專利名稱：：白果內(nèi)酯在制備治療帕金森病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種白果內(nèi)酯在制備治療帕金森病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：1817年，英國醫(yī)生JamesParkinson報(bào)告了第一例帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)，其主要臨床癥狀為震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)步態(tài)異常。如今，PD已成為危害中、老年人健康的位居第二的神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerativedisease,ND)。從全球范圍來看，帕金森病在西歐、北美的患病率約為70—180/10萬人，其年發(fā)病率在8—18/10萬人。其中40歲以上的成年人患病率大約為0.1%—0.2%,而65歲以上的老人更高，其患病率高達(dá)1%。國內(nèi)最新流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示在55歲以上的中國人中，其患病率達(dá)1%，全國的PD患者約為500—700萬。隨著人口老齡化，PD的發(fā)病率必將進(jìn)一步上升。帕金森病中神經(jīng)元退行性病變的細(xì)胞和分子機(jī)制尚未完全闡明，目前主要有三種學(xué)說(1)氧化自由基損傷學(xué)說有足夠的證據(jù)表明PD患者多巴胺神經(jīng)元受到氧化應(yīng)激損害。PD患者死后尸檢中發(fā)現(xiàn)，黑質(zhì)中一些氧化損害的標(biāo)志物質(zhì)明顯增加，包括脂質(zhì)過氧化物丙二醛及過氧化氫、蛋白質(zhì)和DNA的氧化產(chǎn)物碳酰化蛋白等。黑質(zhì)DA神經(jīng)元代謝活躍，消耗大量分子氧，以供線粒體呼吸，產(chǎn)生ATP，線粒體電子傳遞呼吸鏈滲漏即可產(chǎn)生活性氧(ROS)，其次DA在其合成、釋放、代謝過程中也伴有ROS的生成，引起氧化損傷。同時(shí)強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)GSH-GSSG水平在中腦比其它腦區(qū)低。近年來生化分析研究發(fā)現(xiàn)，PD中黑質(zhì)致密區(qū)內(nèi)鐵水平升高，鐵代謝紊亂，誘發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。(2)炎癥反應(yīng)近年來諸多學(xué)者報(bào)道，PD患者腦脊液和黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中炎性細(xì)胞因子均較健康對(duì)照組增高。炎癥反應(yīng)如何誘導(dǎo)DA能神經(jīng)元變性的機(jī)制不明，目前普遍認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞激活釋放的致炎性細(xì)胞因子促發(fā)的毒性反應(yīng)起重要作用。首先，致炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的毒性機(jī)制主要是導(dǎo)致iNOS的激活，iNOS可以介導(dǎo)大量的NO的合成。Himot等研究發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)中表達(dá)iNOS的膠質(zhì)細(xì)胞密度與健康組相比明顯增高。相應(yīng)的PD患者CSF中亞硝酸鹽亦明顯增高，Liberatore等通過研究發(fā)現(xiàn)，缺乏iNOS基因的小鼠可部分對(duì)抗MPTP毒性，在基因水平進(jìn)一步證實(shí)iNOS是MPTP導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性所必需的；Iravani等也發(fā)現(xiàn)iNOS抑制劑可以部分抑制LPS誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元變性。NO誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性可能通過幾種不同的作用機(jī)制1.NO可以與超氧自由基反應(yīng)生成過氧化硝基化合物(ONOO.),ONOO—可以誘導(dǎo)酪胺酸殘基亞硝化生成3-硝基酪氨酸，此外ONOO—還可以啟動(dòng)一系列的細(xì)胞毒性過程。在PD患者、MPTP和LPS模型的動(dòng)物腦內(nèi)-硝基酪氨酸免疫染色均增強(qiáng)進(jìn)一步支持這一機(jī)制。2.NO可以破壞鐵穩(wěn)態(tài)平衡，在PD患者黑質(zhì)發(fā)現(xiàn)鐵濃度升高，鐵可通過Fentoii反應(yīng)產(chǎn)生大量毒性自由基。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞源性致炎性細(xì)胞因子可以通過結(jié)合特定的細(xì)胞表面受體，直接促發(fā)細(xì)胞內(nèi)死亡相關(guān)信號(hào)傳遞途徑。例如，在PD患者中發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TNF-a，而且其受體在黑質(zhì)均增高。TNF-a可以激活Caspase途徑和神經(jīng)酰胺途徑，而神經(jīng)酰胺途徑不僅能放大Caspase途徑而且可以激活NF-kB，NF-icB的激活可以誘導(dǎo)多種炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。Hunot等用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)PD患者腦中細(xì)胞核內(nèi)NF-kB呈陽性的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量是正常人的70倍，提示NF-kB的活化與PD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。(3)基因缺陷目前研究發(fā)現(xiàn)IO個(gè)染色體定位以孟德爾遺傳方式與帕金森病連鎖。其中，5個(gè)涉及常染色體顯性遺傳4個(gè)以常染色體隱性遺傳方式傳遞，1個(gè)可能屬于晚發(fā)性散發(fā)帕金森病。在這些染色體定位中有4個(gè)基因已被克隆a-synuclein(突觸核蛋白)基因、parkin基因、DJ-1基因和UCH-L1基因。帕金森病主要病理特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少，最終導(dǎo)致其在紋狀體的神經(jīng)末梢退變，導(dǎo)致紋狀體的DA含量減少，相應(yīng)的膽堿能神經(jīng)元活性增強(qiáng)，最終導(dǎo)致多巴胺和乙酰膽堿兩種遞質(zhì)的平衡失調(diào)。表現(xiàn)為靜止性震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)緩慢及姿勢(shì)步態(tài)異常，可伴有智能減退、行為情感異常、言語錯(cuò)亂等非運(yùn)動(dòng)癥狀以及其它合并癥。現(xiàn)有的治療帕金森運(yùn)動(dòng)癥狀的方法見表1。YanagisawaN認(rèn)為21世紀(jì)藥物治療帕金森病的進(jìn)展集中在以下幾個(gè)方面新的多巴胺受體激動(dòng)劑的研究、神經(jīng)營養(yǎng)因子的研究、特異性酶抑制劑的研究、肉毒素的應(yīng)用及咖啡因在PD的新發(fā)現(xiàn)。其中除神經(jīng)生長因子外都不能保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，神經(jīng)生長因子雖然在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞少受神經(jīng)毒素的損傷，但因其不能透過血腦屏障，必須直接大腦內(nèi)注射才能有效，這一問題影響了它的使用?？Х纫蚴怯闪餍胁W(xué)調(diào)査發(fā)現(xiàn)的，但其神經(jīng)保護(hù)作用在實(shí)驗(yàn)室卻未得到證實(shí)。其它三類是雖然能改善PD病人的運(yùn)動(dòng)癥狀，但不能根本地保護(hù)黑質(zhì)神經(jīng)元免于死亡。從上可知，尋找新的能保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞的藥物，然后結(jié)合現(xiàn)有改善PD運(yùn)動(dòng)癥狀的藥物，可有效地治療PD,提高PD患者的生活質(zhì)量和存活年限，但目前為止，尚無預(yù)防或根治帕金森病的有關(guān)藥物或療法。表1.現(xiàn)有的治療帕金森病運(yùn)動(dòng)癥狀的方法<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種白果內(nèi)酯在制備治療帕金森病藥物中的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案是白果內(nèi)酯是從植物葉中提取所得，近年來研究發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯有多方面的神經(jīng)保護(hù)作用1.腦缺血時(shí)的神經(jīng)保護(hù)作用提高細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C氧化酶III亞單位和NADH脫氫酶I亞單位的mRNA水平、增加線粒體呼吸鏈3、4階段的氧耗和呼吸鏈控制速率，從而維持線粒體的氧化磷酸化，穩(wěn)定線粒體的功能。2.降低低氧或低血糖時(shí)腦脊液中谷氨酸的釋放，抑制低氧或NMDA誘導(dǎo)的磷脂A2的激活、磷脂降解和膽堿外流，抑制GABA(A)受體的激活。3.降低無血清誘導(dǎo)的雞胚胎神經(jīng)元的凋亡，抑制黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)生成的自由基誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)其能抑制早期氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡及減輕Caspase3、c-myc和p53的激活，減輕NO生成體3-morpholinosydnonimine對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并發(fā)現(xiàn)PC12胞內(nèi)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的水平升高，降低THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS的蛋白和mRNA水平，增加鼠星型細(xì)胞中GDNF和VEGF的蛋白和mRNA水平。4.促外周神經(jīng)再生作用。從上可知，白果內(nèi)酯具有多方面的神經(jīng)保護(hù)作用，包括保護(hù)線粒體、對(duì)抗神經(jīng)興奮性毒性、對(duì)抗凋亡、抗氧化應(yīng)激和抑制iNOS的表達(dá)。而PD發(fā)病機(jī)制中涉及到氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)(iNOS的激活)，因此我們認(rèn)為白果內(nèi)酯對(duì)PD具有治療作用。目前在臨床上尚未有白果內(nèi)酯單體制劑，對(duì)它的研究還在臨床前實(shí)驗(yàn)研究階段。白果內(nèi)酯的神經(jīng)保護(hù)作用正逐漸受到重視，但迄今為止，尚未有人報(bào)道白果內(nèi)酯對(duì)帕金森病的治療作用，本發(fā)明將首次探討白果內(nèi)酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性帕金森病的治療作用及其機(jī)制。本發(fā)明用立體定位技術(shù)將神經(jīng)毒素6-羥基多巴(6-OHDA)注射到左側(cè)大鼠黑質(zhì)(Substantianigra,SN)制作PD大鼠模型。22天后，用左旋多巴(L-dopa)誘導(dǎo)大鼠向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)檢測(cè)大鼠的行為改變；24天后，免疫組化法測(cè)定黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)；尼氏染色觀察黑質(zhì)的病理改變。在6-OHDA注射之后，使用NF-kB核轉(zhuǎn)位抑制劑SN50,采用TUNEL和NF-kBp65熒光雙標(biāo)記法探索6-OHDA誘導(dǎo)的黑質(zhì)細(xì)胞凋亡與NF-kB的關(guān)系。