專(zhuān)利名稱(chēng)：：重組人血管內(nèi)皮抑制素長(zhǎng)效制劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是重組人血管內(nèi)皮抑制素(rhEndostatin)的緩釋長(zhǎng)效制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：血管生成在實(shí)體瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的作用。為了刺激血管的生成，腫瘤細(xì)胞會(huì)上調(diào)一系列血管生成因子，如aFGF，bFGF和VEGF等。同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些血管生成抑制因子。組織中血管生成表型的開(kāi)放與關(guān)閉將取決于組織局部區(qū)域血管生成刺激因子和抑制因子之間的動(dòng)態(tài)平衡(Folkman,J.AtoM￡D.1:27-31,1995;Hanahan，D.,e,CW/.86:353-364,1996)。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的血管生成抑制因子，如血管緊張素(Angiostatin),血管內(nèi)皮抑制素(Endostatin)等，均能夠抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)(O，Relly，M.S.,"a/.Ce〃.79:315-328,1994;O，Relly,M.S.,"a/.Ce〃.88:277-285，1997)。由此說(shuō)明腫瘤的生長(zhǎng)是血管生成依賴(lài)性的。血管內(nèi)皮抑制素(Endostatin)是O'Reilly于1997年從小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系EOMAD的培養(yǎng)液中分離得到的一種具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的物質(zhì)(0，Relly，M.S.，""/.Ce//.88:277-285，1997)。氨基酸序列分析該物質(zhì)為膠原蛋白XV11的羧基末端的降解片段，分子量為20kD左右。血管內(nèi)皮抑制素能夠顯著地抑制小鼠多種原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)。重復(fù)使用可使小鼠腫瘤處于持久的休眠狀態(tài)，并且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性(Boehm，T.Wa/.Atowu390:404-407,1997)。重組人血管內(nèi)皮抑制素(rhEndostatin)與重組鼠血管內(nèi)皮抑制素在氨基酸序列上有85%的同源性。1996年美國(guó)Entremed公司采用酵母作為表達(dá)體系生產(chǎn)了重組人血管內(nèi)皮抑制素。Folkman報(bào)道采用連續(xù)皮下給藥方式能夠使rhEndostatin對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制率達(dá)到99。/。。Entremed公司于1998年10月進(jìn)行了I期臨床試驗(yàn)，研究表明，即使劑量高達(dá)600mg/n^也未發(fā)現(xiàn)劑量限制毒性。利用傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)方法得到的重組人血管內(nèi)皮抑制素難以復(fù)性并且易于形成沉淀，而用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)所耗費(fèi)的生產(chǎn)成本巨大，兩種方法均未能解決將重組人血管內(nèi)皮抑制素進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的問(wèn)題。為此羅永章等人通過(guò)修飾人血管內(nèi)皮抑制素的核苷酸編碼序列，生產(chǎn)出N末端帶有附加氨基酸序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素(rhEndostatin，取名為Endostar，中文名恩度)，大大簡(jiǎn)化了純化歩驟，提高了產(chǎn)物的純度(ZL00107569.1)。