專利名稱：攜帶hiv基因的腺病毒載體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種密碼子優(yōu)化的多核苷酸或其片段或衍生物。本發(fā)明還涉及由 該優(yōu)化的核酸序列或其片段或衍生物所編碼的多肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明更涉及攜帶 該優(yōu)化的多核苷酸的腺病毒載體及其他病毒載體。該多核苷酸、多肽或蛋白質(zhì)及 攜帶該多核苷酸的病毒載體可用為疫苗，較佳者是用于HIV感染的預(yù)防。二、 背景技術(shù)人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV-1)是獲得性免 疫缺陷綜合癥(Acquired human Immune Deficiency Syndrome, AIDS)的病原 體。艾滋病(AIDS)從發(fā)現(xiàn)至今只有短短的20余年時間，全球艾滋病感染者已經(jīng) 累計達(dá)到6900萬人，其中3200萬人已死亡。目前我國的艾滋病流行已進(jìn)入快速增 長時期，累計感染達(dá)84萬人。專家估計，如果不采取有效措施，不到十年我國就 可能成為艾滋病流行大國，到2010年我國艾滋病感染者有可能達(dá)到1000萬人。 2003年全球艾滋病病毒感染500萬人，全年死亡300萬人。艾滋病流行已經(jīng)成為全 球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題和社會熱點問題。從人類與傳染病斗爭的歷史來看，人類最終戰(zhàn)勝傳染病必須依靠疫苗。盡管 艾滋病疫苗研制難度很大，但歐美發(fā)達(dá)國家仍投入巨資進(jìn)行開發(fā)。艾滋病疫苗的 研究至今已有20年的歷史，在技術(shù)策略上經(jīng)歷了四個階段。第一階段(1984—1993年)是艾滋病疫苗研究的起始階段，主要特點是疫苗以單一的蛋白亞單位疫苗 為主，以誘導(dǎo)抗體預(yù)防病毒感染為主要目標(biāo)，忽視細(xì)胞免疫的作用。結(jié)果是令人 失望的，第二階段U994—1995年)特點是強調(diào)疫苗的細(xì)胞免疫反應(yīng)作用的同 時忽視了體液免疫的作用。該階段的疫苗形式以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的重組病毒載 體疫苗(痘苗、金絲雀痘病毒)為主。第三階段(1996—2002年)總結(jié)了注重 疫苗所誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的均衡。第四階段(2002年一至今)伴隨著 超感染(同一個體先后感染不同的HIV毒株)以及其他病毒逃逸細(xì)胞免疫現(xiàn)象的 發(fā)現(xiàn)，有效抗艾滋病疫苗更加注重激活保守的具有交叉保護作用的細(xì)胞免疫或中 和抗體。迄今為止，已經(jīng)對HIV-1晚期結(jié)構(gòu)蛋白(Structual protein)特異性細(xì)胞 免疫應(yīng)答做了較為廣泛的研究。例如，以結(jié)構(gòu)蛋白Gag、 Pol和Env作為靶標(biāo)抗 原的各種疫苗也相繼進(jìn)入臨床試驗。但其有效性和臨床安全性尚有待進(jìn)一步驗 證。當(dāng)前艾滋病疫苗的主流設(shè)計路線除了選用當(dāng)?shù)亓餍兄甑纳鲜鋈齻€結(jié)構(gòu)蛋白 外，同時還選擇1 —2個調(diào)控蛋白(Regulatory protein,主要是Nef)作為疫苗 組分。由于單一或有限表位疫苗難以奏效，且病毒易逃逸。所以新一代疫苗理論上應(yīng)包含盡量多的抗原基因。但是，對HIV早期表達(dá)的輔助蛋白(Accessory protein,例如Vif、 Vpr和Vpu)和調(diào)控蛋白(兩者統(tǒng)稱為非結(jié)構(gòu)蛋白)的研究 報道較少，特別是聯(lián)合應(yīng)用天然的和經(jīng)基因優(yōu)化的HIV-1的所有輔助蛋白、調(diào)控蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白作為疫苗靶標(biāo)抗原的效果還鮮為人知，從而直接影響了艾滋病疫 苗的研發(fā)。HIV-l調(diào)控蛋白和輔助蛋白在病毒生活周期中起重要作用；功能與序 列也較保守，是設(shè)計HIV-1疫苗中的新靶標(biāo)。聯(lián)合應(yīng)用這些早期表達(dá)的非結(jié)構(gòu)蛋 白與晚期表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白可能更加有效。然而，也有人認(rèn)為多種抗原基因的聯(lián)合 可能造成抗原競爭而導(dǎo)致疫苗的免疫原性下降。HIV調(diào)節(jié)/輔助蛋白的融合蛋白在國際專利W003097675中描述。具體地， WO03097675所述融合蛋白包含Vif、 Vpr、 Vpu、 Rev、 Tat和Nef中的至少四種HIV 蛋白的氨基酸序列或者一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物，其中所述融 合蛋白不被加工成單獨的具有天然N和C末端的HIV蛋白。三、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種密碼子優(yōu)化的多核苷酸或其片段或衍生物。本發(fā)明還涉及由 該優(yōu)化的核酸序列或其片段或衍生物所編碼的多肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及包含至 少一個HIV基因的復(fù)制缺陷型或復(fù)制型腺病毒載體疫苗。而該基因包含人源密碼 子優(yōu)化的，并且該基因適當(dāng)?shù)倪B在異源啟動子后。將本發(fā)明的核酸插入所述病毒 基因組的方法和獲得重組病毒的方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的另一個方面涉及腺病毒載體疫苗，包括一種復(fù)制缺陷型的腺病毒基 因組在腺病毒基因組中沒有功能性的E1基因，E3區(qū)域可刪除或可保留；另一種 是復(fù)制型腺病毒基因組在腺病毒基因組中保留了功能性的E1基因，E3區(qū)域缺失。 這些腺病毒載體疫苗是五型或二型或其他亞型腺病毒。在復(fù)制缺陷型的腺病毒載體中，表達(dá)盒嵌入腺病毒基因組的E1區(qū)域。在復(fù)制 型腺病毒載體中，表達(dá)盒插入腺病毒基因組的E3區(qū)域。該表達(dá)盒包括i)編碼HIV調(diào)控、輔助和/或結(jié)構(gòu)蛋白的核酸，該核酸是密碼子優(yōu)化，利于 人宿主中表達(dá)。選擇表達(dá)HIV的基因序列應(yīng)當(dāng)被優(yōu)化以適于在人細(xì)胞中表達(dá)。四個堿基的三 聯(lián)密碼子有64種情況。事實上，某些氨基酸有多達(dá)六個冗余的密碼子，而其它氨 基酸可能只有一個必須的密碼子。由于還不完全了解的原因，在不同類型細(xì)胞， 內(nèi)源性DNA中存在的簡并密碼子的量不一樣多。似乎在某種類型的細(xì)胞中對某些 密碼子有不同程度的偏好。例如，亮氨酸殘基由六種DNA殘基CTA、 CTC、 CTG、 CTT、 TTA和TTG編碼(它們分別對應(yīng)于mRNA密碼子CUA、 CUC、 CUG、 CUU、 UUA和UUG)。 對微生物基因組密碼子頻率的廣泛深入分析揭示了大腸桿菌內(nèi)源性DNA通常都含 有CTG亮氨酸特異性密碼子，而酵母的DNA通常含有TTA亮氨酸特異性密碼子。考 慮到這種偏好性，通常認(rèn)為在大腸桿菌宿主中獲得富含亮氨酸多肽的高水平表達(dá) 的可能性將某種程度上依賴于密碼子使用的頻率。例如，富含TTA密碼子的基因 可能在大腸桿菌中表達(dá)不高，相似地，當(dāng)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞時，在插入DNA中優(yōu)選使用的密碼子是TTA。利用重組DNA技術(shù)使用優(yōu)化密碼子的意義是很明顯的。在成功轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞中內(nèi)源基因沒能獲得高水平表達(dá)，可能是由于插入的基因中密碼子不太優(yōu)化， 并且用于表達(dá)的宿主細(xì)胞可能不能有效工作。利用重組DNA技術(shù)根據(jù)所選擇的宿 主細(xì)胞的密碼子的偏好性進(jìn)行基因合成。