專利名稱：人重組肝刺激因子增強(qiáng)肝癌細(xì)胞抗凋亡的作用及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝刺激因子(HSS)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞抗凋亡的作用及其在 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
月干刺激因子(hepatic stimulator substance，HSS)最初在1975年由 LaBrecque等人自肝臟部分切除的大鼠再生肝臟中提取，并發(fā)現(xiàn)其能特 異性的刺激肝細(xì)胞增殖(1. Teir H， Ravanti K. Mitotic activity and growth factors in the liver of the whole rat. Exp Cell Res， 5:500-507,1953)。爾后 又從初斷乳大鼠肝臟及多種動(dòng)物肝臟包括人類肝臟中發(fā)現(xiàn)了 HSS的存 在。研究證實(shí)，HSS是一種熱穩(wěn)定、帶強(qiáng)負(fù)電荷的多肽類物質(zhì)，分子 量約為15kD，具有抗酸、耐堿等特點(diǎn)(BlomqvistK. Growth stimulation in the liver and tumor development following intraperitoneal injections of liver homogenates in the rat. Acta Pathol Microbid Scand(supp1)，121,1957 ; LaBrecqueD.R.，Pesch L.A. Preparation and partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance(hss) from rat liver. J Physical,248:273-284，1975)。 HSS的功能具有器官特異 性，但無(wú)種屬特異性(LaBrecqueD.R"Pesch L.A. Preparation and partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance(hss) from ratliver. J Physical,248:273-284，1975;唐翰滿，賀福初胞源性肝細(xì)胞 生長(zhǎng)因子研究進(jìn)展。生理科學(xué)進(jìn)展，24: 348 -350， 1993)。 HSS基因 在很多組織例如肝、腎等都有表達(dá)，但是它只能特異性促進(jìn)肝細(xì)胞或 肝源性腫瘤細(xì)胞系DNA合成，使其由Go期進(jìn)入S期，而對(duì)體內(nèi)或體 外的非肝源性正常組織細(xì)胞及惡性細(xì)胞均無(wú)刺激增殖作用(唐翰滿， 賀福初胞源性肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子研究進(jìn)展。生理科學(xué)進(jìn)展，24: 348 -350， 1993;賀福初，涂強(qiáng)，邢桂春等人胎肝細(xì)胞生長(zhǎng)剌激物poly (A) + mRNA在非洲爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)的翻譯。中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，6: 298-302， 1990)。表明HSS對(duì)肝臟細(xì)胞的促增殖作用是特異性的。近年研究表明，HSS具有穩(wěn)定細(xì)胞膜，減輕CC14、半乳糖胺及H202
對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用，且呈劑量依賴性，即劑量與效應(yīng)呈正相關(guān) (LaBrecque DR， Bachur NR: Hepatic stimulator substance (HSS)-physical -chemical characteristics and specificity.Am J Physical,
242(Gadtrointest Liver Physical 5):G281-G288，1982;LaBrecque DR， Steele Get al: Purification and physical-chemical characterization of hepatic substance.Hepatology，7:100-106， 1987; Fleig WE， Hoss G: Partial purification of rat hepatic stimulator substance and characterization of its action on hepatoma cells and normal