黑質(zhì)受損12h后，免疫組化檢測(cè)NF-kBp65、IkBouiNOS、p53、Bcl-2、HSP60蛋白的表達(dá)，24h后檢測(cè)p53蛋白的表達(dá)。分別取3h、6h、12h、24h和60h時(shí)間點(diǎn)，采用免疫組化法觀察腹腔注射白果內(nèi)酯對(duì)NF國kBp65、lKBa、Bcl-2和iNOS的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果白果內(nèi)酯可明顯減少L-dopa誘導(dǎo)的PD大鼠向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)(P〈0.01);6-OHDA注射24天后，大鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞大部分消失，但在腹腔注射白果內(nèi)酯后，黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞存活明顯增多，其中10mg*kg-l*d-l的白果內(nèi)酯的作用最強(qiáng)(P4.01);同時(shí)，白果內(nèi)酯組大鼠同側(cè)紋狀體內(nèi)TH的表達(dá)明顯高于模型組(P4.01);尼氏染色發(fā)現(xiàn)模型組大鼠損傷側(cè)的SN神經(jīng)元大部分消失，并伴有大量的膠質(zhì)細(xì)胞增生，但白果內(nèi)酯組損傷側(cè)SN殘存的神經(jīng)元較多，膠質(zhì)細(xì)胞增生減少。黑質(zhì)損傷48h時(shí)，NF-kBp65向核轉(zhuǎn)位的細(xì)胞TUNEL染色陽性，而在使用SN50后，未發(fā)生核轉(zhuǎn)位的神經(jīng)元TUNEL染色明顯減少。與模型組相比，白果內(nèi)酯在黑質(zhì)受損3h、6h和12h時(shí)均能增強(qiáng)NF-kBp65向核轉(zhuǎn)位，而在24h和60h時(shí)其核轉(zhuǎn)位較模型組減少，相應(yīng)的其抑制蛋白lKBa在3h、6h、12h和24h表達(dá)降低，而在60h有所增加；黑質(zhì)受損后12h，白果內(nèi)酯可提高黑質(zhì)神經(jīng)元HSP60的表達(dá)；在黑質(zhì)損傷24h時(shí)發(fā)現(xiàn)，白果內(nèi)酯可降低促凋亡蛋白p53的表達(dá)；與模型組相比，在6-OHDA注射3h、6h、12h和24h后，白果內(nèi)酯組大鼠黑質(zhì)iNOS蛋白的表達(dá)降低，而Bcl-2的表達(dá)升高。因此，白果內(nèi)酯對(duì)帕金森病大鼠具有治療作用，其作用機(jī)制與雙向調(diào)控NF-kB的激活、降低細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白p53和iNOS的表達(dá)、增加抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60的表達(dá)有關(guān)。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述具體實(shí)施例方式實(shí)施例第一部分白果內(nèi)酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性帕金森病大鼠的治療作用隨著人口老齡化，帕金森病的發(fā)病率正逐漸上升，目前的治療手段主要是藥物治療和手術(shù)治療，其中手術(shù)治療代價(jià)高，風(fēng)險(xiǎn)大，故限制了其推廣。而藥物治療現(xiàn)在主要有多巴胺替代療法，多巴胺受體激動(dòng)劑等，對(duì)黑質(zhì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用的藥物很少。我國是一個(gè)天然藥物大國，中藥資源十分豐富，基于白果內(nèi)酯在抗缺血損傷，神經(jīng)興奮損傷，氧化凋亡中的重要作用，而帕金森病人黑質(zhì)內(nèi)有在氧化應(yīng)激，神經(jīng)細(xì)胞凋亡等，考慮到兩者的相襯之處，故本發(fā)明將探討白果內(nèi)酯對(duì)帕金森病大鼠的治療作用。材料和方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，體重270士5g，清潔級(jí)，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(生產(chǎn)許可證XCYK(蘇)No2002—0008，使用許可證SYXK(蘇)No2002—0037)。2.主要試劑2.1白果內(nèi)酯。2.2左旋多巴，批號(hào)為013K0677,購自SIGMA公司2.3鼠抗TH單克隆抗體，購自SIGMA公司2.46-羥基多巴，批號(hào)為043K4622,購自SIGMA公司2.5水合氯醛，批號(hào)為W20040420,購自上?；瘜W(xué)試劑公司2.6二甲亞砜，批號(hào)為0303B39，購自上海生工生物工程有限公司2.7焦油紫，購自SIGMA公司生產(chǎn)2.8無水乙醇，批號(hào)為0402073601，購自安徽特酒總廠2.9多聚甲醛，批號(hào)為F20010606，購自上?；瘜W(xué)試劑廠2.10生理鹽水，批號(hào)為04030704，購自國營張家港市制藥廠2.11Triton-X100，批號(hào)為BR2681，購自華美生物工程公司2.12牛血清白蛋白，批號(hào)為BP0041,購自華美生物工程公司2.13銀杏總內(nèi)酯(GGs),購自寧波利華制藥有限公司2.14CYTM3驢抗鼠IgG，批號(hào)為56908,購自JacksonImmunoresearchLaboratories,InC公司3.主要儀器3.1立體定位儀，美國Stoelting公司3.2微量注射泵，PO-2213,美國PicoPlusHarvardApparatus公司3.3振動(dòng)切片機(jī)，VT1000S，德國Leica公司3.4微量進(jìn)樣器，200309,中國上海醫(yī)用激光儀器廠3.5熒光顯微鏡，Te2000U，日本Nikon公司3.6脫色搖床，TY-20型，中國上海西巴斯生物技術(shù)開發(fā)有限公司4.實(shí)驗(yàn)方法4.1試驗(yàn)分組和給藥SD雄性大鼠，46只，體重260-280g，隨機(jī)分為六組模型組(Model),小劑量組(L-BB)，中劑量組(M-BB)，大劑量組(H-BB)，假手術(shù)組(Sham)，陽性對(duì)照組(GGs)，除假手術(shù)組6只外，其余各組均8只。白果內(nèi)酯和陽性藥GGs溶解在二甲亞砜和生理鹽水的混合溶劑中(以5:4的比例混合)，小、中、大劑量組大鼠分別腹腔注射5、10、20mg-kg《(T1的白果內(nèi)酯，陽性對(duì)照組大鼠腹腔注射10mgAg+d"的GGs，假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射等量的混合溶劑。手術(shù)前預(yù)防給藥3天，手術(shù)后繼續(xù)給藥4天。6-OHDA溶解于生理鹽水中，濃度為4fig卞r1。除假手術(shù)組大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射2fd的生理鹽水外，其余各組大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射2(d的6-OHDA。4.26-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)制備PD類型實(shí)驗(yàn)前預(yù)試，大鼠黑質(zhì)致密部注射藍(lán)墨水后快速取腦，振動(dòng)切片，鑒定注射部位是否準(zhǔn)確，調(diào)整坐標(biāo)，最后確定黑質(zhì)致密部坐標(biāo)為前囟后5.1mm，左旁開2.1mm,硬腦膜下7.8mm。實(shí)驗(yàn)時(shí)，緩慢進(jìn)針，注射速度0.4nPmiiT1，注射5min，留針lOmin。模型組和假手術(shù)組腹腔注射混合溶劑(DMSO和生理鹽水5:4混合)。手術(shù)后22天，腹腔注射50mg'kg丄d—1L-dopa誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)，注射15miii后記數(shù)各大鼠右側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，模型組小于lOr/min視不成功帕金森病模型。4.3大鼠腦片的制備手術(shù)24天后，4%水合氯醛(0.4g*kg-l)麻醉，打開胸腔，暴露心臟，于左心室開一小口并剪破右心耳，用0.1mol'L-V的PBS左心室灌流至流出液澄清后，用含0.1mol丄"PBS的4%多聚甲醛灌流固定，斷頭取腦，保存在含0.1mol丄'1的PBS的4%多聚甲醛，4'C保存過夜。冠狀面振動(dòng)切片，45fiM。觀察針眼位置，若不在黑質(zhì)部位視手術(shù)不成功并棄之。腦片在30%的甘油中-20'C保存?zhèn)溆谩?.4免疫組化觀察大鼠黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)TH蛋白的變化取上述腦片用0.1mol.L—1PBS清洗兩次，滴加1.0%牛血清白蛋白誦0.iy。TritonX-100后常溫?fù)u床lh，取出腦片并用PBS清洗三次，滴加鼠抗TH單克隆抗體(1:3000)并在常溫下?lián)u床lh，4'C孵育過夜。PBS清洗三次，滴加CYTM3驢抗鼠IgG(1:600)后常溫?fù)u床lh，PBS清洗三次。鋪于載玻片，熒光封閉液覆蓋，加蓋蓋玻片，指甲油封片。熒光顯微鏡10倍物鏡下記數(shù)腦片同一冠狀面SN處的TH陽性細(xì)胞數(shù)，2倍物鏡下觀察紋狀體TH熒光密度。4.5Nissl染色檢測(cè)大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的損傷情況取上述腦冠狀切片貼于載玻片上，自然晾干后，依次浸泡在二甲苯中10min，100%的乙醇中10min，95°/。的乙醇中5min,70%的乙醇中5min，蒸餾水沖洗后放入PH值為3.9的0.5%的焦油紫溶液中染色30min，再用蒸餾水漂洗3min，然后依次在70%的乙醇，PH值為4.1的95%的乙醇，100%乙醇中脫色，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察大鼠黑質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.白果內(nèi)酯對(duì)左旋多巴誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響左旋多巴可誘導(dǎo)6-OHDA損傷大鼠的健側(cè)旋轉(zhuǎn)，白果內(nèi)酯和銀杏總內(nèi)酯可明顯減少左旋多巴誘導(dǎo)的對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)次數(shù)，其中10和20mg-kg—、(T1的白果內(nèi)酯效果非常顯著(P<0.01)(表1.1)。提示白果內(nèi)酯可減少左旋多巴誘導(dǎo)的大鼠對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)。齊糧(mg'kg".d-1)nrotation(r'miiT1)假手術(shù)組6O.OO士O.OO模型組614.55±2.96^L-BB5610.07±2.69M-BB1060.00士0.0(TH-BB2060.00士0.00"GGs1060.00士0.0(T表l.l白果內(nèi)酯對(duì)左旋多巴誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響.注統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示.A表示P^.05，與假手術(shù)組.*和**表示P<0.05、P<0.01，與模型組比較.2.白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞的影響TH免疫組化發(fā)現(xiàn)6-OHDA注射24天后，大鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞幾乎消失。與模型組相比，白果內(nèi)酯組大鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞增多，其中10mg.kg^(T1的白果內(nèi)酯效果最為顯著(P<0.01)，陽性藥銀杏總內(nèi)酯也可減輕TH陽性細(xì)胞的缺失(表1.2，圖1.1和圖1.2)。3.白果內(nèi)酯對(duì)紋狀體TH蛋白表達(dá)的影響TH免疫組化發(fā)現(xiàn)6-OHDA注射24天后，紋狀體TH蛋白消失明顯。