本發(fā)明的一個特征就是含有優(yōu)化的適于 人細(xì)胞中表達(dá)的HIV基因的腺病毒載體。HIV結(jié)構(gòu)蛋白gag、 pol和env以及HIV調(diào)控和輔助蛋白Vif、 Vpr、 Vpu、 Rev、 Tat、 Vpx和Nef的蛋白序列是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。通過實施例，且不限 于所述的實施方案，可參考geneb肌k數(shù)據(jù)庫公開的各種序列，具體是Genbank登 錄號為AY008715 (代表株97CNGX —6F)的HIV—1分離株的序列。在該genbank條 目中，詳述了各種HIV1基因的序列和所述基因編碼的蛋白的序列。攜帶HIV基因的腺病毒載體疫苗包含經(jīng)優(yōu)化的HIV結(jié)構(gòu)蛋白gag和pol以及HIV 調(diào)控蛋白rev、 tat的多核苷酸序列或其片段或衍生物。在此基礎(chǔ)上，它還可以包 含經(jīng)優(yōu)化的輔助蛋白vif、 vpr、 vpu、 vpx和nef。改造及/或優(yōu)化的gag、 pol、 nef、 vpu、 vpr、 vif、 rev及tat序列見實施例。gag基因的492個密碼子中的320個被改 變(65.0%); pol基因的851個密碼子的577個被改變(67.8%); nef基因的207個 密碼子中的121個被改變(58.5%); vpu基因的80個密碼子中的58個被改變 (72.5%); vpr基因的96個密碼子中的57個被改變(59.38%); vif基因的193個密 碼子中的118個被改變(61.14%); rev基因的107個密碼子中的73個被改變 (68.22%)，并在C末端增加了B亞型一致序列的16個氨基酸；Tat基因的96個密碼 子中的55個被改變(57.29%)，并且C末端的5個氨基酸與一致序列不同。i) 一種異源啟動子連在編碼該融合蛋白的核酸的5'端。ii) 一種轉(zhuǎn)錄終止子連在編碼該融合蛋白的核酸的3'端。 優(yōu)選形成所述融合蛋白的HIV蛋白來自同一分化株。根據(jù)可選的實施方案，形成融合蛋白的HIV蛋白來自兩種或更多種分化株。也可能形成所述融合蛋白的 一種或多種HIV蛋白是HIV-1蛋白或HIV-2蛋白。形成所述融合蛋白的HIV蛋白的氨基酸序列優(yōu)選是由已知HIV分離株編碼的 序列，即所述融合蛋白中HIV蛋白的氨基酸序列和天然存在的HIV分離株編碼的相 應(yīng)蛋白的氨基酸序列相同?？蛇x地，融合蛋白中的一種或多種HIV蛋白的氨基酸 序列可以是共有序列，即已知HIV分離株中不出現(xiàn)，但與多種或所有己知的HIV 分離株顯示最佳同源性的序列一特別就CTL表位而言。計算共有序列的計算機算法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。這種編碼HIV全部及/或部分調(diào)控、輔助和/或結(jié)構(gòu)蛋白的核酸能夠產(chǎn)生有效的 免疫應(yīng)答，具體是細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。所述核酸編碼的融合蛋白包含Gag、 Pol、 Nef、 Vpu、 Vif、 Vpr、 Rev、 Tat的所有蛋白或者選自其中的幾種HIV蛋白的氨基 酸序列或者全部及/或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物。該融合蛋白可以包 含其它蛋白的氨基酸序列或其一部分，其它蛋白的實例是HIV Env蛋白。Getggag基因編碼病毒的核心蛋白，翻譯時先形成一個分子量大約55kD的前體蛋白 (p55),然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成p17、 p24、 pl5三個蛋白。p24和pl7 分別參與構(gòu)成HIV顆粒的內(nèi)殼和內(nèi)膜，pl5進(jìn)一步裂解成與病毒RNA結(jié)合的核殼蛋 白p9和p7，輔助逆轉(zhuǎn)錄。Polpol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶類，其中p66蛋白為逆轉(zhuǎn)錄酶，p32蛋白則為整 合酶。從pol和gag基因重疊區(qū)起始的一段序列為pro基因，它編碼蛋白酶p22， p22 在裂解上述HIV蛋白前體形成終末成熟蛋白的過程中起著主要作用。NefNef蛋白主要功能是下調(diào)CD4、 CD8、 CD28和MHC I 、 MHCII分子，從而使HIV病 毒逃逸免疫應(yīng)答；增加病毒的感染力和病毒復(fù)制；同時nef干擾細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路，使細(xì)胞更易受HIV感染；nef調(diào)節(jié)HIV感染細(xì)胞的膽固醇運輸，影響病毒的組 裝、出芽和感染。對于病毒復(fù)制而言非常重要，通過誘導(dǎo)細(xì)胞表面CD4的下調(diào)導(dǎo) 致疾病的迸展。因此，具有降低功能的Nef蛋白顯示降低的與CD4的相互作用。VpuVpu主要誘導(dǎo)CD4受體降解，增加感染細(xì)胞子代病毒的釋放。因此，具有降低 活性的Vpu具有降低的激發(fā)CD4降解的能力。 VifVif主要破壞AP0BEC3G的抗病毒功能，保證病毒的感染性;vif與gag、病毒蛋 白酶及RNA相互作用，有利于病毒的正確裝配和反轉(zhuǎn)錄復(fù)合體穩(wěn)定性，增強反轉(zhuǎn) 錄酶的活性。因此，具有降低活性的Vif蛋白顯示降低的多聚化能力和/或降低的 與核蛋白復(fù)合物的結(jié)合。VprVpr是一個相當(dāng)保守的蛋白，主要介導(dǎo)HIV-l前嵌合復(fù)合體(pre-integarion complex)進(jìn)入核內(nèi)；調(diào)節(jié)G2/M細(xì)胞周期，誘導(dǎo)感染的CD4+T細(xì)胞調(diào)亡，抑制細(xì)胞 和體液免疫反應(yīng)；反式激活LTR和宿主細(xì)胞基因，誘導(dǎo)趨化因子產(chǎn)生。因此，具 有降低活性的Vpr顯示降低的反式激活作用或者甚至不能反式激活和/或與病毒前整合復(fù)合物反應(yīng)。 RevRev主要參與經(jīng)l次剪接或未剪接病毒mRNA從胞核到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運，從而使后續(xù) 的結(jié)構(gòu)蛋白得以表達(dá)；而且rev增加病毒mRNA的穩(wěn)定性和加快mRNA的翻譯。因此， 具有降低活性的Rev顯示與RRE降低的相互作用。TatTat蛋白的主要功能是增加mRNA轉(zhuǎn)錄的起始和延伸效率。在HIV感染急性期產(chǎn) 生的高濃度胞外tat起著病毒毒素的作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制及T細(xì)胞調(diào)亡。最近 研究表明tat抑制Dicer酶的活性從而抑制siRNA的形成及功能。因此，具有降低 活性的Tat蛋白顯示降低的通過TAR元件來反式激活啟動子。在構(gòu)建本發(fā)明的腺病毒載體時，將目的基因插入到質(zhì)?；蛘叽┧筝d體通常是便利的。病毒載體可以在不同的E1互補細(xì)胞系包括293細(xì)胞系和PER. C6中擴增。 這兩種細(xì)胞系都表達(dá)腺病毒E1基因產(chǎn)物。293細(xì)胞系在Graham et al 1977 J. Gen. Virol 36:59-72已有描述。在優(yōu)選的實施例中，El基因從腺病毒載體缺失。HIV表達(dá)盒替代缺失的E1基 因。在另一個優(yōu)選的實施例中，復(fù)制缺陷型腺病毒基因組沒有功能性的E1基因， 并且優(yōu)選地，E3基因被缺失了。優(yōu)選所述病毒載體，尤其是腺病毒載體的病毒基因組中除了包含本發(fā)明的融 合蛋白的編碼序列以外，還可以包含HIVErw基因。如上述，融合蛋白中HIV蛋白 的順序可以改變，除Ad5—n3vrt印外，還包括Ad5-gpn3vrt等等。根據(jù)實施方案， 所有HIV基因可位于該病毒基因組的相同插入位點。在可選的實施方案中，所述 其它基因被插入該病毒基因組的不同位點上。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及 將本發(fā)明的核酸、載體或融合蛋白用作至少部分預(yù)防HIV感染和AIDS的疫苗。四