hepatocytes.Hepatology，9:240-248， 1989; Mei MH， An W, Zhang BH， et al: Hepatic stimulator substance protects against acute liver fa(lure by CC14 poisoning in mice. Hepatology， 17(4): 638~44, 1993)。此外，HSS 還有保護(hù)肝細(xì)胞膜、抗纖維化、抑制Na+-K+-ATPaSe抑制因子等作用 (Mei MH, An W， Zhang BH， et al: Hepatic stimulator substance protects against acute liver failure by CCI4 poisoning in mice. Hepatology，17(4): 638~~44， 1993; Francavilla A， Barone M, et al: Further steps of hepatic stimulatory substance purification. Dig Dis Sci,36:674-680,1991; Francavilla A, Ove P， Polimeno L， et al: Extraction and partial purification of a hepatic stimulatory substance in rats, mice, and dogs. Cancer Res， 47: 5600—5605， 1987)。有人認(rèn)為，肝再生過程中NK細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞增殖 具有明顯的抑制作用，而HSS可抑制NK細(xì)胞功能從而使肝細(xì)胞從束 縛中得到解脫(LaBrecque DR: In vitro stimulation of cell growth by hepatic stimulator substance(HSS). Am J Physiol，242(5):G289-G295，1982; An W， Strobel D， Hahn et al: Increased expression of epidermal growth factor receptor mRNA by hepatic stimulatory substance (abstract). Jap J Pathophysiology 4(2): 19,1995)。而 且，當(dāng)HSS與EGF合用，兩者產(chǎn)生協(xié)同作用(synergistic effect),可 使肝細(xì)胞的DNA合成大大增強(qiáng)，因此也有人將HSS稱為肝再生增強(qiáng) 因子(augmentor of liver regeneration, ALR) (An W, Strobel D， Hahn et al: Increased expression of epidermal growth factor receptor mRNA by hepatic stimulatory substance (abstract). Jap J Pathophysiology，4(2):19，1995 ; LaBrecque DR: Hepatic regenerative stimulator substance (HSS)-liver specific growth promoter (abstract). Clin.Res,28)。相關(guān)報(bào)道稱H202等超氧化物損傷細(xì)胞可誘導(dǎo)凋亡(賀福初，涂強(qiáng)， 邢桂春等人胎肝細(xì)胞生長(zhǎng)刺激物poly (A) +!111^八在非洲爪蟾卵母 細(xì)胞內(nèi)的翻譯。中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，6: 298-302， 1990)。最近，為了探討HSS在H202引起的細(xì)胞損傷中抗細(xì)胞凋亡的作用， 本發(fā)明人克隆了人HSS基因，將其構(gòu)建入真核表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染肝 癌細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSS定位于細(xì)胞的線粒體上，可以減弱細(xì)胞的凋亡 程度。因此，為治療肝癌腫瘤提供了新的靶點(diǎn)和途徑。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供人重組肝刺激因子(human hepatic stimulator substance, hHSS)在抗腫瘤細(xì)胞凋亡的藥劑中的用途。所述的人重組肝 剌激因子可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用，純化后的人重組肝剌激因 子為分子量是31kD的同源二聚體蛋白，等電點(diǎn)為4.5，人重組肝刺激 因子具有強(qiáng)的耐酸耐堿和耐高溫能力，在pH4-10和溫度《8(TC的環(huán)境 中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。另一方面，本發(fā)明還涉及人重組肝刺激因子在抗腫瘤細(xì)胞凋亡中 的一種新用途。換言之，本發(fā)明涉及人重組肝刺激因子在制備抗腫瘤細(xì)胞凋亡的 藥劑中的用途。所述的人重組肝刺激因子純化后為分子量是31kD的同 源二聚體蛋白，等電點(diǎn)為4.5，人重組^^lj激因子在pH4-10和溫度《 8(TC的環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。本發(fā)明還涉及人重組肝剌激因子在抗腫瘤細(xì) 胞凋亡中的用途。


