專利名稱：：人工肝生物反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種以納米纖維支架材料作為肝細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的用于生物人工肝的生物反應(yīng)器，屬于人工肝支持系統(tǒng)的
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：人工肝作為肝功能不全、肝衰竭或相關(guān)疾病的有效輔助治療技術(shù)已在臨床中廣泛應(yīng)用，現(xiàn)在臨床上應(yīng)用的人工肝主要包括三類非生物型人工肝、生物型人工肝、混合型人工肝。其中生物型人工肝在治療肝病病人的臨床應(yīng)用中療效最為顯著，生物型人工肝一般專指人工培養(yǎng)的肝細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)件的體外生物反應(yīng)系統(tǒng)。它不僅具有肝臟的特異性解毒功能，而且具有更高的效能，如參與能量代謝，具有生物合成轉(zhuǎn)化功能，分泌促肝細(xì)胞生長活性物質(zhì)等。生物型人工肝具有自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)單、安全可靠的特點(diǎn)。其治療重型肝炎的臨床結(jié)果顯示，顯效率為36.7％，有效率為46.7％，總有效率為83.3％。目前應(yīng)用于臨床的生物型人工肝在細(xì)胞培養(yǎng)方面存在很多問題，諸如生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的肝細(xì)胞密度過低達(dá)不到人體所需的2～3×1010cells/m2，肝細(xì)胞容易從培養(yǎng)基質(zhì)上脫落從而造成肝細(xì)胞隨循環(huán)的培養(yǎng)液流走和在生物反應(yīng)器內(nèi)分布不均勻造成人工肝功能下降，以及培養(yǎng)液中氧氣供量不足造成的肝細(xì)胞死亡等等。未來生物型人工肝主要在肝細(xì)胞的培養(yǎng)以及肝細(xì)胞的優(yōu)化方面進(jìn)行改進(jìn)(Jung-KeugPark，Doo-HoonLee.BioartificialLiverSystemsCurrentStatusandFuturePerspective.JournalofBioscienceandBioengineering2005.99(4)311-319.)。納米纖維支架是近年來興起的一種細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，具有巨大的比表面積(孔隙率＞85％)以及10nm～10μm的纖維直徑，其紡織狀的形貌結(jié)構(gòu)類似于脊椎動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞生長基質(zhì)-蛋白纖維，有利于細(xì)胞的黏附、生長以及繁殖。有資料表明這種納米纖維支架有利于肝細(xì)胞球狀體的形成以及球狀體生物活性的保持，培養(yǎng)在納米纖維支架上的肝細(xì)胞其合成自蛋白、尿素的能力均大于利用傳統(tǒng)模式培養(yǎng)的肝細(xì)胞(Kian-NgiapChua，Wei-SengLima.Stableimmobilizationofrathepatocytespheroidsongalactosylatednanofiberscaffold.Biomaterials2005.262537-2547)?，F(xiàn)行生物型人工肝的肝細(xì)胞密度一般在5～8×108cells/m2之間，與人肝的肝細(xì)胞密度2～3×1010cells/m2尚有很大差距，因此，現(xiàn)行人工肝不能滿足一個(gè)成人的血液凈化需求。并且現(xiàn)行生物型人工肝的肝細(xì)胞球狀體隨著培養(yǎng)液的流動(dòng)易從細(xì)胞基質(zhì)上脫落，造成肝細(xì)胞的分布不均勻和肝細(xì)胞數(shù)量的減少。肝細(xì)胞對(duì)氧氣的需求量很大，但現(xiàn)有的生物人工肝均有氧氣提供不足的缺點(diǎn)，造成肝細(xì)胞的生物活性降低甚至死亡。以上原因嚴(yán)重影響人工肝的臨床效能。