所生產(chǎn)的重組人血管內(nèi)皮抑制素由192個(gè)氨基酸構(gòu)成，其氨基酸序列為ENSFMTASK其生物活性與按傳統(tǒng)方法制備的重組人血管內(nèi)皮抑制素完全相同，并且沒(méi)有因?yàn)楦郊覰端序列而導(dǎo)致體內(nèi)免疫原性。目前己經(jīng)獲得國(guó)家藥品食品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，進(jìn)行市場(chǎng)銷(xiāo)售。市場(chǎng)上銷(xiāo)售的恩度注射液規(guī)格為15mg/3ml/支，14天一個(gè)療程，患者需每天注射一次，連續(xù)14天，休息一周后，再繼續(xù)下一療程。如此頻繁的注射給藥，一方面在生理上給患者帶來(lái)了巨大的痛苦，另一方面也在心理上給患者帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種重組人血管內(nèi)皮抑制素的長(zhǎng)效制劑，一次注射以后可連續(xù)釋放藥物728天，從而大大降低患者生理上的痛苦，減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，聚乳酸一羥基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide),PLGA]已經(jīng)被廣泛用于蛋白多肽類(lèi)藥物長(zhǎng)效制劑的制備，并且已經(jīng)有多個(gè)產(chǎn)品上市，獲得了很大的成功，如LupronDepot,Neu加pinDepot等。本發(fā)明就是利用PLGA作為基質(zhì)，制備重組人血管內(nèi)皮抑制素長(zhǎng)效制劑。本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑制素與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)的重量比為5:10040:100，優(yōu)選10:10020:100。本發(fā)明所涉及到的基質(zhì)材料PLGA,分子量為2000~150000，聚乳酸羥基乙酸為50:50~85:15。本發(fā)明所涉及到的藥物為重組人血管內(nèi)皮抑制素，優(yōu)選N末端帶有附加氨基酸序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar。本發(fā)明制備長(zhǎng)效制劑的方法有四種1、在體植入泵，包含以下歩驟(1)PLGA溶于l-甲基-2-吡咯烷酮中;(2)與重組人血管內(nèi)皮抑制素水溶液混合；(3)混合物經(jīng)皮下注射至體內(nèi)，溶劑分散至組織中，PLGA析出，形成長(zhǎng)效在體植入泵。2、在體植入微球，包含以下步驟(1)PLGA溶于l-甲基-2-吡咯垸酮中;(2)與重組人血管內(nèi)皮抑制素水溶液混合；(3)混合物在注射用油中乳化；(4)皮下注射至體內(nèi)，溶劑分散至組織中，PLGA析出，形成長(zhǎng)效在體植入微球。3、W/0/0溶劑揮發(fā)法，包含以下步驟(1)PLGA溶于混合有機(jī)溶劑中；(2)與重組人血管內(nèi)皮抑制素水溶液混合；(3)混合物在油相中揮發(fā)溶劑，形成微球。上述歩驟(l)的混合有機(jī)溶劑為乙腈和二氯甲垸，比例為3:7~7:3。上述步驟(3)的油相為含有乳化劑的液體石蠟，菜籽油或者硅油，乳化劑優(yōu)選司盤(pán)80。4、W/0/W溶劑揮發(fā)法，包含以下歩驟(1)PLGA溶于有機(jī)溶劑中；(2)與重組人血管內(nèi)皮抑制素水溶液混合；(3)混合物在含有聚乙烯醇(PVA)的水相中揮發(fā)溶劑，形成微球。上述步驟(l)的有機(jī)溶劑為二氯甲烷，乙睛，丙酮或者乙酸乙酯。本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑制素長(zhǎng)效制劑的體內(nèi)外釋放實(shí)驗(yàn)，測(cè)定方法采用Elisa試劑盒，檢測(cè)范圍在1.95500ng/ml之間，追蹤檢測(cè)不同時(shí)間的釋放量，其釋放速率符合一級(jí)反應(yīng)方程。