專(zhuān)利名稱(chēng)：一種通過(guò)與血藍(lán)蛋白互作調(diào)控酚氧化酶(po)活性的對(duì)蝦qm蛋白的制作方法
一種通過(guò)與血藍(lán)蛋白互作調(diào)控酚氧化酶(PO)活性的對(duì)蝦QM蛋白 本發(fā)明涉及一種QM蛋白的功能，特別是對(duì)蝦中的QM蛋白。
背景技術(shù)：
QM基因是Weissman等首次從人維爾姆斯腫瘤(Wilms，tumor)相關(guān)的細(xì)胞系 中分離的一種新基因，隨后發(fā)現(xiàn)該基因在自然界許多物種中廣泛存在，除了人類(lèi)外， 目前已在小鼠、雞、果蠅、蠶、蛾、酵母、玉米和水稻等生物中克隆了QM同源基 因，分子量約為24-26kDa,這些基因的核苷酸及其編碼的氨基酸序列高度保守。目 前研究顯示，QM是一種多功能蛋白，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、發(fā)育和凋亡等基本生 命活動(dòng)。在酵母中，QM同源基因GRC5 - Q.R1與線粒體呼吸作用有關(guān)，而且QM基 因突變，可導(dǎo)致酵母蛋白質(zhì)合成下降、生長(zhǎng)和分裂阻滯、細(xì)胞骨架異常，QM基因 缺失，則導(dǎo)致酵母死亡；在雞中，QM同源基因Jif-l可與癌基因c-Jun的蛋白產(chǎn)物 結(jié)合從而抑制c-Jun的反式激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，影響細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖。盡管已有很多 QM蛋白的功能被報(bào)道，其在免疫反應(yīng)中的具體功能還不是很清楚。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的對(duì)于QM蛋白的確切研究。本發(fā)明的研究表明，采用抑制性差減雜 交的方法發(fā)現(xiàn)QM基因片段在抗病對(duì)蝦中上調(diào)表達(dá)，預(yù)示QM蛋白可能參與了無(wú)脊椎動(dòng) 物的抗病毒免疫反應(yīng)。對(duì)蝦類(lèi)似于其它無(wú)脊椎動(dòng)物，缺乏髙等動(dòng)物由免疫球蛋白介導(dǎo)的特意性免疫， 因此，體液性免疫因子在對(duì)蝦免疫防御中發(fā)揮著十分重要的作用，這些因子包括先 天的和誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種生物大分子，主要是血淋巴中的各類(lèi)抗菌因子、抗病毒因子、 血凝因子、細(xì)胞激活因子、識(shí)別因子、凝集素、溶血素及溶菌酶、酚氧化酶等具有 免疫活性的酶類(lèi)以及活性氧中間產(chǎn)物。近年來(lái)，關(guān)于對(duì)蝦的抗病毒免疫方面的研究 己逐步開(kāi)展，引起了國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。本發(fā)明研究表明，在抗病蝦中，QM基因上調(diào)表達(dá)，通過(guò)與血藍(lán)蛋白發(fā)生相互作 用，調(diào)控酚氧化酶(P0)的活性，參與無(wú)脊椎動(dòng)物抗病毒免疫反應(yīng)。

圖1RACE分析獲得QM cDNA A:5' RACE產(chǎn)物，B:菌落PCR 圖2. PjQM基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列圖中的下劃線和方框表示PjQM預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)域，箭頭表示poly (A)位點(diǎn)。圖3RT-PCR分析PjQM gene轉(zhuǎn)錄組織特異性1: DNA marker; 2:陰性對(duì)照；3-8:分別是肌肉、心臟、肝胰腺、消化道、血、 鰓。圖4. Western blot分析P jQM蛋白表達(dá)的組織特異性l:蛋白質(zhì)marker; 2-7:Western blot結(jié)果，分別是肌肉、心臟、肝胰腺、消化道、 血、鰓。