專利名稱：：用于藥物遞送的膠束的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及制備用于藥物遞送的膠束的聚合物，還涉及由該聚合物制得的膠束。
背景技術(shù)：
：許多抗癌藥被所有類型的細(xì)胞非特異性地吸收，導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。因此，用于抗癌藥的理想遞送載體應(yīng)該能將藥物特異性地運(yùn)輸?shù)桨┘?xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物分子至其藥理活性部位。最近出現(xiàn)的聚合物膠束為有希望的膠體載體，將水溶性差的藥物或兩親藥物以及基因靶向腫瘤組織。使用這些膠束，由于它們高滲透的血管生成的血管，耙向固體癌癥的藥物可以順利達(dá)到提高的滲透性和保留作用。使用對(duì)周圍溫度或pH敏感的聚合物也可以得到靶向藥物。而且，將生物信號(hào)連接至納米粒子的表面可以實(shí)現(xiàn)活性藥物的靶向，該生物信號(hào)包括抗體、激素、肽和如葉酸的小分子化合物，這些生物信號(hào)能被癌癥細(xì)胞識(shí)別。與抗體、激素和肽相比，葉酸更便宜，更容易與納米粒子結(jié)合，且在運(yùn)輸、貯藏和使用期間更穩(wěn)定。與列出的其它不同，葉酸酯(folate)是非免疫原性的，因?yàn)槿~酸酯自然存在于身體內(nèi)。更重要地，葉酸酯受體時(shí)常表達(dá)于多種人癌癥細(xì)胞類型的表面，且葉酸酯-藥物結(jié)合物或葉酸酯-結(jié)合的納米載體的細(xì)胞吸收是基于葉酸酯受體調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用?？梢哉雇嗨频牟呗裕瑢⒑心z束的藥物在體內(nèi)靶向其它疾病細(xì)胞。人們己經(jīng)全面研究了聚合的核-殼納米粒子(core-shellnanoparticle)，其殼由溫度敏感的聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)或其共聚物構(gòu)成。例如，已經(jīng)報(bào)道了由PNIPAAm-b-聚(甲基丙烯酸丁酉旨)和PNIPAAm-b-聚(D,L-丙交酉旨)嵌段共聚物制得的阿霉素(DOX)-合并的膠束。低于LCST(較低臨界溶液溫度)形成核-殼納米粒子且藥物釋放慢。然而，當(dāng)溫度高于LCST時(shí)，膠束結(jié)構(gòu)變形，包括DOX的釋放。另外，使用通過(guò)LCST的溫度循環(huán)調(diào)節(jié)DOX的釋放。預(yù)期使用溫度感應(yīng)核-殼納米粒子，通過(guò)局部加熱和冷卻達(dá)到暫時(shí)藥物遞送。然而，這種系統(tǒng)遇到不易接近深層組織或腫瘤的不利影響。將藥物靶向腫瘤組織的可選擇方法是使用pH敏感載體?；颊咧写蟛糠止腆w腫瘤的細(xì)胞外pH為5.7至7.8。腫瘤組織液的pH很少降低至低于pH6.5，開(kāi)發(fā)pH變化窄窗的系統(tǒng)具有挑戰(zhàn)性。最近，據(jù)報(bào)道由聚(L-組氨酸)-b-聚(乙二醇)(PEG)制得的核-殼納米粒子對(duì)pH敏感。在pH7.4至6.8時(shí)，這些納米粒子分解，因此釋放附著的藥物，DOX。然而，在pH7.4基于聚(L-組氨酸)-b-PEG的膠束(核-殼納米粒子)不穩(wěn)定，必需與聚(L-丙交酉旨)-b-PEG膠束混合從而提高它們的穩(wěn)定性。并且，響應(yīng)外部pH變化的相變不如溫度變化誘導(dǎo)的變化劇烈。US專利申請(qǐng)?zhí)?0/865,681報(bào)道pH觸發(fā)的熱感應(yīng)的核-殼納米粒子自組裝自兩親三元共聚物聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-N,N-二甲基丙烯酰胺-共-10-十一碳烯酸)[P(NIPAAm-共-DMAAni-共-UA)]。這些膠束改變相(從水溶性，良好分散于水溶液到水不溶性，從水溶液中沉淀)快速響應(yīng)外部pH變化。這些納米粒子顯示pH依賴較低臨界溶液溫度(LCST)。在正常生理環(huán)境(pH7.4)中，納米粒子的LCST較好是高于正常體溫(37GC)，因此納米粒子被良好的分散。然而在酸性環(huán)境(即腫瘤組織、內(nèi)含體或溶酶體)，LCST低于37^，導(dǎo)致核-殼納米粒子的變形和沉淀，且導(dǎo)致附著的藥物分子的最終釋放。本申請(qǐng)公開(kāi)pH觸發(fā)的溫度敏感膠束，該膠束由NIPAAm(溫度敏感)，DMAAm(親水性-調(diào)節(jié)聚合物的LCST)禾QUA(疏水和pH敏感化合物)無(wú)規(guī)共聚物制得。這些膠束具有pH依賴的LCST,其在模擬生理?xiàng)l件下(PBS,pH7.4)高于正常體溫，但在pH6.6或以下低于正常體溫。因此，膠束在生理環(huán)境中是穩(wěn)定的，但在pH6.6或以下就變形和沉淀，釋放附著的藥物分子。這些膠束可以提供用于將抗癌藥遞送至腫瘤組織(微酸性)或用于細(xì)胞內(nèi)藥物遞送的良好載體(從內(nèi)含體-低pH環(huán)境脫離，并由此進(jìn)入胞質(zhì)溶膠)。然而，本申請(qǐng)所述的聚合物是無(wú)規(guī)的兩親共聚物，由其形成的膠束具有彈性核和寬粒度分布。EP00822217公開(kāi)了基于聚(環(huán)氧乙垸)b-聚酯，更特別是聚(環(huán)氧乙烷)b-聚丙交酯或聚內(nèi)酯(polylactone)的二嵌段共聚物。EP00844269公開(kāi)基于聚(環(huán)氧乙垸)b-聚酯或聚(甲基丙烯酸:)的二嵌段共聚物。要求保護(hù)的聚合物與EP00822217中公開(kāi)的聚合物相似。EP00852243公開(kāi)了基于聚(環(huán)氧乙垸)b-聚酯或聚(甲基丙烯酸)的二嵌段共聚物。在聚(環(huán)氧乙垸)嵌段的末端有糖基。要求保護(hù)的聚合物與EP00822217中公開(kāi)的聚合物相似。所有公開(kāi)的聚合物都通過(guò)離子活性聚合來(lái)合成，且都不具有pH和溫度敏感功能。US6224903公開(kāi)了聚合物-脂質(zhì)結(jié)合物。經(jīng)二硫鍵、pH敏感鍵、酶裂解鍵或光化學(xué)裂解鍵將親水聚合物鏈釋放地連接在脂質(zhì)體。親水聚合物鏈釋放后，脂質(zhì)體的疏水段暴露于生理膜，提供與細(xì)胞或脂質(zhì)體膜融合的機(jī)會(huì)。US22082198公開(kāi)了由聚(乙二醇)-b-聚(氨基酸)制得的大分子膠束。所述氨基酸具有氨基或羧基，翻譯可控DNA或蛋白質(zhì)遞送的聚合物。特別是，公開(kāi)了聚(乙二醇)-b-聚(賴氨酸)和聚(乙二醇)-b-聚(門冬氨酸)。US22172711公開(kāi)了聚合物-脂質(zhì)結(jié)合物，與US6224903的結(jié)合物相似。US24077540公開(kāi)了包含生物活性劑和增強(qiáng)粘膜遞送有效量的透化肽的藥物組合物。它要求保護(hù)該藥物組合物與增強(qiáng)膜滲透劑，如表面活性劑、混合膠束或脂質(zhì)體的聯(lián)合應(yīng)用。然而，使用的膠束的類型沒(méi)有被公開(kāi)。WO00226241公開(kāi)了包含藥物遞送配合物的脂質(zhì)，用于基因遞送。所述配合物包括聚(乙二醇)、脂質(zhì)(例如DOTAP,DOPE,DOPC,DSPE,DLPE等)、聚陽(yáng)離子(即PEI)和耙向肽。9WO04002404公開(kāi)將藥物靶向腫瘤的pH敏感嵌段共聚物。所述嵌段共聚物由聚(L-組氨酸)、聚(乙二醇)、聚(L-乳酸沐/或聚(乳酸-共-羥基乙酸)制備。然而，所述聚合物不包含將共聚物靶向腫瘤的靶向成分。US25025821公開(kāi)了與WO04002404所公開(kāi)的相似的聚合物。特別是，公開(kāi)了包含聚(L-組氨酸)-聚(乙二醇)嵌段共聚物和聚(L-乳酸)-聚(乙二醇)嵌段共聚物的混合膠束。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是克服或?qū)嵸|(zhì)上改善上述至少一個(gè)缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明第一方面是提供包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段的嵌段共聚物，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分。各個(gè)疏水單體單元可以包含至少一個(gè)pH-敏感部分，或者一個(gè)或多個(gè)可以包含至少一個(gè)pH-敏感部分且其它的可以不包含pH-敏感部分。各個(gè)溫度敏感單體單元可以與其它溫度敏感單體單元相同，或者一些可以是相同的且一些可以是不同的。各個(gè)親水單體單元可以與其它親水單體單元相同，或者一些可以是相同的且一些可以是不同的。各個(gè)靶向單體單元可以與其它靶向單體單元相同，或者一些可以是相同的且一些可以是不同的。各個(gè)疏水單體單元可以與其它疏水單體單元相同，或者一些疏水單體單元相同且一些疏水單體單元可以不同。所述嵌段共聚物可以采用共聚物是核-殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)造，該核-殼結(jié)構(gòu)具有疏水核和親水殼，其中至少一些耙向單體單元位于親水殼中。所述嵌段共聚物可以具有各個(gè)嵌段中的一個(gè)，或者可以具有多于一個(gè)的第一嵌段、第二嵌段，或者同時(shí)具有第一和第二嵌段。所述嵌段共聚物可以是AB嵌段共聚物。所述pH-敏感部分可以是酸性部分或堿性部分。其可以是例如羧酸、磺酸、亞磺酸、膦酸、次膦酸、硫羧酸、二硫羧酸或者一些其它酸性部分，或者其可以是任選被取代的胺。所述pH-敏感部分可以是能引起嵌段共聚物改變構(gòu)造響應(yīng)介質(zhì)pH變化的部分，其中嵌段共聚物位于介質(zhì)中。所述疏水單體單元來(lái)自能聚合的不飽和脂肪酸，例如末端不飽和((o-l不飽和)脂肪酸。所述脂肪酸可以包含大約2至大約50個(gè)或更多個(gè)主鏈碳原子，或大約2至20、2至10、2至5、5至50、5至30、5至20、5至10、10至50、20至50、10至40、10至30或10至20，例如大約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45或50個(gè)主鏈碳原子。它可以包含一個(gè)碳-碳雙鍵(單不飽和)，或者可以包含至少2個(gè)，例如2、3或多于3個(gè)碳-碳雙鍵(多不飽和)。其可以是co-l脂肪酸。所述脂肪酸可以是例如(E)-9-十八碳烯酸、(Z)-9-十八碳烯酸、(Z)-ll-十八碳烯酸、(E)-9-十六碳烯酸、(Z)-9-十六碳烯酸、(Z)-9-十四碳烯酸、(Z)-ll-二十碳烯酸、(Z)-13-二十二碳烯酸、(Z)-15-二十四碳烯酸、4-戊烯酸、7-辛烯酸、10-十一碳烯酸、15沖六碳烯酸、19-二十碳烯酸、(E,E)-9，12-十八碳二烯酸、(Z,Z)-9，12-十八碳二烯酸、(E，E)-9,11-十八碳二烯酸、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸、(Z,Z,Z)-6,9,12-十八碳三烯酸、(Z,Z,Z，Z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸、(Z,Z，)-lU4-二十碳二烯酸、(Z,Z,Z)-5,8,ll-二十碳三烯酸、(Z,Z,Z)-ll,14,17-二十碳三烯酸、(Z,Z,Z)-8，11,14-二十碳三烯酸、(Z,Z,Z,Z)-8，11,14,17-二十碳四烯酸、(Z,Z,Z,Z)-5,8,11,14-二十碳四烯酸、(Z,Z,Z,Z，Z)-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、(Z,Z)-13，16-二十二碳二烯酸、(Z,Z，Z)-13,16，19-二十二碳三烯酸、(Z,Z,Z,Z)-7,10,13,16-二十二碳四烯酸、(Z,Z,Z，Z,Z)-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、(Z,Z,Z,Z，Z)-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸、(Z,Z,Z,Z，Z,Z)-4,7,10,13,16，19-二十二碳六烯酸或(Z,Z,Z,Z,Z，Z)-6,9，12，15,18,21-二十四碳六烯酸，或任意兩種或多種這些化合物的混合物。它可以是直鏈或支化的。它可以包含或不包含環(huán)狀結(jié)構(gòu)。所述溫度敏感單體單元可以改變其親水性以響應(yīng)溫度的變化。所述溫度敏感單體單元可以賦予嵌段共聚物隨溫度變化的構(gòu)造。它可以賦予嵌段共聚物隨溫度變化的親水性。它可以是能脫水(即失去一個(gè)或多個(gè)水合的水)響應(yīng)溫度升高的單體單元。所述溫度敏感單體單元可以來(lái)自例如，N-丙烯?；哙ぁ-丙烯?；量┩?、N-羥丙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、N-叔丁基丙烯酰胺、N-哌啶基甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、N-甲基丙烯?；哙?、N-甲基丙烯酰基吡咯酮、N-羥丙基甲基丙烯酸酯、羥丙基纖維素、N-甲基丙烯酸叔丁酯、N,N-二乙基甲基丙烯酰胺或N-異丙基甲基丙烯酰胺。所述親水單體單元包含酰胺、羧酸、羧酸酯、胺、羥基胺、二醇或醇。它可以來(lái)自例如丙烯酸、丙烯酰胺、丙烯酸酯、吡咯酮、乙二醇、甲基丙烯酸2-氨基乙酯或其被取代的衍生物。所述丙烯酰胺或其被取代的衍生物可以選自丙烯酰胺(AAm)、N,N'-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)或N-(羥甲基)丙烯酰胺。所述靶向單體單元可以是腫瘤靶向單體單元。所述靶向單體單元可以包含靶向基團(tuán)。它可以包含腫瘤靶向基團(tuán)，和/或可以包含適于在體內(nèi)靶向其它特定細(xì)胞(例如疾病細(xì)胞)的靶向基團(tuán)。靶向基團(tuán)可以是小分子衍生基團(tuán)，如葉酸酯或半乳糖、肽(例如LHRH:促黃體激素-釋放激素，或RGD:含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的肽)、抗體(例如人源抗-CD22抗體用于靶向B細(xì)胞表達(dá)抗原CD22)或一些其它耙向基團(tuán)。所述肽可以是線性的或環(huán)狀的或支化的。在本文中，術(shù)語(yǔ)"抗體"包括抗體片段，包括但不限于，重鏈、輕鏈、可變區(qū)域、穩(wěn)定區(qū)域、Fab、Fc、Fc受體、單鏈(scFV)抗體、互補(bǔ)測(cè)定區(qū)域(CDR)和任何蛋白質(zhì)、多肽或包含抗體或其部分的肽。靶向基團(tuán)可以與腫瘤，例如與腫瘤細(xì)胞、或與一些其它特定細(xì)胞(例如疾病細(xì)胞)在體內(nèi)結(jié)合。