專利名稱：：癌性疾病調節(jié)抗體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及癌性疾病調節(jié)抗體(CDMAB)的分離和制備，以及CDMAB在診斷和治療過程中的應用，任選地與一種或多種化學治療劑聯(lián)合使用。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的CDMAB的結合分析。
背景技術：
：每個患有癌癥的個體都是獨特的，由于個體的差異，其(患有的癌癥也不同于其他人所患的癌癥。盡管如此，目前的治療采用相同的方式治療患有同期同類型胂瘤的所有患者。至少30%的這些患者的一線治療是失敗的，這樣就造成更多輪次的治療，增加了治療失敗、腫瘤轉移及最終死亡的可能性。一種優(yōu)越的治療方式應該是針對特定個體的個體化治療。目前唯一采用個體化治療的方式是外科手術?；熀头暖煵荒茚槍颊吡可矶ㄗ?，而在大多數(shù)情況下，手術本身并不足以治愈癌癥。隨著單克隆抗體的問世，發(fā)展個體化治療方法的可能性變得更為現(xiàn)實，因為每種抗體能針對單一的表位。而且，制備針對多個表位的集群(constellation)的抗體組合成為可能，該表位集群唯一確定了某一特定個體的腫瘤。認識到癌細胞和正常細胞的顯著差異在于癌細胞含有轉化細胞特異異性地靶向轉化細胞的單克隆抗體；這樣就產(chǎn)生了單克隆抗體能夠作為"魔術子彈(MagicBullets)"消除癌細胞的觀點。已經(jīng)顯示，依照本發(fā)明公開的教導分離出的單克隆抗體能夠以有利于患者的方式調節(jié)癌性疾病進程，如通過降低腫瘤負荷；并且本文將這些單克隆抗體稱為癌性疾病調節(jié)抗體(CDMAB)或"抗癌"抗體。目前，癌癥患者通?？梢赃x擇的治療方式很少。目前的癌癥治療方法已經(jīng)改善了總體存活率和發(fā)病率。然而，對特定的個體來說，這些改善的統(tǒng)計數(shù)據(jù)與他們個人情況的改善并無必然關系。因此，如果提出一種方法學，使醫(yī)生能夠在同組患者中，獨立于其他患者治療每例腫瘤，這就使根據(jù)個人進行量身定做的獨特治療成為可能。理論上，這樣一種治療過程可以增加治愈率，產(chǎn)生更好的效果，從而滿足盼望已久的需要。從歷史上來看，多克隆抗體的應用在治療人類癌癥的方面取得的成功有限。一直用人類的血漿來治療淋巴瘤和白血病，但極少有延長的好轉或反應。而且，這種治療方法重復性差，與化療相比，沒有更多的益處。像乳腺癌、黑色素瘤和腎細胞癌等實體肺瘤也用人類血液、黑猩猩的血清、人類血漿和馬血清來治療過，但相應的結果是不可預測和無效的。有很多用單克隆抗體治療實體腫瘤的臨床試驗。在20世紀80年代，就有至少四項針對人類乳腺癌的臨床試驗，在使用了針對特定抗原或基于組織特異性的抗體的至少47名患者中，只產(chǎn)生了一名應答者。直到1998年，才有了成功的臨床試驗，該試驗聯(lián)合使用人源化的抗Her2抗體與順鉑。在這項試驗中，對37個患者的反應進行了評估，大約有四分之一的患者有部分反應，另外一半有輕微的或穩(wěn)定的病情進展。研究結腸直腸癌的臨床試驗涉及針對糖蛋白和糖脂耙標的抗體。對腺癌有某些特異性的諸如17-lA等抗體已經(jīng)進入了II期臨床試驗，其中60多例患者中，只有一例患者產(chǎn)生了部分反應。在其他的試驗中，17-1A的使用在額外采用環(huán)磷酰胺實驗方案的52例患者中，只產(chǎn)生了l例完全反應，2例輕微反應。其他涉及17-1A的臨床試驗得到與此相似的結果。最初被批準用來成像的人源化鼠單克隆抗體也沒能使胂瘤消退。到目前為止，還沒有對結腸直腸癌有效的抗體。同樣地，對于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌的結果同樣不好。用抗CD3單克隆抗體治療黑色素瘤取得了一些有限的成功。因此，可以看到，盡管所測試的抗體在作為人類臨床試驗的先決條件的小動物實驗研究中獲得成功，但在絕大多數(shù)情況下還是無效的?，F(xiàn)有專利美國專利5，750，102公開了一種方法，其中用可以從患者的細胞或組織中克隆的MHC基因轉染來自患者腫瘤的細胞。然后用這些轉染的細胞給患者接種。美國專利4,861,581公開了一種方法，它包括的步驟有獲取對哺乳動物胂瘤細胞和正常細胞的細胞內成分特異、對外部成分沒有特異性的單克隆抗體；標記單克隆抗體；將該標記的抗體與已接受殺滅腫瘤細胞療法的哺乳動物的組織4妄觸；以及通過測量該標記抗體與退化的腫瘤細胞的細胞內成分的結合來確定治療的效果。在制備針對人類細胞內抗原的抗體時，專利權所有人認識到腫瘤細胞是這類抗原的便利來源。美國專利5,171,665提供了一種新型抗體及其制備方法。具體地，該專利敘述了一種單克隆抗體的制備，該抗體有與人類腫瘤(例如腸癌和肺癌)相關的蛋白抗原牢固結合的特性，而與正常細胞的結合程度弱得多。美國專利5,484,596提供了一種癌癥治療的方法，所述方法包括手術去除人類癌癥患者的腫瘤；處理腫瘤組織以獲得腫瘤細胞；照射腫瘤細胞，使其能成活但不致瘤；用這些細胞來制備抑制原發(fā)性腫瘤復發(fā)、同時抑制腫瘤轉移的患者疫苗。該專利講述了能夠與腫瘤細胞表面抗原反應的單克隆抗體的開發(fā)。如在第4欄，第45行等處提到的，專利權所有人在開發(fā)單克隆抗體中應用了自體腫瘤細胞，該單克隆抗體對人類腫瘤表現(xiàn)出活性特異的免疫治療。美國專利5,693,763講述了人類癌細胞的糖蛋白抗原特性，其不依賴于起源的上皮組織。美國專利5,783,186涉及能誘導表達Her2的細胞發(fā)生凋亡的抗-Her2抗體、產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細胞系、用該抗體和包括所述抗體在內的藥物組合物治療癌癥的方法。美國專利5，849，876描述了產(chǎn)生單克隆抗體的新的雜交瘤細胞系，該抗體針對從肺瘤和非腫瘤組織來源中純化的粘液素抗原。美國專利5,869,268涉及一種制備產(chǎn)生特異針對目標抗原的抗體的人類淋巴細胞的方法，制備單克隆抗體的方法及該方法制備的單克隆抗體。該專利特別涉及用于癌癥診斷和治療的抗-HD人類單克隆抗體的制備。美國專利5,869,045涉及與人類癌細胞反應的抗體、抗體片段、抗體偶聯(lián)物和單鏈免疫毒素。這些抗體發(fā)揮功能的機制是雙重的，其中該分子可以與人類癌細胞表面的細胞膜抗原反應，而且該抗體能夠進一步內化入癌細胞內，隨后結合，這使它們對形成抗體-藥物，抗體-毒素的偶聯(lián)物尤其有用。未經(jīng)修飾的抗體在特定濃度下，也表現(xiàn)出細胞毒特性。美國專利5,780,033公開了用于腫瘤治療和預防的自身抗體的用途。不過，這種抗體是來自老年哺乳動物的抗核自身抗體。這里，自身抗體是指一種存在于免疫系統(tǒng)的天然抗體。因為自身抗體來自"老年哺乳動物"，所以就不要求自身抗體真正來自受治患者。此外，該專利公開了來自老年哺乳動物的天然單克隆抗核自身抗體及產(chǎn)生單克隆抗核自身抗體的雜交瘤細^^系。發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人之前已經(jīng)被授予發(fā)明名稱為"個體化患者特異性抗癌抗體"的美國專利6,180,357，該專利要求保護篩選用于癌性疾病治療的個體化抗癌個性抗體的方法。本申請采用了美國專利6,180,357中講述的生產(chǎn)患者特異性抗癌抗體的方法，用以分離編碼癌性疾病調節(jié)單克隆抗體的雜交瘤細胞系。這些抗體可以針對一種腫瘤被專門制備，從而使癌癥治療的個性化成為可能。在本申請公開的內容中，具有殺滅細胞(細胞毒性的)或抑制細胞生長(細胞生長抑制的)特性的抗癌抗體將在下文中被稱為細胞毒性的。這些抗體能夠用于輔助癌癥的分期和診斷，也可以用于治療腫瘤轉移。個性化抗癌治療的前景會給患者的治療方式帶來變化。一種可能的臨床情境是在腫瘤出現(xiàn)時就取樣并入庫。通過該樣本，能夠從預存在的癌性疾病調節(jié)抗體組對該腫瘤進行分型?；颊邔⒈怀Ｒ?guī)分期，但可用的抗體可以對患者進一步分期。用現(xiàn)有的抗體可以直接對該患者進行治療，展示庫并結合本發(fā)明公開的篩選方法制備。因為存在交叉反應性，即存在其他腫瘤攜帶一些與接受治療的腫瘤相同的表位的可能性，所以將制備的所有抗體都加入到抗癌抗體庫中。根據(jù)本方法制備的抗體可以用于治療許多患有與這些抗體結合的腫瘤的患者的癌性疾病。除抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦治療作為多模式治療方案的一部分。