圖5. Real-time PCR分析對(duì)蝦肝胰腺中PjQM基因在受到病毒刺激后轉(zhuǎn)錄的變化 1:正常對(duì)蝦中PjQM的轉(zhuǎn)錄量(100%); 2-8:受病毒刺激4 h、 8 h、 12 h、 24 h、 48 h和72 h后PjQM的轉(zhuǎn)錄量；9:抗病對(duì)蝦中PjQM的轉(zhuǎn)錄量 圖6. Western blot分析QM蛋白在受到病毒剌激后表達(dá)量的變化 圖7.GST pull-down尋找與PjQM互作的蛋白M:蛋白質(zhì)marker; 1:純化的GST-PjQM; 2:純化的GST; 3:未結(jié)合蛋白的4B下拉；4: GST-PjQM下拉；5: GST下拉圖8. Western blot驗(yàn)證myosin與QM的相互作用圖9. Western blot驗(yàn)證血藍(lán)蛋白與PjQM的相互作用圖10.昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證Hc-L與PjQM的相互作用。1:用血藍(lán)蛋白特異的抗體免疫共沉淀后，用V5的抗體檢測(cè)；2:用PjQM的特異抗體免疫共沉淀后，用V5的抗體檢測(cè)。圖11.昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證He-Y與PjQM的相互作用。1:用血藍(lán)蛋白特異的抗體免疫共沉淀后，用V5的抗體檢測(cè)；2:用PjQM的特異抗體免疫共沉淀后，用V5的抗體檢測(cè)。圖12.昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證myosin與PjQM的相互作用。1:用myosin特異的抗體免疫共沉淀后，用V5的抗體檢測(cè)；2:用PjQM的特異抗體免疫共沉淀后，用V5的抗體檢測(cè)。圖13. WSSV感染對(duì)P0的影響圖14.siRNA對(duì)PjQM轉(zhuǎn)錄的抑制作用(Northern blot) 圖15.siRNA對(duì)PjQM蛋白表達(dá)的抑制作用 圖16. siRNA對(duì)對(duì)蝦P0活性的影響具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:QM基因的結(jié)構(gòu)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室抑制差減雜交(suppression subtractive hybridization, SSH)的結(jié) 果，有一段與QM同源性較高的基因片段在抗病對(duì)蝦中上調(diào)表達(dá)。為了研究QM基因 的功能，采用RACE技術(shù)(圖l)，獲得QM基因全長(zhǎng)cDNA序列，GenBank accession No. EU004069 (圖2)。由于該基因來(lái)自日本對(duì)蟲(chóng)下(peneans _/flpo/iic"s)，我們根據(jù)來(lái)源將 其命名為iV(2M。將獲得的1000 bp左右的DNA片段測(cè)序后，同源比較分析發(fā)現(xiàn)對(duì) 蝦QM蛋白分別與人類(lèi)、老鼠、果蠅、啤酒酵母的同源性分別為76.23%， 76.82%, 78.64%和62.44%。參閱附圖lRACE分析獲得QM cDNAA:5'RACE產(chǎn)物，B:菌落PCR對(duì)該cDNA進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，"(2M基因包含一個(gè)長(zhǎng)度為663 bp的開(kāi)放閱讀框 (open reading frame, ORF),預(yù)測(cè)編碼220個(gè)氨基酸，理論分子量約為24.4kDa,其 poly (A)尾位于翻譯終止密碼下游26bp處(參閱圖2)。圖2. PjQM基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列，圖中的下劃線和方框表示 PjQM預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)域，箭頭表示poly ( A)位點(diǎn)。實(shí)施例22 PjQM基因在對(duì)蝦體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析提取日本對(duì)蝦的肌肉、心臟、肝胰腺、消化道、血、鰓的總RNA后，以01igdT(18) 作為逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，分別以各個(gè)組織的cDNA為模板，進(jìn)行iV(2M基因的擴(kuò) 增，結(jié)果顯示肌肉、心臟、肝胰腺、消化道、血、鰓中都能擴(kuò)增到ZVQAf基因，說(shuō) 明iV(2Af在每個(gè)被檢測(cè)的組織中都有轉(zhuǎn)錄(圖3),在轉(zhuǎn)錄水平上沒(méi)有組織特異性。 