所述靶向單體單元可以由靶向化合物，例如葉酸或其衍生物，與基質(zhì)單體單元反應(yīng)得到，其中所述基質(zhì)單體單元包含能與靶向化合物11或其衍生物反應(yīng)的官能團(tuán)從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至基質(zhì)單體單元。所述官能團(tuán)可以是胺，例如伯胺、或羥基或羧酸基。因此，所述靶向單體單元可以包含與基質(zhì)單體單元結(jié)合的靶向化合物。所述基質(zhì)單體單元可以包含胺基或羥基或羧酸基。它可以例如來(lái)自甲基丙烯酸氨基乙酯、丙烯酸氨基乙酯、丙烯酸氨基苯基酯或一些其它合適的氨基官能的單體單元、丙烯酸、N-(羥甲基)丙烯酰胺或甲基丙烯酸2-羥乙酯。所述第一嵌段可以包含無(wú)規(guī)共聚物嵌段或嵌段共聚物嵌段(例如二-、三、四或五-嵌段共聚物嵌段)或可選擇共聚物嵌段或一些其它類型的共聚物嵌段。嵌段共聚物的分子量可以小于約40,000,或小于約35,000、30,000、25,000、20,000、15,000或10,000、或大約2000和大約40000之間、或大約2000和20000之間、2000和15000之間、2000和1000之間、5000和40000之間、10000和40000之間、20000和40000之間、3000和20000之間、3000和2000之間、5000和10000之間或5000和8000之間，例如大約2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8500、9000、9500、1000、11000、12000、13000、14000、15000、20000、25000、30000、35000或40000。第一嵌段的分子量可以小于大約40,000、或小于大約35,000、30,000、25,000、20,000、15,000或10,000、或大約2000和大約40000之間、或大約2000和20000之間、2000和15000之間、2000和1000之間、5000和40000之間、10000和40000之間、20000和40000之間、3000和20000之間、3000和2000之間、5000和10000之間或3000和8000之間，例如大約2000、2500、3000、3500、3600、3700、3800、3卯0、4000、4100、4200、4300、4400、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8500、9000、9500、1000、11000、12000、13000、14000、15000、20000、25000、30000、35000或40000。第二嵌段的分子量可以在大約200和2000之間、或大約200和1500之間、200和1000之間、400和2000之間、500和2000之間、1000和2000之間或500和1000之間，例如大約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000。因此，它可以被認(rèn)為是低聚嵌段。各個(gè)嵌段的多分散性可以獨(dú)立地是狹窄或?qū)挿?。它可以在大約1.1和大約3之間、或大約1.1禾口2之間、1.1禾口1.5之間、1.3禾卩3之間、1.5禾口3之間、2禾口3之間或1.5和2之間，且可以是例如大約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3。所述分子量可以是數(shù)均分子量、重均分子量、粘均分子量或Z-均分子量。所述分子量可以是使用聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的分子量。它們可以是聚苯乙烯-當(dāng)量分子量。所述共聚物的較低臨界溶液溫度(LCST)可以充分低，以致在腫瘤或其它特定細(xì)胞的pH或其附近的pH，或至內(nèi)含體(pH大約5-6.5)或溶酶體(pH大約4-5.5)，嵌段共聚物能伴隨其親脂嵌段遞送藥物至腫瘤或其它特定細(xì)胞。所述共聚物的較12低臨界溶液溫度(LCST)可以在pH小于大約7時(shí)低于大約37Gc。它可以低于大約36.5、36、35.5、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或200C、或大約37和大約200C之間、或大約37和250C之間、37和300C之間、37和35^之間、37和36^C之間、36和35—Gc之間、36和3(^C之間、35和30。C之間、36.5和35.5QC之間、36.5和36QC之間、35和20^C之間、30和200C之間、35和30QC之間、35和32QC之間或30和20°C之間，例如大約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、35.5、35.6、35,7、35.8、35.9、36、36.1、36.2、36.3、36,4、36.5、36.6、36.7、36,8、36.9或37。C,在pH小于大約7、或小于大約6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6、5.5或5、或大約7和大約1之間、6.9和1之間、6.8禾卩1之間、6.7禾P1之間、6.6禾口1之間、6.5禾n1之間、6.4禾n1之間、6.3禾nl之間、6.2禾nl之間、6禾I]1之間、5.5和1之間、5禾Q1之間、4禾l]1之間、3禾口1之間、2和1之間、6.8禾n3之間、6.8禾口5之間、6.8禾口6之間、6.6禾卩3之間、6.6禾口5之間或6.6禾口6之間，例如在大約l、2、3、4、5、5.5、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7。所述共聚物的較低臨界溶液溫度可以在pH7.4(正常生理pH)時(shí)高于大約37QC。在正常生理pH時(shí)，它可以高于大約37.5、38、38.5、39、39.5、40、45或50QC、或可以在大約37和大約50GC之間、或大約37和40QC之間、37和39QC之間、37.5和38.5GC之間、40和5(A:之間、或38和39^，且在正常生理pH時(shí)，可以是大約37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、41、42、43、44、45、46、46、48、49或5(^c。如果每分子的溫度敏感單體單元的數(shù)量是m，每分子的親水單體單元的數(shù)量是n，每分子的靶向單體單元的數(shù)量是x，且每分子的疏水單體單元的數(shù)量是y，那么在嵌段共聚物中可以應(yīng)用下列比例m/n在大約1和大約100之間、或大約1.和50之間、1和20之間、1和10之間、1和5之間、5和100之間、20和100之間、50和100之間、70和100之間、5和50之間、10和50之間、20和50之間、10和80之間、20和70之間、30和60之間、10禾卩20之間、20禾n30之間、30禾卩40之間、40禾卩50之間、50禾口60之間、60和70之間、70和80之間、80和90之間或90和100之間，例如大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100;(m+n)/x在大約500和大約1之間、或大約100和500之間、100和400之間、200和400之間、200和300之間、或230和270之間，例如大約1、10、100、150、160、170、180、190、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330、340、350、400或500;(m+n+x)/y在大約2和大約500之間、或大約2和400之間、2和300之間、2禾口200之間、2和100之間、2禾口50之間、2禾口20之間、2和10之間、10禾口500之間、50和500之間、100和500之間、200和500之間、300和500之間、300和400之間、50和200之間、50和100之間、100和400之間、100和200之間或450和500之間，例如大約500、470、450、425、400、375、370、350、300、250、200、150、135、120、110、100、卯、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3或2。在一個(gè)具體實(shí)施方案中比例m:n:x:y是大約49.0:15.2:0.236:3-10。在另一具體實(shí)施方案中，提供了包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段的嵌段共聚物，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分或能轉(zhuǎn)化成pH敏感部分的官能團(tuán)，且其中每個(gè)所述靶向單體單元由靶向化合物或其衍生物與基質(zhì)單體單元反應(yīng)得到，其中所述基質(zhì)單體單元包含能與靶向化合物或其衍生物反應(yīng)的官能團(tuán)從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至基質(zhì)單體單元。能轉(zhuǎn)化成pH敏感部分的官能團(tuán)可以是能轉(zhuǎn)化成羧酸基或轉(zhuǎn)化成一些其它酸性基團(tuán)，或轉(zhuǎn)化成胺的官能團(tuán)。能轉(zhuǎn)化成pH敏感部分的官能團(tuán)可以是例如甲基丙烯酸2-羥乙酯(HEMA)。在另一具體實(shí)施方案中，提供了包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段的嵌段共聚物，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分，且其中各個(gè)耙向單體單元包含結(jié)合至基質(zhì)單體單元的葉酸。在另一具體實(shí)施方案中，提供了包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段的嵌段共聚物，其中所述第一嵌段包含多個(gè)來(lái)自N-異丙基丙烯酰胺的溫度敏感單體單元、多個(gè)來(lái)自N,N-二甲基丙烯酰胺的親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)包含至少一個(gè)pH敏感部分的疏水單體單元，其中各個(gè)親脂單體單元來(lái)自能聚合的不飽和脂肪酸，且其中各個(gè)靶向單體單元包含結(jié)合至來(lái)自甲基丙烯酸2-氨基乙酯的基質(zhì)單體單元的葉酸。所述嵌段共聚物可以是膠束或納米粒子的形式。所述膠束或納米粒子可以包含疏水核和親水殼。所述嵌段共聚物可以采用包含疏水核和親水殼的構(gòu)造。所述親水殼可以包含靶向基團(tuán)。當(dāng)在極性溶劑中，例如水溶劑，它可以采用該構(gòu)造。所述膠束或納米粒子的平均直徑可以為，在大約10和大約400納米之間、或大約10和300之間、10和200之間、10和150之間、10和100之間、10和80之間、10和50之間、10和20之間、50和400之間、100和400之間、200和400之間、50和200之間、50和100之間、100和300之間、100和200之間、80和100之間、90和100之間、90和95之間、95禾Q100之間、80和150之間、80和130之間或80和120之間、例如大約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、1465、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、120、130、140、150、200、250、300、350或400納米。所述尺寸分布可以狹窄或?qū)挿骸Ｋ龆喾稚⑿钥梢栽诖蠹s0.1和0.5之間、或大約0.1和0.4之間、0.1禾口0.3之間、0.1禾口0.2之間、0.2禾口0.5之間、0.3禾口0.5之間、0.2禾口0.4之間或0.2禾卩0.3之間，例如大約O.l、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5。多分散性P表示如下P=s/R，其中s2是分布變量且R是平均粒子半徑。P正常在0和1之間。膠束或納米粒子在水中的臨界締合濃度(criticalassociationconcentration)可以在大約5和200毫克/升之間、或大約10和200毫克/升之間、20和200毫克/升之間、30和200毫克/升之間、50和200毫克/升之間、100和200毫克/升之間、5和150毫克/升之間、5和100毫克/升之間、5和50毫克/升之間、5和20毫克/升之間、5和10毫克/升之間、10和100毫克/升之間、10和50毫克/升之間、20和50毫克/升之間、30和50毫克/升之間、10和20毫克/升之間或15和20毫克/升之間，例如大約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150或200毫克/升。本發(fā)明還提供了包含第一方面的嵌段共聚物的膠束或納米粒子。本發(fā)明第二方面提供了制備嵌段共聚物的方法，所述方法包括一提供第一大分子單體，所述第一大分子單體包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且—將所述第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)，所述第二大分子單體包含多個(gè)疏水單體單元，且所述疏水嵌段包含至少一個(gè)pH-敏感部分或至少一個(gè)能轉(zhuǎn)化成pH-敏感部分的基團(tuán)。將第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)的歩驟可以包括將第一大分子單體與第二大分子單體進(jìn)行共聚，或者該歩驟包括形成第一大分子單體和第二大分子單體1:1的加合物或1:2的加合物或2:1的加合物，或者該步驟包括一些其它形式的反應(yīng)。所述溫度敏感單體單元、親水單體單元、靶向單體單元和疏水單體單元可以如第一方面中所述。所述提供第一大分子單體的步驟可以包括將前體大分子單體與耙向化合物，例如葉酸，或其衍生物(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯)反應(yīng)。所述反應(yīng)將靶向化合物結(jié)合至前體大分子單體。所述前體大分子單體可以包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)基質(zhì)單體單元，其中各個(gè)基質(zhì)單體單元包含能與耙向化合物或其衍生物反應(yīng)的官能團(tuán)從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至前體大分子單體。所述第一大分子單體和/或所述前體大分子單體每分子可以包含至少一個(gè)羧基、羥基或氨基末端基團(tuán)，且每分子可以包含一個(gè)末端羧基、羥基或氨基。所述羧基/羥基/氨基可以來(lái)自形成所述第一大分子單體和/或所述前體大分子單體使用的鏈轉(zhuǎn)移劑。所述第一大分子單體的主鏈可以具有一個(gè)或多個(gè)端15基，該端基能與，或能被活化以至于能與第二大分子單體的主鏈的端基反應(yīng)。第二大分子單體的主鏈可以具有一個(gè)或多個(gè)端基，該端基能與，或能被活化以至于能與第一大分子單體的主鏈的端基反應(yīng)。