而與模型組相比，白果內(nèi)酯組大鼠紋狀體TH蛋白增加，其中10mg，kg^cT1的白果內(nèi)酯效果最為顯著(P<0.01)，陽性藥銀杏總內(nèi)酯也可減輕TH熒光密度的消失(圖1.3)。假手術(shù)組6217.33±16.10模型組64.67±1.21AAL-BB566.67±2.25M-BB10656.50±17.78**H誦BB20641.00±13.28**GGs10648.67±7.97**表1.2白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)殘存TH陽性細(xì)胞的影響.注統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示.AA表示P<0.01，與假手術(shù)組比較.*和**表示P<0.05、P<0.01，與模型組比較.圖1.1損傷黑質(zhì)內(nèi)TH陽性細(xì)胞數(shù).注統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示.#和##表示P<0.05、P<0.01，與假手術(shù)組比較.*和**表示P<0.05、P<0.01，，與模型組比較.n-6圖1.2TH免疫組化顯示白果內(nèi)酯對(duì)損傷黑質(zhì)內(nèi)TH陽性細(xì)胞的保護(hù)作用.假手術(shù)組A(X20)和H(X200).模型組B(X20)和I(X200).L-BB:C(X20)和dJ(X200).M-BB:D(X20)和K(X200).H誦BB:E(X20)和L(X200).GGs:F(X20)和M(X20O).藍(lán)色箭頭指的是TH陽性細(xì)胞.圖1.3免疫熒光顯示白果內(nèi)酯對(duì)同側(cè)紋狀體TH熒光強(qiáng)度的影響.(I)假手術(shù)組A，模型組B，L-BB:C，M-BB:D，GGs:E(X20).(II)圖像分析軟件分析各組大鼠(n=6)同側(cè)紋狀體TH平均熒光強(qiáng)度.統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示.##表示P<0.01，與假手術(shù)組比較.*和**表示卩<0.05、P<0.01，與模型組比較.4.Nissl染色檢測(cè)白果內(nèi)酯對(duì)黑質(zhì)形態(tài)學(xué)變化的影響Nissl染色發(fā)現(xiàn)6-OHDA注射24天后，模型組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元幾乎消失并伴有大量的膠質(zhì)細(xì)胞增生。而與模型組相比，白果內(nèi)酯組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元較多，膠質(zhì)細(xì)胞增生減少，其中10mg'kg《d—1的白果內(nèi)酯效果最為顯著，陽性藥GGs也可減輕神經(jīng)元的缺失(圖1.4)。圖1.4白果內(nèi)酯對(duì)6—OHDA損傷黑質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用.大鼠預(yù)先服用白果內(nèi)酯并用6—OHDA損傷.Nissl染色大鼠腦片.假手術(shù)組A(X20)和G(X200).模型組B(X20)和H(X200).L-BB:C(X20)和I(X200).M-BB:D(X20)和J(X200).H-BB:E(X20)和K(X200).GGs:F(X20)和L(X200).綠色和黃色箭頭分別指向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞.小結(jié)1.大鼠在6-OHDA損傷22天后，L-dopa誘導(dǎo)的大鼠向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)作用可被白果內(nèi)酯抑制。2.白果內(nèi)酯可抑制6-OHDA產(chǎn)生的大鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞及同側(cè)紋狀體內(nèi)TH蛋白減少作用。3.白果內(nèi)酯可抑制6-OHDA產(chǎn)生的大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元減少和膠質(zhì)細(xì)胞增生作用。以上結(jié)果提示白果內(nèi)酯對(duì)6-OHDA所致實(shí)驗(yàn)性大鼠帕金森病具有一定的治療作用。第二部分白果內(nèi)酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性帕金森病大鼠治療作用的機(jī)制研究一、白果內(nèi)酯對(duì)6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元NF-kB通路激活的影響Hunot等用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)PD患者腦中細(xì)胞核內(nèi)NF-kB呈陽性的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量為正常人的70倍，提示NF-kB的激活與PD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，NF-kB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此我們?cè)谶@部分實(shí)驗(yàn)中主要觀察在6-OHDA誘導(dǎo)的黑質(zhì)DA神經(jīng)元死亡過程中細(xì)胞凋亡與NF-kB的關(guān)系，同時(shí)探討白果內(nèi)酯對(duì)NF-kB及其抑制蛋白lKBa的影響。材料與方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，體重270士5g,由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(生產(chǎn)許可證XCYK(蘇)No2002—0008，使用許可證SYXK(蘇)No2002—0037)。2.主要試劑2.2兔抗NF-kBp65多克隆抗體，批號(hào)為弁J119，購自SantaCruz公司2.3鼠抗TH單克隆抗體，購自SIGMA公司2.4兔抗IKBa多克隆抗體，批號(hào)為弁H259，購自SantaCruz公司2.5InSituCellDeathDetectionKit,POD，批號(hào)為11684817910，購自Roch公司2.6CYTM3驢抗兔IgG，購自JacksonImmunoresearchLaboratories'InC公司2.7FITC驢抗鼠IgG，購自JacksonImmunoresearchLiaboratories，InC公司2.8FITC驢抗兔IgG，購自JacksonImmunoresearchLaboratories，InC公司3.主要儀器3.1激光共聚焦顯微鏡，SP2，德國Leica公司3.2電熱鼓風(fēng)干燥箱，CS101-2EB，重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司實(shí)驗(yàn)方法4.1不同劑量的白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)lKBa蛋白的影響4.1.1實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案SD雄性大鼠，34只，體重260-280g，隨機(jī)分為五組模型組(Model),小劑量組(L-BB)，中劑量組(M-BB)，大劑量組(H-BB)，假手術(shù)組(Sham),除假手術(shù)組6只外，其余各組均7只。白果內(nèi)酯溶解在二甲亞砜和生理鹽水的混合溶劑中(以5:4的比例混合)，小、中、大劑量組大鼠分別腹腔注射5、10、20mg，kg丄d"的白果內(nèi)酯，假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射等量的混合溶劑。手術(shù)前預(yù)防給藥3天。大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA方法同論文第一部分所述。4.1.2免疫組化腦片制備取6-OHDA損傷后12h時(shí)間點(diǎn)大鼠。免疫組化腦片制備方法見第一部分4.34.1.3免疫組化觀察大鼠黑質(zhì)lKBa蛋白的變化免疫組化方法見第一部分4.4，其中兔抗lKBa多克隆抗體的稀釋度為1:50,CYTM3驢抗兔IgG為1:800。4.2不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)lKBa蛋白的影響4.2.l實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案90只SD雄性大鼠，260-280g，隨機(jī)分為三組模型組(Model),中劑量組(M-白果內(nèi)酯)，假手術(shù)組(Sham)，除假手術(shù)組6只外，其余各組均42只。白果內(nèi)酯溶解在二甲亞砜和生理鹽水的混合溶劑中(以5:4的比例混合)，中劑量組大鼠腹腔注射10mg，kg"-cT1的白果內(nèi)酯，假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射等量的混合溶劑。手術(shù)前預(yù)防給藥3天。大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射6—OHDA如同論文第一部分所述。4.2.2免疫組化腦片制備分別取黑質(zhì)損傷后3h、6h、12h、24h、48h和60h不同時(shí)間點(diǎn)的模型組和中劑量組大鼠各7只，假手術(shù)在3h時(shí)間點(diǎn)6只。免疫組化腦片制備方法見第一部分4.3。4.2.3免疫組化觀察黑質(zhì)lKBa蛋白的變化方法同本節(jié)4.1.3。4.3不同劑量白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元中NF-KB激活的影響4.3.1實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案方法同本節(jié)4.1.1。4.3.2免疫組化腦片制備腦片是本節(jié)4.1.2保存的腦片。4.3.3免疫組化雙標(biāo)記觀察大鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元中NF-kB蛋白的變化取上述腦片用0.1MPBS清洗兩次，滴加1.0。/。牛血清白蛋白-0.1。/。TritonX-100后常溫?fù)u床lh，取出腦片并用O.lmol'I/1PBS清洗三次，滴加鼠抗TH單克隆抗體(1:3000)和兔抗NF-kBp65多克隆抗體(1:40)，并在常溫下?lián)u床1h，4'C孵育2天。0.1MPBS清洗三次，先滴加FITC驢抗鼠IgG(1:600)，常溫?fù)u床1h，PBS清洗三次。滴加CYTM3驢抗兔IgG(1:800)后常溫?fù)u床lh，0.1rnol.I/1PBS清洗三次。鋪于載玻片，熒光封閉液覆蓋，加蓋蓋玻片，指甲油封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65的轉(zhuǎn)位。4不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)黑質(zhì)DA神經(jīng)元中NF-KB激活的影響4.4.1實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案方法同本節(jié)4.2.1。4.4.2免疫組化腦片制備腦片是本節(jié)4.2.2保存的腦片。4.4.3免疫組化雙標(biāo)記觀察黑質(zhì)DA神經(jīng)元中NF-kB蛋白的變化方法同本節(jié)4.3.3。熒光雙標(biāo)記檢測(cè)NF-kB與細(xì)胞凋亡的關(guān)系4.5.1實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案SD雄性大鼠，12只，體重260-280g，隨機(jī)分為三組模型組(Model),假手術(shù)組(Sham)，SN50組，每組4只。模型組大鼠黑質(zhì)內(nèi)先注射2fil的6-OHDA(4jig卞l—4后留針5min,后注射1(il無生物活性的SN50(10ng卞l—"，留針10min。SN50組大鼠黑質(zhì)內(nèi)先注射2fil的6-OHDA(4ng卞l—^后留針5min，后注射1nl的SN50(—種選擇性的NF-kB核轉(zhuǎn)位抑制劑，10Hg卞廠"，留針10min。假手術(shù)組大鼠黑質(zhì)內(nèi)先注射2jil的生理鹽水后留針5min，之后注射1fil的生理鹽水(10ng^1—"，留針10min。黑質(zhì)坐標(biāo)如前所述。4.5.2大鼠腦片的制備取6-OHDA注射后48h時(shí)間點(diǎn)大鼠。腦片的制備方法同第一部分4.3。