附圖3RT-PCR分析PjQM gene轉(zhuǎn)錄組織特異性，其中1: DNAmarker; 2:陰性對(duì)照；3-8:分別是肌肉、心臟、肝胰腺、消化道、血、 鰓。日本對(duì)蝦的肌肉、心臟、肝胰腺、消化道、血、鰓等組織分別勻漿后，進(jìn)行SDS-PAGE, 然后電轉(zhuǎn)到NC膜上，經(jīng)196BSA封阻后，先后與PjQM的抗體和AP標(biāo)記的二抗結(jié)合 后顯色。如圖4所示，與肌肉、心臟、肝胰腺、消化道、血、鰓相對(duì)應(yīng)的電泳條帶 上都顯示出一條明顯的特異帶，說(shuō)明在所檢測(cè)的組織中都存在PjQM蛋白，與轉(zhuǎn)錄 的結(jié)果一致，PjQM蛋白的翻譯也沒(méi)有組織特異性。附圖4. Western blot分析PjQM 蛋白表達(dá)的組織特異性l:蛋白質(zhì)marker; 2-7:Western blot結(jié)果，分別是肌肉、心臟、肝胰腺、消化道、血、鰓。實(shí)施例3: l.ro .l QM蛋白在對(duì)蝦免疫中的作用 3.1病毒刺激對(duì)對(duì)蝦QM表達(dá)的影響用WSSV注射感染日本對(duì)蝦，分別在感染后0h、 4h、 8h、 12 h、 24 h、 48 h和 72 h提取對(duì)蝦肝胰腺的總RNA,以O(shè)lig(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。以18S RNA為 對(duì)照，通過(guò)Real-time PCR方法，研究iV(2似基因在對(duì)蝦受WSSV病毒感染后在轉(zhuǎn)錄 水平上的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在受病毒感染4h后，iV(2M的轉(zhuǎn)錄即出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，在 感染72h后其表達(dá)水平約為正常對(duì)蝦的150% (圖5)。與此同時(shí)，Real-time PCR的 結(jié)果表明，在抗病對(duì)蝦中，"(2M基因的表達(dá)是正常水平的180% (圖5),表現(xiàn)為顯 著上調(diào)表達(dá)。同時(shí)，采用Western blot的方法，從蛋白翻譯水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在 抗病蝦中QM蛋白顯著上調(diào)(如圖6)，結(jié)果與Real-time PCR —致。因此，WSSV 病毒感染對(duì)蟲(chóng)下后，iV(2似基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，尤其是在抗病對(duì)蝦中顯著上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明對(duì)蝦QM基因參與了對(duì)蝦的抗病毒免疫過(guò)程。圖5. Real-time PCR分析對(duì)奸肝胰腺中 PjQM基因在受到病毒刺瀲后轉(zhuǎn)錄的變化1:正常對(duì)蝦中PjQM的轉(zhuǎn)錄量(100%); 2-8:受病毒刺激4h、 8 b、 12 h、 24 h、 48h和72h后PjQM的轉(zhuǎn)錄量；9:抗病對(duì)蝦中PjQM的轉(zhuǎn)錄量 圖6. Western blot分析QM蛋白在受到病毒刺激后表達(dá)量的變化3.2對(duì)蝦體內(nèi)與PjQM互作的蛋白分析上述結(jié)果表明，對(duì)蟲(chóng)下QM參與了對(duì)蝦抗病毒免疫，為了了解其以何種途徑參與 免疫反應(yīng)，我們首先進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析，從對(duì)蝦體內(nèi)獲得與PjQM蛋白互作的蛋 白。這對(duì)于闡明QM參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而深入了解對(duì)蝦的免疫應(yīng)答過(guò)程和免 疫機(jī)制，具有重要意義。 