本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑制素長(zhǎng)效制劑，可在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)在本發(fā)明通過(guò)選擇不同配比的PLGA，可將重組人血管內(nèi)皮抑制素長(zhǎng)效制劑的釋放時(shí)間控制在728天。根據(jù)不同需要可選擇延長(zhǎng)控制釋放天數(shù)，極大地降低患者生理上的痛苦，同時(shí)還極大地減輕了患者經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑制素長(zhǎng)效制劑釋放曲線良好，第1天的釋放比例可控制在20%以?xún)?nèi)，甚至10%以?xún)?nèi)，明顯減少藥物的突釋現(xiàn)象。本發(fā)明通過(guò)W/0/0溶劑揮發(fā)法和W/0/W溶劑揮發(fā)法制備的重組人血管內(nèi)皮抑制素長(zhǎng)效制劑包封率高，可達(dá)90%，微球粒徑〈5(^m。本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑制素長(zhǎng)效制劑的生物利用度可達(dá)70%以上，可以節(jié)約費(fèi)用，降低毒副作用，提高療效。本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑制素長(zhǎng)效制劑制備工藝簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化大生產(chǎn)及臨床應(yīng)用。具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例1:將100mgPLGA(Mw=15000，50:50)溶于lmll-甲基-2-吡咯烷酮中(濃度為10%)，再加入O.lml100mg/mlEndostar水溶液(PLGA與Endostar的重量比為10:1)，震蕩器混勻30min，混合溶液用注射器加至截留分子量為30000，直徑為1厘米的透析袋中，兩端用夾子加緊。再將透析袋置于含有10ml磷酸緩沖液(0.1mol/L,pH7.0)的燒杯中，并用磁力攪拌器不斷攪拌。溶劑迅速透析至燒杯中，PLGA固化，形成植入泵。每閂取燒杯緩沖液lml，同時(shí)補(bǔ)充同體積新鮮的磷酸緩沖液。樣品中Endostar的含量用HPLC法測(cè)定。用藥物的累計(jì)釋放百分率與釋藥時(shí)間作圖。第1天釋放18.8%，第7天釋放55.5%，第14天釋放58.0%，第28天釋放91.1%。實(shí)施例2將100mgPLGA(Mw=40500，50:50)溶于lmll-甲基-2-吡咯烷酮中(濃度為,中，再加入O.lml200mg/mlEndostar水溶液(PLGA與Endostar的重量比為10:2)，其余步驟同實(shí)施例l。用藥物的累計(jì)釋放百分率與釋藥時(shí)間作圖。第1天釋放18.1%，第7天釋放21.5%，第14天釋放51.0%,第28天釋放89.1%。實(shí)施例3將100mgPLGA(Mw=40500，75:25)溶于lmll-甲基-2-吡咯烷酮中(濃度為10%)中，再加入0.05ml100mg/mlEndostar水溶液(PLGA與Endostar的重量比為20:1)，其余步驟同實(shí)施例l。用藥物的累計(jì)釋放百分率與釋藥時(shí)間作圖。第1天釋放7.6%，第7天釋放11.5%，第14天釋放23.0%，第28天釋放54.1%。實(shí)施例4將100mgPLGA(Mw=15000，50:50)溶于lmll-甲基-2-吡咯烷酮中(濃度為10%)，再加入0.1mll00mg/mlEndostar水溶液(PLGA與Endostar的重量比為10:1)，震蕩器混勻，混合溶液用注射器加入至含有1%司盤(pán)80的芝麻油溶液中，密封低溫的條件下迅速用高速振蕩器混勻，形成白色乳液。將此白色乳液用注射器加至截留分子量為30000，直徑為1厘米的透析袋中。再將透析袋置于含有10ml磷酸緩沖液(0.1mol/L，pH7.0)的燒杯中，并用磁力攪拌器不斷攪拌。隨著水溶液進(jìn)入透析袋中，透析袋內(nèi)有機(jī)溶劑不斷的透析至燒杯中，與此同時(shí)PLGA不斷析出，形成微球，藥物被包裹于微球之中。每日取燒杯緩沖液lml，同時(shí)補(bǔ)充同體積新鮮的磷酸緩沖液。樣品中Endostar的含量用HPLC法測(cè)定。用藥物的累計(jì)釋放百分率與釋藥時(shí)間作圖。