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。 圖l是融合基因的示意圖。圖2是融合基因n3vrtgp插入腺病毒基因組的策略。 圖3是pAd5-gp腺病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建過程。 圖4表達(dá)的Western Blot分析1、 Ad5-厶E1AE3感染293細(xì)胞2、 Pre-stained protein ladder3、 Ad5-gag感染293細(xì)胞4、 Ad5-gagpol感染293細(xì)胞5、 Ad5-n3vrt感染293細(xì)胞。圖5腺病毒HIV疫苗gag多肽elispot刺激結(jié)果。五具體實施方式
HIV基因組的單基因可通過合成技術(shù)制備。GC含量平均為60X，各段分布在 52%-73%之間。其中實施例lHIV1 gag疫苗序列1、 08BC gag共有序列來自lanl，序列為MGARAS I LRGGKL麗EK I RLRPGGKKHYMLKHL爾SRELERFALNPGLLETSEGCKQIIKQLQPALQTGTEELRSLF NTVATLYCVHAEIEVRDTKEALDKIEEEQNKIQQKTQQAKEADEKVSQNYPIVQNLQGQMVHQPLSPRTLNAWVKVVEE KAFSPEVIPMFTALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKDTINEEMEWDRLHPVHAGPVAPGQMREPRGSDIAGTT STLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIKQGPKEPFRDYVDRFFKTLRAEQATQDVK匪TD TLLVQNANPDCKTILRALGPGASLEEMMTACQGVGGPSHKARVLAEAMSQTNNTILMQRSNFKGSKRIVKCFNCGKEGH IAKNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTERQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQSRPEPTAPPAESFRFEETTPAPKQEPKDR EPLTSLRSLFGSDPLSQ2、以下為完整的含有優(yōu)化密碼子的HIV1 (CRF08BC) gag序列。atgggcgccagggcctccatcctgaggggcggcaagctggacaagtgggagaagatcaggctgaggcctggcggcaagaagcactacatgctgaagcatctggtctgggcctccagggagctggagaggtttgccctgaaccctggcctgctggagacctctgagggctgcaagcagatcatcaagcagctgcagcctgccctgcagacaggcacagaggagctgaggtccctgttcaacacagtggccaccctgtactgtgtgcatgctgagattgaggtgagggacaccaaggaggccctggacaagattgaggaggagcagaacaagatccagcagaagacccagc鄉(xiāng)ccaaggaggctgatgagaaggtctcccagaactaccccattgtgcagaacctgcagggccagatggtgcatcagcccctgtcccccaggaccctgaatgcctgggtgaaggtggtggaggagaaggccttctcccctgaggtgatccccatgttcacagccctgtctgagggcgccaccccccaggacctgaacaccatgctgaacacagtgggcggccatcaggctgccatgcagatgctgaaggacaccatcaatgaggaggctgctgagtgggacaggctgcatcctgtgcatgctggccctgtggcccctggccagatgagggagcccaggggctctgacattgctggcaccacctccaccctgcaggagcagattggctggatgaccaacaaccctcccatccctgtgggcgagatctacaagaggtggatcatcctgggcctgaacaagattgtgaggatgtactcccccacctccatcctggacatcaagcagggccccaaggagccattcagggactatgtggacaggttcttcaagaccctgagggctgagcaggccacccaggatgtgaagaactggatgacagacaccctgctggtgcagaatgccaaccctgactgcaagaccatcctgagggccctgggccctggcgcctccctggaggagatgatgacagcctgccagggcgtgggcggcccatcccacaaggccagggtgctggctgaggccatgtcccagaccaacaacaccatcctgatgcagaggtccaacttcaagggctccaagaggattgtgaagtgcttcaactgtggcaaggagggccacattgccaagaactgcagggcccccaggaagaagggctgctggaagtgtggcaaggagggccatcagatgaaggactgcacagagaggcaggccaacttcctgggcaagatctggccatcccacaagggcaggcctggcaacttcctgcagtccaggcctgagcccacagccccccctgctgagtccttcaggtttgaggagaccacccctgcccccaagcaggagcccaaggacagggagcccctgacctccctgaggtccctgtttggctctgaccccctgtcccagtaaa實施例2HIV1 pol疫苗序列1、 08BC pol共有序列來自lanl，序列為FFREILAFPQGEAREFPPEQT畫SPTSRELQVRG酵SSEAGTERQGTLNFPQITLWQRPLVSI KVGGQIKEALLDTGADDTVLEEVNLPGKWKPKMIGGIGGFIKVRQYEQIPIEICGKKAIGTVLVGPTPV NIIGRNMLTQLGCTLNFPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALTAICDEMEKEGKITKIGP DNPYNTPIFAIRKKDSSKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLD KDFRKYTAFTIPSVNNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQCSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVG SDLEIGQHRTKIEELREHLLKWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIQLPEKDSWTVNDIQK LVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGAKALTDIVPLTEEAELELAENREILKEPVHGAYYDPSKELIAE IQKQGQDQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAKMRTAHTNDVKQLTEAVQKIAMESIVIWGKIPKFRLPIQKET WETWWTDYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKDPIAGVETFYVDGAANRETKIGKAGYVTDRGRKKI VSLTDTTNQKTELQAIYIALQDSGSEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVNQIIEQLIKKERVYLSW VPAHKGIGGNEQVDKLVSNGIRKVLFLDGIDKAQEEHEKYHSNWRAMASDFNLPPIVAKEIVASCDQCQ LKGEAMHGQVDCSPGIWQLDCTHLEGKIILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFILKLAGRWPVKVI HTDNGSNFTSAAVKAACWWAGIQQEFGIPYNPQSQGVVESMNKELKKLIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFI HNFKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDIQTRELQKQIIKIQNFRVYYRDSRDPIWKGPAKLLWKGEGAVVI QDNSDIKVVPRRKAKIIKDYGKQMAGADCVAGRQDED2、 改造步驟為缺失N端151個aa ，并在N端加了M A兩個aa。