3.2.1PjQM蛋白的GST下拉GST下拉試驗(yàn)作為研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的有力手段，被廣泛用于尋找與 已知蛋白有相互作用的蛋白質(zhì)。根據(jù)Western blot試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)蝦6個(gè)組織都存在 QM蛋白，對(duì)蟲(chóng)下頭部存在幾個(gè)組織，所以我們推測(cè)在對(duì)蝦的整個(gè)頭部組織中應(yīng)該容 易找到與QM蛋白互作的因子。GST-PjQM蛋白與Glutathione Sepharose 4B結(jié)合形成親和層析柱，設(shè)置GST蛋 白作為對(duì)照。對(duì)蝦頭部組織勻漿液離心后，取上清，上樣于親和層析柱，在4。C下輕搖混勻2h。用勻漿緩沖液洗去雜蛋白后，與GST-PjQM或GST互作的蛋白保留 下來(lái)。隨后，用還原型谷光甘肽洗脫，洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE，并用硝酸銀染色后， 比較GST-PjQM蛋白和GST蛋白以及沒(méi)有結(jié)合蛋白質(zhì)的4B的下拉結(jié)果。結(jié)果如圖 7所示，有3種蛋白可與GST-PjQM蛋白特異結(jié)合，它們的大小分別約為77kDa、 75kDa和40kDa，說(shuō)明它們可能與對(duì)蝦QM蛋白存在互作。同時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與GST 蛋白互作的蛋白存在，也沒(méi)有可以與Glutathione Sepharose 4B結(jié)合的蛋白質(zhì)(圖7)。 圖7.GST pull-down尋找與PjQM互作的蛋白M:蛋白質(zhì)marker; 1:純化的GST-PjQM; 2:純化的GST; 3:未結(jié)合蛋白的4B下拉；4: GST-PjQM下拉；5: GST下拉 將GST下拉的洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮蘭染色，割取目的條帶進(jìn)行 MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜分析得到的多肽序列采用Mascot在GenBank數(shù)據(jù) 庫(kù)中檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下拉獲得的分子量為40kDa左右的蛋白與myosin蛋白相匹 配，預(yù)測(cè)77kDa和75kDa的蛋白可能為對(duì)蝦血藍(lán)蛋白的兩個(gè)亞基。為了驗(yàn)證質(zhì)譜結(jié)果，將GST-QM下拉的洗脫液經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)膜，用myosin 特異的抗體進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖8)，只有一條蛋白帶，大小與 myosin蛋白相符，這說(shuō)明質(zhì)譜結(jié)果是正確的。與此同時(shí)，結(jié)果也說(shuō)明在對(duì)蝦中，PjQM 與myosin蛋白確實(shí)存在相互作用。圖8. Western blot驗(yàn)證myosin與QM的相互作用 為了證實(shí)這兩個(gè)蛋白是否為血藍(lán)蛋白兩個(gè)亞基，制備血藍(lán)蛋白抗體后，用血藍(lán) 蛋白特異的抗體進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在75kDa左右有兩條特異的帶， 大小與下拉獲得的蛋白帶相同(圖9),說(shuō)明在對(duì)蝦中血藍(lán)蛋白(hemocyanin)與 QM蛋白確實(shí)可以與QM特異結(jié)合。圖9. Western blot驗(yàn)證血藍(lán)蛋白與PjQM的相互作用 3.2.2昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證血藍(lán)蛋白與QM的互作為了進(jìn)一步驗(yàn)證對(duì)蝦血藍(lán)蛋白與QM的互作，需要進(jìn)行蛋白互作的體內(nèi)驗(yàn)證， 由于沒(méi)有對(duì)蝦或甲殼類(lèi)動(dòng)物的細(xì)胞系，因此采用昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行對(duì)蝦血藍(lán)蛋白與QM 互作的細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證。