圖1.純化的hHSS蛋白性質(zhì)。其中分別為(A) Superose 12 HR 10/30 SEC純化hHSS時(shí)洗脫峰，洗脫液為50 mM PB， pH 7.2， 150 mM NaCl,流速0.5ml/min。(B) MALDI-TOF spectrum of hHSS,蛋白分子量為31KD。(C) SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)純化蛋白。其中Lanel，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);lane 2,純化的hHSS，單體分子量約15kD; lane 3,菌液純化前.。(D) Western印跡檢測(cè)純化的hHSS， lane 2，與hHSS抗血清呈現(xiàn)陽(yáng)性 反應(yīng)。(E) hHSS等電點(diǎn)凝膠電泳。圖2.不同pH溶液(Al)和不同溫度中(Bl)hHSS的SFS光譜，其中 (A2)不同pH條件下峰值344.0 nm處的相對(duì)熒光強(qiáng)度。 (B2)不同溫度條件下峰值342.4 nm處的相對(duì)熒光強(qiáng)度。圖3.不同pH溶液(A1， A2)和不同溫度中(B) hHSS的Far-UV CD譜。 其中C:不同pH條件下的[e]222， [e]代表1()3xdegxcm2xdmor1。 D:不同溫度的[e]222。圖4A:實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果。圖4B:激光共聚焦發(fā)現(xiàn)HSS定位于線粒體內(nèi)的情況。圖4C: Western blot檢測(cè)結(jié)果。圖5A—B:熒光顯微鏡觀察結(jié)果。圖5C:PWlips EM208s電鏡觀察結(jié)果。圖6:為流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果。 圖7: Western blot檢測(cè)結(jié)果。 圖8: ATP檢測(cè)結(jié)果。以下將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，其中實(shí)施例僅 僅起說(shuō)明而非限定的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以在本發(fā)明披露的 具體實(shí)施方案中的技術(shù)上做出改進(jìn)，但是不超過本發(fā)明權(quán)利要求的范 圍或者本發(fā)明范圍之內(nèi)所做出的改進(jìn)都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:表達(dá)人重組肝刺激因子載體的構(gòu)建利用鼠HSS基因探針，經(jīng)RT—PCR擴(kuò)增人HSS，經(jīng)DNA序列 分析，得出含有開放讀碼框(open reading frame, ORF)命名為hHSS的基因，將其插入pcDNA3.1質(zhì)粒(Invitrogen)相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成 pcDNA3.1-hHSS。實(shí)施例2:細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將BEL—7402肝癌細(xì)胞系在含有15%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基 中，在37'C， 5%(302條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染用hHSS基因的轉(zhuǎn)染與篩選按lxl0Vml的細(xì)胞密度接種BE L-7402肝癌細(xì)胞于三個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。 待細(xì)胞密度達(dá)到3xl0Vml (60-80%細(xì)胞匯合)后，去除培養(yǎng)液，以無(wú) Ca2+、 Mg2+的Dulbecco's PBS (pH 7.4)洗滌3次，消除殘留血清影 響。加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基(含胰島素l(Hig/ml)。次日進(jìn)行hHSS 基因的轉(zhuǎn)染。準(zhǔn)備4只1.5ml無(wú)菌Eppendorf管，兩兩對(duì)應(yīng)標(biāo)記。取p cDNA3.1-hHSS和pcDNA3.1各5嗎，放入其中兩只Eppendorf管中， 用HBS (HEPES-buffer saline)配成0.1pg4a。另取DOTAP (N-[2， 3 -Dioleoyloxyl]-N， N， N-trimethylammonium methylulfate) 60|il以HB S稀釋至200^1，各取lOOpl移至兩只Eppendorf管中。分別加入pcDN A3.1-hHSS和pcDNA3.1稀釋液，以手指輕輕彈勻。室溫靜置15min， 分別將DOTAP/ pcDNA3.1-hHSS (或pcDNA3.1 )轉(zhuǎn)染液加入兩瓶B EL-7402肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)液中(其中一瓶作為陽(yáng)性對(duì)照)。緩緩晃動(dòng)培 養(yǎng)液，使轉(zhuǎn)染液均勻分散于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染BEL-7402 細(xì)胞8h，去除培養(yǎng)液，以無(wú)Ca"、 Mg2+的Dulbecco's PBS (pH 7.4) 洗滌3次，消除殘余轉(zhuǎn)染液對(duì)細(xì)胞的毒害作用，換以新鮮DMEM培養(yǎng) 基繼續(xù)培養(yǎng)。第二天加G418 (終濃度40(Hig/ml)于DMEM培養(yǎng)液中， 篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞72h后，顯微鏡下可見少量死亡細(xì)胞。更換 新鮮DMEM培養(yǎng)液(G418， 40(Hig/ml)繼續(xù)篩選。 