專利名稱：淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素p450(cyp6f1)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種來自于淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性的細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因。
背景技術(shù)：
及

發(fā)明內(nèi)容
細(xì)胞色素P450單加氧酶是昆蟲體內(nèi)參與各類殺蟲劑以及其它外援性和內(nèi)源性化合物化代謝的主要解毒酶系。細(xì)胞色素P450(簡(jiǎn)稱CYP)是細(xì)胞色素P450單加氧酶系的末端氧化酶，起著與底物結(jié)合以及從NADPH傳遞電子到NADPH細(xì)胞色素P450還原酶的重要作用。細(xì)胞色素P450功能多樣，特別是能夠代謝目前廣泛使用的殺蟲劑如擬蟲菊酯類、氨基甲酸酯類等，其與昆蟲抗藥性形成機(jī)制的研究成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近些年來，隨著分子生物學(xué)及其技術(shù)的發(fā)展，克隆昆蟲P450基因、研究其系統(tǒng)進(jìn)化以及與抗藥性的關(guān)系越來越引起重視。昆蟲細(xì)胞色素P450與諸多殺蟲劑，尤其目前廣泛使用的擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性密切相關(guān)。目前，在眾多已知的昆蟲細(xì)胞色素P450家族中，被認(rèn)為與菊酯類殺蟲劑抗性關(guān)系最為密切的主要為CYP6家族基因。
本發(fā)明所述的淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因是發(fā)明人在山東省寄生蟲病防治研究所醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)研究室應(yīng)用兼并引物，以淡色庫(kù)蚊溴氰聚酯抗性品系提取的RNA為模板，降落RT-PCR技術(shù)克隆擴(kuò)增，并采用快速末端擴(kuò)增法克隆獲得。序列經(jīng)拼接獲得淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因cDNA全長(zhǎng)，為1639bp；其開放閱讀框?yàn)?527bp，編碼508個(gè)氨基酸。在NCBI網(wǎng)站上用BLAST完成序列同源性分析，表明其為新基因。經(jīng)半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)，該基因在淡色庫(kù)蚊溴氰聚酯抗性品系中高表達(dá)。因此，推測(cè)淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因可能與淡色庫(kù)紋溴氰聚酯抗性有關(guān)。
由于淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因在GenBank中為新基因，本發(fā)明人對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)和功能研究成果均為開創(chuàng)性的。美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)已正式接收該基因?yàn)镚enBank的新成員，接收號(hào)為AY662654。
淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因序列1639bp1 cttatgtttg cgtggataat ctgcgctgcg gcagcagttc cgctggtgta cttcctgatc61 gtgtaccagt tcagctactg gaaacgtcgt gggatcacac aactcactcc atcattccca121 tttggagatc ttggaccgtt ctttcggcaa cggtccagcc tcggagtggt ctacgccgat181 gtgtaccggc tgtgcaagcg cctacccttt gtggggatct acttttcctt gcggccaatg241 ctggtggtca acgaccccga gttgattaaa aatgtgcttg tgcgtgattt tgaccacttt301 cacgatcgtg gactgtacgt gaacgaggag aaggacccac tcagtgggca tttgtttgca361 ctcggtggcg aacagtggcg ccatcatcgg tccaagctaa cgccaacgtt cacctcggga421 aggttgaagg agatgttcac gaacttggtc caaattgggc gtgttctcca agatcacgtg481 gcgaaacgtg ctggggagga catcgaaatt cgggacgtga tggcgcggta cactaccgat541 atcattgcat cggttggatt cggaatcgaa aatgactcca tcaacgaaaa gggcaacatt601 ttcagggaaa tgggaacgaa ggtgttctct cctgatctta agacgatact tcgattgacg661 agcacatttt tcactccaaa gctgaacgca ctgtttggat tcaaatttat cgcacaggag721 attgaagact tcatcatgaa cgttgtacgt gaaaccctgg agtacagaga