通過本方法分離的抗體對于非癌細胞相對無毒性這一事實允許大劑量抗體組合單獨應用，或與傳統(tǒng)的治療聯(lián)合應用。高治療指數(shù)也允許短期內的重復治療，從而降低了治療抗性細胞出現(xiàn)的可能性。另外，本發(fā)明還包括將標準的化學治療物質，例如放射性核素，與本發(fā)明的CDMAB偶聯(lián)，從而使所述的化療作用集中。如果患者的初期治療產(chǎn)生耐藥性或發(fā)生了轉移，可以重復肺瘤特異性抗體的制備過程進行再次治療。而且，該抗癌抗體可以與/人該患者體內獲得的紅細胞偶聯(lián)，重新輸注到患者體內用于治療轉移肺瘤。目前幾乎沒有有效的治療轉移癌的方法，而轉移通常預示著導致死亡的不良結果。然而，轉移癌通常血供豐富，通過紅細胞來運輸抗癌抗體可以使抗體富集在腫瘤部位。即便在轉移之前，大多數(shù)癌細胞也要依賴于宿主的血供來存活，與紅細胞偶聯(lián)的抗癌抗體對原位肺瘤同樣有效?？蛇x擇地，所述抗體可以與其他的血細胞，比如淋巴細胞、巨喧細胞、單核細胞、自然殺傷細胞等偶聯(lián)?？贵w有五類，每類都與其重鏈所賦予的功能相關。通常認為通過抗體依賴性細胞毒性作用或補體依賴性細胞毒性作用來介導^^果抗體的癌細胞殺傷功能。例如，鼠IgM和lgG2a抗體能夠通過結合補體系統(tǒng)的C-l組分來活化人類補體，從而活化導致腫瘤裂解的補體活化的經(jīng)典途徑。對于人類抗體，最有效的補體激活抗體通常是IgM和IgGl。鼠IgG2a和IgG3同種型抗體可以有效地召集具有Fc受體的細胞毒細胞，其導致單核細胞、巨謹細胞、粒細胞和某些淋巴細胞的細胞殺傷作用。人的IgGl和IgG3同種型抗體介導ADCC?？贵w介導的癌癥殺傷功能的另一可能機制是^f吏用能夠催化細胞膜及其相關糖蛋白或糖脂中不同的化學鍵水解的抗體，即所謂的催化抗體?？贵w介導癌細胞殺傷的還有另外兩種被更廣泛接受的機制。第一種是抗體作為疫苗誘導機體產(chǎn)生針對位于腫瘤細胞上的假定癌癥抗原的免疫反應。第二是抗體用于靶向生長受體并干擾其功能或者下調該受體以使其功能有效喪失。因此，本發(fā)明的目的是講述引發(fā)抗體誘導的選自人類腫瘤的組織樣本中癌性細胞的細胞毒性作用的方法，該方法包括提供來自人類腫瘤的組織樣本，提供分離的單克隆抗體或其細胞的細胞毒性誘導抗原結合片段，以及將分離的單克隆抗體或其細胞的細胞毒性誘導抗原結合片段與所述組織樣本接觸，所述分離的單克隆抗體結合的一個或多個抗原表位與由以保藏號PTA-4890、PTA-4891或PTA-5643保藏于ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體結合的抗原表位相同。本發(fā)明的另一方面講述了治療哺乳動物中對抗體誘導的細胞的細胞毒性作用敏感的人類乳腺腫瘤或前列腺腫瘤的方法，其中所述乳腺腫瘤或前列腺腫瘤表達與分離的單克隆抗體或其細胞的細胞毒性作用誘導抗原結合片段特異性結合的抗原，所述分離的單克隆抗體結合的一個或多個抗原表位與由以保藏號PTA-4890、PTA-4891或PTA-5643保藏于ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體結合的抗原表位相同。所述方法包括如下步驟給予所述哺乳動物有效誘導細胞的細胞毒性作用的量的分離單克隆抗體或其抗原結合片段，由此P爭低所述哺乳動物的腫瘤負荷。本發(fā)明的再一目的是采用特定個體來源的細胞制備癌性疾病調節(jié)抗體方法，該抗體對癌細胞有細胞毒性，而同時對非癌細胞相對無毒，該方法是為了分離雜交瘤細胞系和該雜交瘤細胞系編碼的相應的分離的單克隆抗體及其抗原結合片段。本發(fā)明的另外目的涉及癌性疾病調節(jié)抗體和其抗原結合片段。本發(fā)明的另外目的是制備癌性疾病調節(jié)抗體，其細胞毒性通過抗體依賴性細胞毒性作用介導。本發(fā)明的另外目的是制備癌性疾病調節(jié)抗體，其細胞毒性通過補體依賴性細胞毒性作用介導。本發(fā)明的另外目的是制備癌性疾病調節(jié)抗體，其細胞毒性是其催化細胞化學鍵水解的能力的作用。本發(fā)明的另外目的是制備癌性疾病調節(jié)抗體，其用于癌癥診斷、預后和監(jiān)測的結合分析。本發(fā)明其它的目的和優(yōu)點通過本發(fā)明下述的說明、舉例和實施方案將變得顯而易見。附圖簡要i兌明圖1包括1A245.6抗體、兩種抗體的同種型對照抗體以及抗-EGFR抗體針對幾種癌細胞系和非癌細胞系的代表性流式細胞術(FACS)直方圖。圖2包括7BD-33-llA抗體、1A245.6的同種型對照抗體、抗EGFR抗體以及抗EGFR的同種型對照抗體針對幾種癌細胞系和非癌細胞系的代表性FACS直方圖。圖3包括11BD-2E11-2抗體、兩種抗體的同種型對照抗體以及抗-EGFR抗體針對幾種癌細胞和非癌細胞系的代表性FACS直方圖。圖4是特定抗體治療時，腫瘤體積隨時間變化的圖解分析。圖5是抗體對MB231人類乳腺癌腫瘤體積的影響隨時間變化的圖解分析。圖6是量化抗體治療的存活百分比隨時間變化的圖解分析。發(fā)明的詳細描述一般而言，下面用于概述、描述、實施例和權利要求書中的字詞或短語通常都有其指定的含義。術語"抗體"使用其最寬泛的涵義，具體來說涵蓋，例如單個單克隆抗體(包括激動劑、拮抗劑和中和抗體，去免疫的、鼠的、嵌合的或人源化的抗體)、攜帶有多表位特異性的抗體組合物、單鏈抗體、抗體的免疫偶聯(lián)物和抗體片段(見下文)。本發(fā)明中使用的術語"單克隆抗體"指從基本同質的抗體群中獲得的抗體，即構成該群抗體的個別抗體是相同的，除了可以少量存在的可能自然發(fā)生的變異。單克隆抗體高度特異性的針對單一抗原位點。而且，與包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相比，每一種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除了特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)勢還在于其合成可以不受其他抗體的污染。修飾語"單克隆的"指從基本同質的抗體群中獲得的抗體的特征，而不能解釋為需要通過任何特定的方法來生產(chǎn)該抗體。例如，本發(fā)明中使用的單克隆抗體可以通過由Kohlere,a/.，vVa^"e，256:495(1975)餘次描述的雜交瘤(鼠或人)方法制備或由重組DNA方法制備(參見，例如，美國專利第4,816,567號)。還可以使用在例如Clackson^a/"胸訓,352:624-628(1991)和Marks&a/,丄Mo/.歷o/，222:581-597(1991)中描述過的技術，從噬菌體抗體庫中分離"單克隆抗體"。"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括其抗原結合區(qū)域或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括小于全長的抗體、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙體(diabodies);線性抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體、單結構域抗體分子、融合蛋白、重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性抗體。"完整"抗體指包括抗原結合可變區(qū)，以及輕《連恒定區(qū)(C。和重鏈恒定區(qū)Ch1、Ch2和Ch3的抗體。恒定區(qū)可以是天然序列的恒定區(qū)(例如，人天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列的變體。優(yōu)選地，所述完整抗體有一個或多個效應器功能。依據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，完整的抗體可以分為不同的"種類"。有五大類完整的抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中的幾類可以進一步分為"亞類，，(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和lgA2。與不同種類抗體對應的重鏈恒定區(qū)分別被稱為a、s、€、7和/i。不同種類的免疫j求蛋白的三維空間構型和亞單位結構是^^知的?？贵w"效應器功能"指那些由抗體Fc區(qū)引起的(天然序列的Fc區(qū)或氨基酸序列變異的Fc區(qū))的生物活性?？