專利名稱：甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子在制備誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子在制備誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用，尤其涉及人甲胎蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子在制備靶向誘導(dǎo)人甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病患者高于100萬(wàn)人。我國(guó)是世界上肝癌的高發(fā)地區(qū)，全球每年肝癌的新發(fā)病例中45％在我國(guó)大陸，每年約有11萬(wàn)人死于肝癌，位居我國(guó)惡性腫瘤死亡率的第2位。
對(duì)于腫瘤的治療基本上停留在腫瘤手術(shù)切除，化學(xué)療法，放射治療三大常規(guī)治療階段，雖然患者生命得以延長(zhǎng)，但是腫瘤細(xì)胞的耐受，放療和化療對(duì)正常組織的損傷，尤其是殘留病變引起的腫瘤復(fù)發(fā)，妨礙了療效的進(jìn)一步提高。值得注意的是，原發(fā)性肝癌患者中約有70％以上伴隨甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)的再表達(dá)，甲胎蛋白已經(jīng)被確定為發(fā)現(xiàn)和診斷HCC的重要手段之一。
抗原特異性轉(zhuǎn)移因子(transfer factor，TF)是一類組分復(fù)雜的多核苷肽，可被多種抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且可以相同的免疫學(xué)原理和類同的方法進(jìn)行大量制備。此種小分子活性肽的分子質(zhì)量約3500～5000Da，pH6～8，研究表明它由核苷酸和多肽組成，蛋白反應(yīng)陰性，雙縮脲反應(yīng)及核糖二羥基甲基反應(yīng)呈陽(yáng)性，能與組織相容性抗原分離，無(wú)免疫原性，也不被脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶和胰蛋白酶滅活。
抗原特異性轉(zhuǎn)移因子分子序列中攜帶有致敏淋巴細(xì)胞的免疫信息，能夠激活體內(nèi)的免疫細(xì)胞，并特異性地誘導(dǎo)、恢復(fù)和擴(kuò)大細(xì)胞免疫及體液免疫的效應(yīng)，但其本身并無(wú)抗原性及種屬特異性。此類因子可作用于免疫系統(tǒng)的多個(gè)環(huán)節(jié)，尚可維系造血干細(xì)胞和其他多種細(xì)胞；可增強(qiáng)IL-2、干擾素和集落刺激因子等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對(duì)機(jī)體的多項(xiàng)免疫指標(biāo)具有良好的調(diào)節(jié)作用。臨床研究表明，抗原特異性轉(zhuǎn)移因子可以治療各種病毒感染、先天性免疫缺陷和某些腫瘤，免除或降低某些藥物的副作用，進(jìn)而保護(hù)免疫器官的功能，并可越過(guò)種屬間限制，將抗原信息傳遞給受體的免疫細(xì)胞，使之獲得特異性免疫力，在臨床應(yīng)用中迄今未發(fā)現(xiàn)有任何的毒副作用。雖然抗原特異性轉(zhuǎn)移因子在臨床治療上已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但是針對(duì)甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子對(duì)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞的作用以及相關(guān)的藥理學(xué)研究，經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)檢索查新，目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有研究的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子的新用途，即甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子在制備誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子在制備誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
其中，有效誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞凋亡、核片段化、DNA凝縮以及細(xì)胞周期阻滯的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子的最佳濃度范圍是0.02U/ml-0.06U/ml。
上述活性單位(U)是以1×108個(gè)白細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)移因子作為一個(gè)活性單位(U)。
上述甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子由如下方法制得[1]免疫抗原的準(zhǔn)備將30μl標(biāo)準(zhǔn)級(jí)甲胎蛋白全蛋白(購(gòu)于Biodesign，USA，4.47mg/ml)稀釋于PH7.2的無(wú)菌PBS緩沖溶液中，并定容至3ml；[2]選用重約60kg的健康成年豬(山東省基建股份有限公司華山管理站養(yǎng)豬場(chǎng))作為免疫動(dòng)物，于第1日、7日和14日分別進(jìn)行豬四肢、腋窩、腹股溝、國(guó)窩等處皮下多點(diǎn)注射免疫，于第20日給豬禁食，以防血脂過(guò)高；24h后取豬血，間接ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)，判定免疫效果；[3]對(duì)判定免疫成功的豬進(jìn)行解剖，獲得脾臟并去脂肪及包膜，用勻漿機(jī)20000rpm勻漿，點(diǎn)動(dòng)十次，然后用四層無(wú)菌紗布過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，并用紅細(xì)胞裂解液完全裂解紅細(xì)胞；對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，用超聲破碎白細(xì)胞至鏡檢完全裂解，并于4℃下將白細(xì)胞裂解液13000rpm離心15min，取上清，6000Da濾膜超濾，濾過(guò)液以0.22μm的微孔過(guò)濾器過(guò)濾除菌，即得甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子溶液，常規(guī)冷凍干燥后，備用。
甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子活性單位(U)是以1×108個(gè)白細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)移因子作為一個(gè)活性單位(U)。