根據(jù)載體和基因的序列特征，設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、 連接、轉(zhuǎn)化、菌落PCR、雙酶切、測(cè)序等步驟，分別將"QM基因與血藍(lán)蛋白ifc-L 亞基和ifc-y亞基基因克隆到昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)載體pIZ/V5-His中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。 將含ifc-l和Wc-y和myos/'n基因分別與"QAf的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 昆蟲(chóng)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，離心收集細(xì)胞并裂解，15000Xg, 4。C離心15min。上清分別與Hc-L和QM特異的抗體、Hc-Y和QM抗體、myosin和QM抗體在4°C 輕搖結(jié)合16 h,然后與protein A-Sepharose結(jié)合30 min。免疫共沉淀收集的樣 品進(jìn)行SDS—PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，用堿性磷酸酶偶連的V5抗體進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。結(jié)果顯示，采用Hc-L特異的抗體免疫共沉淀的樣品中，可以同時(shí)檢測(cè)到Hc-L 與PjQM共表達(dá)，同樣采用PjQM特異的抗體免疫共沉淀的樣品中，可以同時(shí)檢測(cè)
到HC-L與PjQM共表達(dá)(圖10)。圖IO.昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證Hc-L與PjQM的相互作用。1:用血 藍(lán)蛋白特異的抗體免疫共沉淀后，用V5的抗體檢測(cè)2:用PjQM的特異抗體免疫共沉淀后，用V5的
抗體檢測(cè)。分別共轉(zhuǎn)染Hc-Y和QM與共轉(zhuǎn)染myosin和QM重組質(zhì)粒得到的結(jié)果也同
時(shí)檢測(cè)到兩個(gè)蛋白的共表達(dá)(圖11,圖12)圖ll.昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證Hc-Y與PjQM的相互作用。
1:用血藍(lán)蛋白特異的抗體免疫共沉淀后，用V5的抗體檢測(cè)；
2:用PjQM的特異抗體免疫共沉淀后，用V5的抗體檢測(cè)。 圖12.昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證myosin與PjQM的相互作用。
1:用myosin特異的抗體免疫共沉淀后，用V5的抗體檢測(cè)； 2:用PjQM的特異抗體免疫共沉淀后，用V5的抗體檢測(cè)。
抗原和抗體之間的相互作用是特異的，即一種蛋白的抗體只能特異地結(jié)合這種 蛋白，只有這種蛋白和另一種蛋白存在相互作用時(shí)才能同時(shí)被檢測(cè)到，由此可見(jiàn)， Hc-L與PjQM在昆蟲(chóng)細(xì)胞中存在相互作用。血藍(lán)蛋白的Hc-Y亞基與QM的相互作 用和myosin基因與QM也存在相互作用。
以上結(jié)果表明，對(duì)蝦QM蛋白(PjQM)與對(duì)蝦myosin和血藍(lán)蛋白2個(gè)亞基之 間存在相互作用，形成了互作復(fù)合體。 3.2.3對(duì)蝦QM對(duì)酚氧化瞎活性的影響
由上面的研究結(jié)果可知，對(duì)蟲(chóng)下QM蛋白和對(duì)蝦myosin、血藍(lán)蛋白之間存在互作， 提示QM可能參與對(duì)蝦細(xì)胞吞噬、酚氧化酶原激活系統(tǒng)等對(duì)蝦免疫。采用對(duì)蝦QM基 因特異的siRNA干擾其表達(dá)，結(jié)果對(duì)蝦的血細(xì)胞吞噬活性未受到影響，說(shuō)明QM未 采用吞噬反應(yīng)。因此，QM可能是通過(guò)酚氧化酶原激活系統(tǒng)參與對(duì)蝦的免疫。
