專利名稱：參芪復(fù)方中藥成分免疫增強劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種新型參芪復(fù)方中藥成分免疫增強劑，簡稱為參芪增免劑，屬于增強畜禽免疫功能的新型免疫增強劑或提高動物傳染病疫苗免疫效果的新型免疫佐劑。
二、技術(shù)背景畜禽傳染病一直是危害畜牧業(yè)發(fā)展的首要問題，尤其是當前流行的重大病毒性傳染病，迄今尚無有效的治療方法，疫苗預(yù)防仍是最主要的措施。由于種種原因，多數(shù)疫苗只有與免疫增強劑或免疫佐劑配合應(yīng)用才能發(fā)揮良好的防疫效果。但是，目前國內(nèi)外廣泛使用的油乳類、鋁膠類等化學性免疫佐劑常有副作用大、局部刺激強、致癌、制備和使用麻煩或不能足夠提高弱抗原的免疫原性等弊端。因此，研制高效、低毒的新型免疫增強劑已成為亟待解決的問題。研究表明，許多中藥具有免疫增強作用，具備高效、低毒的優(yōu)勢，然而由于中藥的傳統(tǒng)組方多為大復(fù)方，傳統(tǒng)劑型多為湯劑、散劑，給藥不便；而且由于其所含成分復(fù)雜，很難控制質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明針對當前動物疫病防制現(xiàn)有技術(shù)中急需高效、低毒免疫增強劑或免疫佐劑的問題，提供一種新型復(fù)方中藥成分免疫增強劑，具備安全、高效、質(zhì)量可控等優(yōu)點。
技術(shù)方案本發(fā)明一種新型參芪復(fù)方中藥成分免疫增強劑，簡稱為參芪增免劑，其特征在于，每1000ml藥液含人參皂苷0.75g，黃芪多糖3.0g，其余為注射用水。
生產(chǎn)每1000ml藥液的工藝流程為人參皂苷購自制藥廠，用TLC分光光度法測定含量；黃芪多糖用水煎醇沉法提取，用硫酸-蒽酮法測定含量；然后按凈含量取處方量中藥成分加注射用水溶解，精濾，分裝，高壓滅菌。
有益效果本發(fā)明首先選擇文獻報道有較好的增強免疫作用的黃芪多糖(APS)、淫羊藿多糖(EPS)、蜂膠多糖(PPS)、蜂膠黃酮(PF)、人參皂苷(GS)等10種中藥成分為研究對象，分別提取制備、測定含量，用細胞培養(yǎng)、PCR和動物試驗法比較它們的增強免疫作用和量效關(guān)系，篩選出5種作用較好的中藥成分及其最佳劑量。以5種中藥成分分別組成多個復(fù)方，通過系列動物試驗篩選出效果較好的2個中藥成分復(fù)方(方2為參芪增免劑)及其最佳劑量，并與目前常用的油佐劑進行比較。結(jié)果表明，參芪增免劑的增強免疫效果較好，與油佐劑的效果相當，在某些時間點甚至顯著強于油佐劑(表1～表5，圖1)。
進一步研究了參芪增免劑增強免疫的機理，測定該方對雛雞外周血T淋巴細胞IL-2mRNA和IFN-γmRNA表達的影響。結(jié)果表明，參芪增免劑的高劑量能顯著提高IL-2mRNA的表達，高、中、低3個劑量均能顯著提高IFN-γmRNA的表達(圖2～圖3)。
通過臨床試驗比較了參芪增免劑與相應(yīng)的中藥復(fù)方的免疫增強效果。結(jié)果表明，參芪增免劑與相應(yīng)的中藥復(fù)方均能顯著促進雛雞淋巴細胞增殖和提高血清抗體效價，效果與油佐劑相當，但參芪增免劑的效果稍優(yōu)于相應(yīng)的中藥復(fù)方(表6～表7)。
同時測定了參芪增免劑的安全性，證明參芪增免劑對家兔眼結(jié)膜和局部肌肉無任何刺激性，LD50大于5000mg/kg、無毒性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點如下1.與同類化學佐劑相比，參芪增免劑不僅效果可靠，而且來源于天然中藥，無毒副作用，無藥殘隱患，符合綠色藥品要求，保障動物源食品安全；生產(chǎn)無三廢，對環(huán)境無污染，符合綠色環(huán)保的要求。
2.與傳統(tǒng)的中藥方劑相比，參芪增免劑處方精練，劑型先進，質(zhì)量提高，給藥方便。
3.與相應(yīng)的中藥復(fù)方相比，該方劑功效提高，成分明確，質(zhì)量可控。本發(fā)明作為免疫增強劑單用能顯著提高畜禽的細胞免疫和體液免疫功能，顯著促進外周血T淋巴細胞轉(zhuǎn)化、提高血清抗體效價和免疫器官指數(shù)；作為免疫佐劑與疫苗同用具有較好的增強免疫效果，與油佐劑的效果相當，在某些時間點甚至顯著強于油佐劑，而且也優(yōu)于相應(yīng)的中藥復(fù)方；藥理試驗證明，該制劑能顯著促進淋巴細胞增殖，提高雞外周血中IL-2mRNA和IFN-γmRNA的表達。
四