一周后，顯微鏡 下可觀察到陽(yáng)性克隆細(xì)胞，更換DMEM培養(yǎng)液(含G418， 400ng/ml)， 直至肉眼可見單個(gè)克隆細(xì)胞團(tuán)。去除培養(yǎng)液，以PBS (pH 7.4)洗滌3 次，以吸管滴加細(xì)胞消化液于克隆細(xì)胞團(tuán)處，顯微鏡下觀察，細(xì)胞變 圓后，吸出克隆細(xì)胞，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)液(含G 418， 200pg/ml)培養(yǎng)單克隆細(xì)胞。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR逆轉(zhuǎn)錄聚合酶 鏈反應(yīng)(RT-PCR)鑒定hHSS基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。(見以下實(shí)施例4)。下述內(nèi)容的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用以X土SD表示實(shí)驗(yàn)數(shù)值，應(yīng)用t檢驗(yàn)分 析，P<0.05為差異有顯著性。實(shí)施例3:重組hHSS的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性在適合重組蛋白表達(dá)的條件下，表達(dá)如實(shí)施例2獲得的分別表達(dá) 人重組肝刺激因子和空載體的單克隆細(xì)胞株?；厥占兓撊酥亟M肝刺 激因子蛋白，并采用同步熒光光譜技術(shù)和圓二色光譜技術(shù)檢測(cè)其理化 性質(zhì)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。參見圖1,檢測(cè)結(jié)果表明純化后的重組hHSS為分子量為31kD的 同源二聚體蛋白，等電點(diǎn)為4.5。參見圖2、 3，通過同歩熒光光譜技術(shù)和圓二色光譜技術(shù)對(duì)重組 hHSS的研究發(fā)現(xiàn)hHSS 二級(jí)結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，具有很強(qiáng)的耐酸耐堿和 耐高溫能力，在pH4—10和溫度《8(TC的環(huán)境中結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生改變。實(shí)施例4.實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)HSS / mRNA表達(dá)，鑒定hHSS基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)。收集培養(yǎng)的如實(shí)施例2獲得的分別表達(dá)人重組肝刺激因子和空載 體的單克隆細(xì)胞株細(xì)胞以及野生型肝癌細(xì)胞，按TRIzol試劑盒 (Invitrogen)提供的說(shuō)明書提取總RNA。以總RNA為模板，OligodT 為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ,SYBR Green熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 PCR。用GADPH做內(nèi)參照物。反應(yīng)條件50°C 2min，95。C預(yù)變性10min， 95°C變性15s，60。C退火lmin，共40個(gè)循環(huán)。在延伸的過程中搜集熒 光信號(hào)。每次擴(kuò)增的同時(shí)設(shè)置無(wú)cDNA的陰性對(duì)照。擴(kuò)增結(jié)果采用ABI Prism 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)自帶的實(shí)時(shí)熒光 定量PCR分析程序分子Ct值，然后計(jì)算出相應(yīng)的ACt值(厶Ct值二 陰性對(duì)照Ct值一待測(cè)樣本Ct值)，ACt值越大說(shuō)明基因拷貝數(shù)越多。參見圖4A，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明在轉(zhuǎn)染HSS的肝癌細(xì) 胞中檢測(cè)到HSS在mRNA水平的表達(dá)較野生型肝癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)染過空載 體細(xì)胞高。同樣，參見圖4，通過Western blot發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HSS的肝癌細(xì)胞線粒體蛋白中HSS表達(dá)量較另外兩種細(xì)胞高。表明HSS定位于線粒體。實(shí)施例5:激光共聚焦檢測(cè)HSS定位于線粒體內(nèi)如實(shí)施例2獲得的分別表達(dá)人重組肝刺激因子和空載體的單克隆 細(xì)胞株細(xì)胞在培養(yǎng)后，將其中的培養(yǎng)液棄去，換成37'C預(yù)熱的復(fù)染液 (按所需的量向無(wú)血清DMEM中加入MitoTracker Red580和Hoechst 33342，使其終濃度分別為250nM和0.2g/L)，在合適的生長(zhǎng)條件下孵 育45分鐘；將復(fù)染液棄去，用PBS漂洗三遍；向細(xì)胞中加入新鮮37。C 預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，用激光共聚焦觀察。