第l天釋放5.7%，第7天釋放14.5%，第14天釋放51.0°/。，第28天釋放80.1%。實(shí)施例5將100mgPLGA(Mw=40500，50:50)溶于3mll-甲基-2-吡咯烷酮中(濃度為3.3%)中，再加入0.3ml100mg/mlEndostar水溶液(PLGA與Endostar的重量比為10:3)其余步驟同實(shí)施例4。用藥物的累計(jì)釋放百分率與釋藥時(shí)間作圖。第1天釋放37.2%，第7天釋放45%，第14天釋放53.0%，第28天釋放81.1%。實(shí)施例6將100mgPLGA(Mw二40500，75:25)溶于2mll-甲基-2-吡咯烷酮中(濃度為2.5%)中，再加入0.2ml200mg/mlEndostar水溶液(PLGA與Endostar的重量比為10:4)其余步驟同實(shí)施例4。用藥物的累計(jì)釋放百分率與釋藥時(shí)間作圖。第1天釋放5.1%，第7天釋放13.5%，第14天釋放26.0%，第28天釋放50.1%。實(shí)施例7將PLGA(Mw=15000，50:50)2g溶于20ml二氯甲烷和乙睛(1:1)的混合溶劑中，成為油相。精密稱(chēng)取200mgEndostar溶于2ml雙蒸水中(內(nèi)含5%甘露醇)，形成內(nèi)水相。將上述水相加至油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/0初乳，然后將初乳迅速滴加至含有1%司盤(pán)80的液體石蠟中，機(jī)械攪拌揮發(fā)溶劑(750rpm)4小時(shí)，離心，并用石油醚洗滌三次，最后冷凍干燥得到微球。包封率為90%，粒徑〈50nm。稱(chēng)取100mg微球，置于至截留分子量為30000，直徑為l厘米的透析袋中。再將透析袋置于含有10ml磷酸緩沖液(0.1mo1/1，pH7.0)的燒杯中，并用磁力攪拌器不斷攪拌。每日取燒杯中緩沖液lml,同時(shí)補(bǔ)充同體積新鮮的磷酸緩沖液。樣品中Endostar的含量用HPLC法測(cè)定。用藥物的累計(jì)釋放百分率與釋藥時(shí)間作圖。第1天釋放15.0%，第7天釋放54.5%，第14天釋放91.0%。實(shí)施例8微球制備方法同實(shí)施例7，不同之處在于二氯甲垸和乙睛的比例。對(duì)制備的微球進(jìn)行外觀檢查。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3:7均勻均勻形狀規(guī)則，圓球形，表面光滑實(shí)施例9微球制備方法同實(shí)施例7，不同之處在于PLGA的型號(hào)。對(duì)制備的微球進(jìn)行包封率測(cè)定。PLGA(聚乳酸羥基乙酸)分子量包封率％85:151500009185:15405009075:25405009550:50405009750:501500098實(shí)施例10將PLGA(50:50，Mw=15000)2g溶于20ml二氯甲烷中，成為油相。精密稱(chēng)取200mgEndostar溶于2ml雙蒸水中(內(nèi)含5%甘露醇)，形成內(nèi)水相。將上述水相加至油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/0初乳，然后將初乳迅速滴加至含有1。/。PVA的水溶液中，機(jī)械攪拌揮發(fā)溶劑(2000rpm)4小時(shí)，離心，并用水洗滌三次，最后冷凍干燥得到微球。包封率為90%，粒徑〈50^im。稱(chēng)取100mg微球，置于至截留分子量為30000，直徑為l厘米的透析袋中。再將透析袋置于含有10ml磷酸緩沖液(0.1mol/L，pH7.0)的燒杯中，并用磁力攪拌器不斷攪拌。每日取燒杯中緩沖液lml，同時(shí)補(bǔ)充同體積新鮮的磷酸緩沖液。樣品中Endostar的含量用HPLC法測(cè)定。用藥物的累計(jì)釋放百分率與釋藥時(shí)間作圖。第1天釋放28.0%，第7天釋放69.5%，第14天釋放98.0%。實(shí)施例11動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選取雄性SD大鼠，體重200g左右，皮下給予Endostar長(zhǎng)效制劑和普通制劑，在給藥后l-28天，每天用玻璃毛細(xì)管進(jìn)行眼球后靜脈叢采血，每只大鼠采集血液約0.3mL，離心后取上層血漿用試劑盒(CHEMICON，HUMANENDOSTATINKIT)來(lái)測(cè)定血液中Endostar的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予普通制劑的大鼠，血漿中血管內(nèi)皮抑制素的濃度迅速升高，2-4小時(shí)達(dá)到高峰，大約在10002000ng/ml之間，10小時(shí)后藥物濃度低于100ng/ml，而在給予長(zhǎng)效制劑的大鼠中，藥物持續(xù)釋放大約14天28天，血漿中血管內(nèi)皮抑制素的濃度維持在300ng/ml2000ng/ml之間。