這樣得到的08—BC pol不具有蛋白酶的活性。并在08—BCpol上做下表9個突變。這樣突變后的08一BC pol不具有反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶、整合酶的活性。aa residue,t-頓aaenzvmc functionAsp112A!aRTAsp187A!aRTAsp188A!aRTAsp445AJaRNaseHGlu480AlaRNaseHAsp500AlaAsp626AlaIN八sp678AlaINC'u714AlaIN3、以下為完整的改造后的含有優(yōu)化密碼子的HIV1 (CRF08BC) pol序列。Atggcccccatctcccccattgagacagtgcctgtgaagctgaagcctggcatggatggccccaaggtgaagcagtggcccctgacagaggagaagatcaaggccctgacagccatctgtgatgagatggagaaggagggcaagatcaccaagattggccctgacaacccatacaacacccccatctttgccatcaggaagaaggactcctccaagtggaggaagctggtggacttcagggagctgaacaagaggacccaggacttctgggaggtgcagct鵬catcccccatcctgctggcctgaagaagaagaagtctgtgacagtgctggctgt鵬cgatgcctacttctctgtgcccctggacaaggacttcaggaagtacacagccttcaccatcccctctgtgaacaatgagacccctggcatcaggtaccagtacaatgtgctgccccagggctggaagggctcccctgccatcttccagtgctccatgaccaagatcctggagccattcaggaagcagaaccctgacattgtgatctaccagtacatggctgccctgtatgtgggctctgacctggagattggccagcacaggaccaagattgaggagctgagggagcatctgctgaagtggggcttcaccacccctgacaagaagcatcagaaggagcccccattcctgtggatgggctatgagctgcatcctgacaagtggacagtgcagcccatccagctgcctgagaaggactcctggacagtgaatgacatccagaagctggtgggcaagctgaactgggcctcccagatctaccctggcatcaaagtgaggcagctgtgcaagctgctgaggggcgccaaggccctgacagacattgtgcccctgacagaggaggctgagctggagctggctgagaacagggagatcctgaaggagcctgtgcatggcgcctactatgacccatccaaggagctgattgctgagatccagaagcagggccaggaccagtggacctaccagatctaccaggagccattcaagaacctgaagacaggcaagtatgccaagatgaggacagcccacaccaatgatgtgaagcagctgacagaggctgtgcagaagattgccatggagtccattgtgatctggggcaagatccccaagttcaggctgcccatccagaaggagacctgggagacctggtggacagactactggcaggccacctggatacctgagtgggagtttgtgaacaccccccccctggtgaagctgtggtaccagctggagaaggaccccattgctggcgtggagaccttctatgtggctggcgctgccaacagggagaccaagattggcaaggctggctatgtgacagacaggggcaggaagaagattgtctccctgacagacaccaccaaccagaagacagccctgcaggccatctacattgccctgcaggactctggctctgaggtgaacattgtgacagcctcccagtatgccctgggcatcatccaggcccagcctgacaagtctgagtctgagctggtgaaccagatcattgagcagctgatcaagaaggagagggtctacctgtcctgggtgcctgcccacaagggcattggcggcaatgagcaggtggacaagctggtctccaatggcatcaggaaggtgctgttcctggatggcattgacaaggcccaggaggagcatgagaagtaccactccaactggagggccatggcctctgacttcaacctgccccccattgtggccaaggagattgtggcctcctgtgaccagtgccagctgaagggcgaggccstgcatggccaggtggactgctcccctggcatctggcagctggcctgcacccatctggagggcaagatcatcctggtggctgtgcatgtggcctctggctacattgaggctgaggtgatccctgctgagacaggccaggagacagcctacttcatcctgaagctggctggcaggtggcctgtgaaggtgatccacacagccaatggctccaacttcacctctgctgctgtgaaggctgcctgctggtgggctggcatccagcaggagtttggcatcccatacaacccccagtcccagggcgtggtggcctccatgaacaaggagctgaagaagctgattggccaagtgagggaccaggctgagcatctgaagacagctgtgcagatggctgtcttcatccacaacttcaagaggaagggcggcattggcggctactctgctggcgagaggattgtggacatcattgccacagacatccagaccagggagctgcagaagcagatcatcaagatccagaacttcagggtctactacagggactcc agggaccccatctggaagggccctgccaagctgctgtggaagggcgagggcgctgtggtgatccaggacaactctgacatcaaggtggtg cccaggaggaaggccaagatcatcaaggactatggcaagcagatggctggcgctgactgtgtggctggcaggcaggatgaggactaaa實施例3HIV1 nef疫苗序列1、 08BC nef共有序列來自lanl，序列為 MGGKWSKSSIVGWPAIRERIRRTEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTADTNADCAWLETQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTFKGALDLSFFLKEKGGLEGLIYSKKRQEILDLWVYHTQ GYFPDWHNYTPGPGVRFPLTFGWCFKLVPVDPREVEEANEGEDNCLLHPVCQHGMEDEH REVLKWKFDSQLAHRHRARELHPEFYKDC2、 改造步驟為Nef發(fā)揮大多數(shù)功能需要肉豆蔻基化位點(第2位氨基酸甘氨 酸G2，第164和165位的亮氨酸Leu-164-Leu-165)，將這三個位點都突變?yōu)楸?氨酸，Nef功能上是失活的。3、 以下為完整的含有優(yōu)化密碼子的HIV1 (CRF08BC) nef序列。