本說(shuō)明書的上下文中的大分子單體是寡聚或多聚的單體(即能聚合種類)。所述第一大分子單體的分子量(和，獨(dú)立地，所述前體大分子單體的分子量)可以小于大約40,000、或小于大約35,000、30,000、25,000、20,000、15,000或10,000、或大約2000和大約40000之間、或大約2000和20000之間、2000和15000之間、2000和1000之間、5000和40000之間、10000和40000之間、20000和40000之間、3000和20000之間、3000和2000之間、5000和10000之間或3000和8000之間，例如大約2000、2500、3000、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8500、9000、9500、1000、11000、12000、13000、14000、15000、20000、25000、30000、35000或40000。所述第二大分子單體的分子量可以在大約200和2000之間、或大約200和1500之間、200和1000之間、400和2000之間、500和2000之間、1000和2000之間或500和1000之間，例如大約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000。因此，可以認(rèn)為它是寡聚物。各個(gè)大分子單體的多分散性可以獨(dú)立地是狹窄或?qū)挿?。它可以在大約1.1和大約3之間、或大約1.1和2之間、1.1禾卩1.5之間、1.3禾卩3之間、1.5禾口3之間、2禾P3之間或1.5禾n2之間，且可以是例如大約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3。提供第一大分子單體的步驟可以包括提供前體大分子單體的歩驟。提供前體大分子單體的歩驟可以包括將溫度敏感單體、親水單體和基質(zhì)單體進(jìn)行共聚(或者來(lái)自靶向分子與基質(zhì)單體結(jié)合的靶向單體)，其中所述基質(zhì)單體包含能與靶向化合物或其衍生物在所述共聚后反應(yīng)的官能團(tuán)，從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至前體大分子單體。提供前體大分子單體的步驟可以包括自由基共聚。任選在鏈轉(zhuǎn)移劑存在下，它可以使用自由基引發(fā)劑，例如過(guò)氧化苯酰。所述鏈轉(zhuǎn)移劑可以是硫醇。它可以是羧基官能的鏈轉(zhuǎn)移劑，或可以是羥基官能或氨基官能的鏈轉(zhuǎn)移劑，或可以包含能轉(zhuǎn)化成羧酸基、氨基或羥基的基團(tuán)。它可以是例如羧基官能的硫醇，如巰基丙酸、巰基琥珀酸或巰基乙酸。它可以是例如羥基官能的硫醇，如巰基乙醇或硫醇官能的仲醇。它可以是氨基官能的硫醇，如2-氨基乙硫醇。所述反應(yīng)可以在溶劑中進(jìn)行，例如THF或一些其它合適的溶劑。所述反應(yīng)基本上在不含氧的情況下進(jìn)行。它可以在惰性氣氛中進(jìn)行，例如氮?dú)?、二氧化碳、氦氣或氬氣。所述反?yīng)可以在引發(fā)劑充分熱分解至單體聚合的充分程度的溫度和時(shí)間下進(jìn)行。所述溫度可以是例如溶劑的回流溫度(沸點(diǎn))。合適的溫度可以在大約60和大約140。C之間,或大約60和100。C之間、100和140。C之間、60和80。C之間、1680和100。C之間、100和120°C之間或80和900C。C之間，例如大約60、70、80、85、卯、100、110、120、130或140t。所述反應(yīng)可以進(jìn)行大約1至大約48小時(shí)、或1至40、1至30、1至20、1至10、5至48、5至40、5至30、5至20、10至40、10至20或5至10小時(shí)，例如大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、30、36、40、44或48小時(shí)。所述前體大分子單體的分子量可以小于大約40,000、或小于大約35,000、30,000、25,000、20,000、15,000或10,000、或在大約2000和大約40000之間、或大約2000和20000之間、2000和15000之間、2000和1000之間、5000和40000之間、10000和40000之間、20000和40000之間、3000和20000之間、3000和2000之間、5000和10000之間或3000和8000之間，例如大約2000、2500、3000、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、5000、5500、6000、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8500、9000、9500、1000、11000、12000、13000、14000、15000、20000、25000、30000、35000或40000。所述方法可以包括活化耙向化合物，例如形成適合與基質(zhì)單體或與一個(gè)或多個(gè)前體大分子單體的基質(zhì)單體單元結(jié)合的靶向化合物的衍生物。所述方法例如可以包括將耙向化合物的羧酸基與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)從而形成靶向化合物的N-羥基琥珀酰亞胺衍生物(例如酯)。所述反應(yīng)可以使用如N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的活化劑進(jìn)行活化?；罨苌锱c基質(zhì)單體或與前體大分子單體內(nèi)的基質(zhì)單體單元的反應(yīng)可以在合適溶劑如DMSO中或另一能溶解所有試劑的偶極非質(zhì)子溶劑中進(jìn)行。所述第二大分子單體包含疏水單體單元，該疏水單體單元包含至少一個(gè)pH-敏感部分或包含至少一個(gè)能轉(zhuǎn)化成pH-敏感部分的基團(tuán)。它可以是均聚物。它可以包含一個(gè)或多個(gè)羧酸單元如pH-敏感部分。它可以是聚合的羧酸。它可以包含至少一個(gè)(例如一個(gè))末端氨基、羥基或羧基。所述方法也包括制備第二大分子單體的步驟。所述制備第二大分子單體的歩驟包括聚合能聚合疏水單體，所述能聚合疏水單體包含至少一個(gè)pH-敏感部分(例如能聚合羧酸)或包含能轉(zhuǎn)化成如羧酸基的pH敏感部分的官能團(tuán)。所述能聚合的疏水單體可以包含能聚合雙鍵例如C=C雙鍵，任選末端C-C雙鍵。所述聚合可以是自由基的聚合且可以使用自由基引發(fā)劑。其可以使用例如過(guò)硫酸鹽(例如過(guò)硫酸銨)且可以在鏈轉(zhuǎn)移劑存在下進(jìn)行。所述鏈轉(zhuǎn)移劑可以是硫醇。它可以包含氨基、羥基或羧酸基。它可以包含能與第一大分子單體的端基反應(yīng)的官能團(tuán)。它可以是氨基硫醇，例如2-氨基乙硫醇。它可以是例如羧基官能的硫醇，如巰基丙酸、巰基琥珀酸或巰基乙酸。它可以是羥基官能的硫醇如巰基乙醇的或硫醇官能的仲醇。所述鏈轉(zhuǎn)移劑可以與自由基引發(fā)劑形成氧化還原對(duì)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述聚合依據(jù)下列方程式由硫醇基引發(fā)，由氨基乙硫醇鹽酸鹽與過(guò)硫酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生2RSH+S208z-—2RS+2HS0、其中R代表氨乙基。所述反應(yīng)在中性或堿性pH中進(jìn)行，例如大約7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5或11或大約7和11之間、7和9之間、8禾口11之間、9禾口11之間、8禾卩10之間、7.5禾口9之間或8禾口9之間或7.5禾口8.5之間。在第二大分子單體具有末端羧基(例如來(lái)自羧基官能的鏈轉(zhuǎn)移劑)的情況，優(yōu)選所述第二大分子單體和由其制得的疏水單體不含有作為pH敏感部分的羧基。如果期望使用第二大分子單體制得的嵌段共聚物的第二嵌段具有作為pH敏感部分的羧基，優(yōu)選所述第二大分子單體(和由其制得的疏水單體)具有能轉(zhuǎn)化成羧酸基的官能團(tuán)，例如所述第二大分子單體具有受保護(hù)的羧酸基。能轉(zhuǎn)化成羧酸基的官能團(tuán)可以是例如羥基或醛基(其可以被氧化成羧基)或羧酸酯(例如三甲基甲硅烷基、甲基、乙基；其可以被水解成羧基)或酐(例如乙酸酐、硫酸根、磷酸根、碳酸根；其可以水解成羧基)。在此情況下，一旦第二大分子單體通過(guò)與第一大分子單體反應(yīng)并入嵌段共聚物，能轉(zhuǎn)化成羧酸基的官能團(tuán)可以轉(zhuǎn)化成羧酸，以便嵌段共聚物的第二嵌段包含作為pH敏感部分的羧基。將第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)的歩驟可以包括活化第一大分子單體或第二大分子單體上的末端羧酸基?；罨磻?yīng)可以包括將末端羧基與活化劑，例如N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，從而形成活化的酯，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯。所述反應(yīng)可以由上面所述的DCC活化。所述反應(yīng)生成活化的大分子單體(活化的第一大分子單體或活化的第二大分子單體)。在與所述第二或第一大分子單體分別反應(yīng)前，可以分離(例如過(guò)濾)和任選地干燥活化的第一或第二大分子單體。第一大分子單體與第二大分子單體的反應(yīng)可以在合適溶劑中進(jìn)行，例如DMSO或一些其它偶極非質(zhì)子溶劑。因此，將第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)的步驟可以包括例如通過(guò)形成第一大分子單體的N-羥基琥珀酰亞胺酯活化第一大分子單體上的末端羧基，從而形成活化的第一大分子單體，且將活化的第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)?；蛘咴摎i驟可以包括例如通過(guò)形成第二大分子單體的N-羥基琥珀酰亞胺酯活化第二大分子單體上的末端羧基，從而形成活化的第二大分子單體，且將活化的第二大分子單體與第一大分子單體反應(yīng)。在具體實(shí)施方案中，所述方法包括一將溫度敏感單體、親水單體和基質(zhì)單體進(jìn)行共聚從而形成前體大分子單體，其中所述基質(zhì)單體包含能與靶向化合物或其衍生物在所述共聚后反應(yīng)的官能團(tuán)，從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至前體大分子單體，一將耙向化合物結(jié)合至前體大分子單體從而形成第一大分子單體，且—將第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)，所述第二大分子單體包含多個(gè)疏水單體單元，且所述疏水嵌段包含至少一個(gè)pH-敏感部分。在另一具體實(shí)施方案中，所述方法包括—將溫度敏感單體、親水單體和基質(zhì)單體在羧基官能的鏈轉(zhuǎn)移劑存在下進(jìn)行18共聚從而形成羧基官能的前體大分子單體，其中所述基質(zhì)單體包含能與靶向化合物或其衍生物在所述共聚后反應(yīng)的官能團(tuán)從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至前體大分子單體，一將靶向化合物結(jié)合至前體大分子單體從而形成第一大分子單體，—在氨基官能或羥基官能的鏈轉(zhuǎn)移劑存在下，聚合包含至少一個(gè)pH-敏感部分的疏水單體從而形成氨基官能或羥基官能的第二大分子單體，—活化第一大分子單體以與第二大分子單體上的末端官能團(tuán)(例如羥基或氨基)反應(yīng)，且一將活化的第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)。在另一具體實(shí)施方案中，所述方法包括一將溫度敏感單體、親水單體和基質(zhì)單體在羥基官能或氨基官能的鏈轉(zhuǎn)移劑存在下進(jìn)行共聚從而形成羥基官能或氨基官能的前體大分子單體，其中所述基質(zhì)單體包含能與靶向化合物或其衍生物在所述共聚后反應(yīng)的官能團(tuán)，從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至前體大分子單體，—將靶向化合物結(jié)合至前體大分子單體從而形成第一大分子單體，—在羧基官能的鏈轉(zhuǎn)移劑存在下，聚合包含至少一個(gè)pH-敏感部分的疏水單體從而形成羧基官能的第二大分子單體，一活化第二大分子單體以與第一大分子單體上的末端官能團(tuán)(例如羥基或氨基)反應(yīng)，且一將活化的第二大分子單體與第一大分子單體反應(yīng)。在另一具體實(shí)施方案中，所述方法包括—將溫度敏感單體、親水單體和基質(zhì)單體在羥基官能或氨基官能的鏈轉(zhuǎn)移劑存在下進(jìn)行共聚從而形成羥基官能或氨基官能的前體大分子單體，其中所述基質(zhì)單體包含能與靶向化合物或其衍生物在所述共聚后反應(yīng)的官能團(tuán)從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至前體大分子單體，—將耙向化合物結(jié)合至前體大分子單體從而形成第一大分子單體，一在羧基官能的鏈轉(zhuǎn)移劑存在下，聚合包含至少一個(gè)受保護(hù)的羧基的疏水單體，例如三甲基甲硅烷基酯從而形成羧基官能的第二大分子單體，—活化第二大分子單體以與第一大分子單體上的末端官能團(tuán)(例如羥基或氨基)反應(yīng)，一將活化的第二大分子單體與第一大分子單體反應(yīng)，且一將受保護(hù)的羧基脫保護(hù)，例如水解，生成不受保護(hù)的羧基。在另一具體實(shí)施方案中，所述方法包括一將靶向化合物結(jié)合至基質(zhì)單體從而形成靶向單體，其中所述基質(zhì)單體包含與靶向化合物或其衍生物反應(yīng)的官能團(tuán)從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至基質(zhì)單體，一將溫度敏感單體、親水單體和靶向單體進(jìn)行共聚從而形成第一大分子單體，且一將第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)，所述第二大分子單體包含多個(gè)疏水單體單元，且所述第二大分子單體包含至少一個(gè)pH-敏感部分。在另一具體實(shí)施方案中，所述方法包括一將溫度敏感單體、親水單體和氨基官能的單體進(jìn)行共聚從而形成前體大分子單體，一將葉酸衍生物結(jié)合至前體大分子單體從而形成第一大分子單體，且一將第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)，所述第二大分子單體是疏水性的且包含pH敏感部分。