權(quán)利要求1.一種長(zhǎng)效制劑，由重組人血管內(nèi)皮抑制素和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)組成，其特征在于重組人血管內(nèi)皮抑制素與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)的重量比為5∶100～40∶100。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)效制劑，其特征在于重組人血管內(nèi)皮抑制素與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)的重量比為10:10020:100。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)效制劑，其特征在于所述的PLGA為聚乳酸:羥基乙酸50:5085:15，分子量為2000150000，所述的重組人血管內(nèi)皮抑制素為Endostar。4.一種權(quán)利要求1的長(zhǎng)效制劑的制備方法，其特征在于包括以下歩驟(1)PLGA溶于l-甲基-2-吡咯烷酮中;(2)與重組人血管內(nèi)皮抑制素水溶液混合；(3)混合物經(jīng)皮下注射至體內(nèi)，溶劑分散至組織中，PLGA析出，形成長(zhǎng)效在體植入泵。5.—種權(quán)利要求1的長(zhǎng)效制劑的制備方法，其特征在于包括以下歩驟(1)PLGA溶于1-甲基-2-吡咯烷酮中；(2)與重組人血管內(nèi)皮抑制素水溶液混合；(3)混合物在注射用油中乳化；(4)皮下注射至體內(nèi)，溶劑分散至組織中，PLGA析出，形成長(zhǎng)效在體植入微球。6.—種權(quán)利要求1的長(zhǎng)效制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)PLGA溶于混合有機(jī)溶劑中；(2)與重組人血管內(nèi)皮抑制素水溶液混合；(3)混合物在油相中揮發(fā)溶劑，形成微球。7.根據(jù)權(quán)利要求6的制備方法，其特征在于所述歩驟(l)的混合有機(jī)溶劑為乙腈和二氯甲烷，比例為3:7~7:3;所述歩驟(3)的油相為含有乳化劑的液體石蠟，菜籽油或者硅油，乳化劑優(yōu)選司盤(pán)80。8.—種權(quán)利要求l的長(zhǎng)效制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)PLGA溶于有機(jī)溶劑中；(2)與重組人血管內(nèi)皮抑制素水溶液混合；(3)混合物在含有PVA的水相中揮發(fā)溶劑，形成微球。9.根據(jù)權(quán)利要求8的制備方法，其特征在于所述步驟(l)的有機(jī)溶劑為二氯甲烷，乙睛，丙酮或者乙酸乙酯。10.權(quán)利要求1所述重組人血管內(nèi)皮抑制素長(zhǎng)效制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是重組人血管內(nèi)皮抑制素的乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)的長(zhǎng)效制劑以及其作為制備腫瘤治療藥物的用途。本發(fā)明采用在體植入泵、在體植入微球、W/O/W溶劑揮發(fā)法和W/O/O溶劑揮發(fā)法四種方法制備長(zhǎng)效制劑。所制備的長(zhǎng)效制劑緩釋時(shí)間根據(jù)需求分別為7～28天。文檔編號(hào)A61K38/17GK101292951SQ20071002166公開(kāi)日2008年10月29日申請(qǐng)日期2007年4月23日優(yōu)先權(quán)日2007年4月23日發(fā)明者劉春暉,吳錦慧,殷曉進(jìn),征江,胡一橋,許向陽(yáng),陳英杰申請(qǐng)人:江蘇先聲藥物研究有限公司;山東先聲麥得津生物制藥有限公司