本發(fā)明的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子能夠在體外直接靶向誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性人肝癌細(xì)胞凋亡，為新型肝癌藥物的開發(fā)提供了依據(jù)。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)及本發(fā)明所述的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子作用效果，下面結(jié)合甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子的藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果，來(lái)進(jìn)一步闡述其在體外直接誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性人肝癌細(xì)胞凋亡中的作用。
采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)，以觀察甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子抑制甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。
1、MTT法測(cè)定甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子對(duì)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞(Bel7402和HepG2，甲胎蛋白陽(yáng)性；SK-Hep-1，甲胎蛋白陰性)和正常肝細(xì)胞(Changliver，正常肝細(xì)胞)，各向96孔板中加入104個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁，接著各加入濃度為0.005U/ml，0.01U/ml，0.02U/ml，0.04U/ml，0.06U/ml和0.08U/ml的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子，置于飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)；吸出培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，振蕩溶解20分鐘，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定570nm的OD值； 用Excel軟件分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)。
結(jié)果表明甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子對(duì)甲胎蛋白陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2有明顯的抑制作用，而對(duì)甲胎蛋白陰性的肝癌細(xì)胞SK-Hep-1以及正常肝細(xì)胞Changliver無(wú)明顯的作用(圖1)2、倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，察看有無(wú)凋亡小體的形成以濃度為0.005U/ml，0.01U/ml，0.02U/ml，0.04U/ml，0.06U/ml和0.08U/ml的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2、甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1和人類正常肝細(xì)胞Changliver 24小時(shí)后，光鏡下直接觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化和凋亡小體的形成。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理24小時(shí)，可以看到甲胎蛋白陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2有明顯凋亡小體的形成以及凋亡的形態(tài)學(xué)變化，而甲胎蛋白陰性的肝癌細(xì)胞SK-Hep-1以及正常肝細(xì)胞Changliver與對(duì)照相比無(wú)明顯的變化(見圖2)。
3、熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核凝縮及核碎裂情況以濃度為0.005U/ml，0.01U/ml，0.02U/ml，0.04U/ml，0.06U/ml和0.08U/ml的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2、甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1和人類正常肝細(xì)胞Changliver 24小時(shí)后，進(jìn)行Hochest33528染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞核DNA的凝縮及核碎裂情況。
結(jié)果顯示甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理24小時(shí)，可以看到甲胎蛋白陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2有明顯的細(xì)胞核DNA的凝縮及核碎裂情況，而甲胎蛋白陰性的肝癌細(xì)胞SK Hep-1以及正常肝細(xì)胞Changliver與對(duì)照相比無(wú)明顯的變化(見圖3)4、Tunel染色標(biāo)記凋亡細(xì)胞以濃度為0.005U/ml，0.01U/ml，0.02U/ml，0.04U/ml，0.06U/ml和0.08U/ml的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理類甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2、甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1和人類正常肝細(xì)胞Changliver 24小時(shí)后，分別用福爾馬林固定25分鐘，0.2％Triton X-100處理5分鐘，每孔加入50μl rTdr孵育液，37℃下孵育1小時(shí)，SSC終止反應(yīng)，檢測(cè)標(biāo)記凋亡細(xì)胞。
結(jié)果顯示甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子可以誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2凋亡(Tunel陽(yáng)性信號(hào))，而對(duì)甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1以及正常肝細(xì)胞Changliver沒(méi)有明顯的作用(Tunel陰性信號(hào))(圖4)。