aagcaacaaa781 gtcgtccgga aggatatgat gcagctgctc atgcagctac gtaactccgg aacggtttcg841 atcgacgatc gatgggacat cgaagtgtca accaacaaga aaaagctgtc cctggaacaa901 gtcacagcac acgcgttcgt attcttcata gcagcatacg aaacatcatc gaccaccatt961 tcgttctgct tgttcgaact ggcacgcaat ccggagattc aaaagaaagt gcaacaagaa1021 attgaccaag ttctcgcaag ccacaacggc gaaatcacct acgacaacat caacgaaatg1081 aaatacctcg aaaactgcat cgacgaaacg ctccgaaagt atccggcagt tccgttcctg1141 aaccgtgagt gttctaagga ttacaaaatc cccggaacag acaccaccat cgagaaagga1201 acatcgttag tcattccagt cctcggacta caccgcgatc ccgatcacta cccggaaccg1261 gacaggttca ttccggaacg gttcagcaac tttgaagata tttccaccaa accgtatctt1321 ccgtttgggg caggacctcg caactgtatt ggactgagat tgggcaagct gcaaacaaag1381 gcgggactgg tgatgatgct gtccaagttt aacgtgcggc ttgctgatga aacttacgcc1441 agcaaagagc tagcgctcga tgcgcgaagt gtggttctaa tgccggttgg aggtattaag1501 gtgtcgattt cggaacggag ggcttcgtaa tacaaattga agtgactcgt aatataatac1561 ttaaatatca caataaatga taccaaaata aactatttaa tgaacaaaaa aaaaaaaggt1621 ccggtacctc tagatcaga 1639
淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)氨基酸序列508aaMFAWIICAAAAVPLVYFLIVYQFSYWKRRGITQLTPSFPFGDLGPFFRQRSSLGVVYADVYRLCKRLPFVGIYFSLRPMLVVNDPELIKNVLVRDFDHFHDRGLYVNEEKDPLSGHLFALGGEQWRHHRSKLTPTFTSGRLKEMFTNLVQIGRVLQDHVAKRAGEDIEIRDVMARYTTDIIASVGFGIENDSINEKGNIFREMGTKVFSPDLKTILRLTSTFFTPKLNALFGFKFIAQEIEDFIMNVVRETLEYRESNKVVRKDMMQLLMQLRNSGTVSIDDRWDIEVSTNKKKLSLEQVTAHAFVFFIAAYETSSTTISFCLFELARNPEIQKKVQQEIDQVLASHNGEITYDNINEMKYLENCIDETLRKYPAVPFLNRECSKDYKIPGTDTTIEKGTSLVIPVLGLHRDPDHYPEPDRFIPERFSNFEDISTKPYLPFGAGPRNCIGLRLGKLQTKAGLVMMLSKFNVRLADETYASKELALDARSVVLMPVGGIKVSISERRAS淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的全新基因，目前人類對(duì)于此基因的認(rèn)識(shí)和了解僅限于本發(fā)明人所做的研究工作。由于該基因在淡色庫(kù)蚊溴氰聚酯抗性品系中高表達(dá)，因此該基因很可能與淡色庫(kù)蚊溴氰聚酯抗性發(fā)生密切有關(guān)，其表達(dá)量的上調(diào)可能引起抗藥性。該基因可用于1、通過制備該基因的融合蛋白，研究該基因與抗藥性的關(guān)系，為昆蟲抗藥性的治理提供新的思路。
2、制備特異性抗體，用于現(xiàn)場(chǎng)蚊蟲抗藥性的監(jiān)測(cè)。目前，現(xiàn)場(chǎng)蚊蟲抗藥性的監(jiān)測(cè)尚無行之有效的方法，可用該基因表達(dá)蛋白制備特異性抗體，然后制成檢測(cè)試劑盒，可大大簡(jiǎn)化操作步驟，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、省時(shí)省力。
具體實(shí)施例方式淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因片斷的克隆淡色庫(kù)蚊敏感品系引自中國(guó)科學(xué)院上海昆蟲研究所，并在本室經(jīng)傳60余代；抗性品系由本室逐代用溴氰菊酯汰選而成，抗性系數(shù)617。蚊蟲飼養(yǎng)在28℃，相對(duì)濕度為70％-80％的室內(nèi)，14h光照時(shí)間，并用小白鼠飼喂產(chǎn)卵傳代。
根據(jù)GenBank登錄的昆蟲CYP6家族的已知基因序列，包括果蠅、岡比亞按蚊、埃及伊蚊、致倦庫(kù)蚊等CYP6基因，設(shè)計(jì)兼并引物。以淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性品系蚊蟲所提的總RNA為模板，用兩步法RT-PCR克隆擴(kuò)增，第一鏈的合成后，用降落PCR克隆擴(kuò)增基因序列。PCR結(jié)果經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，120V，30min后，用QIAquick Gel Extraction Kit割膠純化。純化產(chǎn)物加A尾，將之插入pGEM-T easy載體，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取培養(yǎng)板上的白斑，于含有抗生素Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm，37℃培養(yǎng)過夜。以菌液為模板，用通用引物及特異性引物PCR方法初步鑒定，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