4.5.3熒光雙標(biāo)記檢測(cè)NF-kB與細(xì)胞凋亡的關(guān)系取上述腦片用0.1mol.L—1PBS清洗兩次，滴加1.0%牛血清白蛋白-0.1%TritonX-100后常溫?fù)u床lh,取出腦片并用PBS清洗三次，滴加兔抗p65多克隆抗體(1:40)并在常溫下?lián)u床1h，4'C孵育48h。PBS清洗三次，滴加FITC驢抗兔IgG(1:600)后常溫?fù)u床1h，PBS清洗三次。鋪于載玻片，維持腦片潮濕，滴加TUNEL反應(yīng)液于腦片上并加蓋一層塑料薄膜，放于潮濕的盒子中，在37"C電熱鼓風(fēng)干燥箱中孵育1h，取出腦片用0.1mol丄—的PBS清洗干凈，最后熒光封閉液覆蓋，加蓋蓋玻片，指甲油封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察黑質(zhì)p65及TUNEL染色共表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.不同劑量的白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)lKBa蛋白的影響實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，在黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA后12h時(shí)，模型組大鼠黑質(zhì)lKBa蛋白的表達(dá)降低(P^).01)。與比模型組相比，各白果內(nèi)酯組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)lKBa的表達(dá)的更低(P〈0.01)，其中10mg'kg—^d—1的白果內(nèi)酯組最能促進(jìn)大鼠黑質(zhì)lKBa蛋白表達(dá)下降(圖2.1-1.11)。2.不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)黑質(zhì)lKBa蛋白的影響在黑質(zhì)損傷后3h、6h、12h、24h和60h時(shí)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠黑質(zhì)IkBoi的表達(dá)逐漸降低(P〈0.01)。同模型組比較，10mg'kg"'(T1的白果內(nèi)酯組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)lKBa表達(dá)在3h、6h、12h和24h時(shí)較低(P〈0.01)，而在60h時(shí)表達(dá)升高(P〈0.01)(圖2.2-I.11)。3.不同劑量白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元中NF-KB激活的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠黑質(zhì)損傷12h時(shí)，模型組大鼠TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65的核轉(zhuǎn)位顯著；與模型組大鼠比較，白果內(nèi)酯各劑量組均可增強(qiáng)NF-KBp65在該時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)位，其中10mg'kg人d"的白果內(nèi)酯作用最強(qiáng)(圖2.3)。4.不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元中NF-KB激活的影響在黑質(zhì)損傷后3h、6h、12h、24h和60h時(shí)，模型組大鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞中NF-kBp65的核轉(zhuǎn)位逐漸增強(qiáng)，在24h時(shí)達(dá)到高峰，之后持續(xù)激活。10mg*kg—、d"的白果內(nèi)酯對(duì)NF-kBp65的核轉(zhuǎn)位影響不一，其中在3h、6h和12h時(shí)能促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位，而到24h和60h時(shí)又能抑制NF-kBp65的核轉(zhuǎn)位(圖2.4-2.8)。5.熒光雙標(biāo)記檢測(cè)大鼠黑質(zhì)NF-kB與細(xì)胞凋亡的關(guān)系實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠黑質(zhì)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)TUNEL染色，p65蛋白也未發(fā)生核轉(zhuǎn)位，模型組大鼠黑質(zhì)有大量的TUNEL染色陽性細(xì)胞，p65發(fā)生了核轉(zhuǎn)位的細(xì)胞也共表達(dá)了TUNEL染色。而SN50組大鼠黑質(zhì)內(nèi)TUNEL染色相對(duì)減弱，大部分細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)位的p65，這些細(xì)胞中未發(fā)生TUNEL染色。(圖2.9)。圖2.1黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后IkBa的表達(dá).(I)A:假手術(shù)組，B:模型組，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.藍(lán)色箭頭指向黑質(zhì)神經(jīng)元.(X400)(n)黑質(zhì)內(nèi)IkBci陽性細(xì)胞數(shù).注統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示.##表示P<0.01，與假手術(shù)組比較.*和**分別表示P<0.05、P<0.01，與模型組比較.11=6圖2.2黑質(zhì)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)IkBa表達(dá)的影響.(I)假手術(shù)組A，模型組B、D、F、H、J，M國BB:C、E、G、I、K.6—OHDA注射后3h:B和C，6—OHDA注射后6h:D和E，6—OHDA注射后12h:F和G，6—OHDA注射后3h:H和I，6—OHDA注射后60h:J和K.藍(lán)色箭頭指向黑質(zhì)神經(jīng)元.(X400)(II)黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA后IkBa陽性細(xì)胞數(shù)的變化.統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示.##表示P<0.01，與假手術(shù)比較.**表示P<0.01，與模型組比較.11=6圖2.3黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后白果內(nèi)酯對(duì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響.在6-OHDA損傷的黑質(zhì)內(nèi)TH陽性細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)核內(nèi)有p65存在.這種核轉(zhuǎn)位可被白果內(nèi)酯加強(qiáng)其中M-BB效果最強(qiáng).綠色和紅色熒光分別代表TH和NF-kBp65，.標(biāo)尺20jim.圖2.4黑質(zhì)損傷3h后TH陽性細(xì)胞內(nèi)發(fā)祥p65發(fā)生了核轉(zhuǎn)位.這種核轉(zhuǎn)位可被M-BB加劇.綠色和紅色熒光分別代表TH和NF-KBp65，.標(biāo)尺20fim.圖2.5黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA6h后白果內(nèi)酯對(duì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響.在6-OHDA損傷的黑質(zhì)內(nèi)TH陽性細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)核內(nèi)有p65存在.這種核轉(zhuǎn)位可被M-BB加劇.綠色和紅色熒光分別代表TH和NF-kBp65，.標(biāo)尺20(im.圖2.6黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后白果內(nèi)酯對(duì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響.在6-OHDA損傷的黑質(zhì)內(nèi)TH陽性細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)核內(nèi)有p65存在.這種核轉(zhuǎn)位可被M-BB加強(qiáng).綠色和紅色熒光分別代表TH和NF誦kBp65，.標(biāo)尺20fim.圖2.7黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA24h后白果內(nèi)酯對(duì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響.在6-OHDA損傷的黑質(zhì)內(nèi)TH陽性細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)核內(nèi)有p65存在.這種核轉(zhuǎn)位可被M-BB減輕.綠色和紅色熒光分別代表TH和NF陽kBp65，.標(biāo)尺20拜.圖2.8黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA60h后白果內(nèi)酯對(duì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響.在6-OHDA損傷的黑質(zhì)內(nèi)TH陽性細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)核內(nèi)有p65存在.這種核轉(zhuǎn)位可被M-BB減輕.綠色和紅色熒光分別代表TH和NF-kBp65，.標(biāo)尺20拜.圖2.9黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA48h后，p65核轉(zhuǎn)位抑制劑SN50對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響.在6-OHDA損傷黑質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)核內(nèi)p65核TUNEL染色共表達(dá)于同一細(xì)胞中.但在使用SN50后，未發(fā)生p65核轉(zhuǎn)位的神經(jīng)元TUNEL染色減少，TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少.p65和TUNEL染色共表達(dá)由激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)所得.標(biāo)尺40fim.二、白果內(nèi)酯對(duì)6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)促凋亡蛋白p53、iNOS表達(dá)的影響PD患者黑質(zhì)區(qū)可見小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞劇增，iNOS的表達(dá)和活性大為提高，且伴隨黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元的喪失，提示iNOS可能在PD的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。病理?xiàng)l件下，iNOS的表達(dá)和活性增高可誘導(dǎo)產(chǎn)生過多的NO，過多的NO可以介導(dǎo)細(xì)胞損傷。iNOS蛋白是NF-kB核轉(zhuǎn)錄因子的下游調(diào)控蛋白，我們?cè)谶@部分觀察了白果內(nèi)酯對(duì)6-OHDA損傷大鼠SN內(nèi)iNOS蛋白的影響。p53蛋白是一種腫瘤抑制物也是一種重要的凋亡促進(jìn)蛋白，當(dāng)細(xì)胞的DNA受到輻射等因素?fù)p傷時(shí)，p53的N-末端會(huì)因磷酸化而影響其和DNA結(jié)合的能力，從而被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯、衰老、分化、凋亡及介導(dǎo)DNA修復(fù)。