圖1.參芪增免劑配合兔瘟疫苗免疫家兔血清抗體效價的動態(tài)變化。參芪增免劑組在免疫后第3～21天的抗體效價均高于對照組、在免疫后第17天的抗體效價顯著高于對照組；在免疫后第3、10、17天的抗體效價稍高于淫蜂增免劑組。
圖2.參芪增免劑影響T淋巴細胞IL-2mRNA表達的RT-PCR電泳圖(a)和統(tǒng)計結(jié)果(b)。參芪增免劑高劑量(cCHMIs2H)能顯著提高淋巴細胞IL-2mRNA的表達。
圖3.參芪增免劑影響T淋巴細胞IFN-γmRNA表達的RT-PCR電泳圖(a)和統(tǒng)計結(jié)果(b)。參芪增免劑的3個劑量(cCHMIs2H、cCHMIs2M、cCHMIs2L)均能顯著提高淋巴細胞IFN-γmRNA的表達。
五具體實施例方式
(一)方劑的篩選和藥效藥理學研究1.雛雞免疫試驗(1)方劑篩選及其與白介素-2免疫協(xié)同作用的比較將通過系列試驗篩選出的黃芪多糖、當歸多糖、淫羊藿多糖、蜂膠黃酮和人參皂苷分別組成的多個復(fù)方，單獨或與白介素-2配合注射13日齡雛雞，連續(xù)3天，在末次注射的同時用ND-IV系苗免疫，分別在免疫后第7、14、21、28天每組隨機抽取10只翼下靜脈采血，檢測ND-HI抗體效價的動態(tài)變化。結(jié)果表明，復(fù)方中藥成分增強免疫作用的效果強于單味中藥成分，APS-GS(參芪增免劑)和EPS-PF(淫蜂增免劑)的作用較好，可作為新型免疫增強劑的候選方(表1)。
表1中藥成分不同組合及其與白介素-2合用對雞血清ND-HI抗體效價的影響(Log2)


(2)功效驗證及其量效關(guān)系的比較試驗1將參芪增免劑(方2)和淫蜂增免劑(方1)分3種劑量配合ND疫苗免疫雛雞，以另2個中藥成分復(fù)方(方3，2味組合；方4，3味組合)和純疫苗為對照，測定血清中ND-HI抗體效價的動態(tài)變化。試驗2將方1、方2的3個劑量分別降低一半配合ND滅活苗免疫雛雞，以油佐劑苗及蜂膠佐劑苗為對照，測定血清抗體效價和免疫器官指數(shù)的動態(tài)變化。結(jié)果證實，參芪增免劑的效果確實，與油佐劑的效果相當，優(yōu)于蜂膠佐劑，低劑量的效果最好(表2～表3)。
表2試驗1各組血清ND-HI抗體效價的動態(tài)變化(Log2)