根據(jù)以往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧的攜帶者血藍(lán)蛋白(He)與抵抗病原入侵有關(guān)， 它與在無(wú)脊椎動(dòng)物非特異性免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的一種酶一一酚氧化酶一樣，同 屬于3型銅蛋白，基于它們相似的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的相似性，推論Hc和PO有著密 切的聯(lián)系，在節(jié)肢動(dòng)物中Hc可以起著PO的作用。在對(duì)蝦中，PO在抵抗外界病原 的入侵免疫反應(yīng)中起著重要的作用。用WSSV感染日本對(duì)蟲(chóng)下后，在0、 2、 4、 6h分別測(cè)定PO的變化，同時(shí)設(shè)置注 射0.9%的NaCl為對(duì)照。結(jié)果如圖13所示，在感染W(wǎng)SSV后，對(duì)蝦PO值迅速升高。 因此，PjQM可能是通過(guò)影響PO的活性來(lái)參與對(duì)蝦免疫的過(guò)程。圖i3. wssv感染對(duì)po 的影響
為了探討對(duì)蝦QM對(duì)免疫指標(biāo)PO的影響，我們采用RNAi抑制干擾QM基因 表達(dá)的途徑，在對(duì)蝦體內(nèi)，檢測(cè)QM對(duì)于PO的影響。
3.2.3.1 RNAi抑制QM的轉(zhuǎn)錄表達(dá)
將體外合成的對(duì)蝦QM基因特異的siRNA即PjQM-siRNA注射到對(duì)蝦體內(nèi)(24 jiM/只)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照PjQM-siRNA序列突變1個(gè)堿基的siRNA (mutation-siRNA)和PjQM-siRNA序列隨機(jī)排列的siRNA (random-siRNA)。在 12、 24、 36、 48、 72h后，抽取對(duì)奸細(xì)胞，通過(guò)Northern blot檢測(cè)經(jīng)過(guò)干擾后，對(duì) 蝦PjQM基因的轉(zhuǎn)錄變化。結(jié)果如圖14所示，在PjQM-siRNA干擾36 h后，PjQM 的轉(zhuǎn)錄量明顯下降；在48h時(shí)達(dá)到最低，用Northern blot未檢測(cè)到PjQM基因的轉(zhuǎn) 錄在72h后，PjQM的轉(zhuǎn)錄又開(kāi)始增加。同時(shí)，對(duì)照mutation-siRNA和random-siRNA 中，QM的轉(zhuǎn)錄量未變化。結(jié)果表明，RNAi具有高度的特異性，而且QM基因的轉(zhuǎn)
錄已被QM基因特異的SiRNA抑制。圖H.siRNA對(duì)PjQM轉(zhuǎn)錄的抑制作用(Northern blot)
在注射siRNA 12、 24、 36、 48、 72h后，分別抽取對(duì)蟲(chóng)下細(xì)胞，通過(guò)Western blot 檢測(cè)經(jīng)過(guò)干擾后，對(duì)蝦PjQM的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖15所示，在PjQM-siRNA 干擾36h后，PjQM蛋白的表達(dá)量明顯下降；在48h時(shí)達(dá)到最低，用Western blot 未檢測(cè)到PjQM蛋白的表達(dá)；在72 h后，PjQM的表達(dá)又開(kāi)始增加。同時(shí)，對(duì)照 mutation-siRNA和random-siRNA中，QM蛋白的表達(dá)量未變化。結(jié)果表明，QM蛋 白的表達(dá)已被QM基因特異的siRNA抑制，這與Northern blot的結(jié)果 一 致。Northern blot和Western blot的結(jié)果表明，PjQM-siRNA已抑制了 QM基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
圖15.siRNA對(duì)PjQM蛋白表達(dá)的抑制作用
3.2.3.2 RNAi抑制QM對(duì)酚氧化酶活性的影響