1、RACE法獲得淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因根據(jù)測(cè)序獲得的基因序列，利用Primer premier軟件設(shè)計(jì)3’RACE和5’RACE引物用于擴(kuò)增3’和5’端序列。
3’RACE引物5’-TGACCAAGTTCTCGCAAGCC-3’5’RACE引物5’-AGTATCCGGCAGTTCCGTTCC-3’以淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性品系蚊蟲所提的總RNA為模板，用兩步法RT-PCR克隆擴(kuò)增，第一鏈的合成后，用降落PCR克隆擴(kuò)增基因序列。PCR結(jié)果經(jīng)電泳鑒定、割膠純化后加A尾后，插入pGEM-T easy載體進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。將3’RACE和5’RACE獲得的序列和RT-PCR獲得的序列進(jìn)行拼接，得到基因全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因全長(zhǎng)引物，以總RNA為模板RT-PCR，擴(kuò)增出1700bp的條帶，和預(yù)期的目的條帶(1639bp)大小相符，說明目的基因拼接正確。淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因全長(zhǎng)序列(GenBank/NCBI AY662654)，總長(zhǎng)度為1639bp；開放閱讀框?yàn)?527bp，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)編碼508個(gè)氨基酸。
2、半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR)鑒定細(xì)胞色素P450(CYP6F1基因在溴氰菊酯抗性品系和敏感品系的表達(dá)差異(1)半定量PCR測(cè)定蚊抗性、敏感品系CYP6F1的表達(dá)分別取30mg淡色庫(kù)蚊對(duì)溴氰菊酯抗性、敏感品系蚊蟲蟲，提取總RNA。電泳鑒定、定量測(cè)定后，稀釋至相同濃度(0.5μg/μl)，RT-PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)確定PCR指數(shù)擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)為25個(gè)循環(huán)。各取5μl擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，以1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Gel-Pro Analyzer軟件定量分析，每次PCR反應(yīng)均以β-actin作為對(duì)照，通過目的基因和管家基因β-actin電泳條帶的光吸收灰度比值來衡量目的基因的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示，敏感品系的CYP6F1/β-actin灰度比值1.0；抗性品系的CYP6F1/β-actin灰度比值為1.6，提示抗性品系的CYP6F1基因的表達(dá)高于敏感品系。
(2)實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定蚊蟲抗性、敏感品系CYP6F1的表達(dá)根據(jù)擴(kuò)增的基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR的引物
CYP6F1上游引物5’-GGCGAAATCACCTACGACAAC-3’下游引物5’-TCCGAGGACTGGAATGACTAAC-3’β-actin作為內(nèi)參照基因，引物如下β-actin上游引物5’-AGCGTGAACTGACGGCTCTTG-3’下游引物5’-ACTCGTCGTACTCCTGCTTGG-3’制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋DNA模板針對(duì)需要測(cè)量的目的基因和管家基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋，設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1，分別稀釋為1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6梯度濃度的DNA，每一濃度取1μl作為模板進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增。以模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，測(cè)得各自的Ct值為縱坐標(biāo)作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)幾個(gè)梯度稀釋的DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)液置于實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為50℃、2min，95℃、10min，然后再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃、15s，60℃、1min。