5、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的變化以濃度為0.005U/ml，0.01U/ml，0.02U/ml，0.04U/ml，0.06U/ml和0.08U/ml的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2、甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1和人類正常肝細(xì)胞Changliver24小時(shí)后，分別收集細(xì)胞，70％預(yù)冷乙醇重懸細(xì)胞并固定，-20℃過(guò)夜，200目篩網(wǎng)過(guò)濾后加入RNA酶處理，最后加入0.5ml PI染液4℃避光染色30分鐘，收集細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并利用Modifit-3program進(jìn)行分析。
結(jié)果顯示與正常的甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2相比，甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理的甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2 G0/G1期的細(xì)胞比例顯著上升，細(xì)胞凋亡率明顯升高；而甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理的甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1和人類正常肝細(xì)胞Changliver與正常生長(zhǎng)的細(xì)胞相比，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期都變化不大(圖5)。
通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果，可以得出如下結(jié)論甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子濃度在0.02U/ml-0.06U/ml范圍時(shí)，能夠明顯有效的靶向抑制甲胎蛋白陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，這預(yù)示本發(fā)明所述甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子作為藥物在靶向治療肝細(xì)胞癌方面具有很大的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2，甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1以及正常肝細(xì)胞Changliver的量效變化曲線其中甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理后，甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2生長(zhǎng)受到明顯的抑制，而甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1以及正常肝細(xì)胞Changlive的生長(zhǎng)幾乎不受影響。
圖2光學(xué)顯微鏡下所示正常生長(zhǎng)的細(xì)胞(A)和0.04U/ml甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理24小時(shí)的細(xì)胞(B)形態(tài)學(xué)觀察其中0.04U/ml甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理24小時(shí)，甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2出現(xiàn)細(xì)胞變小，皺縮，膜泡凸起，并可見凋亡小體的產(chǎn)生，而甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1以及正常肝細(xì)胞Changliver的形態(tài)沒(méi)有明顯變化。
圖3熒光顯微鏡下所示正常生長(zhǎng)的細(xì)胞(A)和0.04U/ml甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理24小時(shí)的細(xì)胞(B)經(jīng)Hochest33528染色后形態(tài)學(xué)觀察其中0.04U/ml甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理24小時(shí)，經(jīng)Hochest33528染色發(fā)現(xiàn)，甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2出現(xiàn)明顯的核凝縮及核碎裂現(xiàn)象，而甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1以及正常肝細(xì)胞Changliver的形態(tài)沒(méi)有明顯變化。
圖4正常生長(zhǎng)的細(xì)胞(A)和0.04U/ml甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理24小時(shí)的細(xì)胞(B)的Tunel染色觀察其中0.04U/ml甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理24小時(shí)，經(jīng)Tunel染色發(fā)現(xiàn)，甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402和HepG2出現(xiàn)明顯的深棕色(Tunel陽(yáng)性信號(hào))，顯示其發(fā)生了凋亡，而甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1以及正常肝細(xì)胞Changliver著色很淺(Tunel陰性信號(hào))。