在另一具體實(shí)施方案中，所述方法包括一將N-異丙基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸2-氨基乙酯共聚，一將葉酸結(jié)合至前體大分子單體從而形成第一大分子單體，且—將第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)，所述第二大分子單體是10-十一碳烯酸的聚合物。在另一具體實(shí)施方案中，所述方法包括一將N-異丙基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸2-氨基乙酯在羧基官能的硫醇存在下進(jìn)行共聚從而形成前體大分子單體，一將葉酸的N-羥基琥珀酰亞胺衍生物與前體大分子單體反應(yīng)從而形成第一大分子單體，一活化第一大分子單體以與胺反應(yīng)從而形成活化的第一大分子單體，且一將活化的第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)，所述第二大分子單體是具有末端氨基的10-十一碳烯酸的聚合物。本發(fā)明還提供了通過(guò)第二方面的方法制備的嵌段共聚物。本發(fā)明第三方面提供了溫度和pH敏感組合物，所述組合物包含一治療劑，和—包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段的嵌段共聚物，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，且所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分。所述嵌段共聚物是第一方面的嵌段共聚物，或依據(jù)第二方面制備得到。所述治療劑可以是藥物，例如抗癌藥、抗炎藥或治療神經(jīng)障礙的藥物、或可以包含兩種或多種這些藥物的混合物，或可以是一些其它類型的藥物。所述抗癌藥可以是例如阿霉素、阿納托唑、依西美坦、環(huán)磷酰胺、表柔比星、托瑞米芬、來(lái)曲唑、曲妥單抗、甲地孕酮、他莫昔芬、紫杉醇、多西他奇、卡培他濱、醋酸高錫林、羥基尿素、乙琥紅霉素、環(huán)孢霉素或順鉑或任意兩種或多種這些藥物的混合物。所述組合物可以包含膠束或納米粒子，或者是膠束或納米粒子的形式。所述20膠束可以是球形的、偽球形的、基本上球形的、圓形的、扁球形的、卵球形的或一些其它形狀。膠束的平均直徑可以小于250納米，或小于大約200、150、100或50納米、或大約50和大約250納米之間、或大約50和200之間、50和150之間、50和100之間、100和250之間、200和250之間、100和200之間、50和150之間或80和130納米之間，例如大約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200或250納米，或者可以大于250納米。所述共聚物被制成至少一個(gè)包含疏水核和親水殼的納米粒子。所述治療劑包含或位于或分布在所述疏水核內(nèi)。所述殼可以包含靶向基團(tuán)。至少一些靶向基團(tuán)可以在納米粒子的外表面。本發(fā)明第四方面提供了制備溫度和pH敏感組合物的方法，所述方法包括將治療劑與嵌段共聚物的溶液結(jié)合，所述嵌段共聚物包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段嵌段，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分。所述嵌段共聚物的溶液可以是膠束溶液。所述方法可以包括制備膠束或納米粒子形式的組合物，或者可以包括將組合物轉(zhuǎn)化成膠束或納米粒子。所述膠束或納米粒子可以各自包含疏水核和親水殼，其中所述治療劑包含在所述疏水核內(nèi)本發(fā)明還提供了由第四方面的方法制備的組合物、納米粒子或膠束。所述嵌段共聚物的溶液可以是在合適溶劑中的溶液。合適溶劑可以是偶極非質(zhì)子溶劑。它可以是和水混溶的。它可以是例如二甲乙酰胺、DMSO或一些其它合適的溶液。當(dāng)與嵌段共聚物溶液結(jié)合時(shí)，所述治療劑可以在溶液中。所述治療劑可以是中和的治療劑。所述方法可以包含中和治療劑。所述結(jié)合可以包括一次或多次混合、回蕩、超聲、震搖、共混、渦旋或一些其它形式的攪拌。所述方法包括一次或多次一透析結(jié)合的嵌段共聚物溶液和治療劑從而形成包含所述治療劑和所述嵌段共聚物的膠束或納米粒子，且除去沒(méi)有并入膠束或納米粒子的治療劑，且除去沒(méi)有并入膠束或納米粒子的嵌段共聚物，例如使用具有大約500和大約40000之間、或大約500和20000之間、500和10000之間、500和5000之間、500和2000之間、500和1500之間、1500和3000之間、1500和2000之間、2000和3000之間、1500和2500之間、2000和10,000之間、2000和40000之間、5000和40000之間、10000和40000之間、20000和40000之間、1000和20000之間、1000和10000之間、1000和5000之間或大于40000，例如大約500、1000、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000或40000或大于40000分子量篩截的透析膜；一通過(guò)過(guò)濾器過(guò)濾結(jié)合的嵌段共聚物溶液和治療劑，例如0.45微米、0.3微米、0.2微米或0.1微米尺寸的過(guò)濾器或膜；21一干燥濾液，例如冷凍干燥。在具體實(shí)施方案中，所述方法包括一將治療劑與嵌段共聚物的溶液結(jié)合，所述嵌段共聚物包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段嵌段，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分；一使用具有大約2000分子量篩截的透析膜透析所述結(jié)合的嵌段共聚物溶液和治療劑從而形成包含所述治療劑和所述嵌段共聚物的膠束或納米粒子；一通過(guò)0.45微米的過(guò)濾器過(guò)濾嵌段共聚物溶液和治療劑的透析結(jié)合物從而分離濾液(即通過(guò)過(guò)濾分離膠束或納米粒子)；且一冷凍干燥濾液(即膠束或納米粒子)。本發(fā)明第五方面提供了給受實(shí)驗(yàn)者，例如動(dòng)物或人類提供治療劑的方法，所述方法包括給予動(dòng)物或人類溫度和pH敏感組合物，該溫度和pH敏感組合物包含一治療劑，和一包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段的嵌段共聚物，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，且所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分；其中所述共聚物被制成至少一個(gè)包含疏水核和親水殼的納米粒子且其中所述治療劑包含、處于或分散在所述疏水核內(nèi)。所述組合物可以經(jīng)口服、局部、靜脈內(nèi)、局部區(qū)域(tropically)、腸胃外遞送，經(jīng)吸收或眼部途徑遞送。所述治療劑包含抗癌藥。靶向基團(tuán)在納米粒子的外表面上。所述組合物可以是抗癌組合物。所述靶向基團(tuán)可以是腫瘤靶向基團(tuán)。所述受實(shí)驗(yàn)者可以是人類或非人類動(dòng)物。它可以是靈長(zhǎng)類動(dòng)物。它可以是家畜或者它可以是非家畜。它可以是例如猿、猴、馬、綿羊、母牛、公牛、山羊、豬、狗、貓、大象或一些其它類型的動(dòng)物。當(dāng)用于給動(dòng)物或人類提供治療劑時(shí)，還提供了第一方面的嵌段共聚物或第三方面的組合物。本發(fā)明第六方面提供藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明第三方面的組合物以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體和/或佐劑。所述載體可以例如包含無(wú)菌水、注射用水、其它合適的水、復(fù)方氯化鈉注射液、哈特曼氏溶液、葡萄糖溶液或鹽水溶液。還提供所述藥物組合物治療患者病癥的用途，其中治療劑用于所述治療。所述病癥可以是癌癥、或神經(jīng)障礙，或可以是一些其它病癥。本發(fā)明第七方面提供了第一方面的嵌段共聚物或第三方面的組合物在制備治療癌癥或神經(jīng)障礙的藥物或藥物組合物中的用途。本發(fā)明第八方面提供了包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段的前體嵌段共聚物，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)基質(zhì)單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，且所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分，其中各個(gè)基質(zhì)單體單元包含能與耙向化合物或其衍生物反應(yīng)的官能團(tuán)從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至前體嵌段共聚物。所述溫度敏感單體單元、親水單體單元、基質(zhì)單體單元和疏水單體單元如前面所述。所述前體嵌段共聚物可以與第一方面的嵌段共聚物相同，除了所述靶向單體單元被基質(zhì)單體單元代替。因此，例如分子量、嵌段中單體數(shù)量等可以如第一方面的嵌段共聚物所述。各個(gè)溫度敏感單體單元可以與其它溫度敏感單體單元相同，或者一些可以相同且一些可以不同。各個(gè)親水單體單元可以與其它親水單體單元相同，或者一些可以相同且一些可以不同。各個(gè)基質(zhì)單體單元可以與其它基質(zhì)單體單元相同，或者一些可以相同且一些可以不同。各個(gè)疏水單體單元可以與其它疏水單體單元相同，或者一些可以相同且一些可以不同。所述嵌段共聚物可以采用所述共聚物為含有疏水核和親水殼的核-殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)造，其中至少一些基質(zhì)單體單元位于親水殼。所述嵌段共聚物可以具有各個(gè)嵌段中的一個(gè)，或可以具有多于一個(gè)的第一嵌段、第二嵌段、或第一嵌段和第二嵌段。所述嵌段共聚物可以是AB嵌段共聚物。本發(fā)明第九方面提供制備前體嵌段共聚物的方法，所述方法包括一提供前體大分子單體，所述前體大分子單體包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)基質(zhì)單體單元，且—將所述前體大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)，所述第二大分子單體包含多個(gè)疏水單體單元，且所述第二大分子單體包含至少一個(gè)pH-敏感部分。所述前體大分子單體可以如本發(fā)明第二方面所述。本發(fā)明還提供了通過(guò)第九方面的方法制備的前體嵌段共聚物。本發(fā)明第十方面提供了制備嵌段共聚物的方法，所述方法包括將本發(fā)明第八方面的前體嵌段共聚物或通過(guò)本發(fā)明第九方面的方法制備的前體嵌段共聚物，與靶向化合物或其衍生物反應(yīng)從而將所述靶向化合物或其衍生物結(jié)合至前體嵌段共聚物。所述嵌段共聚物可以是本發(fā)明第一方面的嵌段共聚物。現(xiàn)在通過(guò)實(shí)施例描述本發(fā)明優(yōu)選的方式并參考隨附的附圖，其中圖1顯示UA(A)和PUA(B)的^-NMR圖譜(d-DMSO作為溶劑)；圖2顯示PUA-NH2(A)和葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA(B)的FT-IR圖譜(其中AMA是甲基丙烯酸2-氨基乙酯)；圖3是葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA的^-NMR圖譜(d-DMSO作為溶劑)；圖4是膠束在PBS(磷酸鹽緩沖溶液)中的透光率曲線，為溫度的函數(shù)，在500納米變化pH:(a)pH7.4;(b)pH6.6;23圖5是I335.5/I334.0的強(qiáng)度比曲線，為在去離子水中聚合物濃度(logC)的對(duì)數(shù)函數(shù)；圖6是I335.5/I334.0的強(qiáng)度比曲線，為聚合物在不同緩沖液中pH的函數(shù)；圖7顯示空白膠束(a)和DOX(阿霉素)-負(fù)載的膠束(b)的透射電子顯微鏡(TEM)影像；圖8顯示在37°C(a)pH7.4;(b)pH6.6孵育從膠束釋放DOX的分布；圖9顯示共焦纖維影像(a)用游離DOX孵育的4T1細(xì)胞；(b)由P(NIPAAm-共-DMAAm-共-UA)制得的DOX-負(fù)載的膠束；禾Q(c)葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA(DOX濃度=10毫克/升)；圖IO是顯示用DOX,DOX-負(fù)載的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-UA)和葉酸酉B-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA膠束在37QC孵育48小時(shí)后的4T1細(xì)胞的存活率圖11是顯示腫瘤中DOX濃度的圖，用于游離DOX禾卩DOX-負(fù)載的膠束的制劑；圖12是顯示游離DOX生物分布的圖；和圖13是顯示DOX-負(fù)載的膠束的生物分布的圖。具體實(shí)施例方式在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本說(shuō)明書公開(kāi)基于葉酸酯-結(jié)合聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-N,N-二甲基丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸2-氨基乙酯)-b-聚(10-十一碳烯酸))的嵌段共聚物，其是pH-和溫度敏感的。該聚合物可以自組裝成核-殼納米粒子。在自組裝過(guò)程中，一種或多種藥物可以被包封入納米粒子。所述納米粒子在正常生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的，但是在低pH環(huán)境如腫瘤組織、內(nèi)含體或溶酶體中變形。靶向基團(tuán)(葉酸酯)將納米粒子導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞且納米粒子釋放藥物分子至胞質(zhì)溶膠(細(xì)胞內(nèi)藥物遞送)。生物信號(hào)(即耙向基團(tuán))被結(jié)合至共聚物的親水嵌段，用于靶向過(guò)度表達(dá)葉酸酯受體的癌癥細(xì)胞。更具體而言，本文公開(kāi)了(AaBbQO-Dy結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物，其中A是溫度敏感單體單元，B是親水單體單元，C是耙向單體單元且D是疏水單體單元，且a、b、x和y大于1。所述A3bC、嵌段可以包含無(wú)規(guī)共聚物嵌段或嵌段共聚物嵌段或可選擇的共聚物嵌段或一些其它類型的共聚物嵌段。(AaBbCx)-Dy的分子量可以小于大約40,000且AaBbCx的分子量可以小于大約40,000。