上述結(jié)果表明，PjQM-siRNA已抑制了 QM基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在此時(shí)運(yùn)用測(cè) 定P0的方法測(cè)定對(duì)蝦體內(nèi)P0值的變化，結(jié)果如圖16所示。從圖16可發(fā)現(xiàn)，在 PjQM-siRNA干擾24 h后，P0值開(kāi)始下降，到36和48h時(shí)，PO值下降到最底點(diǎn)， 為對(duì)照對(duì)蝦PO的60%左右。而陰性對(duì)照mutation-siRNA和random-siRNA作用后，對(duì)蝦PO在干擾后不同時(shí)間檢測(cè)的PO值均無(wú)明顯變化(結(jié)果未示)。
綜合上述結(jié)果，對(duì)蝦QM通過(guò)與血藍(lán)蛋白相互作用，調(diào)控對(duì)蝦體內(nèi)PO活性，
從而參與對(duì)蝦抗病毒免疫。圖16為注射siRNA后小時(shí)數(shù)，siRNA對(duì)對(duì)蝦PO
活性的影響。
對(duì)蟲(chóng)下QM序列
61
21
121
41
181
61
241
81
301 101
361 121
421 141 431 161
541 181
601 201 661 221
TG
TA1TJLCGJLCTCACTATAGGGCGJULTTGGGCCCGACGTCGCJTGCTCCCGGCCGCCATGGC CGCGGGJLTTTCGAXJCGGCCGCCCGGGCJLGGTACGCGGGGJLGTGAAGGTTCGTGTTGAGTG TAAACGTGTGAGAGAGTCGCTGCTATATCTTGTTATJLTCTCTGTCATCCJLTJLCGGCAAGA ATGGGGCGCCGTCCGGCCCGJLTGCTACCGCTATTGCJLkGJUTJLAGCCGTACCCGJLAGTCC H G R R PARCTRTTCKNKPYPKS
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polyA
10
權(quán)利要求
1、一種對(duì)蝦QM蛋白，通過(guò)與血藍(lán)蛋白相互作用，調(diào)控對(duì)蝦體內(nèi)PO活性，參與對(duì)蝦抗病毒免疫。
2、 根據(jù)權(quán)利l所述的對(duì)蝦QM蛋白，其基因包含一個(gè)長(zhǎng)度為663 bp的開(kāi)放閱讀框，220 個(gè)氨基酸，理論分子量約為24.4kDa。
3、 根據(jù)權(quán)利1所述的對(duì)蝦QM蛋白，其對(duì)蝦QM蛋白(PjQM)與對(duì)蝦myosin和血 藍(lán)蛋白2個(gè)亞基之間存在相互作用，形成了互作復(fù)合體。
全文摘要
QM蛋白被發(fā)現(xiàn)可能是腫瘤抑制因子，QM蛋白已在植物、動(dòng)物和真菌中得到廣泛研究。迄今為止，對(duì)于QM蛋白的確切功能尚未研究清楚。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在抗病蝦中，QM基因(命名為PjQM)的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)顯著上調(diào)，表明該蛋白可能參與了對(duì)蝦的免疫反應(yīng)。GST下拉實(shí)驗(yàn)表明在對(duì)蝦體內(nèi)，QM蛋白可與血藍(lán)蛋白和肌球蛋白發(fā)生相互作用。蛋白質(zhì)互作提示，PjQM可能通過(guò)酚氧化酶激活系統(tǒng)等途徑參與對(duì)蝦免疫。采用RNAi技術(shù)，首次證實(shí)在對(duì)蝦中，QM蛋白可以通過(guò)與血藍(lán)蛋白互作，來(lái)調(diào)控參與無(wú)脊椎動(dòng)物抗病毒免疫反應(yīng)的酚氧化酶(PO)的活性。
文檔編號(hào)A61K36/16GK101254218SQ20071000984
公開(kāi)日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2007年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日
發(fā)明者吳穗潔, 章曉波, 許建陽(yáng) 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所