贵w效應器功能的例子包括Clq結合、補體依賴性細胞毒性作用、Fc受體結合、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體的下調(例如B細胞受體，BCR)等。"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用"和"ADCC"指細胞介導的反應，在所述反應中表達Fc受體(FcR)的非特異性的細胞毒細胞(例如自然殺傷(NK)細胞、噬中性粒細胞和巨噬細胞)識別耙細胞上結合的抗體，并隨后導致靶細胞的裂解。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達Fc7Rin，而單核細胞表達Fc7RI、F(ryRH和FcyRIII。Ravetch和Kinet,iev./mww"o/9:457-92(1991)的第464頁的表3總結了造血細胞的FcR表達。為了評估目標分子的ADCC活性，可以進行例如在美國專利5,500,362或5,821,337描述的體外ADCC分析。用于這類分析的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞?？蛇x4奪地或附加地，可以在體內評估目標分子的ADCC活性，例如在諸如Clynes^a/.iWA5(TJSA)95:652-656(1998)中公開的動物模型中。"效應器細胞"指表達一種或多種FcRs并執(zhí)行效應器功能的白細胞。優(yōu)選地，這些細胞至少表達Fc^RIII,并執(zhí)行ADCC效應器功能。介導ADCC的人類白細胞的實例包括外周血單個核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒T細胞和中性粒細胞；優(yōu)選PBMC和NK細胞。效應器細胞可以從其天然來源中分離，例如從本文中描述的血液或PBMCs中分離。術語"Fc受體"或"FcR"用于描述結合于抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人類FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結合于IgG抗體(7受體)的受體，并包括Fc7RI、Fc7RII和F(yyRin亞類的受體，其包括這些受體的等位基因變體和選擇性的剪切形式。FcryRII受體包括FcryRIIA("激活性受體")和FctRIIB("抑制性受體")，兩者的氨基酸序列相似，區(qū)別主要在于其胞漿區(qū)。激活性受體FcryRIIA在其胞漿區(qū)含有免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受體FctRIIB在其胞漿區(qū)含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)。(參見Dagron，iev./mmw"o/.15:203-234(1997)中的綜述M)。在Ravetch和Kinet,iev.7mmw"o/9:457國92(1991);CapelWfl/"/附mwwomC/cxis4:25-34(1994)牙口deHaasda/"/Z^6.C7/".126:330-41(1995)中對FcR進行了綜述。其他FcR,包括將來要被確認的FcR,都包括在本發(fā)明中的術語"FcR"中。該術語也包括負責將母體的IgG轉運到胎兒體內的新生受體，F(xiàn)cRn(GuyerefaA，丄/mmimo/.117:587(1976)和Kimda/"五wk/mmw"o/.24:2429(1994))。"補體依賴性細胞毒性作用"或"CDC"指分子在補體存在下，裂解靶標的能力。補體激活途徑通過補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)與和關聯(lián)抗原形成復合物的分子(比如，抗體)的結合啟動。為了評^階補體激活，可以進行如在Gazzano-Santoro&a/.，乂7m附畫/.Me/Ao^202:163(1996)中描述的CDC分析。術語"可變的"指可變區(qū)某些部分的序列在抗體間高度不同，并用于每一種特定抗體與其特定抗原的結合及其特異性。然而，變異并不是均勻分布在抗體的可變區(qū)域內。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)的三個所謂的高度可變區(qū)的片段內?？勺儏^(qū)內保守性較高的部分被稱為骨架區(qū)(FRs)。每個天然的重鏈和輕鏈可變區(qū)，包含主要采用/5-片層構型的四個FR,由三個高度可變區(qū)連接在一起，形成環(huán)狀連接，在一些情況下形成部分〉片層結構。每條鏈的高度可變區(qū)通過FRs以密切靠近的方式與另一條鏈的高度可變區(qū)結合在一起，促成抗體的抗原結合部位的形成(參見Kabatetal:<Se《we"ceyo/尸ra/e/"517mww"o/og7'ca//"/emy/(免疫學目才示蛋白的序歹ll)，第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.pp15-17;48-53(1991))。恒定區(qū)并不直接參與抗體與抗原的結合，而是呈現(xiàn)各種效應器功能，例如在抗體依賴性的細胞毒效應(ADCC)中抗體的參與。本發(fā)明中使用的術語"高度可變區(qū)"指抗體中負責與抗原結合的氨基酸殘基。高度可變區(qū)通常包括"互補決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基24-34(U)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat"a/，5fe《Mewcaso//Vo/e/wso//附mwwo/og/ca/intems^(免疫學目才示蛋白的序歹'J)，第5片反.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.pp15-17;48-53(1991))和/或"高變環(huán)"區(qū)的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基2632(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變區(qū)的26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLesk,Mo/.196:901-917(1987))。"骨架區(qū)"或"FR"殘基指除了本發(fā)明定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變區(qū)的殘基?？贵w經(jīng)木瓜蛋白酶水解產(chǎn)生兩個相同的被稱為"Fab"片段的抗原結合片段和一個殘余的"Fc"片段，每個"Fab"片段都有單一的抗原結合部位，"Fc"片段的名稱反映了其易結晶的能力。胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生一個F(ab')2片段，其有兩個抗原結合部位，且仍能夠與抗原交聯(lián)。"Fv"是含有完整的抗原識別和抗原結合部位的最小抗體片段。該區(qū)域由以緊密、非共價結合的一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)的二聚體構成。每個可變區(qū)的三個高變區(qū)正是以這種構型相互作用，來決定Vh-Vl二聚體表面的抗原結合位點。六個高變區(qū)域共同賦予了抗體的抗原結合特異性。然而，即便單一的可變區(qū)(或只含有三個抗原特異性高變區(qū)的Fv的一半)仍能夠識別和結合抗原，盡管比完整結合位點的親和性低。Fab片段也含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab'片段不同于Fab片段之處在于其重鏈CH1區(qū)的羧基末端多了幾個氨基酸殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH在本發(fā)明中指代Fab',其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基至少攜帶一個游離的巰基。最初的F(ab')2抗體片段以Fab'片段對產(chǎn)生，之間有鉸鏈的半胱氨酸。其他的抗體片段的化學偶聯(lián)也是公知的。