Dy嵌段的分子量可以在大約200和2000之間，且因此被認(rèn)為是寡聚嵌段。各個(gè)嵌段的多分散性可以獨(dú)立地是大約1.1和大約3之間。每分子溫度敏感單體單元的數(shù)量除以每分子親水單體單元的數(shù)量之值可以在大約1和大約100之間。每分子溫度敏感單體單元的數(shù)量加上每分子親水單體單元的數(shù)量的總數(shù)與每分子靶向單體單元的數(shù)量的比率可以是大約500和大約1之間。AaBbQc嵌段中單體單元的數(shù)量和Dy嵌段嵌段中單體單元的數(shù)量的比率可以在大約2和大約500之間。將具有聚合物結(jié)構(gòu)的AaBbCx結(jié)構(gòu)的共聚物，特別是A3bCx-G！結(jié)構(gòu)的聚合物與Dy-G2結(jié)構(gòu)的聚合物反應(yīng)可以制備嵌段共聚物(AaBbCx)-Dy，其中G!和G2是能反應(yīng)將AaBbQrGi與Dy-G2偶聯(lián)的基團(tuán)?；蛘撸淇梢酝ㄟ^(guò)(AaBbSx)-Dy結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物與靶向分子反應(yīng)而制備，其中S是能與靶向分子反應(yīng)從而生成耙向單體單元C的基質(zhì)單體基團(tuán)。將衍生出A、B和C的單體進(jìn)行共聚，或者將AaBbSx結(jié)構(gòu)的共聚物與靶向分子反應(yīng)可以制備共聚物AaBbCx。將衍生出A、B和S的單體進(jìn)行共聚可以制備共聚物AaBbSx。通過(guò)自由基共聚合成聚合物的親水和疏水嵌段，然后將這兩種嵌段結(jié)合形成嵌段共聚物，其可以自組裝成核-殼納米結(jié)構(gòu)或納米粒子(即膠束)。所述膠束能吸收內(nèi)含體或溶酶體內(nèi)的質(zhì)子，打破內(nèi)含體或溶酶體內(nèi)外的質(zhì)子濃度的平衡，因此與內(nèi)含體或溶酶體膜融合。另外，所述納米粒子的表面在低pH環(huán)境如腫瘤位置、內(nèi)含體或溶酶體中是疏水性的，因此提高納米粒子對(duì)腫瘤位置的附著或與內(nèi)含體或溶酶體膜融合。p(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA是嵌段親水共聚物，與現(xiàn)有技術(shù)相比其形成具有用于藥物并入的更穩(wěn)定殼和更小尺寸具有更窄分布的膠束。所述聚合物能在親水嵌段并入葉酸酯部分，導(dǎo)致具有殼的膠束，在共聚物自組裝后所述殼包含葉酸酯分子。這些膠束適于靶向抗癌藥至過(guò)度表達(dá)葉酸酯受體的腫瘤細(xì)胞且在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物分子至胞質(zhì)溶膠，提供癌癥治療的更好方法。在現(xiàn)在的工作中，本發(fā)明人已經(jīng)合成了多官能嵌段共聚物葉酸酯-結(jié)合聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-N，N-二甲基丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸2-氨基乙酯)-b-10-十一碳烯酸(P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA)。應(yīng)用單體甲基丙烯酸2-氨基乙酯生成用于葉酸酯結(jié)合的氨基。所述嵌段共聚物能在水溶液中自組裝成膠束，每個(gè)所述膠束具有包含葉酸分子的殼。這些膠束也顯示依賴pH的LCST，但是當(dāng)與P(NIPAAm-共-DMAAm-共-UA)膠束相比時(shí)，顯示更穩(wěn)定的內(nèi)核和具有更窄分布的更小尺寸(<100納米)。阿霉素(DOX)被用作抗癌藥模型。DOX釋放響應(yīng)環(huán)境pH變化。研究和比較空白膠束、游離DOX和DOX-負(fù)載的膠束對(duì)4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞吸收和體外細(xì)胞毒性。應(yīng)用由4T1細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌模型研究DOX的生物分布和其血液濃度，為時(shí)間的函數(shù)。當(dāng)與游離DOX相比時(shí)，DOX-負(fù)載的膠束用藥后，在腫瘤組織中累積了更多的DOX。這些多官能膠束可以成為有希望的載體從而特異性地運(yùn)輸抗癌藥至腫瘤細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物至胞質(zhì)溶膠。在本系統(tǒng)中，聚合10沖一碳烯酸(UA)從而形成PUA，且將具有氨基的單體，甲基丙烯酸2-氨基乙酯(AMA)與N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)進(jìn)行共聚。將所得的聚(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)與葉酸酯結(jié)合，所述葉酸酯是耙向信號(hào)(腫瘤靶向化合物)，它能識(shí)別過(guò)度表達(dá)葉酸酯受體的癌癥細(xì)胞。將葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)進(jìn)一步結(jié)合至PUA從而形成多官能嵌段共聚物，其是pH和溫度敏感的以及對(duì)腫瘤細(xì)胞敏感。25該兩親嵌段共聚物可以自組裝成具有小尺寸和窄尺寸分布的膠束(核-殼納米粒子)。另夕卜，當(dāng)與P(NIPAAm-共-DMAAni-共-UA)膠束相比時(shí)，形成的膠束顯示更穩(wěn)定的并入藥物的內(nèi)核。這些膠束可以靶向抗癌藥至過(guò)度表達(dá)葉酸酯受體的腫瘤細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物至胞質(zhì)溶膠，提供癌癥治療的更好方法。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了多官能膠束，例如核-殼納米粒子的形式，其可以由葉酸酯-結(jié)合的聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-N,N-二甲基丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸2-氨基乙酯)-b-聚(10-十一碳烯酸)(P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA)自組裝。所述膠束可以用于藥物，例如抗癌藥的靶向遞送。當(dāng)與由無(wú)規(guī)共聚物聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-N,N-二甲基丙烯酰胺-共-十一碳烯酸)(P(NIPAAm-共-DMAAm-共-UA))(公開(kāi)在美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/865,681)制得的膠束相比，己證明這些膠束具有更好定義的核-殼結(jié)構(gòu)、更穩(wěn)定的核、具有更窄分布的更小尺寸。以P(NIPAAm-共-DMAAm-共-UA)膠束相似的方式，P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA膠束也顯示依賴pH的LCST(較低臨界溶液溫度)，其在生理?xiàng)l件下，于pH7.4時(shí)高于正常體溫，但是于pH6.6或以下時(shí)低于正常體溫。因此，所述膠束在PBS中于pH7.4時(shí)穩(wěn)定，但是于pH6.6或以下時(shí)變形和沉淀，釋放附著的藥物化合物。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)膜透析的方法，將抗癌藥模型，阿霉素(DOX)加載至葉酸酯結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA的膠束。所述DOX-負(fù)載的膠束小于大約100納米，具有狹窄尺寸分布。從膠束釋放DOX也是依賴pH的，于37QC在pH6.6或以下時(shí)釋放更慢，但是在pH7.4時(shí)釋放更快。本發(fā)明膠束的另一特征是它們靶向抗癌藥至過(guò)度表達(dá)葉酸酯受體的腫瘤細(xì)胞的能力，因?yàn)槿~酸酯分子存在與膠束的表面。因此，通過(guò)葉酸酯受體-表達(dá)細(xì)胞株，4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞的模型，它們的細(xì)胞吸收高于不含葉酸酯的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-UA)膠束，導(dǎo)致更大的細(xì)胞毒性。體內(nèi)研究顯示，當(dāng)與游離DOX相比時(shí)，DOX-負(fù)載的葉酸酯結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA膠束在腫瘤組織產(chǎn)生更高的DOX水平，在心臟產(chǎn)生更低水平且延長(zhǎng)血液循環(huán)。本發(fā)明人假設(shè)所述膠束通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)穩(wěn)定DOX且降低它的吸收。另外，在心臟DOX水平的降低可以減少DOX的心臟毒性，DOX的主要副作用。因此，這些多官能膠束可以用作更充分遞送抗癌藥的載體。與美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/865,681公開(kāi)的聚合物相比，本發(fā)明的嵌段共聚物提供了具有更穩(wěn)定的用于藥物并入的內(nèi)核和具有更窄分布的更小尺寸的膠束。更重要的是，所述聚合物在親水嵌段包含腫瘤靶向部分，例如葉酸酯部分，導(dǎo)致自組裝后膠束具有含腫瘤靶向部分的殼。這些膠束能靶向抗癌藥至過(guò)度表達(dá)葉酸酯受體的腫瘤細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物至胞質(zhì)溶膠，提供癌癥治療的更好方法。本發(fā)明可以比先前膠束更有效用于靶向藥物至腫瘤組織。另外，它可以在體外或動(dòng)物研究中用于藥物發(fā)現(xiàn)。26在下面所述的實(shí)施例中，多官能嵌段共聚物葉酸酯-結(jié)合的聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-N,N-二甲基丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸2-氨基乙酯)-b-聚(十一碳烯酸)已成功合成且并用于制備抗癌藥靶向遞送的膠束。在自然界所述膠束是球形的，且空白和DOX-負(fù)載的膠束的平均直徑小于100納米。所述膠束的較低臨界溶液溫度(LCST)是依賴pH的。因此，粒度和從膠束的藥物釋放也是依賴pH的。所述膠束在37。C于PBS(pH7.4)中是穩(wěn)定的，但是在酸性環(huán)境中變形，導(dǎo)致快速藥物釋放。經(jīng)受體介導(dǎo)細(xì)胞攝粒作用，通過(guò)葉酸酯受體-表達(dá)4Tl細(xì)胞吸收具有葉酸酯的DOX-負(fù)載的膠束。當(dāng)與不含葉酸酯的DOX-負(fù)載的膠束相比時(shí)，觀測(cè)到更多的吸收，導(dǎo)致升高的細(xì)胞毒性。從體內(nèi)研究得到的結(jié)果顯示當(dāng)與游離DOX相比時(shí)，由該多官能聚合物自組裝的DOX-負(fù)載的膠束在血液中具有更長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間，并在腫瘤中產(chǎn)生更高濃度，但是在心臟中產(chǎn)生更低濃度。使用這些膠束在腫瘤中DOX的累積升高，可以提供更有效的癌癥治療。實(shí)施例嚴(yán)拜^力一法麟通過(guò)從正己烷中重結(jié)晶純化N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm,購(gòu)自Sigma-Aldrich)。N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)和10-^^—碳烯酸(98%,UA)購(gòu)自Sigma且在使用前真空蒸餾。牛血清白蛋白(FBS)由Invi加genCorporation供給。阿霉素鹽酸鹽(DOX)、芘、3-巰基丙酸(MPA)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯鹽酸鹽(卯％)、2-氨基乙硫醇(AET)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、3-[4,5-二甲基噻唑基-2]-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)、L-谷氨酰胺、乙腈(HPLC級(jí))、無(wú)水二氯甲烷(DCM)、無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲乙酰胺(DMAc)和甲醇(HPLC級(jí))購(gòu)自Sigma-Aldrich，且未處理直接使用。過(guò)硫酸銨(APS)購(gòu)自Bio-RadLaboratories。四氫^^喃(THF)和甲苯購(gòu)自Merck，且用鈉干燥。4T1細(xì)胞株購(gòu)自ATCC。所以其它化學(xué)試劑為分析級(jí)，且未處理直接使用。葉酸酯-結(jié)合的聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-N,N-二甲基丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸2-氨基乙酯)-b-聚(lO-i^—碳烯酸)(P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA)的合成P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-COOH的合成27H2C=CHIINHCHMe2NIPAAmHSCH2CH2COOHBPO,THF回流H2C=CHH3IIC=0+xCH2=^IIC=0DMAAmOCH2CH2NH2AMAH-H2C—CH.H2C—CH"嚴(yán)H2C—C——-SCH2CH2COOH廣oij;==o-廠crNHCHMe2NMe2OCH2CH2NH2方案1P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-COOH的合成。通過(guò)自由基共聚，使用作為引發(fā)劑的過(guò)氧化苯酰(BPO)和作為鏈轉(zhuǎn)移劑的3-巰基丙酸(MPA)制備羧酸-封端的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)前體聚合物(方案l)。