng) 1小時(shí)。然后，用預(yù)先加熱到37。C的CSC培養(yǎng)基(無血清)清洗細(xì)胞2 遍，將終濃度為1 p g/ml的人骨膜素-1蛋白質(zhì)和抗人外顯子-17肽單 克隆抗體(No. 1和No. 3)添加到CSC培養(yǎng)基(無血清)中，使終濃度達(dá)到 20jig/ml。只使用人骨膜素-1蛋白質(zhì)作為陽性對照，使用BSA作為陰 性對照。于37"C培養(yǎng)3. 5小時(shí)后，在顯微鏡觀察中，只添加了人骨膜 素蛋白質(zhì)的組，細(xì)胞幾乎完全剝離，用PBS(-)清洗2次后，用10%中 性緩沖福爾馬林液固定細(xì)胞30分鐘。然后，用PBS(-)清洗3次后， 用曱基紫染色30分鐘。然后。用550nm的讀板儀(BI0-RAD，Model 680 MICRO讀板儀)測定細(xì)胞的染色度(

圖11)。其結(jié)果是，判明了抗人外 顯子-17單克隆抗體是具有抑制人骨膜素-1蛋白質(zhì)的抗細(xì)胞細(xì)胞粘附 作用，即即中和人骨膜素-1蛋白質(zhì)的抗細(xì)胞粘附作用的活性的抗體。
而且，如上所述，通過針對人骨膜素-l蛋白質(zhì)的外顯子-17且特 異性識(shí)別外顯子-17的N末端第l位-第6位的氨基酸序列或其部分的 抗體，人骨膜素-1蛋白質(zhì)的抗細(xì)胞粘附作用受到抑制，提示外顯子 -17，至少由外顯子-17的N末端第l位-第6位的氨基酸序列或其部 分構(gòu)成的肽部分或其一部分構(gòu)成與人骨膜素-1蛋白質(zhì)的抗細(xì)胞粘附 作用相關(guān)的區(qū)域。
實(shí)施例17使用急性心肌梗塞模型大鼠的抗人外顯子-17單克隆抗體 的效果
' 與實(shí)施例4相同，用體重為250-300g的雄性Lewis大鼠，在腹 腔給藥戊巴比妥麻醉劑(0. lmg/100g)充分麻醉后，固定在大鼠用手術(shù) 臺(tái)上。經(jīng)口插入氣管，連接到大鼠用呼吸器上(一次換氣量3ml， 80
次/分)，從左胸骨第3肋間橫切開皮膚，再橫切開位于其下的大胸肌, 此外再用大鼠用開胸器擴(kuò)張肋間，露出心臟。
[108然后，用直徑為5mm的曲針用1. 0絲綁住位于左心房下方 附近的左冠動(dòng)脈。此時(shí)左冠動(dòng)脈的環(huán)流區(qū)域-前壁和側(cè)壁由紅色變?yōu)榘?色，冠脈血流量被充分阻斷，目視確認(rèn)相同部位的壁運(yùn)動(dòng)消失(在 Shamop操作組中，在冠動(dòng)脈中通入針后，不用絲綁住而拔出針)，用 3. 0絲綁住第3肋骨和第4肋骨，并固定(此時(shí)，排出使肺擴(kuò)張的肺的 外部的空氣，使得肺容易擴(kuò)張后再綁)。然后，用3. 0絲縫合相同的皮 膚切開部位，片刻后開始觀察，確認(rèn)意識(shí)恢復(fù)，逐漸自己發(fā)出呼吸后， 拔管。
[109按照以上步驟，依次制備急性心肌梗塞模型。1101次日，用異氟烷經(jīng)鼻麻醉后，進(jìn)行經(jīng)皮的心臟超聲波檢查， 除去梗塞大小不到左心室全周的20%的小梗塞模型。其它的梗塞模型 按照心臟功能的損傷的順序排列，按順序分為分組為抗人外顯子-17 單克隆抗體(No. 3)給藥組和對照抗體(家兔IgG)給藥組，從尾靜脈給 藥各200 ja g。
[111在模型制作的次日給藥抗體，再在初次給藥的每六天給各 組給藥4次。
[112另一方面，在直至4周后，每一周用心臟超聲波檢查經(jīng)胸 壁評價(jià)心臟。模型制作4周后的心臟超音波檢查的結(jié)果是，在給藥抗 人外顯子-17單克隆抗體的組中，與給藥兔IgG的對照組相比，心臟 的前壁厚和后壁厚的變薄明顯受到抑制，擴(kuò)張末期心臟內(nèi)徑和收縮末 期心臟內(nèi)徑的擴(kuò)大受到抑制，并且心臟的收縮機(jī)能的指標(biāo)-FS值或EF 值上升?？傊?，清楚了心臟擴(kuò)大受到抑制，心臟機(jī)能得以改善(圖12-1 至圖12-3)。
而且，如上所述，在急性心肌梗塞模型大鼠中，通過針對人骨膜 素-1蛋白質(zhì)外顯子-17,且具有至少含有外顯子-17的N末端第1-6 位的氨基酸序列或其部分而構(gòu)成的表位的抗體，顯示出心臟擴(kuò)大的抑 制和心臟功能的改善效果，由此提示人骨膜素-1蛋白質(zhì)外顯子-17，尤其是至少含有外顯子-17的N末端第1-6位的氨基酸序列構(gòu)成的肽 部分或其部分的區(qū)域是與心肌梗塞后的心臟擴(kuò)張和心臟功能的惡化相 關(guān)的區(qū)域。
工業(yè)上利用的可能性