來自任一脊推動物的抗體的"輕鏈"基于其恒定區(qū)的氨基酸序列，都可以歸于兩種截然不同的所謂kappa(k)和lambda(入)鏈中的一種。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和VL區(qū)，其中這些區(qū)域存在于單一的多肽鏈上。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽還包含VH和Vj^區(qū)之間的多肽連接子，其使scFv形成適于抗原結合的結構。關于scFv的綜述參見PltickthuninT7iei^armaco/ogyo/Mowoc/owaMwWoA&s(單克隆抗體藥理學)，vol.113,RosenburgandMooreeds.，Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。術語"雙體(Diabodies)"指帶有兩個抗原結合位點的小型抗體片段，該片段在同一多肽鏈上(VH-VO包含與輕鏈可變區(qū)(VO結合的重鏈可變區(qū)(Vh)。通過使用因過短而不能使同一條鏈上的兩個區(qū)域配對的連接子，使這些區(qū)域一皮迫與另一條鏈上的互補區(qū)域配對，由此產(chǎn)生了兩個抗原結合位點。例如在EP404,097;WO93/11161;和Hollingera/，Ato/v4cad5W.90:6444-6448(1993)中對雙體作了更詳細的描述。"分離的"抗體是指從其天然環(huán)境的組分中鑒別、分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境下的污染成分是指干擾抗體診斷或治療作用的物質，可以包括酶、激素和其它的蛋白質或非蛋白質溶解物。因為缺乏抗體的天然環(huán)境中的至少一種組分，分離抗體包括重組細胞內部的原位抗體。但是，通常分離抗體會經(jīng)過至少一步的純化步驟來制備。"結合"目的抗原的抗體是指對該抗原有充分親和力的抗體，以致該抗體在靶定表達該抗原的細胞時，可以作為治療或診斷試劑。如果該抗體能結合抗原性部分，它通常會優(yōu)先結合其抗原性部分，而不是其它受體，這不包括諸如非特異性的Fc接觸的偶然結合或與其他抗原共有的翻譯后修飾成分結合，該抗體不會與其他蛋白有明顯的交叉反應。檢測與目的抗原結合的抗體的方法在本領域中是公知的，可以包括但并不局限于例如FACS、細胞ELISA和Western印跡等分析。正如本發(fā)明中使用的，"細胞"、"細胞系"、"細胞培養(yǎng)物"的表述可以交替使用，所有這些用法都包括其子代。也可以理解為由于人為的或非人為的突變，所有的子代在DNA組成上不可能完全相同。在原始轉化細胞內篩選的有相同功能或生物學活性的突變子代包括在內。根據(jù)有意使用的不同指代的上下文，指代是清楚的。"治療"既指治療性處理，也指預防性或防止性的措施，其目的就是預防或減緩(減輕)目標病理狀態(tài)或病癥。需要治療的個體包括那些已經(jīng)存在所述病癥的個體，還包括那些將發(fā)展為該病癥的或欲對其病癥進行預防的個體。因此，本文中欲被治療的哺乳動物已經(jīng)被診斷為患有該病癥或傾向于或易患該病癥。術語"癌癥"和"癌性(的)"是指或描述哺乳動物的生理狀態(tài)，其典型特征是細胞生長或死亡不受調控。癌癥的實例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性腫瘤。這些癌癥更多具體的實例包括鱗狀細胞癌(例如鱗狀上皮細胞癌)，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌在內的肺癌，腹膜癌，肝細胞癌，包括胃腸道癌在內的胃癌，胰腺癌，膠質母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝臟癌癥，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結腸癌，直腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌，肛癌，陰莖癌，還有頭頸部癌。"化療劑"是用于癌癥治療的化合物。化療劑的實例包括諸如噻替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化劑；諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基石黃酸酯類；諸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)、烏瑞替派(uredopa)的氮丙啶類；包括六曱蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和三曱基奧羅蜜胺(trimethylolomelamine)在內的乙烯業(yè)胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamine);諸如瘤可寧(chlorambucil)、萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀(esLmmusdne)、異環(huán)磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸曱氧氮芥、美法侖(melphalan)、新氮齊(novembichin)、苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀(uracilmustard)等氮芥類藥物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司丁、雷莫司汀等硝脲類(nitrosureas);如阿克拉霉素類、放線菌素、安曲霉素、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、加里剎霉素、洋紅霉素、碳霉素(camomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依達比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、灰霉素、紫菜霉素(porfiromycin)、噤呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、殺結核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星類抗生素；曱氨碟呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)類抗代謝類藥；如二曱葉酸、氨曱喋呤、蝶羅呤、三曱曲沙等葉酸擬似物；如氟達拉濱、6-巰噤呤、硫米嘌呤、硫鳥嘌呤類噤呤類似物；如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU等嘧啶類似物；如卡魯睪酮、屈他雄酮丙酸酯、表^5危雄醇、美雄烷、睪內酯酮等男性激素類藥物；如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦等抗腎上腺類藥物；如亞葉酸等葉酸補充物；醋葡醛內酯；醛石舞酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil;比生群；依達曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鳥氨酸；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇；尼曲吖咬；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足葉草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK;雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2',2"-三氯三乙胺；烏拉坦；長春地辛；達卡巴溱；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");環(huán)磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(TAXOL⑧，Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ.)