目前還沒有檢索到關(guān)于利用納米纖維支架對(duì)人工肝生物反應(yīng)器進(jìn)行改進(jìn)的報(bào)道或?qū)＠?br/>發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明目的在于提供一種利于提高肝細(xì)胞濃度和固定化肝細(xì)胞的人工肝生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)了生物反應(yīng)器內(nèi)肝細(xì)胞的黏附生長，不僅可以避免傳統(tǒng)人工肝的肝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所帶來的細(xì)胞流失問題，而且納米纖維無紡布的類生物體蛋白纖維的結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)肝細(xì)胞的繁殖和生長，從而可以在很大程度上提高肝細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的密度以及肝細(xì)胞的生物活性，增強(qiáng)肝細(xì)胞合成白蛋白及分泌染色素的能力。技術(shù)方案本發(fā)明將納米纖維支架應(yīng)用于人工肝生物反應(yīng)器并通過優(yōu)化內(nèi)部結(jié)構(gòu)對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行改進(jìn)，以提高生物型人工肝的肝細(xì)胞密度和增加培養(yǎng)液的氧含量并改善肝細(xì)胞在生物反應(yīng)器內(nèi)分布情況，從而提高生物型人工肝的臨床效能。針對(duì)以上問題本發(fā)明在對(duì)人工肝生物反應(yīng)器的改進(jìn)中引入納米纖維支架，利用納米纖維支架利于細(xì)胞黏附、生長的特點(diǎn)，可達(dá)到固定肝細(xì)胞進(jìn)而提高生物型人工肝的肝細(xì)胞密度的目的，并且有利于細(xì)胞培養(yǎng)液的循環(huán)以及促進(jìn)肝細(xì)胞的繁殖和球狀體的形成。此外對(duì)生物反應(yīng)器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，增加輸氧管，以提高肝細(xì)胞的成活率和生物活性。進(jìn)而提高肝細(xì)胞凈化血液的能力。本發(fā)明的人工肝生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)為在生物反應(yīng)器外殼的一端設(shè)有血漿進(jìn)口、氧氣進(jìn)口，在生物反應(yīng)器外殼的另一端設(shè)有血漿出口、氧氣出口，在生物反應(yīng)器外殼的側(cè)面地兩頭分別設(shè)有營養(yǎng)液進(jìn)口、營養(yǎng)液出口，在生物反應(yīng)器外殼的內(nèi)部設(shè)有由納米纖維支架、中空纖維組成的細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)；納米纖維支架與中空纖維之間形成卷曲的“夾心式”結(jié)構(gòu)，即納米纖維支架卷曲成螺旋的卷筒狀，在卷曲的夾層中設(shè)有中空纖維，肝細(xì)胞聚集體附在中空纖維旁；在生物反應(yīng)器中設(shè)置氧氣通道，可以實(shí)現(xiàn)適時(shí)加氧功能。所述的納米纖維支架的材料為海藻酸鹽、多聚賴氨酸、殼聚糖、瓊脂糖、聚乙烯醇中的一種或幾種的混合物，呈長方形無紡布結(jié)構(gòu)。所述納米纖維支架的纖維直徑在30nm～400nm之間，孔隙率＞85％。將納米纖維支架中排布的中空纖維每間隔5～10根選取一根，按此方法將選出的中空纖維作為氧氣的通道，將余下的中空纖維作為血漿的通道。有益效果該生物反應(yīng)器首次引入納米纖維支架，實(shí)現(xiàn)了生物反應(yīng)器內(nèi)肝細(xì)胞的黏附生長，不僅可以避免傳統(tǒng)人工肝的肝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所帶來的細(xì)胞流失問題，而且納米纖維無紡布的類生物體蛋白纖維的結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)肝細(xì)胞的繁殖和生長，從而可以在很大程度上提高肝細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的密度以及肝細(xì)胞的生物活性，增強(qiáng)肝細(xì)胞合成白蛋白及分泌染色素的能力。針對(duì)肝細(xì)胞的培養(yǎng)需氧量大的特點(diǎn)，在生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)中加入了通氧設(shè)施，可以實(shí)現(xiàn)適時(shí)向反應(yīng)器中供氧的功能。