圖5正常生長(zhǎng)的細(xì)胞和0.04U/ml甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理24小時(shí)的細(xì)胞的流失細(xì)胞術(shù)分析其中0.04U/ml甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理24小時(shí)，經(jīng)流失細(xì)胞術(shù)分析，甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞Bel7402(A)和HepG2(B)在G0/G1期出現(xiàn)明顯的細(xì)胞阻滯，并且凋亡率增加，而甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞SK-Hep-1(C)以及正常肝細(xì)胞Changliver(D)的細(xì)胞周期和凋亡率變化不顯著。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子的制備[1]免疫抗原的準(zhǔn)備將30μl標(biāo)準(zhǔn)級(jí)甲胎蛋白全蛋白(購(gòu)于Biodesign，USA，4.47mg/ml)稀釋于PH7.2的無(wú)菌PBS緩沖溶液中，并定容至3ml；[2]選用重約60kg的健康成年豬(山東省基建股份有限公司華山管理站養(yǎng)豬場(chǎng))作為免疫動(dòng)物，于第1日、7日和14日分別進(jìn)行豬四肢、腋窩、腹股溝、國(guó)窩等處皮下多點(diǎn)注射免疫，于第20日給豬禁食，以防血脂過(guò)高；24h后取豬血，間接ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)，判定免疫效果；[3]對(duì)判定免疫成功的豬進(jìn)行解剖，獲得脾臟并去脂肪及包膜，用勻漿機(jī)20000rpm勻漿，點(diǎn)動(dòng)十次，然后用四層無(wú)菌紗布過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，并用紅細(xì)胞裂解液完全裂解紅細(xì)胞；對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，用超聲破碎白細(xì)胞至鏡檢完全裂解，并于4℃下將白細(xì)胞裂解液13000rpm離心15min，取上清，6000Da濾膜超濾，濾過(guò)液以0.22μm的微孔過(guò)濾器過(guò)濾除菌，即得甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子溶液，常規(guī)冷凍干燥后，備用。
甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子活性單位(U)是以1×108個(gè)白細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)移因子作為一個(gè)活性單位(U)。
實(shí)施例2 甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子靶向抑制甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)方法量效分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞Bel7402、HepG2、SK-Hep-1和正常肝細(xì)胞Changliver，0.25％胰蛋白酶消化，用DMEM完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cells/ml；取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4塊，每塊分別檢測(cè)Bel7402、HepG2、SK-Hep-1和Changliver的存活率。每孔加入不同的細(xì)胞懸液100μl，置于37℃，5％CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)，使細(xì)胞貼壁；向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入實(shí)施例1制備的不同濃度的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子，使其終濃度分別為0.005U/ml，0.01U/ml，0.02U/ml，0.04U/ml，0.06U/ml和0.08U/ml，每種濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)對(duì)照組(只加含有培養(yǎng)液的細(xì)胞)和空白對(duì)照(只加培養(yǎng)液)；置于37℃，5％CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)；吸出培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，振蕩溶解20分鐘，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定570nm的OD值。
用Excel軟件分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果0.005-0.08U/ml甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子分別作用于Bel7402細(xì)胞24小時(shí)，MTT檢測(cè)所得的OD值逐漸下降，計(jì)算所得的細(xì)胞存活率也從91.02％降低到24％；同樣濃度梯度的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子作用于HepG2細(xì)胞24h，細(xì)胞存活率由97.42％降低到42.14％；而當(dāng)濃度為0.005-0.08U/ml甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子分別作用于SK-Hep-1和Changliver細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率僅由98.82％降至78.78％(SK-Hep-1)以及97.36％降至82.14％(Changliver)(圖1)。
實(shí)施例3 甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子靶向誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)方法將長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的細(xì)胞(Bel7402、HepG2、SK-Hep-1和Changliver)用0.25％胰蛋白酶液消化，并制成細(xì)胞懸液；細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cell/ml；取0.5ml加入底部鋪有無(wú)菌蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞緊貼于蓋玻片生長(zhǎng)，即得到所需的細(xì)胞爬片。
Hochest 33258染色換加新的DMEM培養(yǎng)液，然后加入實(shí)施例1制備的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子使其終濃度至0.04U/ml，處理細(xì)胞24小時(shí)，然后收集細(xì)胞爬片，經(jīng)甲醇固定5分鐘，Hochest 33258染色液室溫避光染色15分鐘，將細(xì)胞懸液滴片，待完全干燥后用中性樹膠封片，置熒光顯微鏡下觀察。對(duì)照為正常生長(zhǎng)細(xì)胞的染色。