和多西他賽(TAXOTERE⑧，Aventis,Rhone-PoulencRorer,Antony,France)等紫杉烷類；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰噤呤；曱氨蝶呤；如順輛和卡鉑等鉑類似物；長春4^;粕；依托泊苦(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長春新i威；長春瑞濱；去甲長春石咸；諾消靈(novantrone);替尼泊苷；柔紅霉素；氨蝶呤鈉；希羅達；伊班膦酸鈉；CPT-11;拓樸異構酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；埃斯波霉素；卡培他濱；以及上述任一種藥鉤在藥學上可以接受的鹽、酸或^f汙生物。調節(jié)或抑制激素對腫瘤作用的抗激素類藥物也包括在本定義內，諸如抗雌激素藥物，包括例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制劑4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷諾昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬(法樂通)；以及抗雄激素物質，諸如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一種藥物在藥學上可以接受的鹽、酸或衍生物。用于治療目的的"哺乳動物"指任何一種可以歸于哺乳類的動物，包括人類、小鼠、免疫缺陷鼠(SCID)或棵鼠或品系小鼠、家畜和農(nóng)場動物及動物園內的動物、體育動物或寵物，比如綿羊、狗、馬、貓、母牛等。優(yōu)選地，本發(fā)明中的哺乳動物指人類。"寡核苷酸"指短長度、單鏈或雙鏈多聚脫氧核苷酸，其通過已知的方法(例如磷酸三酯、亞磷酸鹽、亞磷酰胺化學)，利用例如發(fā)表于1988年5月4日的EP266,032中描述的固相技術，或利用Froehler&a/,7Vmc/.v4dA14:5399-5407，1986描述的脫氧核苷H-磷酸鹽中間物化學合成。然后將其用聚丙烯酰胺凝膠純化。"嵌合"抗體指免疫球蛋白，其部分重鏈和/或輕鏈與來源于特定種屬或屬于特定抗體種類或亞類的抗體的對應序列相同或同源，同時鏈上的其余序列與來源于另一種屬或屬于另一種類或亞類的抗體的對應序列相同或同源，此外還指這些抗體的片段，只要它們能夠表現(xiàn)出所需的生物活性(美國專利4,816,567和Morrison"a/,iVa".Sd6^4，81:6851-6855(1984))。非人類(例如鼠科)抗體的"人源化"形式指特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv,Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab)2或抗體的其他抗原結合序列)，其包含來自非人類免疫球蛋白的最小序列。在絕大多數(shù)情況下，人源化抗體是人的免疫球蛋白(受者抗體)，其中，來自受者抗體的互補決定區(qū)(CDRs)的殘基被諸如具有所需的特異性、親和力、能力的小鼠、大鼠或兔等非人類抗體(供者抗體)的CDRS的殘基所替代。在一些情況下，人類免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)殘基被相應的非人類FR殘基所替代。此外，人源化抗體可以包含既不在受者抗體也不在引入的CDR或FR序列的殘基。這些修飾進一步改善和優(yōu)化了抗體的性能。通常，人源化抗體包含至少一個，通常是兩個可變區(qū)的幾乎所有的部分，其中所有或幾乎所有的CDR區(qū)對應非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)，且所有或幾乎所有的FR殘基是人類免疫球蛋白共有序列的FR殘基。最優(yōu)地，人源化抗體也包含免疫球蛋白恒定區(qū)序列的至少一部分，通常是人類免疫球蛋白的序列。"去免疫化"抗體是針對給定的物種沒有免疫原性或免疫原性較差的免疫球蛋白。通過改造抗體的結構可以實現(xiàn)去免疫化?？梢証吏用任何本領域技術人員公知的去免疫化技術。例如，在于2000年6月15日公布的WO00/34317中，描述了一項使抗體去免疫原性的適當?shù)募夹g。誘導"細胞凋亡"的抗體是通過任何方式誘導程序性細胞死亡的抗體，這些方式例如但不限于結合膜聯(lián)蛋白V(AnnexinV)、半胱天冬酶(caspase)活性、DNA斷裂、細胞皺縮、內質網(wǎng)擴張、細胞破碎和/或膜嚢泡(所謂的凋亡小體)的形成。在本說明書中，雜交瘤細胞系及其產(chǎn)生的分離的單克隆抗體可以選擇用內部分類號7BD-33-llA，1A245.6和11BD-2E11-2或其各自的保藏號PTA-4890，PTA-4889和PTA-5643來表示。本文中使用的"抗體-配體"包括至少對輩巴抗原的一個抗原表位有結合特異性的部分，所述部分可以是完整的抗體分子、抗體片段和至少有一分子、Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、雙特異性抗體、融合蛋白或任一基因工程分子，所述分子特異性識別和結合抗原的至少一個抗原表位，所述抗原可被分別以ATCC號PTA-4890、PTA-4889或PTA-5643命名的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的分離的單克隆抗體結合(ATCCPTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCCPTA-5643抗原)。本文中使用的"癌性疾病調節(jié)抗體"(CDMAB)指以有益于患者的方式，例如通過減輕腫瘤負荷或延長腫瘤患者的生存期的方式，調節(jié)癌性疾病過程的單克隆抗體，以及其抗體-配體。本發(fā)明中使用的"抗原結合區(qū)"指識別靶抗原的分子的部分。本發(fā)明中使用的"竟爭性抑制"是指通過常規(guī)的抗體相互竟爭分析(BelangerL.，SylvestreC.和DufourD.(1973)，Enzymelinkedimmunoassayforalphafetoproteinbycompetitiveandsandwichprocedures(竟爭和夾心法的曱胎蛋白的酶聯(lián)免疫測定).C//m'caC//mz'ca爿cto48，15),能夠識別和結合由分別以ATCC號PTA-4890、PTA-4889或PTA-5643命名的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的單克隆抗體(ATCC號PTA-4890、PTA-4889或PTA-5643抗體)針對的抗原決定表位。本發(fā)明中使用的"靶抗原"指ATCC號PTA-4890、PTA-4889或PTA-5643抗原或其部分。本發(fā)明中使用的"免疫偶聯(lián)劑"指以化學或生物學方式連接到細胞毒素、放射物質、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療劑的諸如抗體的任一分子或CDMAB。只要能夠與其靶標結合，該抗體或CDMAB可以在其分子的任一部位與細胞毒素、放射物質、抗腫瘤藥或治療劑連接。免疫偶聯(lián)劑的實例包括抗體毒素化學偶聯(lián)劑和抗體-毒素融合蛋白。本發(fā)明中使用的"融合蛋白"指任何嵌合蛋白，其抗原結合區(qū)與例如毒素、酶或蛋白藥物的生物活性分子連接。本發(fā)明的CDMAB可以被修飾，即通過分子內的氨基酸修飾，產(chǎn)生出衍生分子。也可能是化學修飾。衍生分子要保留多肽的功能特性，也就是說，具有這類取代的分子仍能夠使該多肽分別與ATCC號PTA-4890、PTA-4889或PTA-5643抗原或其部分結合。氨基酸取代包括但不必然限于在本領域中公知的"保守"氨基酸取代。舉例來說，被稱為"保守氨基酸取代"的某些氨基酸取代能夠在蛋白質中頻繁出現(xiàn)，但不改變該蛋白質的構象或功能，這是蛋白質化學中已建立的法則。這些改變包括用異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和亮氨酸(L)的任一種取代這些疏水氨基酸的任何其它一種；天門冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N),反之亦然；以及絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T),反之亦然。