表3試驗2各組血清ND-HI抗體效價的動態(tài)變化(Log2)

為了進一步篩選最佳劑量，試驗3將方2、方1的3個劑量再分別降低一半，與新城疫疫苗病毒混合制成中藥佐劑苗免疫雛雞，以無佐劑苗和油佐劑苗為對照，于免疫后第7、14、21、28、35、42d采血，分別用MTT法和微量法測定外周血T淋巴細胞轉(zhuǎn)化和血清ND-HI抗體效價的動態(tài)變化；同時測定2個復(fù)方對培養(yǎng)的雞脾淋巴細胞增殖的影響。結(jié)果表明，參芪增免劑能顯著促進外周血T淋巴細胞轉(zhuǎn)化、提高血清抗體效價，在多數(shù)時間點與油佐劑的效果相當，中劑量(原低劑量)的效果最好，在某些時間點顯著強于油佐劑；在一定的濃度顯著促進脾淋巴細胞增殖(表4～表5)。
表4外周血T淋巴細胞轉(zhuǎn)化的變化(OD570)

表5血清ND-HI抗體效價的動態(tài)變化

2.家兔免疫試驗用參芪增免劑和淫蜂增免劑分別配合兔瘟滅活苗免疫家兔，對照組為生理鹽水，于免疫后第3、7、10、14、21、28、35、42天用血凝抑制試驗法測定血清抗體效價的動態(tài)變化。結(jié)果表明，參芪增免劑和淫蜂增免劑均能顯著提高家兔的血清抗體效價，參芪增免劑在免疫后某些時間點、尤其是早期的效果優(yōu)于淫蜂增免劑(圖1)。
3.復(fù)方增強T淋巴細胞IL-2mRNA表達的比較為了研究復(fù)方中藥成分增強免疫的機理，從ConA刺激的雞外周血淋巴細胞提取總RNA，擴增出469bp的IL-2基因片段，然后采用半定量RT-PCR方法測定了參芪增免劑和淫蜂增免劑對雞外周血T淋巴細胞IL-2mRNA表達水平的影響。結(jié)果表明，參芪增免劑高劑量能顯著提高淋巴細胞IL-2mRNA的表達水平(圖2)。
4.復(fù)方增強T淋巴細胞IFN-γmRNA表達的比較為了研究復(fù)方中藥成分增強免疫的機理，應(yīng)用Primer Premier軟件設(shè)計了一對干擾素-γ引物，從ConA刺激的雞外周血淋巴細胞總RNA中擴增出510bp的IFN-γ基因片段，然后采用半定量PCR法測定了參芪增免劑和淫蜂增免劑對雞外周血淋巴細胞IFN-γmRNA表達水平的影響。結(jié)果表明，參芪增免劑的3個劑量均能顯著提高淋巴細胞IFN-γmRNA的表達水平(圖3)。
(二)與相應(yīng)的中藥復(fù)方增強免疫效果的比較分別用淫羊藿多糖(EPS)加蜂膠黃酮(PF)、人參皂甙(GS)加黃芪多糖(APS)制成2個中藥成分復(fù)方(cCHMI1，cCHMI2)，同時用相應(yīng)的淫羊藿加蜂膠、人參加黃芪的提取物制成相應(yīng)成分含量相同的2個中藥復(fù)方(cCHM1，cCHM2)。將4個復(fù)方分別與滅活的新城疫強毒混合制成疫苗免疫雛雞，以油佐劑苗(OA)和無佐劑苗(NA)為對照，分別于免疫后第7、14、21、28、35、42天用MTT法和血凝抑制試驗法檢測外周血淋巴細胞增殖和血清抗體效價的動態(tài)變化。結(jié)果表明，4個復(fù)方均能顯著促進雛雞淋巴細胞增殖和提高血清抗體效價，效果與油佐劑相當，但中藥成分復(fù)方的效果稍優(yōu)于中藥復(fù)方(表6～表7)。
表6雞淋巴細胞增殖的動態(tài)變化