通過使用針對具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素的抗體，抑制在心臟 衰竭等疾病中表達(dá)增大的具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素的作用，進(jìn)行 病狀的惡化的抑制和組織功能的改善，可以進(jìn)行與骨膜素的疾病的預(yù) 防和治療。而且，通過測定患者試樣中的該骨膜素量，可以了解疾病 的有無以及病狀的進(jìn)行程度。
權(quán)利要求
1、針對具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素的抗體。
2、 針對具有序列號1或序列號2所示的氨基酸序列的骨膜素的抗體。
3、 針對具有序列號3或序列號4所示的氨基酸序列的骨膜素的抗體。
4、 針對具有序列號34所示的氨基酸序列的骨膜素的抗體。
5、 針對與具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素的抗細(xì)胞粘附活性相關(guān)區(qū)域的抗體。
6、 針對具有序列號3或序列號4所示的氨基酸序列或其部分構(gòu)成的肽的抗體。
7、 針對具有序列號34所示的氨基酸序列或其部分的氨基酸序列的肽的抗體。
8、 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)中記載的抗體，所述抗體是特異性識(shí)別 序列號3或4所示的氨基酸序列或其部分的部位的抗體。
9、 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)中記載的抗體，所述抗體是特異性識(shí)別 序列號34所示的氨基酸序列或其部分的肽的抗體。
10、 與序列號26所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽結(jié)合的抗體。
11、 權(quán)利要求l-10任一項(xiàng)中記載的抗體，所述抗體是具有中和抗 細(xì)胞粘附活性能力的抗體。
12、 權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)中記載的抗體，所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
13、 權(quán)利要求12記載的抗體，所述抗體是單克隆抗體。
14、 由雜交瘤細(xì)胞林FERM BP-10718產(chǎn)生的抗體。
15、 權(quán)利要求13中記載的單克隆抗體的部分片段構(gòu)成的抗體片段。
16、 結(jié)合了權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)中記載的抗體或權(quán)利要求15中 記載的抗體片段與蛋白質(zhì)或低分子的藥劑的抗體的衍生物。
17、 產(chǎn)生權(quán)利要求l-14任一項(xiàng)中記載的抗體的雜交瘤。
18、 權(quán)利要求17中記載的雜交瘤，其是雜交瘤細(xì)胞林FERM BP-10718。
19、 DNA，其編碼權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)中記載的抗體、權(quán)利要求 15中記載的抗體片段或權(quán)利要求16中記載的與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體或抗 體片段的衍生物。
20、 含有權(quán)利要求19中記載的DM的重組載體。
21、 通過在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入權(quán)利要求20中記載的重組載體而獲 得的轉(zhuǎn)化體。
22、 抗體，抗體片段，或蛋白質(zhì)與抗體或抗體片段結(jié)合的衍生物 的制備方法，其特征在于培養(yǎng)權(quán)利要求21中記栽的轉(zhuǎn)化體，使權(quán)利要 求l-14任一項(xiàng)中記載的抗體，權(quán)利要求15中記載的抗體片段或權(quán)利要 求16中記載的抗體或抗體片段結(jié)合的衍生物在培養(yǎng)物中生成，從該培 養(yǎng)物中收集該抗體，該抗體片段，或蛋白質(zhì)與抗體或抗體片段結(jié)合的衍 生物。
23、 含有權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)中記栽的抗體，權(quán)利要求15中記 載的抗體片段或權(quán)利要求16中記載的衍生物的藥物組合物。