根據(jù)梯度稀釋DNA分別進(jìn)行目的基因和管家基因定量PCR反應(yīng)，得出各自的Ct值，再以Ct值為縱坐標(biāo)，拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，算得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝-3.666x+6.216，R2＝0.99976，表明反應(yīng)體系狀態(tài)良好，具有可重復(fù)性。樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機(jī)器生成。每個(gè)樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對(duì)含量。經(jīng)計(jì)算獲知抗性品系細(xì)胞色素P450(CYP6F1)表達(dá)是敏感品系的1.93倍，提示抗性品系的CYP6F1基因的表達(dá)高于敏感品系，即CYP6F1基因在溴氰菊酯抗性品系蚊蟲中表達(dá)增加。
盡管從原核生物到真核生物，全球科學(xué)家已就多種物種的細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因進(jìn)行了研究，但這是首次獲得的在淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性品系高表達(dá)的細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因，這對(duì)進(jìn)一步研究昆蟲抗藥性機(jī)制及其治理具有重要意義。
序列表淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因序列1639bp1 cttatgtttg cgtggataat ctgcgctgcg gcagcagttc cgctggtgta cttcctgatc61 gtgtaccagt tcagctactg gaaacgtcgt gggatcacac aactcactcc atcattccca121 tttggagatc ttggaccgtt ctttcggcaa cggtccagcc tcggagtggt ctacgccgat181 gtgtaccggc tgtgcaagcg cctacccttt gtggggatct acttttcctt gcggccaatg241 ctggtggtca acgaccccga gttgattaaa aatgtgcttg tgcgtgattt tgaccacttt301 cacgatcgtg gactgtacgt gaacgaggag aaggacccac tcagtgggca tttgtttgca361 ctcggtggcg aacagtggcg ccatcatcgg tccaagctaa cgccaacgtt cacctcggga421 aggttgaagg agatgttcac gaacttggtc caaattgggc gtgttctcca agatcacgtg481 gcgaaacgtg ctggggagga catcgaaatt cgggacgtga tggcgcggta cactaccgat541 atcattgcat cggttggatt cggaatcgaa aatgactcca tcaacgaaaa gggcaacatt601 ttcagggaaa tgggaacgaa ggtgttctct cctgatctta agacgatact tcgattgacg661 agcacatttt tcactccaaa gctgaacgca ctgtttggat tcaaatttat cgcacaggag721 attgaagact tcatcatgaa cgttgtacgt gaaaccctgg agtacagaga aagcaacaaa781 gtcgtccgga aggatatgat gcagctgctc atgcagctac gtaactccgg aacggtttcg841 atcgacgatc gatgggacat cgaagtgtca accaacaaga aaaagctgtc cctggaacaa901 gtcacagcac acgcgttcgt attcttcata gcagcatacg aaacatcatc gaccaccatt961 tcgttctgct tgttcgaact ggcacgcaat ccggagattc aaaagaaagt gcaacaagaa1021 attgaccaag ttctcgcaag ccacaacggc gaaatcacct acgacaacat caacgaaatg1081 aaatacctcg aaaactgcat cgacgaaacg ctccgaaagt atccggcagt tccgttcctg1141 aaccgtgagt gttctaagga ttacaaaatc cccggaacag acaccaccat cgagaaagga1201 acatcgttag tcattccagt cctcggacta caccgcgatc ccgatcacta cccggaaccg1261 gacaggttca ttccggaacg gttcagcaac tttgaagata tttccaccaa accgtatctt1321 ccgtttgggg caggacctcg caactgtatt ggactgagat tgggcaagct gcaaacaaag1381 gcgggactgg tgatgatgct gtccaagttt aacgtgcggc ttgctgatga aacttacgcc1441 agcaaagagc tagcgctcga tgcgcgaagt gtggttctaa tgccggttgg aggtattaag1501 gtgtcgattt cggaacggag ggcttcgtaa tacaaattga agtgactcgt aatataatac1561 ttaaatatca caataaatga taccaaaata aactatttaa tgaacaaaaa aaaaaaaggt1621 ccggtacctc tagatcaga 1639
淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)氨基酸序列508aaMFAWIICAAAAVPLVYFLIVYQFSYWKRRGITQLTPSFPFGDLGPFFRQRSSLGVVYADVYRLCKRLPFVGIYFSLRPMLVVNDPELIKNVLVRDFDHFHDRGLYVNEEKDPLSGHLFALGGEQWRHHRSKLTPTFTSGRLKEMFTNLVQIGRVLQDHVAKRAGEDIEIRDVMARYTTDIIASVGFGIENDSINEKGNIFREMGTKVFSPDLKTILRLTSTFFTPKLNALFGFKFIAQEIEDFIMNVVRETLEYRESNKVVRKDMMQLLMQLRNSGTVSIDDRWDIEVSTNKKKLSLEQVTAHAFVFFIAAYETSSTTISFCLFELARNPEIQKKVQQEIDQVLASHNGEITYDNINEMKYLENCIDETLRKYPAVPFLNRECSKDYKIPGTDTTIEKGTSLVIPVLGLHRDPDHYPEPDRFIPERFSNFEDISTKPYLPFGAGPRNCIGLRLGKLQTKAGLVMMLSKFNVRLADETYASKELALDARSVVLMPVGGIKVSISERRAS。
權(quán)利要求
1.一種淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因，其特征是淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因，氨基酸序列為MFAWIICAAAAVPLVYFLIVYQFSYWKRRGITQLTPSFPFGDLGPFFRQRSSLGVVYADVYRLCKRLPFVGIYFSLRPMLVVNDPELIKNVLVRDFDHFHDRGLYVNEEKDPLSGHLFALGGEQWRHHRSKLTPTFTSGRLKEMFTNLVQIGRVLQDHVAKRAGEDIEIRDVMARYTTDIIASVGFGIENDSINEKGNIFREMGTKVFSPDLKTILRLTSTFFTPKLNALFGFKFIAQEIEDFIMNVVRETLEYRESNKVVRKDMMQLLMQLRNSGTVSIDDRWDIEVSTNKKKLSLEQVTAHAFVFFIAAYETSSTTISFCLFELARNPEIQKKVQQEIDQVLASHNGEITYDNINEMKYLENCIDETLRKYPAVPFLNRECSKDYKIPGTDTTIEKGTSLVIPVLGLHRDPDHYPEPDRFIPERFSNFEDISTKPYLPFGAGPRNCIGLRLGKLQTKAGLVMMLSKFNVRLADETYASKELALDARSVVLMPVGGIKVSISERRAS
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因，其特征是應(yīng)用兼并引物，以淡色庫(kù)蚊溴氰聚酯抗性品系蚊蟲提取的RNA為模板，降落RT-PCR技術(shù)克隆擴(kuò)增，并采用快速末端擴(kuò)增法克隆獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因制備的融合蛋白，其特征是融合蛋白可用作制備治理昆蟲抗藥性的有關(guān)藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因制備的特異性抗體，其特征是可用該抗體制成試劑盒，用于現(xiàn)場(chǎng)蚊蟲抗藥性的監(jiān)測(cè)和蚊蟲抗藥性機(jī)理的研究。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，所述淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450(CYP6F1)基因(Culex pipiens pallens CYP6F1)，基因全長(zhǎng)為1639bp，其開放閱讀框?yàn)?527bp，編碼508個(gè)氨基酸。該基因在GenBank中的編號(hào)為AY662654。本發(fā)明以淡色庫(kù)蚊溴氰聚酯抗性品系蚊蟲提取的RNA為模板，應(yīng)用降落RT－PCR技術(shù)克隆擴(kuò)增，并采用快速末端擴(kuò)增法(rapid amplification cDNA ends，RACE)克隆獲得。利用該基因制備融合蛋白及特異性抗體，用于制備與抗藥性治理有關(guān)的藥物及試劑盒。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101078014SQ20071001418
公開日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2007年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月14日
發(fā)明者公茂慶, 鄧緒禮, 閆歌, 劉波, 寇景軒, 王懷位, 程鵬, 朱昌亮 申請(qǐng)人:山東省寄生蟲病防治研究所