p53基因又是NF-kB下游調(diào)控基因，我們的前文的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯對(duì)NF-kB有調(diào)控作用，本節(jié)觀察白果內(nèi)酯對(duì)6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)p53蛋白表達(dá)是否有調(diào)控作用。材料與方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，體重270士5g，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(生產(chǎn)許可證XCYK(蘇)No2002—0008，使用許可證SYXK(蘇)No2002—0037)。2.主要試劑2.1白果內(nèi)酯。2.26-羥基多巴，批號(hào)為043K4622,購自SIGMA公司2.3兔抗iNOS多克隆抗體，批號(hào)為12004，購自中杉金橋生物公司2.4CYTM3驢抗兔IgG，購自JacksonImmunoresearchLaboratories，InC公司2.5鼠抗p53單克隆抗體，批號(hào)為#1018,購自SantaCruz公司2.6免疫組化超敏SP試劑盒，批號(hào)為Kit—9706/9707/9708，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司2.7蘇木精，購自上海化學(xué)試劑公司3.主要儀器同上節(jié)34.實(shí)驗(yàn)方法4.1不同劑量的白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)iNOS蛋白的影響4.1.1實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案方法同本部分第一節(jié)4.1.14.1.2免疫組化腦片制備腦片是本部分第一節(jié)4.1.2保存的腦片。4.1.3免疫組化觀察黑質(zhì)iNOS蛋白的變化方法同本部分第一節(jié)4.1.3，兔抗iNOS多克隆抗體的稀釋度為1:40。4.2不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)iNOS蛋白的影響4.2.1實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案方法同本部分第一節(jié)4.2.14.2.2免疫組化腦片制備腦片是方法同本部分第一節(jié)4.2.2保存的腦片。4.2.3免疫組化觀察大鼠黑質(zhì)iNOS蛋白的變化免疫組化方法同本部分第一節(jié)4.2.3，兔抗iNOS多克隆抗體的稀釋度為4.3不同劑量的白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)p53蛋白的影響4.3.1實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案方法同本部分第一節(jié)4.1.14.3.2免疫組化腦片制備損傷24h時(shí)，大鼠4%水合氯醛(0.4g*kg—"麻醉，打開胸腔，暴露心臟，于左心室開一小口并剪破右心耳，用0.1mol.I/1的PBS左心室灌流至流出液澄清后，以含0.1mol丄"PBS的4。/。多聚甲醛灌流固定，斷頭取腦，保存在含0.1mol'L—1的PBS的4%多聚甲醛中固定6天，脫水，石蠟包埋，冠狀面石蠟切片，片厚2fiM。4.3.3免疫組化觀察黑質(zhì)p53蛋白的變化免疫組化根據(jù)SP超敏試劑盒說明操作(鼠抗p53單克隆抗體的稀釋度為1:40)，最后蘇木精復(fù)染。顯微鏡IO倍物鏡下計(jì)數(shù)黑質(zhì)p53陽性細(xì)胞數(shù)，40倍物鏡下攝影。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.不同劑量的白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)iNOS蛋白的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，黑質(zhì)損傷12h時(shí)模型組大鼠黑質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)iNOS。白果內(nèi)酯使6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)內(nèi)iNOS陽性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.01)。其中10mg-kg-、d—1的白果內(nèi)酯大鼠黑質(zhì)最為顯著(圖2.10—i.n)。2.不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)iNOS蛋白的影響在黑質(zhì)損傷后3h、6h、12h和24h的時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)模型組的大鼠黑質(zhì)iNOS表達(dá)比正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，在12h時(shí)表達(dá)到高峰。10mg'kg-^d-1的白果內(nèi)酯在3h、6h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)都能明顯降低iNOS的表達(dá)(P<0.01)(圖2.10—I.11)。不同劑量的白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)p53蛋白的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，24h時(shí)模型組大鼠黑質(zhì)p53的表達(dá)顯著增加"<0.01)。5mrkg《cT1的白果內(nèi)酯與模型組比較無差異性，但10、20mg.kg—、d-i的白果內(nèi)酯組大鼠黑質(zhì)內(nèi)p53的表達(dá)明顯降低(P〈0.05)(圖2.12—III)。圖2.10黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后iNOS的表達(dá).(I)A:假手術(shù)組，B:模型組，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.(X400)(II)大鼠黑質(zhì)內(nèi)iNOS陽性細(xì)胞數(shù).統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示.##表示P<0.01，與假手術(shù)組比較.**表示P〈0.01，與模型組比較.n=6圖2.11黑質(zhì)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)iNOS表達(dá)的影響.(I)假手術(shù)組A，模型組B、D、F、H，M-BB:C、E、G、I.6-OHDA注射后3h:B和C，6-OHDA注射后6h:D和E，6-OHDA注射后12h:F和G，6-OHDA注射后24h:H和I.(X400)(II)黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA后iNOS陽性細(xì)胞數(shù)的變化.統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示.##表示P<0.01，與假手術(shù)比較.**表示PO.01，與模型組比較.n=6圖2.12黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA24h后p53的表達(dá).(I)A:假手術(shù)組，B:模型組，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.紅色箭頭指向黑質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元(X400)(II)大鼠黑質(zhì)內(nèi)p53陽性細(xì)胞數(shù).統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示.##表示P<0.01，與假手術(shù)組比較.*表示P〈0.05，與模型組比較.n=6三、白果內(nèi)酯對(duì)6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)抗凋亡蛋白Bcl-2、HSP60表達(dá)的影響B(tài)cl-2蛋白是一種重要的凋亡抑制蛋白，增加Bcl-2蛋白的表達(dá)在PD的治療中具有重要的意義。目前，基因水平治療PD主要是轉(zhuǎn)基因治療，但還處于實(shí)驗(yàn)階段，Bcl-2基因是PD的治療基因之一。白果內(nèi)酯以前未見報(bào)道有調(diào)控Bcl-2的作用，因此我們通過6-OHDA誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)降低，在此基礎(chǔ)上觀察白果內(nèi)酯對(duì)Bcl-2表達(dá)的影響。HSP60屬于熱激蛋白，主要存在與線粒體內(nèi)，在胞漿內(nèi)也有少量表達(dá)，在維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)定和保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激及其它損傷中具有重要作用。HSP60在6-OHDA誘導(dǎo)的大鼠黑質(zhì)DA細(xì)胞損傷中的作用未見報(bào)道，前文我們發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯對(duì)Bcl-2表達(dá)有升高作用，而HSP60可升高Bcl-2的表達(dá)，為了探討白果內(nèi)酯升高Bcl-2表達(dá)是否與HSP60有關(guān)，本研究通過觀察6-OHDA注射大鼠黑質(zhì)后HSP60的表達(dá)情況，白果內(nèi)酯對(duì)HSP60的干預(yù)作用，探討B(tài)B神經(jīng)保護(hù)作用是否與HSP60相關(guān)。材料與方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，體重270士5g，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(生產(chǎn)許可證XCYK(蘇)No2002—0008，使用許可證SYXK(蘇)No2002—0037)c2.主要試劑2.1兔抗Bcl-2多克隆抗體，批號(hào)為弁G1403，購自SantaCruz公司2.2兔抗HSP60多克隆抗體，購自SantaCruz公司3.主要儀器3.1立體定位儀，美國Stoelting公司3.2微量注射泵，PO隱2213，美國PicoPlusHarvardApparatus公司3.3振動(dòng)切片機(jī)，VTIOOOS，德國Leica公司3.4熒光顯微鏡，Te2000U,日本Nikon公司4.實(shí)驗(yàn)方法4.1不同劑量的白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)Bcl-2蛋白的影響方法同本部分第二節(jié)4.3.1，其中大鼠在6-OHDA注射12h后進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)Bcl-2蛋白的影響4.2.1實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案方法同本部分第一節(jié)4.2.1。4.2.2免疫組化腦片制備腦片是本部分第一節(jié)4.2.2保存的腦片。4.2.3免疫組化觀察大鼠黑質(zhì)Bcl-2蛋白的變化方法同本部分第一節(jié)4.1.3。不同劑量的白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)HSP60蛋白的影響4.3.1實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案方法同本部分第一節(jié)4.1.1。4.3.2免疫組化腦片制備腦片是本部分第一節(jié)4.1.2保存的腦片。4.3.3免疫組化觀察大鼠黑質(zhì)HSP60蛋白的變化方法同本部分第一節(jié)4.1.3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.不同劑量的白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)Bcl-2蛋白的影響與正常對(duì)照組比，模型組黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2的表達(dá)減少(P〈0.01)，各劑量的白果內(nèi)酯可不同程度地增加bcl-2的表達(dá)，其中10mg'kg—、d—1的白果內(nèi)酯作用最強(qiáng)(P〈0.01)(圖2.13-I.11)。2.