參見圖4B，激光共聚焦發(fā)現(xiàn)HSS定位于線粒體內(nèi)。實(shí)施例6:形態(tài)學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡HE染色和熒光染料Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡 將野生型肝癌細(xì)胞及如實(shí)施例2獲得的分別表達(dá)人重組肝剌激因 子和空載體的單克隆細(xì)胞株分種于25cr^培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿底部鋪以 0.01%多聚賴氨酸Poly-L-Lysine處理過夜的蓋玻片)，"106個(gè)細(xì)胞/ 培養(yǎng)皿，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)12 h同步化后分別給予0.6 mmol/L H202 損傷細(xì)胞6小時(shí)。以甲醇固定10分鐘后，用蘇木精一伊紅染色，蒸餾 水沖洗，甘油明膠封片，鏡下觀察。經(jīng)HE染色后，細(xì)胞核染成深蘭色， 胞漿染成深淺不等的粉紅色。未加損傷組細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整，核大 著色較淺，染色質(zhì)分布均勻。給予0.6mMH2O2(以PBS稀釋)損傷后， 野生型細(xì)胞表現(xiàn)為大量細(xì)胞核明顯固縮，染色加深。而轉(zhuǎn)染HSS細(xì)胞 的胞核多數(shù)明顯完整，形態(tài)正常。提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞組中凋亡細(xì)胞數(shù)較對(duì) 照組明顯減少。另將同樣培養(yǎng)的野生型肝癌細(xì)胞和11202損傷的野生型肝癌細(xì)胞和 如實(shí)施例2獲得的表達(dá)人重組肝刺激因子的單克隆細(xì)胞株細(xì)胞以3%多 聚甲醛固定15分鐘，加入Hoechst 33342熒光染料(終濃度為 10嗎/ml)，室溫孵育15分鐘。熒光顯微鏡下觀察。以Hoechst33342特 異性DNA染料染色發(fā)現(xiàn)，野生型細(xì)胞核呈彌散均勻熒光。給予H202 損傷，野生型細(xì)胞核內(nèi)可見大量濃染致密顆粒狀熒光，提示細(xì)胞由于 受到損傷而發(fā)生DNA碎裂。而如實(shí)施例2獲得的表達(dá)人重組肝刺激因子的單克隆細(xì)胞株細(xì)胞核內(nèi)熒光較均勻，說(shuō)明轉(zhuǎn)染HSS后，細(xì)胞核損 傷程度明顯減弱(參見圖5A—B)。透射電鏡細(xì)胞凋亡形態(tài)檢測(cè)將同樣培養(yǎng)的野生型肝癌細(xì)胞和如實(shí)施例2獲得的分別表達(dá)人重 組肝刺激因子和空載體的單克隆細(xì)胞株細(xì)胞給予11202損傷處理，收集 細(xì)胞，以PBS洗滌后，多聚甲醛-戊二醛固定液固定2小時(shí)，1%鋨酸固 定2小時(shí)，4'C，梯度酒精脫水，環(huán)氧丙烷置換，浸透、包埋、修塊、 切片。Philips EM208s電鏡觀察。參見圖5C，結(jié)果提示野生型組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，核大而圓，核 染色質(zhì)均勻，核仁清晰完整，胞質(zhì)中細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，線粒體豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體無(wú)擴(kuò)張。通過觀察發(fā)現(xiàn)給予H202損傷后野生型組細(xì)胞體積變小，染色質(zhì)濃縮凝聚成塊，邊聚于核膜周圍，此為明顯的調(diào) 亡現(xiàn)象，提示細(xì)胞發(fā)生了調(diào)亡；轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞損傷后染色質(zhì)也呈 新月狀或小帽狀聚集于核膜周圍；而轉(zhuǎn)染HSS細(xì)胞組，只發(fā)現(xiàn)染色質(zhì) 有少量的凝集未出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)新月狀凝集于核膜周圍，表明轉(zhuǎn)染HSS后，由H202損傷導(dǎo)致的細(xì)胞調(diào)亡程度明顯減弱。 實(shí)施例7:細(xì)胞凋亡率檢測(cè)給予野生型肝癌細(xì)胞和如實(shí)施例2獲得的分別表達(dá)人重組肝刺激 因子的單克隆細(xì)胞株細(xì)胞11202損傷處理，收集細(xì)胞，以PBS洗滌后， 采用異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的Ca"依 賴性磷脂結(jié)合蛋白(AnnexinV-FITC)和碘化丙啶(PI)染色(LaBrecque DR， Bachur NR: Hepatic stimulator substance (HSS)-physical -chemical characteristics and specificity. Am J Physical, 242(Gadtrointest Liver Physical 5):G281-G288，1982，于FCAS-440流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡 檢測(cè)。