該生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)新穎，納米纖維支架的引入在國內(nèi)外尚屬首例，且制備方法在技術(shù)上均能實(shí)現(xiàn)?？梢韵嘈胚@種新型的生物反應(yīng)器在人工肝以及其他細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。圖1為生物反應(yīng)器橫切面示意圖，圖2為生物反應(yīng)器縱切面示意圖，以上的圖中有營養(yǎng)液進(jìn)口1、血漿進(jìn)口2、氧氣進(jìn)口3、營養(yǎng)液出口4、血漿出口5、氧氣出口6，生物反應(yīng)器外殼7、納米纖維支架8、中空纖維9、肝細(xì)胞聚集體10。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的人工肝生物反應(yīng)器在生物反應(yīng)器外殼7的一端設(shè)有血漿進(jìn)口2、氧氣進(jìn)口3，在生物反應(yīng)器外殼7的另一端設(shè)有血漿出口5、氧氣出口6，在生物反應(yīng)器外殼7的側(cè)面地兩頭分別設(shè)有營養(yǎng)液進(jìn)口1、營養(yǎng)液出口4，在生物反應(yīng)器外殼7的內(nèi)部設(shè)有由納米纖維支架8、中空纖維9組成的細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)；納米纖維支架8與中空纖維9之間形成卷曲的“夾心式”結(jié)構(gòu)，即納米纖維支架8卷曲成螺旋的卷筒狀，在卷曲的夾層中設(shè)有中空纖維9，肝細(xì)胞聚集體10附在中空纖維9旁；在生物反應(yīng)器中設(shè)置氧氣通道，可以實(shí)現(xiàn)適時(shí)加氧功能。其中面臨的主要問題為支架材料的選擇以及生物反應(yīng)器內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的問題。納米纖維支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性以及一定的力學(xué)強(qiáng)度。為此，制備納米纖維支架的材料選擇有利于肝細(xì)胞繁殖、生長的海藻酸鹽、多聚賴氨酸、殼聚糖、瓊脂糖、聚乙烯醇等高分子聚合物。內(nèi)部結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)應(yīng)利于細(xì)胞營養(yǎng)液的適時(shí)加氧以及減小具體制備過程中的操作難度。利用靜電紡絲法將以上高分子聚合物制備成具有30nm～400nm直徑纖維的長方形無紡布支架，將中空纖維規(guī)則排布于無紡布支架上，其中部分中空纖維作為氧氣通道而其他中空纖維作為血漿通道，將納米纖維支架卷曲包裹中空纖維后填充于生物反應(yīng)器內(nèi)(見附圖)，即制得此新型生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器的特征在于引入納米纖維支架作為細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)，此納米纖維支架原材料為海藻酸鹽、或多聚賴氨酸、或殼聚糖、或瓊脂糖、或聚乙烯醇等高分子聚合物，具有30nm～400nm的纖維直徑，呈長方形無紡布結(jié)構(gòu)；納米纖維支架與中空纖維間呈規(guī)則的卷曲“夾心式”結(jié)構(gòu)；中空纖維束分為兩束，其中一束作為氧氣通道，向細(xì)胞培養(yǎng)液中適時(shí)加氧；在反應(yīng)器的外殼上留有血漿、氧氣、營養(yǎng)液的進(jìn)出口各兩個(gè)。本發(fā)明通過以下方法加以實(shí)施。利用靜電紡絲技術(shù)將聚合物(海藻酸鹽、多聚賴氨酸、殼聚糖、瓊脂糖、聚乙烯醇等)制備成一定面積的長方形無紡布支架，然后將聚砜中空纖維規(guī)則的排布于納米纖維無紡布上(間距在0.5mm～2mm)，每隔5～15根選擇一根中空纖維作為氧氣的通道，卷曲納米纖維支架將聚砜中空纖維包裹起來，后填充于外殼支架內(nèi)，在外殼支架上留有氧氣通道、血漿通道、培養(yǎng)液通道各兩個(gè)分別作為進(jìn)口和出口。該方法包括以下過程1.納米纖維支架的制備選擇不同的溶劑將聚合物(海藻酸鹽、多聚賴氨酸、殼聚糖、瓊脂糖、聚乙烯醇等)溶解制備成靜電紡絲溶液。根據(jù)聚合物溶液的不同性質(zhì)制定不同的靜電紡絲條件(電壓、接受距離、注射速度)，然后進(jìn)行紡絲，在紡絲過程中通過移動(dòng)接受器的位置和控制紡絲的時(shí)間對(duì)納米纖維支架的形狀和厚度進(jìn)行調(diào)節(jié)。