Atggctggcaagtggtccaagtcctccattgtgggctggcctgccatcagggagaggatcaggaggacagagcctgctgctgatggcgtgggcgctgtctccagggacctggagaagcatggcgccatcacctcctccaacacagctgacaccaatgctgactgtgcctggctggagacccaggaggaggaggaggtgggcttccctgtgaggccccaggtgcccctgaggcccatgaccttcaagggcgccctggacctgtccttcttcctgaaggagaagggcggcctggagggcctgatctactccaagaagaggcaggagatcctggacctgtgggtctaccacacccagggctacttccctgactggcacaactacacccctggccctggcgtgaggttccccctgacctttggctggtgcttcaagctggtgcctgtggaccccagggaggtggaggaggccaatgagggcgaggacaactgtgctgcccatcctgtctgccagcatggcatggaggatgagcacagggaggtgctgaagtggaagtttgactccc縛ctggcccacaggcacagggccagggagctgcatcctgagttctacaaggactgctaaa實施例4HIV1 vpu疫苗序列1、 08BC vpu共有序列來自lanl，序列為 MLDLELAVGALIVALIIAIVVWTIVYIEYRRLVKQRKIDWLIKRIRERAEDSGNESEGDTEELSTMVDMGRLRLLDVNDL2、 以下為完整的含有優(yōu)化密碼子的HIV1 (CRF08BC) vpu序列 Atgctggacctggagctggctgtgggcgccctgattgtggccctgatcattgccattgtggtctggaccattgtctacattgagtacaggaggc tggtgaagcagaggaagattgactggctgatcaagaggatcagggaga鵬ctgaggactctggcaatgagtctgagggcgacacagag gagctgtccaccatggtggacatgggcaggctgaggctgctggatgtgaatgacctgtaaa實施例5HIV1 vif疫苗序列1、 08BCvif共有序列來自lanl，序列為 MENRWQVLIVW()VDRMKIRTWNSLVKHHMYVSRRANGWFYRHHYDSRHPKVSSEFADSAIRKAILGHVVIPRCDYQAGHNNKVGSLQYLALTALIKPKRIKPPLPSIKKLVEDR^ NPQKIRGRRGNHT副GH2、 以下為完整的含有優(yōu)化密碼子的HIV1 (CRF08BC) vif序列 Atggagaacaggtggcaggtgctgattgtctggcaggtggacaggatgaagatcaggacctggaactccctggtgaagcatcacatgtatgtctccaggagggccaatggctggttctacaggcatcactatgactccaggcatcccaaggtctcctctgaggtgcacatccccctgggcgaggccaggctggtgatcaagacctactggggcctgcagacaggcgagagggactggcatct鵬ccatggcgcctccattgagtggaggctgaggtcctacaacacccagattgagcctggcctggctgaccagctgatccacatgtactactttgactgctttgctgactctgccatcaggaaggccatcctgggccatgtggtgatccccaggtgtgactaccaggctggccacaacaacaaggtgggctccctgcagtacctggccctgacagccctgatcaagcccaagaggatcaagccccccctgccatccatcaagaagctggtggaggacaggtggaacaacccccagaagatcaggggcaggaggggcaaccacaccatgaatggccactaaa實施例6HIVI vpr疫苗序列1、 08BCvpr共有序列來自lanl，序列為 MEQPPEDQGPQREPYNEWTLELLEELKQEAVRHFPRPWLHGLGQYVYETYGDTWTGVETIIRILQQLLFIHFRIGCQHSRIGIVRQRRARNGASRS2、 以下為完整的含有優(yōu)化密碼子的HIV1 (CRF08BC) vpr序列 Atggagcagccccctgaggaccagggcccccagagggagccatacaatgagtggaccctggagctgctggaggagctgaagcaggag gctgtgaggcacttccccaggccatggctgcatggcctgggccagtatgtctatgagacctatggcgacacctggacaggcgtggagaccat catcaggattctgcagcagctgctgttcatccactttaggattggctgccagcactccaggattggcattgtgaggcagaggagggccaggaa tggcgcctccaggtcttaaa實施例7HIV1 rev疫苗序列1、 08BC rev共有序列自己比對(下述四個病毒株基因組中Rev序歹iJ)得到，但在 N端補上B型consensus的相應(yīng)序列QILVESPAVLESGTKE,序列為MAGRSGDSDEALLRAVRIIKILYQSNPYPEPRGTRQARKNRRRRWRARQNQIHSISER ILSTCLGRPTEPVPLQLPPLERLHITDSERGGTSGTQQPQGTTEGVGSPQILVESPAVLESGT KEAccession Number Strain NameAF286229 98CN006AY008715 97CNGX—6FAY008716 97CNGX—7FAY008717 97CNGX 9F2、以下為完整的含有優(yōu)化密碼子的HIV1 (CRF08BC) rev序列Atggctggcaggtctggcgactctgatgaggccctgctgagggctgtgaggatcatcaagatcctgtaccagtccaacccataccctgagcccaggggcaccaggcaggccaggaagaacaggaggaggaggtggagggccaggcagaaccagatccactccatctctgagaggattctgtccacctgcctgggcaggcccacagagcctgtgcccctgcagctgccccccctggagaggctgcacatcacagactctgagaggggcggcacctctggcacccagcagccccagggcaccacagagggcgtgggctccccccagatcctggtggagtcccctgctgtgctggagtctggcaccaaggagtaaa實施例8HIV1 tat疫苗序列1、 08BCtat共有序列自己比對(下述四個病毒株基因組中Rev序列)得到Accession NumberAF286229AY008715AY008716AY008717Strain Name 98CN006 97CNGX—6F 97CNGX—7F 97CNGX 9F說明書第10/15頁MEPVDPNLEPWNHPGSQPETACNNCYCKRCSYHCLVCFQKKGLG1SYGRKKRRQRR SAPQSSEDHQNLISKQSLPRTQGDQAGSEESKKKVESKTKPDPFDTat基因是使用含有終止密碼子的寡核苷酸合成的，該基因?qū)⒈徊迦刖幋a本 發(fā)明的融合蛋白的核酸的最后的位置，并因此應(yīng)當(dāng)含有正確終止多聚蛋白的翻譯 的終止三聯(lián)密碼、2、以下為完整的含有優(yōu)化密碼子的HIV1 (CRF08BC) tat序列Atggagcctgtggaccccaacctggagccatggaaccatcctggctcccagcctgagacagcctgcaacaactgctactgcaagaggtgctcctaccactgcctggtctgcttccagaagaagggcctgggcatctcctatggc鄉(xiāng)aagaagaggaggcagaggaggtctgccccccagtcctctgaggaccatcagaacctgatctccaagcagtccctgcccaggacccagggcgaccaggctggctctgaggagtccaagaagaaggtggagtccaagaccaagcctgacccatttgactaaa實施例9融合蛋白DNA的獲得:編碼HIV Optn3vrtgp融合蛋白的DNA的生成。 合成 3vrt 基因。合成 nef上游引物 ， 5-GCAAGCTTATGGCTGGCAAGTGGTCCAAGTC-3 ， nef 下游引物， 5-TGGGATCCGCAGTCCTTGTAGAACTCAGG-3。擴增出的nef基因在5'端和3， 端分別帶上了 Hind III與BamH I位點，同時去掉TAA終止密碼子，再與Hind III 及BamH I雙酶切后的pGAl-3vrt連接即得到pGAl- n3vrt。 pGAl- n3vrt與pAd5 重組即得到pAd5-n3vrt。重組步驟如下用SgrAl和BstZ171限制性內(nèi)切酶酶切 帶有pGAl- n3vrt穿梭質(zhì)粒載體，Clal線性化El/E3基因缺失的pAd5質(zhì)粒載體， 酶切產(chǎn)物共轉(zhuǎn)化A/5/W感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆酶切和PCR鑒定，將陽性克隆 轉(zhuǎn)化sure感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)一步鑒定。