例如，將N-異丙基丙烯酰胺(20.0克，176.9毫摩爾)、N,N-二甲基丙烯酰胺(3.50克，35.38毫摩爾)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯鹽酸鹽(90%)(158.4毫克，0.86毫摩爾)、MPA(269毫克，2.54毫摩爾)和BPO(85.6毫克，0.35毫摩爾)溶解在30毫升THF中。將溶液用氮?dú)夤呐?0分鐘除空氣。在氮?dú)庵杏?5。C將反應(yīng)混合物回流8小時(shí)。反應(yīng)完成后，加入乙醚，沉淀析出產(chǎn)物。使用緩慢液-液擴(kuò)散法從THF-乙醚中通過(guò)三次再沉淀純化該產(chǎn)物，然后真空干燥。使用2000分子量篩截的透析膜(Spectra/Por7，SpectrumLaboratoriesInc.)對(duì)去離子(DI)水透析一星期來(lái)進(jìn)一步純化該產(chǎn)物。通過(guò)冷凍干燥獲得最終產(chǎn)物。〃/"變潔層茲合游iYA^A4w-^M)M44m-^^4M^-COC^游^V龍<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>方案2葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-COOH的合成。在室溫，用DCC(0.495克，2.4毫摩爾)和NHS(0.463克4毫摩爾)預(yù)活化溶解在20毫升DMSO中的葉酸的羧酸基(1,0克，2毫摩爾)(方案2)。在該反應(yīng)中，形成二環(huán)己基脲并通過(guò)過(guò)濾去除。將真空干燥的前體聚合物加至反應(yīng)液中。反應(yīng)在室溫中進(jìn)行48小時(shí)。將所得的溶液置于2000分子量篩截的透析膜上，并用一周對(duì)DI水透析。通過(guò)冷凍干燥獲得最終產(chǎn)物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>APSyH2C=CH+H2NCH2CH2SH-CH2(CH2)5CH2ICH2ICOOH方案3H—pH8.0H2C—CH-PUA-NH2的合成c-SCH2CH2NH2CH2Jy(CH2)5a,CH2b'CH2c,COOH通過(guò)自由基共聚，使用作為引發(fā)劑的氧化還原劑過(guò)硫酸鈸(APS)和作為鏈轉(zhuǎn)移劑的2-氨基乙硫醇制備胺基-封端的聚(10-十一碳烯酸)前體聚合物。簡(jiǎn)要地，通過(guò)與100毫升氫氧化鈉溶液(0.1M)反應(yīng)首先將^—碳烯酸(40.0克，217.0毫摩爾)轉(zhuǎn)化成鈉鹽，且將溶液的pH調(diào)至8.0。將該溶液用氮?dú)夤呐葸^(guò)夜。然后，攪拌下將AET(2.0%-2.5%的單體，以摩爾計(jì))和APS(4%的單體，以重量計(jì))加入到溶液中(方案3)。反應(yīng)在70。C進(jìn)行48小時(shí)。反應(yīng)完成后，加入冷乙醇，沉淀析出粗產(chǎn)物。將沉淀物在乙醇中再分散三次去除未反應(yīng)的單體。使用1000Da分子量篩截的透析膜，將產(chǎn)物對(duì)DI水透析從而去除鹽，且通過(guò)冷凍干燥獲得產(chǎn)物。戶tt4-A^2與〃戶凝:^-茲合游iYMP^4m-^-"M14m-^^4Mi)-C00//游祭會(huì)-H2C—CH-I^c=oNHCHMe2過(guò)濾，乙醚沉淀H2C—CH~卞=0CH3I'H2C~C—SCH2CH2COOH-NHS,DCCDCMc=o」xNMe2OCH2CH2NH—FA真空干燥PUA-NH2DMSOH--H2C—CH.H2C—CH"6=0,NHCHMe2OT3H2C——=0-SCH2CH2CONHCH2CH2S--H2C—CH.NMe2bC=0」xOCH2CH2NH—FA-HCH2Jy(CH"a'fH2b'CH2c,COOH方案4葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA的合成。使用DCM中的DCC(1.2毫摩爾)和NHS(2毫摩爾)活化葉酸酯-結(jié)合的30P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-COOH的羧酸基(1毫摩爾)。通過(guò)過(guò)濾去除二環(huán)己基脲，加入過(guò)量的乙醚沉淀活化的葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-MAm)-COOH，其進(jìn)一歩真空干燥。將活化的葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-MAm)-COOH(1克)和過(guò)量的PUA-NH2(3克)溶解在30毫升DMSO中，并在室溫下攪拌48小時(shí)(方案4)。通過(guò)使用3,500Da分子量篩截的透析膜，用一周對(duì)DMSO透析從而去除未反應(yīng)的PUA-NH2，且每天補(bǔ)充DMSO。進(jìn)一步用另一周對(duì)DI水透析。通過(guò)冷凍干燥得到最終的淺黃色的產(chǎn)物，且該產(chǎn)物通過(guò)GPC、)H-NMR、FTIR和滴定法鑒定。分殘分折通過(guò)具有差示折光檢測(cè)器(Waters410,MA,USA)的凝膠滲透色譜(GPC)(Waters2690,MA，USA)測(cè)定聚合物的分子量。使用的流動(dòng)相是THF，流速為1毫升/分鐘。從使用一系列聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品(PolymerLaboratoriesInc.,MA,USA,分子量范圍從1350至151,700)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算重均分子量以及多分散性指數(shù)。凝拱嚴(yán)(7VM&分,使用BrukerAvance400光譜儀(400MHz)研究聚合物的'H-NMR圖譜，且將氯仿-d(CDCl3)用作溶劑。Fr-/i分橋應(yīng)用傅里葉變換紅外線光譜儀(FT-IR,Perkin-ElmerSpectrum2000)研究聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在FT-IR分析前將樣品壓制成溴化鉀壓片。,潘定酸堿滴定用于評(píng)價(jià)聚合物的羧酸基。簡(jiǎn)單地，將100毫克聚合物溶解在10毫升DI水中，且用O.OlNNaOH滴定，使用酚酞作指示劑。，透郝應(yīng)定使用UV-VIS光譜儀(Jasco,V-570,日本)于500納米測(cè)定在不同溫度的聚合物水溶液(5毫克/毫升)的光學(xué)透射率。以溫度控制器將樣品細(xì)胞自動(dòng)調(diào)溫。加熱速率為0.1。C/分鐘。在顯示50%光學(xué)透射率的溫度測(cè)定結(jié)合物溶液的LCST值?？v俯使用裝有He-Ne激光束的Zetasizer3000HAS(MalvernInstrumentLtd.,Malvern,英國(guó))在658納米(散射角90°)測(cè)定膠束的粒度。每個(gè)測(cè)定重復(fù)5次。從ii次測(cè)定得到平均值。通過(guò)多模式分析進(jìn)行尺寸測(cè)定。透i/冶^M錄楚r^M檢產(chǎn)通過(guò)TEM(PhilipsCM300,荷蘭)分析空白和DOX-負(fù)載的膠束的形態(tài)學(xué)。將幾滴包含O.Ol(w/v)。/。磷鎢酸的新制備的膠束溶液置于涂有碳膜的銅載網(wǎng)，并在室溫空氣干燥。用300keV的電子動(dòng)能進(jìn)行觀測(cè)。游岸/齡濃度通過(guò)熒光光譜使用芘作為探針評(píng)價(jià)嵌段聚合物在DI水和PBS中的臨界締合濃31度(CAC)。通過(guò)LS50B熒光光譜儀(PerkinElmer,美國(guó))在室溫記錄熒光光譜。將芘的丙酮溶液(6.16xl(^M，IOO微升)加至15毫升容量燒瓶中，并讓丙酮蒸發(fā)。然后，將10mL從0.01ppm至500卯m不同濃度的聚合物溶液加入燒瓶中。最終芘濃度為6.16xl0-7M。在室溫(20。C)平衡該溶液24小時(shí)。以395納米發(fā)射波長(zhǎng)從300至360納米記錄激發(fā)光譜。激發(fā)和發(fā)射的帶寬都設(shè)在2.5納米。繪制1335.5與1334.0的強(qiáng)度比，為聚合物濃度的對(duì)數(shù)的函數(shù)。在曲線拐點(diǎn)的切線與低濃度通過(guò)該點(diǎn)的水平切線的交點(diǎn)得到CAC值。棘層備通過(guò)膜透析法制備空白和DOX-負(fù)載的膠束。對(duì)于空白膠束，將聚合物(20毫克)溶解在4毫升DMAc中。然后使用2,000Da的分子量篩截的透析膜(Spectra/Por7,SpectrumLaboratoriesInc.),將所述溶液在室溫(20V)對(duì)DI水進(jìn)行透析24小時(shí)。最初3小時(shí)每小時(shí)換水。對(duì)于DOX-負(fù)載的膠束，將聚合物(20毫克)溶解在2毫升DMAc中。用2毫升DMAc中用過(guò)量?jī)赡柕娜野分泻虳OX(10毫克)。將該DOX溶液加至聚合物溶液中并通過(guò)渦旋混合5分鐘。使用2,000Da的分子量篩截的透析膜，將混合物在室溫(2(^C)對(duì)DI水進(jìn)行透析48小時(shí)。透析后，收集透析袋里的溶液，并用0.45微米注射器式過(guò)濾器過(guò)濾且冷凍干燥2天。為了測(cè)定DOX的負(fù)載水平，將已知量的DOX-負(fù)載的納米粒子溶解在1毫升DMAc中。使用UV-VIS分光光度計(jì)在485納米評(píng)價(jià)DOX濃度?；趶腄MAc中的DOX得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物的負(fù)載。膠束的產(chǎn)率被計(jì)算成回收的膠束與最初聚合物和藥物的重量比。斜藥激微將制備的DOX-負(fù)載的膠束溶液稀釋至1毫克/mL。將稀釋溶液(5毫升)轉(zhuǎn)移至10,000Da的分子量篩截的透析膜試管(Spectra/Por7，SpectrumLaboratoriesInc.)。然后將試管浸入包含30毫升PBS緩沖液(pH7.4和6.6)的燒杯中，其以100轉(zhuǎn)/分鐘的速度震搖，并在37。C孵育。在特定的時(shí)間間隔，抽取l毫升溶液并用新鮮的PBS緩沖液替換。使用UV-VIS分光光度計(jì)在485納米分析樣品的DOX濃度。ZX)X飾應(yīng)分布將在RPMI1640培養(yǎng)基(不含葉酸酯)中的游離DOX(10毫克/升)和DOX-負(fù)載的膠束(DOX濃度10毫克/升)用4T1細(xì)胞在檢測(cè)前孵育4小時(shí)。用PBS充分三次洗滌蓋玻片上的細(xì)胞且用CLSM(OlympusFV300,日本)顯像。在532納米用595納米的發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)DOX。激光功率為10%。使用相同的分辨率進(jìn)行所有的觀測(cè)。浙應(yīng)毒絲試驗(yàn)將4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞在補(bǔ)充有10%FBS、5%盤尼西林、2mML-谷氨酰胺(Sigma)的RPMI1640(不含葉酸酉旨)中培養(yǎng)，且在37°C，5%(:02孵育。將細(xì)胞種于96-孔板上，每孔10，000細(xì)胞，且孵育一天。用生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋在RPMI1640中的游離DOX，DOX-負(fù)載的膠束從而使最終DOX濃度為0.01、0.1、1.0、5.0、10.0和20.0毫克/升。將在RPMI1640中的空白聚合物膠束稀釋至1、10、50.0、100.0、300.0和600.0毫克/升。用IOO微升預(yù)制備樣品替換孔中的培養(yǎng)基。然后將板返回孵育器且在5%C02，37°C中保持48小時(shí)。48小時(shí)后，將新生長(zhǎng)培養(yǎng)基和10微升MTT溶液用于替換各孔中的混合物。然后將平板返回孵育器且在5%C02，37°C中進(jìn)一步保持3小時(shí)。然后去除各個(gè)孔中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和過(guò)量的MTT。然后將DMSO(150微升)加入至各個(gè)孔從而溶解內(nèi)化的紫色甲臜(internalisedpurplefonnazari)結(jié)晶。從各個(gè)孔吸取100微升樣品并轉(zhuǎn)移至新的96-孔板。每個(gè)樣品在每個(gè)板重復(fù)檢測(cè)八份。使用三個(gè)板，每個(gè)樣品總共有24份復(fù)制品。然后在550納米和690納米測(cè)定所述板。在550納米扣除690納米的讀數(shù)得到甲臜結(jié)晶的吸收率讀數(shù)。結(jié)果被表示為空白對(duì)照的吸收率的百分比。動(dòng)激微將4T1細(xì)胞皮下植入雌性balb/c(體重19-21克)(每個(gè)動(dòng)物107細(xì)胞)。將腫瘤生長(zhǎng)2周。將游離DOX和DOX-負(fù)載的膠束通過(guò)尾部靜脈注射給予動(dòng)物，當(dāng)量DOX劑量為5毫克/千克。在10分鐘、30分鐘、2小時(shí)和4小時(shí)，抽取血液樣品，并處死動(dòng)物。取出肝、肺、心臟、脾、腎和腫瘤，并保藏在-80t用于將來(lái)的分析。將器官稱重并均質(zhì)化。使用氯仿和異丙醇提取不同器官分布的DOX，且通過(guò)H.S.Yoo,T.G.Park,_/Co",to/.M2004，100,247中所述的方法進(jìn)行分析。在800C將均質(zhì)化的組織加入到包含2.0MHC1溶液的酸性水解緩沖液中，維持10分鐘。收集上清液，然后加入0.9毫升氯仿和異丙醇的混合物(以體積計(jì)，3:1)。渦旋混合后，在室溫通過(guò)16,000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘收集有機(jī)層。干燥溶液，并將其再溶解在流動(dòng)相中且用高效液相色譜(HPLC)分析?；厥章蕿?0%，通過(guò)內(nèi)標(biāo)物校正。HPLC系統(tǒng)由Waters2690分離模塊和Waters2475多入熒光檢測(cè)器組成。流動(dòng)相由0.01%三氟乙酸水溶液和乙腈組成，在40分鐘內(nèi)乙腈的百分比從5%至45%梯度增加。在480納米激發(fā)波長(zhǎng)和580納米發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)DOX峰?！?^f/#-^^^/YA7^^/"-^r-JDM^4,"-^^Mi)-6-JPK4必會(huì)成通過(guò)多步驟合成所述葉酸酯-結(jié)合的共聚物。第一，通過(guò)NIPAAm,DMAAm和AMA的自由基共聚，使用作為引發(fā)劑的過(guò)氧化苯酰(BPO)和作為鏈轉(zhuǎn)移劑的3-巰基丙酸制備羧酸-封端的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)。由于胺基的存在引入AMA單體，所述胺基可以用于進(jìn)一步和葉酸的結(jié)合。