將不同材料的納米纖維支架進(jìn)行相應(yīng)的改性和消毒，制備成能放置于細(xì)胞培養(yǎng)液中作為細(xì)胞生長基質(zhì)的納米纖維支架。2.中空纖維與納米纖維支架的構(gòu)造設(shè)計(jì)將納米纖維無紡布支架平坦，在支架上順序排布聚砜中空纖維(間距0.5mm～2mm)，然后卷曲納米纖維支架將中空纖維包裹在其內(nèi)部，即制得生物反應(yīng)器的核心組件。每間隔5～10根選擇一根中空纖維作為供應(yīng)氧氣的通道，按此方式將兩端的中空纖維分成兩束，一束作為血漿的通道，一束作為氧氣的通道。3.核心組件的封裝將步驟2種得到的核心組件用聚丙烯外殼封裝，在外殼上留有血漿、氧氣、培養(yǎng)液的進(jìn)出孔各兩個(gè)。將兩端的兩束中空纖維按順序分別放入血漿和氧氣的通道孔中，并用醫(yī)用膠水封裝，即制得此新型生物反應(yīng)器。例一以海藻酸鹽作為納米纖維支架的原材料來制作此新型生物反應(yīng)器。1.納米纖維支架的制備(1)靜電紡絲溶液的制備將海藻酸鈉溶于去離子水中制備成濃度為質(zhì)量比W海藻酸鈉∶W去離子水＝4％的溶液。將聚氧化乙烯(Mw＝900kD)溶于去離子水中制備成濃度為質(zhì)量比W聚氧化乙烯∶W去離子水＝4％的溶液。然后將兩種溶液按體積比V海藻酸鈉溶液∶V聚氧化乙烯溶液＝8∶2的比率混合，常溫?cái)嚢?00min至混合均勻，得到海藻酸鈉與聚氧化乙烯的混合溶液。然后按體積比V表面活性劑∶V混合溶液＝0.5％的比率加入表面活性劑曲拉通X-100，持續(xù)攪拌10min。之后按體積比V助溶劑∶V混合溶液＝10％的比率加入助溶劑二甲亞砜。在室溫下持續(xù)攪拌60min。即獲得均一、穩(wěn)定的淺黃色紡絲溶液。(2)靜電紡絲工藝制備納米纖維支架使用離心機(jī)將步驟(1)中獲得的紡絲溶液在5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5min，之后將其注入到注射器(直徑為20mm)中，將注射器固定在微量注射泵上，距針頭15cm處固定鋁箔作為接收器。在針頭上施加18kv的高壓，注射泵流速為1.0mL/h。在紡絲過程中不斷移動(dòng)接收器，即獲得一定面積的纖維膜，其纖維直徑在50nm～500nm。(3)海藻酸鈉納米纖維支架的改性處理將步驟(2)中所得的納米纖維材料浸泡在無水乙醇中10min，之后將該材料浸泡在濃度為質(zhì)量比WCaCl2∶WH2O＝2％的CaCl2溶液中并持續(xù)120min，然后用去離子水沖洗10min以去除殘留的CaCl2。即制得海藻酸鈉納米纖維支架。2.核心組件中中空纖維與納米纖維支架的構(gòu)造將海藻酸鹽納米纖維無紡布支架平坦，在支架上順序排布聚砜中空纖維其間距為1mm，然后卷曲納米纖維支架將中空纖維包裹在其內(nèi)部，形成“夾心式”結(jié)構(gòu)，即制得生物反應(yīng)器的核心組件。然后每間隔5～10根選擇一根中空纖維作為供應(yīng)氧氣的通道，按此方式將兩端的中空纖維分成兩束，一束作為血漿的通道，一束作為氧氣的通道。3.核心組件的封裝將步驟2種得到的核心組件用聚丙烯外殼封裝，在外殼上留有血漿、氧氣、培養(yǎng)液的進(jìn)出孔各兩個(gè)。將兩端的兩束中空纖維按順序分別放入血漿和氧氣的通道孔中，并用醫(yī)用膠水封裝，即制得此新型生物反應(yīng)器例二以殼聚糖作為納米纖維支架的原材料來制作此新型生物反應(yīng)器。1.納米纖維支架的制備(1)靜電紡絲溶液的制備將殼聚糖(Mw＝190kD，Deacetylation＝85％)溶于質(zhì)量比為5％的醋酸溶液中制備成濃度為質(zhì)量比W殼聚糖∶W醋酸溶液＝2％的溶液。將聚氧化乙烯(Mw＝900kD)溶于質(zhì)量比為5％的醋酸溶液中制備成濃度為質(zhì)量比W聚氧化乙烯∶W醋酸溶液＝3％的溶液。然后將兩種溶液按體積比V殼聚糖溶液∶V聚氧化乙烯溶液＝9∶1的比率混合，常溫?cái)嚢?00min至混合均勻，得到殼聚糖與聚氧化乙烯的混合溶液。然后按體積比V表面活性劑∶V混合溶液＝0.3％的比率加入表面活性劑曲拉通X-100，持續(xù)攪拌10min。之后按體積比V助溶劑∶V混合溶液＝10％的比率加入助溶劑二甲基甲酰胺。在室溫下持續(xù)攪拌60min。即獲得均一、穩(wěn)定的紡絲溶液。(2)靜電紡絲工藝制備納米纖維支架使用離心機(jī)將步驟(1)中獲得的紡絲溶液在5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5min，之后將其注入到注射器(直徑為20mm)中，將注射器固定在微量注射泵上，距針頭18cm處固定鋁箔作為接收器。在針頭上施加22kv的高壓，注射泵流速為1.5mL/h。在紡絲過程中不斷移動(dòng)接收器，即獲得一定面積的纖維膜，其纖維直徑在30nm～80nm。