其他的取代也可以被認為是保守的，取決于特定氨基酸的環(huán)境和其在蛋白質三維結構中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可以經(jīng)?；Q，丙氨酸和纈氨酸(V)也是。相對疏水的蛋氨酸(M)可以經(jīng)常與亮氨酸和異亮氨酸互換，有時與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)經(jīng)?；Q，其發(fā)生部位氨基酸殘基的明顯特征是其帶電特性，這兩種氨基酸的不同pK并不重要。在特定情境下，仍有其他的一些變化可以被認為是"保守的"。實施例1雜交瘤制名、雜交瘤細月包系7BD-33-11A,1A245.6,11BD-2E11-2雜交瘤根據(jù)布達佩斯條約，雜交瘤細胞系7BD-33-11A和1A245.6于2003年1月8日分別以4呆藏號PTA-4890和PTA-4889保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，該中心位于美國弗吉尼亞州20110-2209馬納薩斯大學路10801(10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209)。依據(jù)37CFR1.808的規(guī)定，保藏者保證在專利授權時將不可撤銷地取消對公眾獲取該保藏材料的所有限制。才艮據(jù)布達佩斯條約，雜交瘤細胞系11BD-2E11-2于2003年11月11日以保藏號PTA-5643保藏于美國典型培養(yǎng)物保存中心，該中心位于美國弗吉尼亞州20110-2209馬納薩斯大學路10801。依據(jù)CFR1.808的規(guī)定，保藏者保證在專利授權時將不可撤銷地取消對公眾獲取該保藏材料的所有限制。為了制備產(chǎn)生7BD-33-11A抗癌抗體的雜交瘤，在冷PBS中制備抗原，即人類乳腺癌細胞的單細胞懸液。通過以分次劑量皮下和腹腔注射含有20萬至250萬個細胞的100微升抗原-佐劑和弗氏完全佐劑免疫8到9周齡的BALB/c小鼠。初次免疫三周后，用新鮮制備的含有20萬至250萬個細胞的抗原-佐劑以同樣的方式加強免疫小鼠，并在上次加強后兩周再加強一次。在最后一次免疫后的至少兩天，取出脾臟用于融合。通過將分離的脾細胞與Sp2/0骨髓瘤伴倡融合以制備雜交瘤。檢測所述雜交瘤亞克隆融合的上清。為了制備產(chǎn)生1A245.6抗癌抗體的雜交瘤，在冷PBS中制備抗原，即人類乳腺癌細胞的單細胞懸液。通過以分次劑量皮下和腹腔注射含鴻250萬個細胞的100微升抗原-佐劑和弗氏完全佐劑免疫8到9周齡的BALB/c小鼠。初次免疫后3周，用新鮮制備的含有250萬個細胞的抗原-佐劑以同樣的方式加強免疫小鼠，2周后、5周后以及上一次加強三周后再加強免疫小鼠。在最后一次免疫后的至少三天，取出脾臟用于融合。將分離的脾細胞與NSO-l骨髓瘤伴侶融合以制備雜交瘤。檢測所述雜交瘤亞克隆融合的上清。為了制備產(chǎn)生11BD-2Ell-2抗癌抗體的雜交瘤，在冷PBS中制備抗原，即人類乳腺癌細胞的單細胞懸液。通過以分次劑量皮下和腹腔注射含有20萬至250萬個細胞的100微升抗原-佐劑和弗氏完全佐劑免疫8到9周齡的BALB/c小鼠。初次免疫后兩周或三周，用新鮮制備的含有20萬至250萬個細胞的抗原-佐劑以同樣的方式加強免疫小鼠，并在上次加強后兩周再加強一次。在最后一次免疫后至少兩天，取出脾臟用于融合。將分離的脾細胞與NSO-l骨髓瘤伴侶融合以制備雜交瘤。檢測所述雜交瘤亞克隆融合的上清。為了檢測雜交瘤細胞分泌的抗體是IgG，還是IgM同種型，進行ELISA分析。將4。C包被緩沖液(0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液,pH9.2-9.6)中的濃度為2.4gg/ml的山羊抗小鼠的IgG+IgM(H+L)，按100/zl/孔加入ELISA板過夜。該ELISA板用洗滌緩沖液(PBS+0.05%Tween)洗3次。按100/xl/孔加入封閉緩沖液(含5。/。奶的洗滌緩沖液)，室溫l小時，隨后用洗滌緩沖液洗3次。按100/il/孔加入雜交瘤上清，將該板室溫孵育1小時。所述板用洗滌緩沖液洗3次，按100/xl/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣根過氧化物酶偶聯(lián)物的1/5000稀釋液(用含1%牛血清白蛋白的PBS稀釋)。室溫孵育l小時后，該板用洗滌緩沖液洗3次。按100/d/孔加入TMB溶液，室溫孵育1至3分鐘。按100/d/孔加入2MH2S04,終止顏色反應，用Perkin-ElmerHTS7000讀板儀在450nm波長處讀板。如表1所示，7BD-33-llA、1A245.6、11BD-2E11-2雜交瘤主要分泌IgG同種型抗體。經(jīng)過1至4輪有限稀釋，在細胞ELISA分析中，；險測雜交瘤上清中200680055621.3說明書第19/26頁與靶細胞結合的抗體。檢測了三種乳腺癌細胞系MDA-MB-231C也被稱為MB-231)、MDA-MB-468(也被稱為MB-468)和SKBR-3。板內的細胞在使用前先固定。室溫下，該板用含MgCl2和CaCl2的PBS洗三次。每孔加100MlPBS稀釋的2%多聚曱醛，室溫10分鐘，然后棄掉多聚曱醛。再用含MgCl2和CaCl2的PBS在室溫下洗滌該板3次。每孔加1005%奶洗滌液(PBS+0.05%Tween)進行封閉，室溫1小時。該板用洗滌液洗3次，按100/xl/孔加入雜交瘤上清，室溫孵育l小時。用洗滌緩沖液將該板洗3次，按100/d/孔加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠的IgG或IgM的1/5,000稀釋液(用含1%牛血清白蛋白的PBS稀釋)。室溫孵育1小時后，該板用洗滌緩沖液洗3次，每孔加入100jLdTMB底物，室溫孵育1-3分鐘。每孔加入100gl2MH2S04終止反應，用Perkin-ElmerHTS7000讀板儀在450nm波長處讀板。如圖1列表所示，結果表示為與IgG同種型對照(3BD-27)比較高出背景的倍數(shù)。7BD-33-11A和1A245.6雜交瘤細胞系產(chǎn)生的抗體與檢測的所有三種乳腺癌細胞系都強烈結合，至少比背景高出6倍。兩種抗體與MDA-MB-231細胞系的結合最強。雜交瘤細胞系11BD-2E11-2產(chǎn)生的抗體也與MDA-MB-231細胞系結合最強，但是與另外兩種細胞系的結合并沒顯示出比背景強。這些結果表明該抗體識別的表位在MDA-MB-468或SKBR-3細胞上不存在，且與7BD-33-11A和1A245.6識別的表位明顯不同。進行抗體結合試驗的同時，在相同的乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468和SKBR-3上，檢測了雜交瘤上清的細胞毒性作用?；?死細胞毒性分析試劑盒購自MolecularProbes公司(Eu,OR)。根據(jù)廠商的說明書并作下述的改動后進行分析。在分析前，將細胞根據(jù)預先確定的適當密度進行鋪板。2天后，將100/xl來自雜交瘤微量滴定板的上清轉移到細胞培養(yǎng)板中，在5。/。C02培養(yǎng)箱中孵育5天。將陽性對照孔吸凈，加入100pi疊氮鈉和/或放線菌酮。因為已知3BD-27單克隆抗體不與檢測的三種乳腺癌細胞系結合，所以該抗體也被加入作為同種型對照。出于比較，該分析也用了抗-EGFR抗體(C225)。經(jīng)過5天的處理后，倒空反應板的液體并吸干。通過多通道擠瓶，將含MgCl2和CaCl2的室溫DPBS分到每孔中，叩打三次，倒出液體并吸干。每孔加入50pl用含MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的熒光活/死(Live/Dead)染料，在37°C含5%C02的培養(yǎng)箱內孵育30分鐘。將該板置于Perkin-ElmerHTS7000熒光讀板儀內讀數(shù)，用MicrosoftExcel分析數(shù)據(jù)。結果在表l中列出。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>觀察到三種抗體的細胞毒性有所差異。11BD-2Ell-2顯示出39-73%的殺傷作用，在SKBR-3細胞上觀察到的細胞毒性最高。1A245.6和7BD-33-11A在MDA-MB-231細胞中呈現(xiàn)相似的細胞毒性，但1A245.6對于MDA-MB-468細胞也具有細胞毒性，而7BD-33-11A則沒有。這表明來源于雜交瘤細胞的抗體能在癌細胞中產(chǎn)生細胞毒性。