不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)大鼠黑質(zhì)Bcl-2蛋白的影響不同時(shí)間點(diǎn)的免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)，在3h時(shí)模型組大鼠黑質(zhì)內(nèi)Bcl-2表達(dá)就顯著降低(PO.Ol)，相應(yīng)的此時(shí)IOmg'kg人d"的白果內(nèi)酯組大鼠Bcl-2表達(dá)升高(P〈0.01)。同樣，在6h、12h和24h時(shí)間點(diǎn)，模型組大鼠黑質(zhì)內(nèi)Bcl-2表達(dá)逐漸、持續(xù)降低，其中在3h-6h時(shí)間段降低幅度較大，到24h時(shí)，其表達(dá)幾乎消失。與模型組相比，10mgAg^(T1的白果內(nèi)酯組大鼠黑質(zhì)在各吋間點(diǎn)都能明顯升高Bcl-2的表達(dá)(P〈0.01)，在6h達(dá)到高峰(圖2.14—I.11)。3.免疫組化檢測(cè)大鼠黑質(zhì)HSP60的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，12h時(shí)模型組大鼠黑質(zhì)HSP60的表達(dá)明顯減少(P<0.01)。5mg.kg-hd-l的白果內(nèi)酯大鼠黑質(zhì)與模型組比較無差異性，但10、20mg*kg-l'd-l的白果內(nèi)酯可顯著增加HSP60的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)(圖2.15—I.11)0圖2.13黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后Bcl-2的表達(dá).(I)A:假手術(shù)組，B:模型組，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.紅色箭頭指向黑質(zhì)神經(jīng)元.(X400)。(II)黑質(zhì)內(nèi)Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù).注統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示.##表示P<0.01，與假手術(shù)組比較.*和**分別表示P<0.05和P<0.01，與模型組比較.n-6圖2.14黑質(zhì)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)Bcl-2表達(dá)的影響.(I)假手術(shù)組A，模型組B、D、F、H，M-BB:C、E、G、I.6-OHDA注射后3h:B和C，6-OHDA注射后6h:D和E，6-OHDA注射后12h:F和G，6-OHDA注射后24h:H和I.藍(lán)色箭頭指向黑質(zhì)神經(jīng)元.(X400)(II)黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA后Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)的變化.統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示.##表示P<0.01，與假手術(shù)組比較."表示P〈0.01，與模型組比較.n=6圖2.15黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后HSP60的表達(dá).(I)A:假手術(shù)組，B:模型組，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.藍(lán)色箭頭指向黑質(zhì)神經(jīng)元.(X400)(II)大鼠黑質(zhì)HSP60陽性細(xì)胞數(shù).統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用學(xué)生t檢驗(yàn).結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示.##表示P<0.01，與假手術(shù)組比較.*和**分別表示P<0.05和P<0.01，與模型組比較.n-6小結(jié)在本實(shí)驗(yàn)條件下，白果內(nèi)酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性帕金森病大鼠的治療作用與下列機(jī)制有關(guān)一.白果內(nèi)酯對(duì)6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)NF-KB通路激活的影響l.大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA誘導(dǎo)NF-kB的抑制蛋白lKBa的降解在3h、6h、12h、24h、60h呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，24h開始加快，60h時(shí)表達(dá)幾乎消失；白果內(nèi)酯在3h、6h、12h和24h時(shí)間點(diǎn)可加劇lKBa的降解，而在60h時(shí)抑制其降解。2.大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA誘導(dǎo)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)的p65發(fā)生核轉(zhuǎn)位，12h后逐漸增強(qiáng)，在24h時(shí)達(dá)到髙峰，之后持續(xù)激活。白果內(nèi)酯在3h、6h和12h時(shí)能促進(jìn)p65發(fā)生核轉(zhuǎn)位，而到24h和60h時(shí)又能抑制NF-kBp65的核轉(zhuǎn)位。3.大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA誘導(dǎo)的TUNEL陽性染色與p65核轉(zhuǎn)位平行，共表達(dá)于同一神經(jīng)元中。而NF-kB轉(zhuǎn)位抑制劑SN50可減輕p65核轉(zhuǎn)位，TUNEL染色明顯減少，提示NF-kB的激活對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。二.白果內(nèi)酯對(duì)6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)促凋亡蛋白p53、iNOS表達(dá)的影響1.大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA后3h、6h、12h、24h，黑質(zhì)細(xì)胞表達(dá)iNOS逐漸增強(qiáng)，在12h達(dá)到高峰，白果內(nèi)酯可降低各個(gè)時(shí)間點(diǎn)iNOS的表達(dá)。2.大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA后24h，可明顯增加黑質(zhì)p53的表達(dá)，白果內(nèi)酯可抑制其表達(dá)。三.白果內(nèi)酯對(duì)6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)抗凋亡蛋白Bc卜2、HSP60表達(dá)的影響1.6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)后6h、12h，Bcl-2的表達(dá)逐漸降低，24h時(shí)幾乎消失，白果內(nèi)酯可恢復(fù)其表達(dá)，其作用在6h達(dá)到高峰，之后逐漸減弱。2.大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后，可使黑質(zhì)HSP60表達(dá)下降，白果內(nèi)酯可恢復(fù)其表達(dá)量。以上結(jié)果提示1.NF-kB通路激活參與6-OHDA誘導(dǎo)的黑質(zhì)神經(jīng)元死亡，白果內(nèi)酯的神經(jīng)保護(hù)作用與其調(diào)控NF-kb激活有關(guān)。2.白果內(nèi)酯通過降低NF-kB的下游靶蛋白p53、iNOS的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用3.白果內(nèi)酯通過升高抗凋亡蛋白Bcl-2、HSP60的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用討論一.白果內(nèi)酯對(duì)帕金森病大鼠的治療作用給大鼠單側(cè)黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA制備6-OHDA單側(cè)損傷大鼠PD模型，因單側(cè)紋狀體內(nèi)DA耗竭，表現(xiàn)為自發(fā)運(yùn)動(dòng)和身體姿勢(shì)不對(duì)稱，比如自發(fā)旋轉(zhuǎn)。由于單側(cè)DA耗竭和DA受體超敏，某些DA受體激動(dòng)劑可誘導(dǎo)單側(cè)黑質(zhì)一紋狀體通路損傷大鼠對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)，這種藥物誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)與大鼠DA耗竭及不對(duì)稱的DA受體激動(dòng)相平行，DA耗竭越嚴(yán)重旋轉(zhuǎn)越厲害，DA受體激動(dòng)的程度越高，旋轉(zhuǎn)也越嚴(yán)重。因此DA受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為可反應(yīng)大鼠黑質(zhì)一紋狀體通路的損傷程度。目前常用于誘導(dǎo)單側(cè)損傷模型大鼠旋轉(zhuǎn)的藥物有阿樸嗎啡(健側(cè)旋轉(zhuǎn))、L-dopa(健側(cè)旋轉(zhuǎn))。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6-OHDA損傷后L-dopa誘導(dǎo)大鼠健側(cè)旋轉(zhuǎn)(IOr.miiT1以上)，這時(shí)的紋狀體內(nèi)TH染色幾乎消失，說明黑質(zhì)紋狀體通路已經(jīng)被嚴(yán)重?fù)p傷，在給予白果內(nèi)酯治療后能夠明顯減少L-dopa誘導(dǎo)大鼠對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)，提示白果內(nèi)酯能夠減輕損傷側(cè)紋狀體內(nèi)DA受體的超敏和DA耗竭，改善PD大鼠的行為缺陷。免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)，6-OHDA單側(cè)損傷大鼠模型中，TH陽性細(xì)胞明顯減少，白果內(nèi)酯能夠保護(hù)大鼠黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞，提示白果內(nèi)酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性PD大鼠具有治療作用。為了進(jìn)一步證實(shí)白果內(nèi)酯保護(hù)黑質(zhì)紋狀體通路免受6-OHDA的神經(jīng)毒性，我們用TH免疫組化法觀察了黑質(zhì)DA陽性細(xì)胞投射在紋狀體的神經(jīng)末梢狀況，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6-OHDA可使紋狀體TH染色消失，由此提示黑質(zhì)DA陽性細(xì)胞投射在紋狀體的神經(jīng)末梢發(fā)生了根本性的退變；而白果內(nèi)酯能夠增加紋狀體內(nèi)的TH陽性密度，也就是保護(hù)了黑質(zhì)DA神經(jīng)元投射在紋狀體的神經(jīng)末梢。為了證實(shí)6-OHDA誘導(dǎo)的黑質(zhì)神經(jīng)元死亡，我們進(jìn)一步的Nissl染色實(shí)驗(yàn)觀察了黑質(zhì)神經(jīng)元胞體的存活情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6-OHDA誘導(dǎo)黑質(zhì)神經(jīng)元死亡，并伴有大量的膠質(zhì)細(xì)胞增生，而在使用白果內(nèi)酯干預(yù)后，6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，膠質(zhì)細(xì)胞增生減少。提示白果內(nèi)酯可保護(hù)黑質(zhì)神經(jīng)元抵抗6-OHDA的神經(jīng)毒性。