通過(guò)液-液擴(kuò)散法(THF/Et20)純化后，得到前體聚合物，接著對(duì)DI水透析。該聚合物的重均分子量為6.8kDa，具有1.7的多分散性(表1)。表l共聚物的性質(zhì)。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>-DMAAm-共-AMA)-COOH葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA7.75.01.5接著，將活化的葉酸結(jié)合至P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-COOH的胺基。雖然葉酸具有a-和Y-羧酸基，但是Y-羧酸由于它的高活性，主要在DCC/NHS反應(yīng)中被活化。離心得到的溶液從而丟棄片狀沉淀物，接著對(duì)DI水透析。冷凍干燥后得到葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-COOH。該聚合物的重均分子量為7.1kDa，具有1.8的分散性。第三，通過(guò)UA的自由基共聚，使用作為引發(fā)劑的氧化還原劑過(guò)硫酸銨(APS)和作為鏈轉(zhuǎn)移劑的2-氨基乙硫醇制備胺基-封端的PUA聚合物。UA單體的成功聚合通過(guò)在S4.8-5.0(C壓=CHCH2)禾B55.7-5.9(CH2-C/ZCH2)的乙烯質(zhì)子信號(hào)的缺失得到證實(shí)(圖1A)。在S1.3,1.5和2.2的峰分別歸屬于CZ/2CH2(方案3，信號(hào)a')HOOCCH2CH2和HOOCCH2(方案3,信號(hào)b')(圖1B)。PUA-NH2的FT-IR光譜在3084cm"(=CH伸縮峰)和911cm"(HC-CH變形峰)沒(méi)有吸收，進(jìn)一步證明UA單體的成功聚合(圖2A)。PUA-NH2的光譜還顯示來(lái)自COOH基團(tuán)的羰基帶(vo-cK),a)，在1712.3cm—1。最后，使用在DCM中的DCC/NHS，活化葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-MAm)-COOH的羧酸基。將活化的葉酸酯-結(jié)合的聚(NIPAAm-共-DMAAm-共-MAm)-COOH溶解在DMSO中，并與過(guò)量的PUA-NH2反應(yīng)。最終產(chǎn)物的NMR光譜顯示在圖3中。在53.8(信號(hào)a)的峰歸屬于NIPAAm部分的-NHCm4e2基團(tuán)的氫質(zhì)子。在S2.7-3.0(信號(hào)b)的寬峰來(lái)自DMAAm部分的-NMe2基團(tuán)。在S6.6(信號(hào)c),57.7(信號(hào)d)和S8.7(信號(hào)e)的弱峰來(lái)自葉酸部分。NIPAAm、DMAAm、葉酸酯的摩爾比為3.7:1:0.026，其由信號(hào)a、b和c的積分值得到(圖3)。FTIR光譜在1647.1cm"(v脂—c-。)和1547.8cm"(Vc-N)顯示兩個(gè)強(qiáng)吸收，其來(lái)自P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)嵌段。另一個(gè)在1720cm"(vo-oo,b)的弱吸收來(lái)自PUA-NH2嵌段和葉酸酯部分(圖2B)。最終產(chǎn)物的重均分子量是7.7kDa，具有1.5的多分散性(表1)。Mw的提高顯示PUA-NH2己成功結(jié)合至葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-COOH。通過(guò)滴定評(píng)價(jià)COOH的濃度，為每克聚合物18.4毫克。艦mcsr御//諸PNIPAAm顯示在水中32QC的LCST。通過(guò)引入親水單體(例如DMAAm)，可以將LCST在生理環(huán)境調(diào)節(jié)至稍微高于正常體溫(37^C)。在不同pH的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中，測(cè)定由葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-PUA自組裝膠束的LCST。如圖4所示，它是依賴pH的。例如，在pH7.4，LCST為38.0GC，高于正常體溫。然而，在pH6.6，它降至36.2GC，低于37QC。隨著外環(huán)境pH的升高，10-十一碳烯酸片段的羧酸基和葉酸酯更容易脫質(zhì)子，因此提高聚合物的親水性。這導(dǎo)致聚合物的LCST提高，由此納米粒子的提高。pH越高，LCST越大。由于在生理環(huán)境(PBS，pH7.4)膠束的LCST高于正常體溫，但是34低于正常體溫，因此這些膠束可以用于細(xì)胞內(nèi)藥物遞送。在pH范圍從4.0至6.5的內(nèi)含體和溶酶體中，所述膠束的核-殼結(jié)構(gòu)可以變形，是否附著的藥物分子。另一方面，膠束吸收質(zhì)子，且在這些環(huán)境中，膠束的殼由于LCST的提高而變?yōu)槭杷?，引起核?nèi)質(zhì)/溶酶體膜的滲透性提高，因此促進(jìn)附著的藥物分子運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)。C4C,淀使用使用芘作探針，通過(guò)熒光光譜分析聚合物的CAC。芘的激發(fā)光譜顯示在圖5A中。由于聚合物濃度升高，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)且第三峰從334.0納米移至335.5納米。第三峰的紅移說(shuō)明芘分子被轉(zhuǎn)移至膠束核的低極性區(qū)域。圖5B顯示在DI水中1334.0與1335.5比率隨聚合物濃度的變化。CAC值測(cè)定為17.8毫克/升。應(yīng)注意，當(dāng)與由無(wú)規(guī)聚合物P(NIPAAm-共-DMAAm-共-UA)制得的膠束相比時(shí)，由嵌段共聚物自組裝的膠束形成后，由芘發(fā)射光譜得到的I3/Ii大得多，提示更多疏水核的形成可能歸因于更多數(shù)量的UA單元和更好定義的核-殼結(jié)構(gòu)的存在。-膽1紛妙/德鎖為了研究pH對(duì)膠束結(jié)構(gòu)變化的作用，在37。C，溶解在不同pH，但是154mM的離子強(qiáng)度相同的PBS中的聚合物存在下，研究芘強(qiáng)度比(I335.5/I334.0)的變化。如圖6所示，對(duì)于pH7.4和pH7.2的膠束，該比率高，說(shuō)明芘分子在低極性的微環(huán)境中。然而，由于pH從7.0降至6.8，該比率快速下降，提示芘分子暴露于更高極性的環(huán)境(即水介質(zhì))。如前面部分所討論，膠束中的羧酸基在pH6.8或以下容易質(zhì)子化，導(dǎo)致LCST低于37。C，因此導(dǎo)致膠束的核-殼結(jié)構(gòu)變形。這將芘分子暴露于水介質(zhì)中。該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一歩證明所述核-殼結(jié)構(gòu)對(duì)外部pH變化敏感。麼貴游^V"、/#分務(wù)///#漆學(xué)表2空白和DOX-負(fù)載的膠束的性質(zhì)樣品有效直徑多分散性(納米)空白膠束92.8±0.10.27±0.01DOX-負(fù)載的膠束98.5+2.10.28+0.01表2顯示DI水中制備的空白和DOX-負(fù)載的膠束的尺寸和尺寸分布。應(yīng)該發(fā)現(xiàn)膠束具有相對(duì)狹窄的尺寸分布?？瞻缀虳OX-負(fù)載的膠束的平均有效直徑分別為92.8納米和98.5納米。SEM影像說(shuō)明空白和DOX-負(fù)載的膠束在自然界是球形的(圖7)。從TEM影像觀察到的粒度與通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的非常一致?？紤]到臨床應(yīng)用，膠束的物理穩(wěn)定性是另一重要方面，因?yàn)槟z束的聚集可以引起血管阻塞，且使它們對(duì)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的清除更敏感。在室溫，超過(guò)一周，粒度在PBS(pH7.4)中變化不大，范圍從87.0納米至97.0納米，提示所述膠束是穩(wěn)定的。另一方面，經(jīng)過(guò)五次稀釋后，粒度沒(méi)有顯著變化(87.0納米對(duì)92.1納米)。這很重要，由35于給藥后膠束的分解可以導(dǎo)致附著的藥物快速釋放，在體內(nèi)引起副作用。而且，應(yīng)該觀察到經(jīng)在PBS(pH7.4)中10。/。牛血清白蛋白(BSA)刺激后，空白膠束的尺寸保持穩(wěn)定，說(shuō)明膠束和BSA的相互作用被親水殼和負(fù)電荷很好的抑制，所述負(fù)電荷由葉酸分子的羧酸基在pH7.4脫質(zhì)子引起。應(yīng)預(yù)期所述膠束在體內(nèi)可以具有良好的物理穩(wěn)定性。在37QC，PBS中膠束的尺寸是依賴pH的，為117.2納米和612.6納米，分別對(duì)應(yīng)pH7.4和pH6.6。粒度的增加是由于在pH6.6膠束團(tuán)聚。另外，粒度也是依賴溫度的。例如，在PBS(pH7.4)中，當(dāng)穩(wěn)定升高至4(^C，膠束的粒度提高到740.0納米，因?yàn)樵贚CST以上膠束團(tuán)聚。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明所述膠束是pH-和溫度敏感的。特別是，粒度的變化是可逆的。辦藥激微在膠束中DOX的實(shí)際負(fù)載水平是大約2.5重量％。圖8顯示在37。C，刺激生理?xiàng)l件下(PBS，pH7.4)和酸性環(huán)境中(pH6.6)，DOX從膠束的體外釋放分布。24小時(shí)內(nèi)，在pH6.6時(shí)DOX的釋放比在pH7.4時(shí)更快，分別具有大約85%和40%的藥物釋放。在pH6.6，膠束的LCST降低至36.2QC，導(dǎo)致膠束的疏水殼。膠束的親水/疏水平衡(HLB)的喪失導(dǎo)致核-売結(jié)構(gòu)的最終變形，釋放附著的藥物分子。"0￥-^^^^^_^游一智應(yīng)級(jí)#//7/^^毒絲通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)游離DOX和DOX-負(fù)載的膠束通過(guò)4T1細(xì)胞的細(xì)胞吸收。如圖9所示，當(dāng)用4T1細(xì)胞孵育游離DOX時(shí)，通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散途徑將阿霉素分子轉(zhuǎn)移至所述細(xì)胞，且僅僅在細(xì)胞核內(nèi)累積。然而，當(dāng)所述細(xì)胞與DOX-負(fù)載的膠束孵育時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核觀測(cè)到強(qiáng)熒光。出現(xiàn)在細(xì)胞核的強(qiáng)信號(hào)歸因于從膠束釋放的阿霉素分子。該發(fā)現(xiàn)說(shuō)明通過(guò)內(nèi)吞作用，DOX-負(fù)載的膠束被納入所述細(xì)胞，然后從內(nèi)含體和/或溶酶體脫離，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。另外，由葉酸酯-結(jié)合的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-AMA)-b-UA制得的DOX-負(fù)載的膠束的細(xì)胞吸收高于不含葉酸酯的DOX-負(fù)載的P(NIPAAm-共-DMAAm-共-UA)的細(xì)胞吸收，可能因?yàn)槿~酸酯受體介導(dǎo)細(xì)胞攝粒作用特異性更高。研究游離DOX和DOX-負(fù)載的膠束對(duì)4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性。DOX的IC50值，50%細(xì)胞被殺死的濃度，針對(duì)游離DOX、具有葉酸酯和不含葉酸酯的DOX-負(fù)載的膠束分別為3.0、3.8和7.6毫克/升(圖IO)。因?yàn)楦叩募?xì)胞吸收，具有葉酸酯的D0X-負(fù)載的膠束對(duì)4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性比不含葉酸酯的DOX-負(fù)載的膠束的細(xì)胞毒性大得多。應(yīng)當(dāng)提及的是空白膠束在濃度高達(dá)500毫克/升時(shí)沒(méi)有細(xì)胞毒性。/他微使用小鼠皮下4T1乳腺腫瘤進(jìn)行動(dòng)物研究，從而研究游離DOX和DOX-負(fù)載的膠束的生物分布。圖11顯示給予游離DOX和DOX-負(fù)載的膠束后，腫瘤組織中DOX的水平，為時(shí)間的函數(shù)。對(duì)于游離DOX，在30分鐘達(dá)到最大DOX水平，為2.9微克/克，但是DOX水平迅速降低，在240分鐘僅為1.0微克/克。相反，在膠束制劑中DOX保持在較高水平直至240分鐘。這可能是因?yàn)镋PR作用和基于葉酸酯受體介導(dǎo)細(xì)胞攝粒作用的DOX-負(fù)載膠束的增強(qiáng)的細(xì)胞吸收。另外，還分析了血液中的DOX水平。如圖12和13所示，對(duì)于游離DOX，當(dāng)與DOX-負(fù)載的膠束相比時(shí)，血液中的DOX水平降低得快得多。清楚地，DOX-負(fù)載的膠束顯示更長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間，與J.W.Cowens,P.J.Creaven，W.R.Greco,D.E.Brenner,Y.Tung，M.Ostro,F.Pilkiewicz,R.Ginsberg,N.Petrelli,Owcwiew"r/21993,53,2796報(bào)道的結(jié)論相一致。游離DOX和DOX-負(fù)載的膠束在血液中的t/2分別為大約30分鐘和140分鐘。這延長(zhǎng)的循環(huán)可能歸因于膠束通過(guò)RES和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)降低DOX的吸收的事實(shí)。圖12和13還顯示在不同器官中的DOX水平，例如脾、腎、心臟、肝和肺。游離DOX具有寬泛的分布，均勻地累積在心臟、肺和肝。然而，在膠束的制劑中，DOX優(yōu)先地積累在富含RES的器官中，例如肝和脾。發(fā)現(xiàn)DOX水平在心臟中顯著降低，說(shuō)明所述膠束可以降低DOX的心臟毒性，DOX的主要副作用。權(quán)利要求1、一種嵌段共聚物，包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌段共聚物，其中所述耙向單體單元是腫瘤靶向單體單元。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的嵌段共聚物，其中所述各個(gè)疏水單體單元包含至少一個(gè)pH-敏感部分。