得到鑒定正確的pAd5-n3vrt腺病毒載體質(zhì)粒。 pAd5-gp腺病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建過程見圖3。Ad5-gp與Ad5-n3vrt。這兩個病毒均已拯救出來，并WB驗證過無誤。 Western Blot檢測將成功構(gòu)建的pAd5-n3vrt及pAd5-gp感染HEK293細(xì)胞，24小時后棄去培養(yǎng)上清，用PBS洗兩遍細(xì)胞，加SDS-PAGE上樣緩沖液，水浴煮10分鐘，用Western blot檢測蛋白表達(dá)。如圖4所示，Ad5-gag感染293細(xì)胞后為可見55kD的明顯條帶。Ad5-gagpol感染293細(xì)胞后在145kD處可見到明顯條帶。Ad5-n3vrt感染293細(xì)胞后檢測出一條80kd的條帶。實施例IO攜帶優(yōu)化過的08BC n3vrtgp 5型腺病毒的獲得、擴增及純化用引物擴增出n3vrt片段(兩端分別帶上了 Hind III位點，同時去掉TAA終 止密碼子，與pGAl-gp連接即得到pGAl-n3vrtgp。 pGAl-n3vrtgp與pAd5重組 即得到pAd5-n3vrtgp。重組步驟如上所述。見圖2。將鑒定正確的重組腺病毒載體質(zhì)粒用？acl線性化，利用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染Trex293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天鋪Trex293至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2X105，次日 晨待細(xì)胞達(dá)70%左右匯集度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后8-10天內(nèi)出現(xiàn)病毒斑。10-15天細(xì)胞 開始出現(xiàn)明顯的CPE現(xiàn)象，將細(xì)胞連同培養(yǎng)基一起收集，凍融三次后低速離心去 除細(xì)胞碎片。取部分上清凍存于超低溫冰箱。部分上清繼續(xù)感染細(xì)胞得到第二代 病毒，提取病毒DNA進(jìn)行酶切和PCR鑒定，確保拯救的重組腺病毒正確無誤。用Trex293細(xì)胞大量擴增重組腺病毒，CsCl密度梯度離心純化兩次。以10mM Tris (pH8.0)， 2mMMgC12， 5%蔗糖緩沖液透析病毒。應(yīng)用TCIDso法檢測純化 后重組腺病毒的滴度。實施例ll 腺病毒HIV疫苗免疫原性的驗證每組4只2—4kg恒河猴，雌雄各半(檢測證實SRV、 STLV和SIV陰性)。用胰 島素注射器(BD),分別在猴子兩側(cè)三角肌進(jìn)行單點肌肉注射。每側(cè)注射0.51111(病 毒用PBS稀釋至濃度為10Allvp/ml); 20060830第一次免疫，20061213初免后15 周加強免疫。每次免疫后按照4周間隔靜脈釆血，分離PBMCs，用ELISPOT和ICS 檢測細(xì)胞免疫應(yīng)答。以gag多肽刺激為例，結(jié)果如圖5所示，初次免疫后，能夠激 發(fā)較強的抗原特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。加強免疫后，Ad2亞型腺病毒載體能夠克服 初免激發(fā)的針對Ad5的中和抗體。PBMC分離按實際所需用量配制好95X的Opti-prep(達(dá)科為，AS1114542); 全血與95X的Opti-prep比例為8: 1，如用8ml全血，則需lml 95X的Opti-prep， 用無菌水稀釋好95X的Opti-prep;顛倒混勻全血，準(zhǔn)確混勻8ml全血與lml 95% 的Opti- prep，上下顛倒數(shù)次以充分混勻，之后沿壁輕輕地在上層液面加入lml RO;水平轉(zhuǎn)子800g-1000g， 20°C，離心30min;吸取淋巴細(xì)胞層，用R0重懸(R0 體積以能填滿15ml離心管為準(zhǔn))，水平轉(zhuǎn)子250g， 20°C，離心8min;棄上清， 再用10mlR0重懸(R0體積以能填滿15ml離心管為準(zhǔn))，水平轉(zhuǎn)子250g， 20'C， 離心8min;棄上清，用2mlR10重懸，計數(shù)。Elispot檢測取一管抗猴Y干擾素的多克隆抗體用無菌PBS(PH7，2-7.4)1:100 稀釋，100ul/孔，4'C包被過夜。甩去液體，用無菌PBS洗滌3次，每孔加入200ul R10完全培養(yǎng)基，37。C封閉2小時。封閉期間分離PBMC。釆用95M稀釋的opti-pep 分離淋巴細(xì)胞。棄去封閉液，每孔加入100ulPBMC。實驗中設(shè)陽性對照組(ConA 組)，刺激多肽組(gag等肽庫)，DMSO對照。在37'C 5XC02培養(yǎng)箱中孵育。 24h后，棄去細(xì)胞懸液，用無菌raST220ul/well洗滌6次。甩去洗液，在無菌干燥 紙上扣干。用含5XFBS的PBST按1:400稀釋檢測抗體生物素標(biāo)記的抗猴Y干擾素 的多克隆抗體，100ul/wdl， 4。C過夜。用無菌PBST 220ul/well洗滌4次。甩去洗 液，在無菌千燥紙上扣干。配置鏈霉素偶聯(lián)的堿性磷酸酶用含5XFBS的PBST 按1:2500稀釋鏈霉素偶聯(lián)的堿性磷酸酶(BD PharMingen， Cat#554065)， lOOul/well, 37°C, 2小時。處理BCIP/NBT底物(Pierce, Cat. #34042) ，37。C溫浴 30min。用無菌PBST220ul/well洗滌5次，甩去洗液，在無菌干燥紙上扣干。加入 BCIP/NBT底物，100ul/wel1，避光反應(yīng)7分鐘。棄去底物，用水洗滌2次。風(fēng)干讀 板。攜帶HIV基因的腺病毒載體疫苗<110>中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院 〈120>攜帶HIV基因的腺病毒載體疫苗<160> 8<170> FastSEQ for Windows DEMONSTRATION Version 4. 0<210> 1 <211> 1477 <212> ■ <213>人工序列<400> 1atgggcgccagggcctccatCCtg8ggggCggc卿ctgg8C卿tggg3gaagatcagg60ctgaggcctggcggcaagaagcactacatgctgaagcatctggtctgggcctccagggag120ctgg柳ggtttgccctg肌ccctggcctgctggagacctctg鄉(xiāng)gctgcaagcagatc180atcaagcagctgcagcctgccctgcagacaggcacagaggagctgaggtccctgttcaac240acagtggccaccctgtactgtgtgcatgctg卿Ug郷tg3gggeiC3Ccaaggaggcc300ctggscaagattgaggaggagcagaacaag3tcc3gc3gaagacccagcaggCC3￡Lgg￡tg360gctgatgagaaggtctcccetgaactaccccattgtgcagaacc^gc3gggccagatggtg420catcagcccctgtcccccaggaccctgaatgcctgggtga郷tggtgg3gg卿aggcc■ttctcccctgaggtgatccccatgttcacagccctgtctg郷gcg固ccccccaggac540ctgaacaccatgctgaacac兆tgggcggccatcaggctgccatgcagatgctgaaggac600兆g郷ctgctgeigtgggacaggctgcatcctgtgcatgctggccctgtg660gcccctggcc卿tgagggagccc鄉(xiāng)ggctCtg￡lC3ttgctggcaccacctccaccctg720caggagcagattggctggstg3CC幼C肌Ccctcccatccctgtgggcgsgatctacaag780柳tgg8tC3tcctgggcctgaacaagattgtgaggstgt3CtCCCCC3Cctccatcctg840gacatcaagcagggcccc幼ggagccattc3ggg￡tCt￡ltgtgg3caggttcttcaagacc900ctgsgggctgagcaggccacccaggatgtgaagaactggacctgctggtg960cagaatgccaaccctgactgcaagaccatcctgagggccctgggccctggcgcctccctg1020gaggagatgatgacagcctgccagggcgtgggcggcccatcccaca鄉(xiāng)ccagggtgctg畫gCtg鄉(xiāng)CC8tgtcccagacatcctgatgcagaggtccaacttcaagggc1140tccaagagg8ttgtg卿tgcttcaactgtggc卿gagggccacattgccaag犯ctgc1200agggcccccagg犯g卿ggctgctgg卿tgtggcaaggg3tg幼gg3C1260tgcacagagaggc郷ccttcctgggc肌gatctggcgggc鄉(xiāng)cct1320ggc肌cttcctgcagtccaggcctgagcccscagccccccctgctgagtccttcaggttt1380cccctgccccc卿caggaggggagcccctgacctccctg1440aggtccctgtttggctctgaccccctgtcccagtaaa1477〈210〉 