在抗體的結合程度與雜交瘤上清產(chǎn)生的細胞毒性之間也存在普遍的聯(lián)系。這種趨向有一些例外，比如盡管11BD-2E11-2對MB-468和SKBR-3癌細胞結合微弱，但11BD-2E11-2在MB-468和SKBR-3癌細胞中仍有細胞毒性。這提示該抗體具有在這種細胞類型上無法被細胞ELISA結合分析檢測到的調節(jié)作用，或者由于分析本身的限制(例如細胞的固定)而檢測不到其結合。最后，另一個可能性是所述分析在該特定情況下對檢測足以介導細胞毒性的結合不是足夠的敏感。另一個例外是盡管7BD-33-llA對MB-468細胞的結合與同種型對照相比高出背景6倍，但該抗體對MB-468細胞的細胞毒性作用相對較弱。這提出了一種可能性，即結合不一定必然預測抗體與其相關抗原連接的結果。已知的非特異性細胞毒性物質放線菌酮產(chǎn)生了預期的細胞毒性。實施例2抗體制備通過在CL-1000瓶(BDBiosciences,Oakville，ON)中培養(yǎng)雜交瘤7BD-33-llA、1A245.6、11BD-2E11-2來制備單克隆抗體，每星期進行兩次收集和再接種。然后用蛋白G瓊脂糖4快流(ProteinGSepharose4FastFlow)(AmershamBiosciences,Baied'Urf6，QC)進行標準的抗體純化才喿作。本發(fā)明的范圍包括利用人源化的、嵌合的或鼠單克隆抗體。在細胞毒性分析中，將7BD-33陽11A、1A245.6、11BD-2E11-2與許多陽性對照(抗Fas(EOS9.1,IgM,k,20《鼓克/毫升，eBioscience,SanDiego，CA)，抗-Her2/neu(IgGl,k，10孩i克/毫升，InterMedico,Markham，ON),抗-EGFR(C225,IgGl,k，54斂克/毫升，Cedarlane，Homby，ON),;改線菌酮(100微摩爾，Sigma,Oakville,ON)，NaN3(0.1%,Sigma,Oakville,ON))以及陰性對照(107.3(抗-TNP，IgGl，k，20孩t克/毫升，BDBiosciences,Oakville,ON)，G155-178(抗-TNP，IgG2a,k，2(M鼓克/毫升，BDBiosciences,Oakville,ON),MPC-11(抗原特異性未知，IgG2b，k,20微克/毫升)，J606(抗-果聚糖，IgG3，k,20微克/毫升)，IgG緩沖液(2%))進行比較(表2)。檢測了乳腺癌(MB-231，MB-468,MCF-7)、結腸癌(HT-29，SW1116,SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(OVCAR)、前列腺癌(PC-3)以及非-癌(CCD27sk，Hs888Lu)細胞系(所有這些細胞系都來自ATCC，Manassas,VA)?；?死細胞毒性檢測試劑盒購自MolecularProbes公司(Eugene，OR)。根據(jù)廠商的說明書并作下述的改動后進行分析。在檢測前將細胞以預確定的合適密度鋪板。2天后，將100微升純化抗體稀釋到培養(yǎng)基中，然后轉移入細胞板中，在含8。/。C02的培養(yǎng)箱中孵育5天。然后倒空培養(yǎng)板并吸干。通過多通道擠瓶，將含MgCl2和CaCl2的室溫DPBS分到每孔中，叩打三次，倒出液體并吸干。每孔加入50/il用含MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的熒光活/死染料，在37。C含5%C02的培養(yǎng)箱內孵育30分鐘。該板置于Perkin-ElmerHTS7000熒光讀板儀內讀數(shù)，數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel進行分析，結果在表2中列出。數(shù)據(jù)表示為四次試驗的平均值，每次三個重復，并以如下方式定性4次試驗中4次高于閾細胞毒性(thresholdcytotoxicity)記為(+++)，4次試驗中3次高于閾細胞毒性記為(++)，4次試驗中2次高于閾細胞毒性記為(+)。表2中未標記的細胞表示幾次結果不一致或低于閾細胞毒性的作用?？贵w7BD-33-llA和1A245.6在乳腺以及前列腺腫瘤細胞系中顯示出選擇性的細胞毒性，而對非轉化的正常細胞沒有影響。兩種抗體都顯示出比陽性對照抗-Fas抗體高25至50%的殺傷作用。11BD-2E11-2在乳腺和卵巢癌細胞中具有特異的細胞毒性，并且對正常細胞沒有影響?？紤]到生物的細胞分析的局限性，化學細胞毒性試劑誘導了預期的細胞毒性，同時用于對比的許多其他的抗體的表現(xiàn)也與預期相同。總之，三種抗體均顯示出對許多類型的癌細胞都有細胞毒性活性。由于并不是所有的癌細胞類型都是敏感的，抗體在其活性上有選擇性。此外，所述抗體顯示出功能性特異性，因為其在非-癌細胞類型中并沒產(chǎn)生細胞毒性，這在治療情況下是一個很重要的因素。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>用于FACS的細胞的制備如下首先用DPBS(無4丐離子和鎂離子)沖洗單層細胞，然后在37。C用細胞解離緩沖液(INVITROGEN)使細胞脫離培養(yǎng)板。離心并收集細胞之后，在4。C用含MgCl2、CaCl2以及25。/。胎牛血清的Dulbecco's磷酸鹽緩沖液(洗滌培養(yǎng)基)重懸細胞并計數(shù)，分至適當?shù)募毎芏龋x心以沉淀細胞并將其重懸于含20微克/毫升7BD-33-llA、1A245.6、11BD-2E11-2或對照抗體(同種型對照或抗-EGFR)染色培養(yǎng)基(含MgCl2和CaCl2的DPBS)中，冰上放置30分鐘。加入AlexaFluor488-偶聯(lián)的二抗之前，用洗滌培養(yǎng)基洗細胞一次。然后加入溶于染色培養(yǎng)基的AlexaFluor488-偶聯(lián)的抗體，放置20分鐘。接著，最后洗一次細胞并將其重懸在含1|ag/mL石典化丙咬(propidiumiodide)的染色培養(yǎng)基中。通過在使用CellQuest軟件的FACScan(BDBiosciences)上運行樣本來評估流式細胞計數(shù)的細胞獲取結果。細胞的前向散射(FSC)和側向散射(SSC)通過調整FSC和SSC檢測器的電壓和振幅設定。三個熒光通道(FL1、FL2和FL3)的檢測器通過運行用純化的同種型對照抗體染色，繼而用AlexaFluor488-偶聯(lián)二抗染色的細胞來調整，以使細胞有中位熒光強度為大約1-5個單位的統(tǒng)一的波峰。通過FSC設門和碘化丙"定排除來獲取活細胞。對于每一份樣本，獲取大約10,000個活細胞進行分析，結果列于表3中。表3列出高于同種型對照的平均熒光強度的倍增，并如下定性小于5為(-);5至50為(+);50至100為(++);高于100為(+++),括號中為染色細月包的百分比。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>7BD-33-11A抗體的代表性直方圖匯編至圖1，1A245.6抗體的代表性直方圖匯編至圖2，11BD-2Ell-2抗體的代表性直方圖匯編至圖3并顯示結合特征，在某些情況下包含示例的雙峰。11BD-2Ell-2呈現(xiàn)出對于乳腺腫瘤細胞系MDA-MB-231的特異性腫瘤結合。7BD-33-llA和1A245.6均顯示出對于乳腺(MDA-MB-231和MCF-7)、結腸、月申、卵巢和前列腺來源的癌細胞系類似的結合，但對一種乳腺癌細胞系(MDA-MB-468)的結合有所不同。這三種抗體全部都與非-癌細胞結合，但所述結合并不產(chǎn)生細胞毒性作用。這是結合并不必然地預示著抗體與其相關抗原連接的結果的進一步證據(jù)，并且是非顯而易見的發(fā)現(xiàn)。1S表明在不同細胞中細胞毒性作用取決于抗體連接的情形，而并不僅僅取決于抗體結合。實施例3體內試驗參見圖5和圖6顯示的數(shù)據(jù)，將頸背部皮下注射的100微升中的五百萬個MDA-MB-231人乳腺癌細胞植入到4至8周齡的雌性SCID小鼠。小鼠4皮隨沖幾分成四個處理組，每組10只。植入前一天，將20mg/kg的11BD2E-ll-2、7BD-33-llA、1A245.6測試抗體或3BD-27同種型對照抗體(已知不與MDA-MB-231細胞結合)以300微升的體積經(jīng)腹腔給藥，所述體積由含2.7mMKC1，1mMKH2P04，137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液將儲存液稀釋后得到。