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌段共聚物，其中所述疏水單體單元來(lái)自能聚合的不飽和脂肪酸。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌段共聚物，其中所述溫度敏感單體單元來(lái)自N-丙烯?；哙?、N-丙烯酰基吡咯酮、N-羥丙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、N-叔丁基丙烯酰胺、N-哌啶基甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、N-甲基丙烯?；哙?、N-甲基丙烯?；量┩?、N-羥丙基甲基丙烯酸酯、羥丙基纖維素、N-叔丁基甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基甲基丙烯酰胺或N-異丙基甲基丙烯酰胺。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌段共聚物，其中所述親水單體單元包含酰胺、羧酸、羧酸酯、胺、二醇或醇。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的嵌段共聚物，其中所述親水單體單元來(lái)自選自以下的種類丙烯酸、丙烯酰胺(AAm)、丙烯酸酯、吡咯酮、乙二醇、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、N，N'-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)或N-(羥甲基)丙烯酰胺或其取代的衍生物。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌段共聚物，其中所述靶向單體單元包含葉酸酯、半乳糖、肽、抗體或抗體片段。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌段共聚物，其中所述靶向單體單元由靶向化合物或其衍生物與基質(zhì)單體單元反應(yīng)得到，其中所述基質(zhì)單體單元包含能與靶向化合物或其衍生物反應(yīng)的官能團(tuán)從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至基質(zhì)單體單元。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌段共聚物，其中所述共聚物的分子量小于大約40,000。11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌段共聚物，其中所述共聚物的較低臨界溶液溫度(LCST)在pH大約6.6至大約1時(shí)低于大約37QC。12、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌段共聚物，其中所述共聚物的較低臨界溶液溫度在正常生理pH時(shí)高于大約37QC。13、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌段共聚物，其中所述溫度敏感單體單元來(lái)自N-異丙基丙烯酰胺，所述親水單體單元來(lái)自N,N-二甲基丙烯酰胺，所述靶向單體單體單元是來(lái)自甲基丙烯酸2-氨基乙酯的結(jié)合葉酸酯的單體單元，且所述疏水單體單元來(lái)自10-十一碳烯酸。14、一種制備嵌段共聚物的方法，所述方法包括—提供第一大分子單體，所述第一大分子單體包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)耙向單體單元，且一將所述第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)，所述第二大分子單體包含多個(gè)疏水單體單元，且所述第二大分子單體包含至少一個(gè)pH-敏感部分。15、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述靶向單體單元是腫瘤靶向單體單元。16、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述提供第一大分子單體的歩驟包括將前體大分子單體與靶向化合物或其衍生物反應(yīng)。17、根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，包括將溫度敏感單體、親水單體和基質(zhì)單體進(jìn)行共聚從而形成前體大分子單體，其中所述基質(zhì)單體包含能與靶向化合物或其衍生物在所述共聚后反應(yīng)的官能團(tuán)從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至前體大分子單體。18、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述提供第一大分子單體的歩驟包括將溫度敏感單體、親水單體和來(lái)自結(jié)合靶向分子和基質(zhì)單體的靶向單體進(jìn)行共聚。19、根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述共聚在硫醇鏈轉(zhuǎn)移劑存在下進(jìn)行，所述硫醇鏈轉(zhuǎn)移劑為羧基官能、氨基官能或羥基官能或其包含能轉(zhuǎn)化成羧酸基、氨基或羥基的官能團(tuán)。20、根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述共聚在硫醇鏈轉(zhuǎn)移劑存在下進(jìn)行，所述硫醇鏈轉(zhuǎn)移劑為羧基官能、氨基官能或羥基官能或其包含能轉(zhuǎn)化成羧酸基、氨基或羥基的官能團(tuán)。21、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，包括將能聚合的疏水單體聚合制備第二大分子單體的歩驟，所述能聚合的疏水單體包含至少一個(gè)pH-敏感部分或包含能轉(zhuǎn)化成pH-敏感部分的官能團(tuán)。22、根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述聚合在鏈轉(zhuǎn)移劑存在下進(jìn)行，所述鏈轉(zhuǎn)移劑是硫醇，該硫醇包含能與第一大分子單體端基反應(yīng)的官能團(tuán)。23、根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述官能團(tuán)選自胺基、羥基或羧酸基。24、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，所述方法包括一將N-異丙基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸2-氨基乙酯在羧基官能的硫醇存在下進(jìn)行共聚從而形成前體大分子單體，一將葉酸的N-羥基琥珀酰亞胺衍生物與前體大分子單體反應(yīng)從而形成第一大分子單體，一活化的第一大分子單體以與胺反應(yīng)從而形成活化的第一大分子單體，且一將活化的第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)，所述第二大分子單體是具有末端氨基的10-十一碳烯酸的聚合物。25、一種通過(guò)以下方法制備的嵌段共聚物，該方法包括一提供第一大分子單體，所述第一大分子單體包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且一將所述第一大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)，所述第二大分子單體包含多個(gè)疏水單體單元，且所述第二大分子單體包含至少一個(gè)pH-敏感部分。26、一種溫度和pH敏感組合物，所述組合物包含一治療劑，和一包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段的嵌段共聚物，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分。27、根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述治療劑選自抗癌藥、抗炎藥或治療神經(jīng)障礙的藥物，或所述治療劑包含兩種或多種這類藥物的混合物。28、根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述治療劑是抗癌藥且所述靶向單體單元是腫瘤靶向單體單元。29、根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述治療劑選自阿霉素、阿納托唑、依西美坦、環(huán)磷酰胺、表柔比星、托瑞米芬、來(lái)曲唑、曲妥單抗、甲地孕酮、他莫昔芬、紫杉醇、多西他奇、卡培他濱、醋酸高錫林、羥基尿素、乙琥紅霉素、環(huán)孢霉素、順鉑或這些藥物任意兩種或多種的混合物。30、根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述嵌段共聚物被制成至少一個(gè)納米粒子，所述納米粒子包含疏水核和親水殼，且其中所述治療劑包含在所述疏水核內(nèi)。31、根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，所述組合物在納米粒子的外表面包含靶向基團(tuán)。32、一種制備溫度和pH敏感組合物的方法，所述方法包括將治療劑與嵌段共聚物溶液結(jié)合，所述嵌段共聚物包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段嵌段，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分。33、根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述靶向單體單元是腫瘤靶向單體單元。34、根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，所述方法包括一次或多次以下步驟一透析所述結(jié)合的嵌段共聚物溶液和治療劑從而形成包含所述治療劑和所述嵌段共聚物的膠束或納米粒子，且除去沒(méi)有并入膠束或納米粒子的治療劑，且除去沒(méi)有并入膠束或納米粒子的嵌段共聚物；一通過(guò)過(guò)濾分離所述膠束或納米粒子；—干燥所述膠束或納米粒子。35、根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，所述方法包括—將治療劑與嵌段共聚物溶液結(jié)合，所述嵌段共聚物包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段嵌段，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)耙向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元且所述第二嵌段包含至少一個(gè)PH敏感部分；一使用具有大約2000分子量篩截的透析膜透析所述結(jié)合的嵌段共聚物溶液和治療劑從而形成包含所述治療劑和所述嵌段共聚物的膠束或納米粒子；—通過(guò)0.45微米過(guò)濾器過(guò)濾所述膠束或納米粒子從而分離粒子或膠束；且—冷凍干燥所述粒子或膠束。36、一種給動(dòng)物或人類提供治療劑的方法，所述方法包括給予所述動(dòng)物或人類溫度和pH敏感組合物，該溫度和pH敏感組合物包含—治療劑，和—嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分；其中所述共聚物被制成至少一個(gè)包含疏水核和親水殼的納米粒子且其中所述治療劑包含在所述疏水核內(nèi)。37、根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述組合物經(jīng)口服、局部、靜脈內(nèi)、局部區(qū)域、腸胃外遞送，經(jīng)吸收或眼部途徑遞送。38、根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述治療劑包含抗癌藥，且其中在納米粒子的外表面上有腫瘤靶向基團(tuán)。39、一種藥物組合物，該藥物組合物包含一溫度和pH敏感組合物，該溫度和pH敏感組合物包含治療劑，禾口包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段的嵌段共聚物，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分，和_至少一種藥學(xué)上可接受的載體和/或佐劑。40、一種甜體嵌段共聚物，其包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)基質(zhì)單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，且所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分，其中各個(gè)基質(zhì)單體單元包含能與靶向化合物或其衍生物反應(yīng)的官能團(tuán)從而將耙向化合物或其衍生物結(jié)合至前體嵌段共聚物。41、一種制備前體嵌段共聚物的方法，所述方法包括—提供一種前體大分子單體，所述前體大分子單體包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)基質(zhì)單體單元，且—將所述前體大分子單體與第二大分子單體反應(yīng)，所述第二大分子單體包含多個(gè)疏水單體單元，且所述第二大分子單體包含至少一個(gè)pH-敏感部分。42、一種制備嵌段共聚物的方法，所述方法包括將前體嵌段共聚物與靶向化合物或其衍生物反應(yīng)從而將所述靶向化合物或其衍生物結(jié)合至前體嵌段共聚物，其中所述前體嵌段共聚物包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段，其中所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)基質(zhì)單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元，且所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分，其中各個(gè)基質(zhì)單體單元包含能與靶向化合物或其衍生物反應(yīng)的官能團(tuán)從而將靶向化合物或其衍生物結(jié)合至前體嵌段共聚物。全文摘要本發(fā)明提供包含至少一種第一嵌段和一種第二嵌段的嵌段共聚物。所述第一嵌段包含多個(gè)溫度敏感單體單元、多個(gè)親水單體單元和多個(gè)靶向單體單元，且所述第二嵌段包含多個(gè)疏水單體單元。所述第二嵌段包含至少一個(gè)pH敏感部分。文檔編號(hào)A61P35/00GK101501108SQ200680055523公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期2006年7月5日優(yōu)先權(quán)日2006年7月5日發(fā)明者S-Q·劉,Y-Y·楊申請(qǐng)人:新加坡科技研究局