2 <211> 2554 <212> DNA<213>人工序列〈400> 2atggcccccatctcccccattg卿C3gtgcctgtg卿ctgaagcctggcatggatggc60CCC犯ggtg3agcagtggccCCtg3C6Lg3gg8g幼g3tcaaggccctgacagccatctgt120gatg卿tggcaagatcaccaag8ttggccctgacaaccc180cccatctttgccatcaggaagaaggactcctccaagtggaggaagctggtgg3CttC鄉(xiāng)240gagctgaac8agaggacccaggacttctggg鄉(xiāng)tgc柳tgggcatcccccatcctgct300ggcctg,aag肌g8agtctgtgacagtgctggctgtgggcgatgcctacttctctgtg360cccctggacaeiggax;ttc3ggccttcaccatcccctctgtgaac￡iatg￡Lg420acccctggcatcaggtaccagt3C33tgtgctgccccagggctgg肌gggctcccctgcc480atcttccagtgctccatgacc犯gatcctggagccattcagg犯gcagaaccctgacatt540gtgatctaccagtacatggctgccctgtatgtgggctctg3cctggeig3ttggCC3gC3C600aggacc犯gattgaggagctgagggagcatctgctg幼gtggggCttC3Ccacccctgac660aag肌gcatcftg犯ggagcccccattcctgtggatgggctatgagctgcatcctgacaag720tgg6lC3gtgCagcccatccagctgcctgag肌ggactcctgg腦gtg犯tgacatccag780肌gctggtgggcaagctgaactgggcctcccagatctaccctggcatcaa3gtg鄉(xiāng)C8g840ctgtgcaagctgctg鄉(xiāng)ggcgcc犯ggccctgacagacattgtgcccctgacagaggag900gctg鄉(xiāng)tggagctggctgagaacagggagatcctgaaggagcctgtgcatggcgcctac960tatgacccatccaaggagctgattgctgagatccagaagcagggccaggaCC3gtgg3CC翻taccagatctaccEiggsgccattcaagaacctgaagacaggcaagt￡itgcc肌geitg3gg1080acagcccacgiccaatgatgtg卿c鄉(xiāng)tg3C卿ggCtgtgcagaagattgCC3tgg3g1140tccattgtgatctggggcaagatccccaagttcaggctgcccatccagaaggagacctgg1200g卿cctggtggacagactactggcaggcc3CCtgg3t3Cctgagtgggagtttgtgaac12603CCCCCCCCCtggtg卿ctgtggtaccagctgg卿aggaccccattgctggcgtggag1320accttctatgtggctggcgctgccaacaggg3gaccaagattggcaaggctggctotgtg1380ac柳caggggC3gga卿agattgtctccg肌gacagcc1440ctgcaggccatctacattgccctgcaggactctggctctgaggtgaacattgtg3C3gCC1500tcccagtatgccctgggcatcatccaggcccagcctgacaagtctgagtctgsgctggtg1560aaccagatcattgagcagctgatcaagaagg卿gggtctacctgtcctgggtgcctgcc1620C3C肌gggcattggcggc犯tgagcaggtggacaagctggtctccaatggcatcaggaag1680gtgctgttcctggatggcattg3C犯ggCCC3gg3gg3gCCC3CtCC幼C1740tggagggccatggcctctgscttcaacctgccccccattgtggccaaggagattgtggcc1800tcctgtgaccagtgccagctg卿ggcgsggccatgcatggcceiggtggeictgctcccct1860ggcatctggcagctggcctgcacccatctggagggcaagatcatcctggtggctgtgcat1920gtggcctctggctacattgaggctgaggtgatccctgctg3gacaggcc3ggagacagcc1980tacttcatcctg卿ctggctggc郷tggcctgtg鄉(xiāng)gtgatccacacagccaatggc2040tccaacttcacctctgctgctgtg,gctgcctgctggtgggctggcatccagcaggag2100tttggcatcccatac肌cccccagtcccagggcgtggtggcctccatgaac犯gg柳tg2160ttggccaagtgagggaccaggctgagcatctgaagacagctgtgcgigatg2220gctgtcttcatccacaacttcaagaggaagggcggcattggcggcteictctgctggcgag2280aggattgtggacatcattgccacag3catcc鄉(xiāng)ccagggagctgcagaagcagatcatc2340acttcagggtctactacaggg3CtCC3gggaccccatctgg卿ggccct2400gccaagctgctgtggaagggcgagggcgctgtggtgatcctg8C3tC8lElg2460gtggtgcccaggaggaaggccaagatcatc犯ggactatg 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權(quán)利要求
1. 一種攜帶HIV基因的腺病毒載體疫苗，它包含經(jīng)優(yōu)化的HIV結(jié)構(gòu)蛋白gag和pol以及HIV調(diào)控蛋白rev、tat的多核苷酸序列或其片段或衍生物，相關(guān)核苷酸序列如下含有優(yōu)化密碼子的HIV1gag序列atgggcgcca gggcctccat cctgaggggc ggcaagctgg acaagtggga gaagatcagg 60ctgaggcctg gcggcaagaa gcactacatg ctgaagcatc tggtctgggc ctccagggag 120ctggagaggt ttgccctgaa ccctggcctg ctggagacct ctgagggctg caagcagatc 180atcaagcagc tgcagcctgc cctgcagaca ggcacagagg agctgaggtc cctgttcaac 240acagtggcca ccctgtactg tgtgcatgct gagattgagg tgagggacac caaggaggcc 300ctggacaaga ttgaggagga gcagaacaag atccagcaga agacccagca ggccaaggag 360gctgatgaga aggtctccca gaactacccc attgtgcaga acctgcaggg