由上可知，白果內(nèi)酯通過保護(hù)黑質(zhì)DA神經(jīng)元，抑制6-OHDA損傷所致黑質(zhì)DA神經(jīng)元投射在紋狀體上的神經(jīng)末梢退變，減輕紋狀體DA的耗竭和DA受體超敏，從而保護(hù)大鼠黑質(zhì)一紋狀體通路，由此減少6-OHDA損傷所致L-dopa誘導(dǎo)大鼠健側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)，改善PD大鼠的行為缺陷，提示白果內(nèi)酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性帕金森病大鼠有一定的治療作用。1.白果內(nèi)酯調(diào)控6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)NF-kB通路激活NF-KB是一種能與免疫球蛋白K輕鏈基因的增強(qiáng)子KB序列特異結(jié)合的蛋白因子，在細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)、病毒感染等多種刺激后，NF-kB可被激活，從而啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，在機(jī)體的器官發(fā)育、炎癥反應(yīng)、感染和組織損傷中發(fā)揮重要作用。目前，國內(nèi)外許多文章報(bào)道了NF-kB和細(xì)胞凋亡的關(guān)系，有些學(xué)者認(rèn)為NF-kB抗細(xì)胞凋亡，而有些則認(rèn)為NF-kB可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。多數(shù)研究結(jié)果認(rèn)為NF-kB在細(xì)胞凋亡中具有雙向作用，既能保護(hù)細(xì)胞免于凋亡又能促進(jìn)凋亡，其不同作用可能與活化時(shí)間、部位、誘導(dǎo)因子、調(diào)控不同的靶基因DNA序列而轉(zhuǎn)錄不同蛋白質(zhì)進(jìn)而影響凋亡的進(jìn)程、與其同時(shí)激活的其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響等密切相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在6-OHDA損傷后3hNF-KB未被激活，而在6h時(shí)開始激活并進(jìn)入核內(nèi)，隨著時(shí)間的后推，其激活程度逐漸增強(qiáng)，在24h時(shí)達(dá)到高峰，60h時(shí)持續(xù)高表達(dá)，與此相對(duì)應(yīng)的，其胞漿內(nèi)抑制蛋白lKBa在6-OHDA損傷后逐漸降解，3h-6h時(shí)變化相對(duì)較小，在12h時(shí)顯著，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)表達(dá)減少，核內(nèi)表達(dá)增加，而在24h、60h時(shí)其表達(dá)幾乎消失。提示NF-kB信號(hào)通路的激活參與了6-OHDA誘導(dǎo)的黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Tunel與p65雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6-OHDA損傷后60h時(shí)，在黑質(zhì)處，NF-kB激活的神經(jīng)元Tunel染色陽性，但在使用NF-kB核轉(zhuǎn)位抑制劑SN50后，黑質(zhì)凋亡的神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，NF-kB未激活的神經(jīng)元Tunel染色較少，提示NF-kB在6-OHDA注射后60h可促進(jìn)黑質(zhì)神經(jīng)元的凋亡。而大鼠在預(yù)先給予白果內(nèi)酯后，發(fā)現(xiàn)在6-OHDA損傷早期的3h-12h時(shí)，白果內(nèi)酯可誘導(dǎo)NF-kB的核轉(zhuǎn)位及其抑制蛋白lKBa的降解，而在黑質(zhì)損傷后24h、60h時(shí)可明顯抑制NF-kB的激活，且增加其抑制蛋白lKBa表達(dá)，故我們推測(cè)白果內(nèi)酯抑制6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能細(xì)胞凋亡與其調(diào)控NF-kB的激活有關(guān)。其損傷早期觀察到的白果內(nèi)酯促進(jìn)NF-kB激活，可能原因有兩個(gè)在黑質(zhì)損傷早期，白果內(nèi)酯確實(shí)能促進(jìn)NF-kB激活；另外一個(gè)原因可能是模型組大鼠黑質(zhì)在6-OHDA的損傷下黑質(zhì)神經(jīng)元已經(jīng)大量死亡，而白果內(nèi)酯組大鼠因?yàn)榻o予了神經(jīng)保護(hù)劑白果內(nèi)酯，使得大部分的黑質(zhì)神經(jīng)元免于凋亡，這時(shí)觀察到的白果內(nèi)酯促進(jìn)NF-kB激活可能與白果內(nèi)酯組大鼠黑質(zhì)細(xì)胞數(shù)較多有關(guān)。有趣的是，在大鼠黑質(zhì)損傷6h時(shí)，白果內(nèi)酯上調(diào)Bcl-2表達(dá)的作用最強(qiáng)，而這時(shí)其又能促進(jìn)NF-kB的激活，有文獻(xiàn)報(bào)道Bcl-2通過激活NF-kB保護(hù)細(xì)胞免受凋亡，同樣的也有文獻(xiàn)報(bào)道了NF-kB保護(hù)細(xì)胞是通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，因此我們推測(cè)在黑質(zhì)損傷早期這兩者之間相互促進(jìn)，共同發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。但在6-OHDA損傷后24h、60h,NF-kB的持續(xù)激活可能與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，我們的Tunel與p65雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這點(diǎn)，相反地，這個(gè)時(shí)間段內(nèi)發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯可明顯抑制NF-kB的激活及增加IkB(x的表達(dá)，提示白果內(nèi)酯保護(hù)受6-OHDA損傷的黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞的機(jī)制之一可能是在損傷早期先激活NF-kb發(fā)揮抗凋亡作用，而后在NF-kB發(fā)揮促凋亡作用時(shí)抑制其活化。2.白果內(nèi)酯下調(diào)6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)促凋亡蛋白p53、iNOS的表達(dá)前文我們探討了白果內(nèi)酯調(diào)控6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)NF-kB的作用，而受其調(diào)控的下游靶蛋白iNOS和p53在細(xì)胞凋亡中具有重要作用，因此我們研究了白果內(nèi)酯對(duì)它們表達(dá)的影響。自從1987年P(guān)almer等發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞可以合成一氧化氮以來(NO)，其在生理、病理、藥理等的廣泛作用已越來越引起人們的重視。目前的研究業(yè)已證明NO有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)的性能，在一定的條件下NO又能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。NO在體內(nèi)是由L-精氨酸和分子氧在三種不同的一氧化氮合酶(NOS)催化下生成的。根據(jù)NOS的細(xì)胞或組織來源不同，將NOS分為三型nNOS(神經(jīng)元型)、eNOS(內(nèi)皮細(xì)胞型)和iNOS(誘導(dǎo)型)，前二者是原生型，具有鈣離子依賴性表達(dá)，后者在生理?xiàng)l件下不被表達(dá)，當(dāng)神經(jīng)元損傷或免疫機(jī)制參與時(shí)以非鈣離子依賴性表達(dá)，并介導(dǎo)遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。Youdim等研究揭示，PD患者黑質(zhì)區(qū)可見小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞劇增，iNOS的表達(dá)和活性大為提高，且伴隨黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元的喪失，提示iNOS可能在PD的發(fā)生和發(fā)展中起了重要作用。iNOS的表達(dá)和活性增高后可誘導(dǎo)產(chǎn)生過多的NO，過多的NO可以介導(dǎo)細(xì)胞損傷。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)后，黑質(zhì)區(qū)大量表達(dá)iNOS，根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的免疫組化發(fā)現(xiàn)，iNOS的表達(dá)在注射6-OHDA后逐漸增加，在12h時(shí)達(dá)到高峰，間接提示有大量的NO的產(chǎn)生。NO在介導(dǎo)6-OHDA的神經(jīng)毒性中具有重要作用，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯可明顯抑制黑質(zhì)受6—OHDA損傷后各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)iNOS，間接地降低黑質(zhì)NO的產(chǎn)生，減輕6-OHDA的神經(jīng)毒性，從而保護(hù)受6-OHDA損傷的神經(jīng)元。iNOS基因是NF-KB轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游基因之一，所以隨著NF-kb在黑質(zhì)受損后逐漸激活，iNOS蛋白的表達(dá)水平也逐漸升高，在12h達(dá)到髙峰，但隨后的下降可能與黑質(zhì)神經(jīng)元大量死亡有關(guān)。由于iNOS基因轉(zhuǎn)錄激活過程中NF-KB信號(hào)通路不是唯一的途徑，這可能是白果內(nèi)酯在大鼠黑質(zhì)損傷早期促進(jìn)NF-KB激活，但又抑制iNOS表達(dá)的原因。p53蛋白是一種腫瘤抑制物，它可控制蠕蟲、果蠅及人類等大多數(shù)動(dòng)物的細(xì)胞數(shù)。當(dāng)細(xì)胞的DNA受到輻射等因素?fù)p傷時(shí)，p53的N-末端會(huì)因磷酸化而影響其和DNA結(jié)合的能力，從而被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯、衰老、分化、凋亡及介導(dǎo)DNA修復(fù)。若損傷的細(xì)胞處于G1期，p53觸發(fā)細(xì)胞周期限制點(diǎn)。如果損傷的細(xì)胞已進(jìn)入S期，那么p53觸發(fā)細(xì)胞凋亡。P53蛋白通過靶基因P21WAF1/eiP1抑制周期依賴性激酶誘導(dǎo)Gl/S阻滯，還能通過14-3-3sigma抑制Cdc25c參與G2/M關(guān)卡的調(diào)控。Qin等發(fā)現(xiàn)781海人藻酸誘導(dǎo)的大鼠紋狀體細(xì)胞凋亡是通過激活NF-kB，從而增強(qiáng)p53的表達(dá)，使用NF-kB抑制劑SN50能夠減少p53的表達(dá)，因?yàn)閜53基因是NF-kB下游調(diào)控基因，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，證實(shí)了p53在細(xì)胞凋亡中具有十分重要的作用。p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是(1)降低細(xì)胞內(nèi)源性Bcl—2蛋白的表達(dá)并抑制其功能；(2)提高細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白的表達(dá)，使Bcl-2/Bax蛋白比例失調(diào)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6-OHDA損傷后24h,NF-kB的激活達(dá)到高峰，相應(yīng)的，其下游調(diào)控蛋白p53的表達(dá)升高，提示p53在6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用，然而，當(dāng)大鼠預(yù)先給予白果內(nèi)酯后，可明顯抑制6-OHDA誘導(dǎo)的黑質(zhì)細(xì)胞內(nèi)p53表達(dá)的升高，這與白果內(nèi)酯在大鼠黑質(zhì)損傷24h時(shí)抑制NF-kB的轉(zhuǎn)位相呼應(yīng)，提示白果內(nèi)酯保護(hù)受6-OHDA損傷的多巴胺能細(xì)胞與其降低胞內(nèi)p53的蛋白水平有關(guān)，而下調(diào)p53蛋白可能原因是抑制NF-kB的激活。