24、 用于預(yù)防或治療與具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素相關(guān)的疾病 的藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)中記載的抗體，權(quán)利要求 15中記載的抗體片段或權(quán)利要求16中記載的衍生物。
25、 權(quán)利要求24中記載的藥物組合物，前述疾病是心臟衰竭，心 肌梗塞，心臟擴(kuò)張，心臟肥大，心纖維化，心肌病，心肌炎，瓣膜癥， 癌癥，動(dòng)脈瘤，動(dòng)脈硬化，中樞神經(jīng)變性疾病，腎臟病，關(guān)節(jié)風(fēng)濕病， 骨質(zhì)疏爭〉癥，肺氣腫，肺高血壓癥，慢性閉塞性肺疾病(COPD)，腎炎， 胰腺炎，肝炎，肝纖維癥或肺纖維癥。
26、 與具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素相關(guān)的疾病的預(yù)防或治療方 法，其由對患者施以權(quán)利要求23的藥物組合物構(gòu)成。
27、 權(quán)利要求26中記載的預(yù)防或治療方法，前述疾病是心臟衰 竭，心肌梗塞，心臟擴(kuò)張，心臟肥大，心纖維化，心肌病，心肌炎，瓣膜癥，癌癥，動(dòng)脈瘤，動(dòng)脈硬化，中樞神經(jīng)變性疾病，腎臟病，關(guān)節(jié)風(fēng)濕病，骨質(zhì)疏松癥，肺氣腫，肺高血壓癥，慢性閉塞性肺疾病(e0PD), 腎炎，胰腺炎，肝炎，肝纖維癥或肺纖維癥。
28、 與具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素相關(guān)的疾病的診斷方法，其 使用權(quán)利要求l-14任一項(xiàng)中記載的抗體，權(quán)利要求15中記載的抗體片 段或權(quán)利要求16中記載的衍生物。
29、 權(quán)利要求28中記載的診斷方法，前述抗體是標(biāo)記的抗體。
30、 權(quán)利要求28或29中記載的診斷方法，前述疾病是心臟衰竭， 心肌梗塞，心臟擴(kuò)張，心臟肥大，心纖維化，心肌病，心肌炎，瓣膜癥， 癌癥，動(dòng)脈瘤，動(dòng)脈硬化，中樞神經(jīng)變性疾病，腎臟病，關(guān)節(jié)風(fēng)濕病， 骨質(zhì)疏松癥，肺氣腫，肺高血壓癥，慢性閉塞性肺疾病(COPD)，腎炎， 胰腺炎，肝炎，肝纖維癥或肺纖維癥。
31、 標(biāo)記的權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)中記載的抗體，^5L利要求15中 記載的抗體片段或權(quán)利要求16中記栽的衍生物。
32、 定量試樣中的具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素的方法，其使用 權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)中記載的抗體，權(quán)利要求15中記載的抗體片段或 權(quán)利要求16中記載的衍生物。
33、 檢測試樣中的具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素的方法，其使用 權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)中記載的抗體，權(quán)利要求15中記載的抗體片段或 權(quán)利要求16中記載的衍生物。
34、具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素相關(guān)疾病的診斷劑，其使用權(quán)利 要求1-14任一項(xiàng)中記載的抗體，權(quán)利要求15中記載的抗體片段或權(quán)利要 求16中記栽的衍生物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種針對具有抗細(xì)胞粘附活性的骨膜素的抗體，尤其是具有中和抗細(xì)胞粘附作用的能力的抗骨膜素抗體，以及使用該抗體的骨膜素相關(guān)疾病的預(yù)防或治療藥。而且，還提供了使用該抗體的試樣中的該多肽的檢測和定量方法，以及通過用該方法測定骨膜素量從而診斷骨膜素相關(guān)疾病的方法。
文檔編號A61P9/00GK101389656SQ20068005336
公開日2009年3月18日 申請日期2006年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日
發(fā)明者森下龍一, 葛城鳴門, 谷山義明 申請人:阿斯比奧制藥株式會(huì)社;國立大學(xué)法人大阪大學(xué)