表7.雞血清抗體效價的動態(tài)變化

(三)安全性研究用家兔點眼法和股四頭肌注射法測定了參芪增免劑的局部刺激性，用小鼠腹腔注射法測定了參芪增免劑的急性毒性，結(jié)果表明，參芪增免劑對家兔眼結(jié)膜和局部肌肉無任何刺激性，LD50為8435.29±1379.28mg/kg，根據(jù)文獻，5000mg/kg以上為實際無毒，因此該制劑對動物無毒性。
實施例1000ml參芪復(fù)方中藥成分免疫增強劑藥液人參皂苷購自吉林亞威制藥廠，用TLC分光光度法(劉儉健等.黃芪注射液中黃芪總皂苷的含量測定.上海中醫(yī)，1997，733～34)測定含量；黃芪多糖用水提醇沉法(劉小平等.黃芪多糖口服液的研究.中藥材，1994，17(6)40～43)提取，用硫酸-蒽酮法(趙文等.伊犁黃芪和蒙古黃芪成分的比較及多糖含量的測定.中草藥，2001，32(2)122～124)測定含量；然后按凈含量取人參皂苷0.75g，黃芪多糖3.0g分加注射用水溶解，精濾，分裝，高壓滅菌，獲得。
試驗證明，參芪增免劑作為免疫增強劑單獨應(yīng)用，能顯著促進淋巴細胞增殖，顯著提高雞外周血T淋巴細胞IL-2mRNA和IFN-γmRNA的表達；作為免疫佐劑配合兔瘟疫苗免疫家兔，在免疫后第3～21天的抗體效價均高于、免疫后第17天的抗體效價顯著高于不用佐劑的對照組；與新城疫疫苗病毒混合制成中藥佐劑苗免疫雛雞，以無佐劑苗和油佐劑苗為對照，能顯著促進雛雞外周血T淋巴細胞轉(zhuǎn)化、提高血清抗體效價，在多數(shù)時間點與油佐劑組的效果相當，在某些時間點的抗體效價顯著高于油佐劑組，也優(yōu)于用人參和黃芪制成的中藥復(fù)方。
權(quán)利要求
1.一種參芪復(fù)方中藥成分免疫增強劑，簡稱為參芪增免劑，其特征在于，每1000ml藥液含人參皂苷0.75g，黃芪多糖3.0g，其余為注射用水。
2.權(quán)利要求1所述參芪復(fù)方中藥成分免疫增強劑的制備方法，其特征在于，人參皂苷購自制藥廠，用TLC分光光度法測定含量；黃芪多糖用水提醇沉法提取，用硫酸-蒽酮法測定含量；然后按凈含量取權(quán)利要求1所述的處方量中藥成分加注射用水溶解，精濾，分裝，高壓滅菌，獲得。
全文摘要
本發(fā)明為一種新型參芪復(fù)方中藥成分免疫增強劑，簡稱為參芪增免劑，屬于增強畜禽免疫功能的新型免疫增強劑。每1000ml藥液含人參皂苷0.75g，黃芪多糖3.0g，其余為注射用水。臨床試驗證明，該制劑作為免疫增強劑單用能顯著提高畜禽的細胞免疫和體液免疫功能，作為免疫佐劑與疫苗同用有較好的增強免疫效果，與油佐劑的效果相當，在某些時間點甚至顯著強于油佐劑，而且也優(yōu)于相應(yīng)的中藥復(fù)方。藥理試驗證明，該制劑能顯著促進淋巴細胞增殖，顯著提高雞外周血T淋巴細胞IL－2mRNA和IFN－γmRNA的表達。安全試驗證明，該藥對動物無刺激性、無毒性。因此，參芪增免劑具有高效、安全、質(zhì)量可控等優(yōu)點。
文檔編號A61P37/04GK101019885SQ20071001934
公開日2007年8月22日 申請日期2007年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月17日
發(fā)明者胡元亮, 王德云, 張寶康, 孔祥峰, 孫峻嶺, 李祥瑞, 劉家國 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學