在室溫下使納米纖維膜干燥即制得海藻酸鈉納米纖維支架。2.核心組件中中空纖維與納米纖維支架的構(gòu)造將殼聚糖納米纖維無紡布支架平坦，在支架上順序排布聚砜中空纖維其間距為1mm，然后卷曲納米纖維支架將中空纖維包裹在其內(nèi)部，形成“夾心式”結(jié)構(gòu)，即制得生物反應(yīng)器的核心組件。然后每間隔5～10根選擇一根中空纖維作為供應(yīng)氧氣的通道，按此方式將兩端的中空纖維分成兩束，一束作為血漿的通道，一束作為氧氣的通道。3.核心組件的封裝將步驟2種得到的核心組件用聚丙烯外殼封裝，在外殼上留有血漿、氧氣、培養(yǎng)液的進(jìn)出孔各兩個(gè)。將兩端的兩束中空纖維按順序分別放入血漿和氧氣的通道孔中，并用醫(yī)用膠水封裝，即制得此新型生物反應(yīng)器權(quán)利要求1.一種人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于在生物反應(yīng)器外殼(7)的一端設(shè)有血漿進(jìn)口(2)、氧氣進(jìn)口(3)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的另一端設(shè)有血漿出口(5)、氧氣出口(6)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的側(cè)面地兩頭分別設(shè)有營養(yǎng)液進(jìn)口(1)、營養(yǎng)液出口(4)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的內(nèi)部設(shè)有由納米纖維支架(8)、中空纖維(9)組成的細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)；納米纖維支架(8)與中空纖維(9)之間形成卷曲的“夾心式”結(jié)構(gòu)，即納米纖維支架(8)卷曲成螺旋的卷筒狀，在卷曲的夾層中設(shè)有中空纖維(9)，肝細(xì)胞聚集體(10)附在中空纖維(9)旁；在生物反應(yīng)器中設(shè)置氧氣通道，可以實(shí)現(xiàn)適時(shí)加氧功能。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于所述的納米纖維支架(8)的材料為海藻酸鹽、多聚賴氨酸、殼聚糖、瓊脂糖、聚乙烯醇中的一種或幾種的混合物，呈長方形無紡布結(jié)構(gòu)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于所述納米纖維支架(8)的纖維直徑在30nm～400nm之間，孔隙率＞85％。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工肝生物反應(yīng)器，其特征在于將納米纖維支架(8)中排布的中空纖維(9)每間隔5～10根選取一根，按此方法將選出的中空纖維(9)作為氧氣的通道，將余下的中空纖維(9)作為血漿的通道。全文摘要人工肝生物反應(yīng)器涉及一種以納米纖維支架材料作為肝細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的用于生物人工肝的生物反應(yīng)器。此生物反應(yīng)器在生物反應(yīng)器外殼(7)的一端設(shè)有血漿進(jìn)口(2)、氧氣進(jìn)口(3)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的另一端設(shè)有血漿出口(5)、氧氣出口(6)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的側(cè)面地兩頭分別設(shè)有營養(yǎng)液進(jìn)口(1)、營養(yǎng)液出口(4)，在生物反應(yīng)器外殼(7)的內(nèi)部設(shè)有由納米纖維支架(8)、中空纖維(9)組成的細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)；納米纖維支架(8)與中空纖維(9)之間形成卷曲的“夾心式”結(jié)構(gòu)，即納米纖維支架(8)卷曲成螺旋的卷筒狀，在卷曲的夾層中設(shè)有中空纖維，肝細(xì)胞聚集體(10)附在中空纖維(9)旁；在生物反應(yīng)器中設(shè)置氧氣通道，可以實(shí)現(xiàn)適時(shí)加氧功能。文檔編號(hào)A61F2/00GK101050418SQ200710020669公開日2007年10月10日申請(qǐng)日期2007年3月20日優(yōu)先權(quán)日2007年3月20日發(fā)明者顧忠澤,馮章啟,付德剛申請(qǐng)人:東南大學(xué)