3.白果內(nèi)酯上調(diào)6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)抗凋亡蛋白Bcl-2、HSP60的表達(dá)Bcl-2蛋白是一種重要的凋亡抑制蛋白，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，Bcl-2基因及其表達(dá)蛋白可以抑制多種組織細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命，并且它能抑制多種因素如脂質(zhì)過氧化、電離輻射、血清及生長因子缺乏等引起的細(xì)胞凋亡，故也稱"存活基因"。其主要通過自身二聚或與Bax蛋白形成異二聚體來發(fā)揮其調(diào)控細(xì)胞凋亡的功能，Bax-Bcl-2異二聚體可以抵消Bcl-2-Bcl-2同二聚體的抑凋亡作用，而發(fā)揮促凋亡的功能。線粒體膜上的Bcl-2在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮及其重要的作用，至少在三個(gè)水平發(fā)揮抑制凋亡的功能。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)典的多巴胺能神經(jīng)元毒物6-OHDA可顯著減少黑質(zhì)神經(jīng)元表達(dá)Bcl-2蛋白，在黑質(zhì)損傷后3h時(shí)，其表達(dá)已經(jīng)很低，隨著時(shí)間的延長，表達(dá)逐漸消失。有文獻(xiàn)報(bào)道Bcl-2蛋白可通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子kb來發(fā)揮其抗氧化作用或抑制氧化自由基的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡，因此我們推測(cè)模型組大鼠黑質(zhì)早期NF-kB未能激活可能與早期Bcl-2表達(dá)減少有關(guān)。近來SiRNA研究表明，Bcl-2基因的沉默可以誘導(dǎo)p53依賴的凋亡途徑活化。同樣活化和穩(wěn)定狀態(tài)的p53可以改變Bcl-2的表達(dá)率，從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，推測(cè)模型組大鼠黑質(zhì)p53的激活與損傷早期Bcl-2表達(dá)降低有關(guān)。但是在使用白果內(nèi)酯后Bcl-2表達(dá)明顯升高，在6-OHDA注射6h后這種抑制Bcl-2表達(dá)減少的作用達(dá)到高峰，其表達(dá)升高可能與促進(jìn)NF-kB激活、降低p53的表達(dá)有關(guān)。提示白果內(nèi)酯保護(hù)受6-OHDA損傷的多巴胺能神經(jīng)元的機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。熱休克蛋白(HSPs)是一類廣泛存在于所有原核和真核細(xì)胞內(nèi)，具有高度保守性的蛋白家族，當(dāng)生物細(xì)胞受到某些應(yīng)激剌激和其它損傷因素作用而發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，就會(huì)大量合成，對(duì)細(xì)胞起一定的保護(hù)作用。HSP60是熱休克蛋白家族成員，在大鼠早期發(fā)育及成年時(shí)腦中都有HSP60的基礎(chǔ)表達(dá)，其主要存在于線粒體中，在胞漿中也有少量表達(dá)。在細(xì)胞受到應(yīng)激或損傷時(shí)，有些文獻(xiàn)報(bào)道HSP60表達(dá)升高，而有些則報(bào)道其表達(dá)降低，這可能與細(xì)胞所在環(huán)境和觸發(fā)條件有關(guān)。HSP60保護(hù)細(xì)胞免于凋亡的機(jī)制主要是通過調(diào)控Bcl-2家族和穩(wěn)定線粒體膜電位。過表達(dá)HSP60可增加抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2的表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax和Bad的表達(dá)，升高Bcl-xl的表達(dá)是通過抑制其泛素化之后的蛋白水解，也可與Bcl-xl、Bax結(jié)合形成復(fù)合物，這可能也是HSP60行使抗凋亡的機(jī)制之一。線粒體凋亡途徑的激活主要是由Bcl-2家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比率，而HSP60能夠的上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax和Bad的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6-OHDA可誘導(dǎo)大鼠黑質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元HSP60減少，而使用白果內(nèi)酯后可明顯減輕其表達(dá)減少，此點(diǎn)可能是前文提到白果內(nèi)酯能維持Bcl-2表達(dá)的原因之一，提示白果內(nèi)酯保護(hù)黑質(zhì)神經(jīng)元與其減輕HSP60表達(dá)減少有關(guān)。結(jié)論本發(fā)明首次證實(shí)了植物提取物白果內(nèi)酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性帕金森病大鼠的治療作用及其機(jī)制研究。1.白果內(nèi)酯可減少L-dopa誘導(dǎo)的PD大鼠對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)，改善PD大鼠的行為缺陷，保護(hù)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞抵抗6-OHDA的毒性，保護(hù)黑質(zhì)一紋狀體通路，提示白果內(nèi)酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性帕金森病大鼠具有一定的治療作用。2.本實(shí)驗(yàn)研究顯示NF-kb信號(hào)通路激活參與6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯在黑質(zhì)損傷早期促進(jìn)NF-kB激活，而在損傷后期抑制其持續(xù)激活，因此，白果內(nèi)酯通過雙向調(diào)控黑質(zhì)NF-kB激活，從而保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞。3.白果內(nèi)酯對(duì)6-OHDA所致黑質(zhì)內(nèi)細(xì)胞促凋亡蛋白p53和iNOS的高表達(dá)具有抑制作用。4.白果內(nèi)酯可增加6-OHDA所致?lián)p傷的黑質(zhì)抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60表達(dá)。綜上所述，白果內(nèi)酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠帕金森病具有一定的治療作用，其機(jī)制與雙向調(diào)控NF-kB的激活、降低細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白p53和iNOS的表達(dá)、增加抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60的表達(dá)有關(guān)。基于以上實(shí)驗(yàn)證據(jù)，我們得出結(jié)論白果內(nèi)酯對(duì)帕金森病具有一定的治療作用。圖1.1損傷黑質(zhì)內(nèi)TH陽性細(xì)胞數(shù)；圖1.2TH免疫組化顯示白果內(nèi)酯對(duì)損傷黑質(zhì)內(nèi)TH陽性細(xì)胞的保護(hù)作用；圖1.3免疫熒光顯示白果內(nèi)酯對(duì)同側(cè)紋狀體TH熒光強(qiáng)度的影響；圖1.4白果內(nèi)酯對(duì)6—OHDA損傷黑質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用圖2.1黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后IkBa的表達(dá)；圖2.2黑質(zhì)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)IkBa表達(dá)的影響；圖2.3黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后白果內(nèi)酯對(duì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響；圖2.4黑質(zhì)損傷3h后TH陽性細(xì)胞內(nèi)發(fā)祥p65發(fā)生了核轉(zhuǎn)位；圖2.5黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA6h后白果內(nèi)酯對(duì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響；圖2，6黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后白果內(nèi)酯對(duì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響；圖2.7黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA24h后白果內(nèi)酯對(duì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響；圖2.8黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA60h后白果內(nèi)酯對(duì)TH陽性細(xì)胞內(nèi)NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響；圖2.9黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA48h后，p65核轉(zhuǎn)位抑制劑SN50對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響；圖2.10黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后iNOS的表達(dá)；圖2.11黑質(zhì)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)iNOS表達(dá)的影響；圖2.12黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA24h后p53的表達(dá)；圖2.13黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后Bcl-2的表達(dá)；圖2.14黑質(zhì)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)白果內(nèi)酯對(duì)Bcl-2表達(dá)的影響；圖2.15黑質(zhì)內(nèi)注射6-OHDA12h后HSP60的表達(dá)。權(quán)利要求1.一種白果內(nèi)酯，其特征在于制備治療帕金森病藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開一種白果內(nèi)酯在制備治療帕金森病藥物中的用途，白果內(nèi)酯對(duì)帕金森病大鼠具有治療作用，其作用機(jī)制與雙向調(diào)控NF-κB的激活、降低細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白p53和iNOS的表達(dá)、增加抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60的表達(dá)有關(guān)，據(jù)此說明白果內(nèi)酯對(duì)帕金森病具有一定的治療作用。文檔編號(hào)A61P25/00GK101095674SQ200710022139公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年4月30日優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日發(fā)明者勞安娜,周文軒,梁中琴,殷夢(mèng)龍,秦正紅,趙喜林,郭次儀,陳仲良,顧振綸申請(qǐng)人:蘇州中藥研究所