ccagatggtg 420catcagcccc tgtcccccag gaccctgaat gcctgggtga aggtggtgga ggagaaggcc 480ttctcccctg aggtgatccc catgttcaca gccctgtctg agggcgccac cccccaggac 540ctgaacacca tgctgaacac agtgggcggc catcaggctg ccatgcagat gctgaaggac 600accatcaatg aggaggctgc tgagtgggac aggctgcatc ctgtgcatgc tggccctgtg 660gcccctggcc agatgaggga gcccaggggc tctgacattg ctggcaccac ctccaccctg 720caggagcaga ttggctggat gaccaacaac 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caggcagaac cagatccact ccatctctga gaggattctg 180tccacctgcc tgggcaggcc cacagagcct gtgcccctgc agctgccccc cctggagagg 240ctgcacatca cagactctga gaggggcggc acctctggca cccagcagcc ccagggcacc 300acagagggcg tgggctcccc ccagatcctg gtggagtccc ctgctgtgct ggagtctggc 360accaaggagt aaa373含有優(yōu)化密碼子的HIV1tat序列atggagcctg tggaccccaa cctggagcca tggaaccatc ctggctccca gcctgagaca 60gcctgcaaca actgctactg caagaggtgc tcctaccact gcctggtctg cttccagaag120aagggcctgg gcatctccta tggcaggaag aagaggaggc agaggaggtc tgccccccag180tcctctgagg accatcagaa cctgatctcc aagcagtccc tgcccaggac ccagggcgac240caggctggct ctgaggagtc caagaagaag gtggagtcca agaccaagcc tgacccattt300gactaaa 307。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述疫苗，其特征在于它還包含經(jīng)優(yōu)化的輔助蛋 白vif、 vpr、 vpu和nef，相關(guān)核苷酸序列如下含有優(yōu)化密碼子的HIVlvif序列:atggag肌caggtggc柳tgctgattgtctggC8ggtggg3tC3gg3CC60tggaactccctggtg卿C3tcacatgtatgtctccaggagggccaatggctggttctac1208ggC3tC8Ct3tg3CtCC3ggcatcccaaggtctcctctgaggtgcacatccccctgggc180gaggccaggctggtg3tc肌gacctactggggcctgc卿caggcg卿ggg3CtggC3t240CtgggCC3tggcgcctccattgagtgg鄉(xiāng)ctgaggtcctgattgagcct300ggcctggctgaccagctgatccacatgtactactttgactgctttgctgactctgccatc360agg犯ggccatcctgggccatgtggtgatccccaggtgtgactaccaggctggccacaac420咖肌ggtgggctccctgcagtacctggccctgacagccctgatcaagcccaagaggatc480幼gccccccctgccatccatcaagaagctggtggeigg織ggtgga織acccccagaag540atcaggggcaggaggggc犯ccacaccatgaatggccact583;含有優(yōu)化密碼子的HIVlvpr序列 atggagcagc cccctgagga ccagggcccc gagctgctgg aggagctg肌gcaggaggct ggcctgggcc agtatgtcta tgagacctat atcaggattc tgcagcagct gctgttcatc attggcattg tgaggc柳g gagggccaggcagagggagc cstacaatga gtggaccctg 60gtgaggcact tccccaggcc atggctgcat 120ggcgacacct ggacaggcgt ggagaccatc 180cactttagga ttggctgcca gcactccagg 240aatggcgcct ccaggtctta aa 292;含有優(yōu)化密碼子的HIVlvpn序列-atgctggacc tggagctggc tgtgggcgcc gtctggacca ttgtctacat tgagtacagg ctgatcaaga ggatcaggga gagggctgag gaggagctgt ccaccatggt ggacatgggc ta犯ctgattgtgg ccctgatcat tgccattgtg 60 aggctggtga agcagaggaa gattgactgg 120 gactctggca atgagtctga gggcgacaca 180 aggctgaggc tgctggatgt gaatgacctg 240244;含有優(yōu)化密碼子的HIVlnef序列-atggctggca agtggtcc肌gtcctccatt aggagg織g agcctgctgc tgatggcgtg ggcgccatca cctcctccaa cacagctgacgtgggctggc ctgccatcag ggagaggatc 60 ggcgctgtct ccagggeicct gg卿agcat 120 accaatgctg actgtgcctg gctggagacc 180caggaggagg aggaggt鵬cttccctgtg aggccccagg tgcccctgag gcccatgacc 譜ttcaagggcg ccctggacct gtccttcttc ctgaaggaga agggcggcct ggagggcctg 300atctactcca agaagaggca ggagatcctg gacctgtggg tctaccacac ccagggctac 360ttccctgact ggcacaacta cacccctggc cctggcgtga ggttccccct gacctttggc 420ggtgcttca agctggtgcc tgtggacccc agggaggtgg aggaggccaa tgagggcgag 480gacaactgtg ctgcccatcc tgtctgccag catggcatgg aggatgagca cagggaggtg 540ctgaagtgga agtttgactc ccagctggcc cacaggcaca gggccaggga gctgcatcct 600gagttctaca aggactgcta aa 622。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述疫苗，其特征在于它還包含相關(guān)核酸序列或其片段或衍生物編碼的多肽或蛋白質(zhì)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述疫苗，其特征在于它攜帶有相關(guān)多核苷酸腺病毒載體或其它病毒載體。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種腺病毒載體，它攜帶密碼子優(yōu)化的HIV結(jié)構(gòu)基因和/或HIV調(diào)控和輔助基因，以及異源啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子。當(dāng)單獨或者聯(lián)合質(zhì)粒載體疫苗采用初次-加強免疫的方案時，該病毒載體疫苗可以用于預(yù)防HIV感染。
文檔編號A61K48/00GK101219221SQ20071002629
公開日2008年7月16日 申請日期2007年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月12日
發(fā)明者凌 陳, 鑫 馬 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院