所述抗體以同樣方式每周給藥一次，一共7周。大約每7天用測徑器測量腫瘤生長，測量長達10周，或直至動物個體達到加拿大動物保護協(xié)會(CCAC)的終點。在研究期間記錄動物的體重。研究結束時所有動物都^4tCCAC的指導原則施以安樂死。整個研究中沒有出現(xiàn)臨床毒性癥狀。每周一次測量的體重可以作為健康或發(fā)育停滯的替代指標。在用同種型對照、3BD-27以及7BD-33-llA、1A245.6或11BD-2Ell-2治療的各組之間，在體重上有最小的差異。在第60天(停止治療后11天)，1A245.6治療組的腫瘤體積是對照組的5.2%(p=0.0002),表明抗體治療在降低肺瘤負荷方面的有效性。那些用7BD-33-l1A抗體治療的攜帶癌細胞的小鼠沒有得病，并且沒有肺瘤負荷。11BD-2E11-2治療組在第67天時腫瘤體積縮小(對照的45%)(p=0.08)。這也表明，細胞毒性抗體治療與對照抗體相比，能減小腫瘤負荷。用7BD-33-llA、1A245.6和11BD-2E11-2細胞毒性抗體治療還有相應的存活益處(圖6)。用3BD-27抗體治療的對照組在移植后第74天達到100%的死亡率。相反，7BD-33-llA治療組沒有得病并且1A245.6治療的動物呈現(xiàn)100%的存活率，11BD-2E11-2治療組存活率為24%?？傊啾葘φ湛贵w，細胞毒性抗體治療在公認的人類癌癥模型中使腫瘤負荷降低并增加了存活率，這表明這些抗體(7BD-33-llA、1A245.6和11BD-2Ell-2)在用于包括人類在內的其他哺乳動物的治療中具有藥理學和藥物學益處。實施例4體內建立的胂瘤試-驗將頸背部皮下注射的100微升中的五百萬個MDA-MB-231乳腺癌細胞植入到5至6周齡的雌性SCID小鼠。每周用測徑器測量肺瘤生長。植入后第34天，當該群小鼠的大多數(shù)的腫瘤體積達到100mm、范圍從50至200mn^)時，三個處理組的每組;故隨機分入8-10只小鼠。將15mg/kg的7BD-33-11A、1A245.6測試抗體或3BD-27同種型對照抗體(已知不結合MDA-MB-231細胞)以150微升的體積經(jīng)腹腔給藥，所述體積由含2.7mMKC1,1mMKH2P04，137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋液將儲存液稀釋后得到。然后所述抗體以同樣方式給藥，每周三次，總共10次，直至植入后第56天。每7天用測徑器測量腫瘤生長，直至植入后第59天或直到動物個體達到加拿大動物保護協(xié)會(CCAC)的終點。在研究期間記錄動物的體重。研究結束時所有動物都根據(jù)CCAC的指導原則施以安樂死。整個研究中沒有出現(xiàn)臨床毒性癥狀。每周測量一次體重。同種型對照和7BD-33-llA或1A245.6抗體治療組之間在體重上沒有顯著差異。由圖4可以看出，植入后第59天(治療結束后兩天)，7BD-33-llA治療組的腫瘤體積是對照組的29.5%(p=0.0003)。在該組，第59天的數(shù)值與第52天比較時，平均腫瘤體積還有衰退的趨勢^=0.25)。同樣，1A245.6抗體治療也顯著地抑制腫瘤生長，并降低腫瘤負荷。用這種抗體處理的攜帶建立的腫瘤的動物的腫瘤體積是用同種型處理對照組的56.3%(p=0.017)?？傊?，相比對照抗體，7BD-33-llA或1A245.6抗體治療在公認的人類癌癥模型中顯著降低了建立的腫瘤的腫瘤負荷，表明了這些抗體在用于包括人類在內的其他哺乳動物的治療中具有藥理學和藥物學益處。本說明書中提及的所有專利和公開出版物代表了本發(fā)明所屬領域的技術人員的水平。所有專利和公開出版物通過引用的方式并入本文，其虧1用程度如同每個出版物被特別單獨地指明以引用的方式并入本文。應該明白，盡管本發(fā)明以某種形式被說明，但這不是要將本發(fā)明限定在本文所描述和顯示的特定形式或布局。對本領域的技術人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的范圍的前提下還可以做出各種變化，且不應當認為本發(fā)明限于本說明書中顯示和描述的內容。本領域的技術人員很容易看出本發(fā)明較好地適合實現(xiàn)所描述的目的并獲得最終結果和益處，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相關化合物、方法、程序和技術都是優(yōu)選實施方案中有代表性的，其目的在于示例，并不是限制本發(fā)明的范圍。本領域的技術人員能夠想到包括在本發(fā)明精神的范疇內的變化和其它用途，并由所附權利要求書的范圍所限定。盡管借助特定的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但是應理解所要的實施本發(fā)明的方式的各種變化，對本領域的技術人員來說是顯而易見的，均在所附權利要求書的范圍內。權利要求1.引發(fā)抗體誘導的選自人類乳腺腫瘤或前列腺腫瘤的組織樣本中癌性細胞的細胞毒性的方法，所述方法包括提供所述人類乳腺腫瘤或前列腺腫瘤的組織樣本；提供分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其與以保藏號PTA-4890保藏于ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體結合相同的表位；以及將所述分離的單克隆抗體或其細胞毒性誘導抗原結合片段與所述組織樣本接觸。2.治療哺乳動物中人類乳腺腫瘤或前列腺胂瘤的方法，其包括給予所述哺乳動物分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段與以保藏號PTA-4890保藏于ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體結合相同的表位，其中所述給予是采用有效誘導細胞毒性的量并由此降低所述哺乳動物的腫瘤負荷。3.如權利要求2所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片段與細胞毒性部分偶聯(lián)。4.如權利要求3所述的方法，其中所述細胞毒性部分是放射性同位素。5.如權利要求2所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體活化補體。6.如權利要求2所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體介導抗體依賴的細胞的細胞毒性作用。7.如權利要求2所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體是人源化抗體。8.如權利要求2所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體是嵌合抗體。9.可給藥形式的化合物治療哺乳動物中人類乳腺腫瘤或前列腺腫瘤的用途，其中所述化合物包含與以保藏號PTA-4890保藏于ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體結合相同表位的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，所述可給藥形式是采用有效誘導細胞毒性的量并由此降低所述哺乳動物的腫瘤。10.如權利要求9所述的用途，抗原結合片段與細胞毒性部分偶聯(lián)。11.如;K利要求IO所述的用途，同位素。12.如權利要求9所述的用途，補體。13.如權利要求9所述的用途，抗體依賴的細胞的細月包毒性作用。14.如權利要求9所述的用途，源化抗體。15.如權利要求9所述的用途，合抗體。其中所述分離的單克隆抗體或其其中所述細胞毒性部分是放射性其中所述分離的單克隆抗體活化其中所述分離的單克隆抗體介導其中所述分離的單克隆抗體是人其中所述分離的單克隆抗體是嵌全文摘要本發(fā)明涉及一種使用新型篩選模式制備患者癌性疾病調節(jié)抗體的方法。該方法利用癌細胞的細胞毒性作為指標來分離抗癌抗體，使制備用于治療和診斷目的的抗癌抗體成為可能。所述抗體可以用于輔助癌癥分期和診斷，還可以用于治療原發(fā)性腫瘤，例如前列腺癌或乳腺癌，以及治療腫瘤轉移。所述抗癌抗體能夠與毒素、酶、放射性化合物和造血細胞偶聯(lián)。文檔編號A61K39/395GK101534857SQ200680055621公開日2009年9月16日申請日期2006年11月17日優(yōu)先權日2006年8月3日發(fā)明者大衛(wèi)·S·F·楊,海倫·P·芬德利,蘇姍·E·哈恩申請人:F·霍夫曼-羅氏股份公司