參見圖6，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型細(xì)胞組損傷后的凋亡細(xì) 胞占總體細(xì)胞數(shù)的55.64%;而轉(zhuǎn)染HSS細(xì)胞組的凋亡細(xì)胞數(shù)僅為 31.39% (圖6A)。提示轉(zhuǎn)染HSS的細(xì)胞組凋亡細(xì)胞出現(xiàn)率明顯降低， 同樣損傷條件下，細(xì)胞凋亡率降低了 43.58%。說(shuō)明轉(zhuǎn)染HSS的細(xì)胞可以減輕11202損傷而造成的細(xì)胞凋亡。實(shí)施例8:線粒體跨膜電位檢測(cè)(MPT)收集野生型肝癌細(xì)胞和如實(shí)施例2獲得的分別表達(dá)人重組肝刺激 因子的單克隆細(xì)胞株細(xì)胞的細(xì)胞懸液，用PBS將細(xì)胞稀釋成IX 106 / ml，使用MitoProbeTMDilC！(5) Assay Kit(MolecularProbes)試劑盒檢測(cè)。 將DilC,(5)加入到培養(yǎng)基中在37°CC02孵箱中孵育30分鐘，于 FCAS-440流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體跨膜電位。參見圖6 (A-D)，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H202損傷后三種細(xì)胞的 跨膜電位都明顯降低，轉(zhuǎn)染HSS細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞的跨膜電 位降低較野生型細(xì)胞組明顯，提示HSS對(duì)于H202損傷的細(xì)胞有保護(hù)作 用。(圖6B)實(shí)施例9: ATP的檢測(cè)野生型肝癌細(xì)胞和如實(shí)施例2獲得的分別表達(dá)人重組肝刺激因子 的單克隆細(xì)胞株細(xì)胞受11202損傷處理，加入細(xì)胞裂解液提取蛋白并定 量；采用ATP Assay Kit (Promega)，通過熒光素酶檢測(cè)儀測(cè)定ATP含里。參見圖8， ATP檢測(cè)結(jié)果表明，在H202損傷后三種細(xì)胞的ATP都 明顯降低，轉(zhuǎn)染HSS細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞的跨膜電位降低較野 生型細(xì)胞組明顯，提示HSS對(duì)于&02損傷的細(xì)胞有保護(hù)作用。實(shí)施例10: Western blot檢測(cè)細(xì)胞色素e提取野生型肝癌細(xì)胞和如實(shí)施例2獲得的分別表達(dá)人重組肝刺激 因子的單克隆細(xì)胞株細(xì)胞的線粒體蛋白及胞漿蛋白并定量。50嗎蛋白 于15。/。SDS-PAGE凝膠分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，過夜封閉(化)。 次曰分別與兔抗人anti-cytochemc單克隆抗體(Santa Cruz)及羊抗小 鼠IgG抗體-辣根過氧化物酶(中山公司)各孵育lh。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā) 光法(enhanced chemiluminescene，ECL)檢測(cè)雜交信號(hào)。經(jīng)GS-700掃 描儀(Bio-Rad,美國(guó))進(jìn)行半定量分析。參見圖7， Western blot結(jié)果表明&02損傷后三種細(xì)胞中的線粒體蛋白中細(xì)胞色素C的表達(dá)量均降低，而在胞質(zhì)蛋白中損傷后的細(xì)胞 色素C的表達(dá)量均升高，表明在細(xì)胞受損后細(xì)胞色素C從線粒體中釋放出進(jìn)入胞質(zhì)中，這種改變提示我們HSS對(duì)細(xì)胞的保護(hù)可能與線粒體有關(guān)。
權(quán)利要求
1. 人重組肝刺激因子在制備抗腫瘤細(xì)胞凋亡的藥劑中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的用途，其特征在于人重組肝刺激因子純化 后為分子量是31kD的同源二聚體蛋白，等電點(diǎn)為4.5，人重組肝 刺激因子在pH4-10和溫度《8(TC的環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
3. 人重組肝刺激因子在抗腫瘤細(xì)胞凋亡中的用途。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3中所述的用途，其特征在于人重組肝刺激因子純化 后為分子量是31kD的同源二聚體蛋白，等電點(diǎn)為4.5，人重組肝刺 激因子在pH4-10和溫度《80'C的環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
全文摘要
本發(fā)明涉及人重組肝刺激因子在制備抗腫瘤細(xì)胞凋亡的藥劑中的用途。所述的人重組肝刺激因子純化后為分子量是31kD的同源二聚體蛋白，等電點(diǎn)為4.5，在pH4-10和溫度≤80℃的環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。本發(fā)明還涉及人重組肝刺激因子在抗腫瘤細(xì)胞凋亡中的用途。
文檔編號(hào)A61K38/18GK101234191SQ20071000829
公開日2008年8月6日 申請(qǐng)日期2007年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月29日
發(fā)明者媛 吳, 威 安, 杜海軍, 琳 楊, 陽(yáng)志成, 莉 陳 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)