TUNEL染色換加新的DMEM培養(yǎng)液，然后加入實(shí)施例1制備的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子使其終濃度至0.04U/ml，處理細(xì)胞24小時(shí)，然后收集細(xì)胞爬片，經(jīng)甲醇固定5分鐘，PBS中洗兩次，每次5分鐘；浸在0.2％Triton X-100通透中5分鐘；PBS中洗兩次，每次5分鐘；加入100μl平衡液，室溫平衡5-10分鐘；將100μl TdT反應(yīng)混合液加到細(xì)胞爬片上，不能讓細(xì)胞完全干燥，蓋上另一個(gè)玻片保證反應(yīng)液分布均勻，放在37℃潮濕的溫箱中60分鐘；移去覆蓋的蓋玻片，浸到2×SSC中反應(yīng)15分鐘以終止反應(yīng)；PBS中洗三次，每次5分鐘；浸到0.3％H2O2中封閉3-5分鐘；PBS中洗三次，每次5分鐘；加100μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素(1∶500PBS稀釋)，室溫孵育30分鐘；PBS中洗三次，每次5分鐘；加入100μl DAB著色(用前準(zhǔn)備)，直到淺的褐色背景出現(xiàn)，不要讓背景變得很深；去離子水終止反應(yīng)并洗滌；中性樹膠封固爬片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光顯微鏡下觀察，甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理后，Bel7402和HepG2細(xì)胞體積縮小，核固縮，表現(xiàn)為濃染致密的顆粒塊狀熒光，有的可見核內(nèi)出現(xiàn)不連續(xù)的空洞；正常細(xì)胞的細(xì)胞核則表現(xiàn)為彌散均勻的熒光，細(xì)胞核體積大，呈現(xiàn)圓形或橢圓型。而甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理前后的SK-Hep-1和Changliver細(xì)胞均表現(xiàn)為比較彌散均勻的熒光(圖3)。光鏡下觀察，經(jīng)過(guò)甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理的Bel7402和HepG2細(xì)胞顯示出深棕色，即強(qiáng)烈的陽(yáng)性信號(hào)，表明細(xì)胞凋亡的發(fā)生；正常細(xì)胞的著色則要淺很多。而甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理前后的SK-Hep-1和Changliver細(xì)胞均表現(xiàn)為較淺的著色(圖4)。
實(shí)施例4 甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子作用于甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析實(shí)驗(yàn)方法收集實(shí)施例1中制備的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子，以0.04U/ml濃度處理Bel7402、HepG2、SK-Hep-1和Changliver各組細(xì)胞24小時(shí)，同時(shí)正常培養(yǎng)對(duì)照的各組細(xì)胞24小時(shí)，1000rpm離心5分鐘，去上清；PBS洗滌兩次，1000rpm離心5分鐘，去上清；70％預(yù)冷乙醇重懸細(xì)胞，固定，-20℃過(guò)夜；離心棄去固定液，PBS洗滌兩次；200目篩網(wǎng)過(guò)濾，1000rpm離心5分鐘，去上清；加入0.5ml PI染液，4℃避光染色30分鐘；PBS洗滌一次；收集106個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并利用Modifit-3 program進(jìn)行分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)及分析表明，0.04U/ml甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子處理Bel7402細(xì)胞24小時(shí)后，與正常生長(zhǎng)的Bel7402細(xì)胞相比，G0/G1期的細(xì)胞比例由46.38％上升至66.48％，G2/M期的細(xì)胞比例由0.80％上升至5.68％，而S期的細(xì)胞比例則由52.82％降至27.84％，細(xì)胞凋亡率由1.26％上升至28.41％；同樣條件處理的HepG2細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞比例由45.25％上升至60.29％，G2/M期的細(xì)胞比例由34.18％下降至16.41％，而S期的細(xì)胞比例則由20.58％上升至23.30％，細(xì)胞凋亡率由2.96％上升至19.54％。而對(duì)于SK-Hep-1和Changliver細(xì)胞，在同樣條件下各時(shí)期的細(xì)胞比例和細(xì)胞凋亡率都變化不大(圖5)。
上述實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞研究所之中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。
權(quán)利要求
1.甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子在制備誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，有效誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞凋亡、核片段化、DNA凝縮以及細(xì)胞周期阻滯的甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子的濃度范圍是0.02U/ml-0.06U/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子的應(yīng)用，尤其涉及甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子在制備靶向誘導(dǎo)人甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。所述甲胎蛋白特異性轉(zhuǎn)移因子在濃度為0.02U/ml－0.06U/ml時(shí)，能有效靶向誘導(dǎo)甲胎蛋白陽(yáng)性肝癌細(xì)胞凋亡、核片段化、DNA凝縮以及細(xì)胞周期阻滯，而對(duì)甲胎蛋白陰性的肝癌細(xì)胞以及正常肝細(xì)胞沒(méi)有明顯的作用。本發(fā)明為制備靶向誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的藥物和治療甲胎蛋白陽(yáng)性肝細(xì)胞癌提供了一條開發(fā)和應(yīng)用的途徑。
文檔編號(hào)A61P1/00GK101032622SQ20071001397
公開日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2007年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月9日
發(fā)明者白增亮, 張輝, 王澤 , 李娟 申請(qǐng)人:山東大學(xué)