專利名稱：用于治療阿爾采末氏病的中藥單體組方的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中醫(yī)藥研究開發(fā)利用領域，具體涉及一種用治療阿爾采末氏病(Alzheimer’s disease，AD)的中藥，可以明顯改善AD所致的學習記憶障礙。
背景技術：
隨著人類平均壽命的逐年增加，阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)已經(jīng)成為威脅人類晚年生活質量的主要疾病之一，AD是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進行性神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為進行性認知功能障礙和記憶力衰退，性格和行為改變，生活自理能力下降等。AD特征性病理病變是在大腦皮層和海馬區(qū)域出現(xiàn)老年斑(senile plaque，SP)和神經(jīng)元纖維纏結(neurofibrillary tangle，NFT)，此外，還有神經(jīng)元顆?？张葑冃?granulovacuolar degeneration，GD)、平野細胞(hirano body，HB)、神經(jīng)元突觸異常、星形細胞增生樣反應等，AD的發(fā)生與β淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)及其前體淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、tau蛋白、載脂蛋白E(ApoE)、早老素(presenilin，PS)等關系密切，其中Aβ是SP的主要物質，在發(fā)病過程中起著極為重要的作用，它的沉積可能是所有因素導致AD的共同途徑，體內外研究表明Aβ的毒性作用主要表現(xiàn)在破壞細胞膜的完整性、擾亂細胞內環(huán)境的穩(wěn)定及誘導細胞發(fā)生凋亡等方面。
關于AD治療方面，包括①抑制Aβ的產生(提高α-分泌酶活性、抑制β-分泌酶和γ-分泌酶活性)促進其降解(如胰島素降解酶IDE)；②抑制神經(jīng)細胞的凋亡(保護線粒體功能、抑制細胞內鈣超載、氧化應激和自由基釋放)；③抑制神經(jīng)膠質細胞激活后促炎因子上升導致的炎癥損傷；④維持膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能；⑤其他降脂治療、雌激素替代治療、神經(jīng)生長因子治療、改善腦循環(huán)和能量代謝、免疫治療、基因治療、免疫治療、神經(jīng)干細胞技術、RNA干擾技術等。
PC12是細胞源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤的細胞株，用神經(jīng)生長因子(NGF)誘導后可長出突起，具有神經(jīng)細胞特性，均質性好，而且容易培養(yǎng)和傳代且細胞特性穩(wěn)定，是一種較為理想的神經(jīng)細胞模型。Aβ對體外培養(yǎng)及在體的神經(jīng)細胞均有神經(jīng)毒性作用，因此越來越多的學者都將Aβ作為研究AD的關鍵。采用Aβ誘導PC12細胞凋亡可建立AD模型具有代表性，且實驗條件易于控制，是體外進行AD研究的理想模型。
根據(jù)文獻檢索的結果，我們知道有大量文獻報道中藥復方可以延緩AD發(fā)生和改善AD的作用。但是組方藥物較多，一般至少為5味以上，多的高達數(shù)10味中藥，且多為自買和自煎為主，品質難以保證。
根據(jù)文獻檢索的結果，我們知道有大量文獻報道中藥復方的可以改善動物的學習記憶障礙。但是組方藥物較多，一般至少為5味以上，多的高達數(shù)10味中藥，且多為自買和自煎為主，品質難以保證。
發(fā)明人先前經(jīng)研究得出的中藥復方(自定義代號Q0409)，由補腎、益氣、安神、醒腦功效的7味中藥組成(補腎蓯蓉，巴戟天，干地黃；益氣人參；安神茯神，遠志；醒腦石菖蒲)。經(jīng)研究證明具有明顯改善動物學習記憶障礙的作用。但是同樣具有藥物較多，品質難以保證的缺點。
發(fā)明人經(jīng)過實驗研究證明上述中藥Q0409的篩選方(由人參和遠志組成)具有明顯改善藥物所致的動物學習記憶障礙的作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是對中藥Q0409的篩選方進行研究，提供一種用于治療阿爾采末氏病的中藥單體組方。
本發(fā)明用于治療阿爾采末氏病的中藥單體組方，由以下配比的有效成分組成人參皂甙Rg1 1.0～50mol、人參皂甙Re 1.0～50mol、人參皂甙Rb11.0～50mol；遠志皂苷元Pre-Se 1.0～50mol。
上述組方的優(yōu)選配比為人參皂甙Rg1 3.0mol、人參皂甙Re 6.0mol、人參皂甙Rb1 12.0mol；遠志皂苷元Pre-Se 14.8mol。
可采用常規(guī)加工方法，制成上述中藥單體為主的注射劑、口服液、膠囊、片劑、提取物再混合等劑型。
發(fā)明人采用NGF誘導PC12細胞分化+Aβ誘導凋亡的模型，進行以下觀察1.建立NGF誘導PC12細胞分化+Aβ誘導凋亡的模型2.MTT法檢測中藥單體組方對PC12細胞活力的影響3.中藥單體組方NGF誘導PC12細胞Aβ?lián)p傷模型作用機制的研究a.細胞凋亡檢測采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術，證實本發(fā)明中藥單體組方能抑制NGF誘導分化后的Aβ25-35損傷所致的PC12細胞凋亡率；
b.細胞線粒體膜電位變化采用DiOC6(3)染色流式細胞術，證實本發(fā)明中藥單體組方抑制NGF誘導分化后的Aβ25-35損傷所致的PC12細胞線粒體膜電位降低；c.細胞線粒體質量檢測(心磷脂含量變化)采用NAO染色流式細胞術，證實本發(fā)明中藥單體組方抑制NGF誘導分化后的Aβ25-35所致PC12細胞的損傷，維持線粒體質量(NAO染色流式細胞術)；d.細胞形態(tài)學變化，凋亡細胞核的Hochest染色結果，證實本發(fā)明中藥單體組方抑制NGF誘導分化后的Aβ25-35所致PC12細胞的凋亡，發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用。
可見，本發(fā)明的中藥單體組方可用于治療阿爾采末氏病。


圖1～圖3為PC12細胞凋亡的Hochest染色的照片(×400)。其中，圖1藍色熒光下(激發(fā)波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左右)NGF培養(yǎng)組的正常的PC12細胞，細胞核熒光染色均勻，未見凋亡時致密濃染高熒光的細胞核。
圖2藍色熒光下NGF+Aβ組的PC12細胞，細胞核熒光染色明顯不均勻，可見到凋亡時因細胞核固縮引起的致密濃染的高熒光細胞核。
圖3藍色熒光下中藥單體組方+NGF+Aβ組的PC12細胞，細胞核熒光染色均勻，未見凋亡時致密濃染高熒光的細胞核。
具體實施例方式
實施例11.建立NGF誘導PC12細胞分化+Aβ誘導凋亡的模型表1 NGF誘導PC12分化+Aβ?lián)p傷后細胞活力(x±s)

*P＜0.001，vs Aβ＝0μmol/L由表1可以看出，隨著Aβ在培養(yǎng)基中濃度的增加，MMT法測定的PC12細胞活力明顯下降，Aβ10～100μmol/L的各組細胞活力均小于不加Aβ的各組，差異有顯著性(P＜0.001)。若正常細胞對照組(Aβ為0μmol/L)細胞活力為100％，培養(yǎng)基中Aβ為10μmol/L時，細胞活力降低至約60％左右，20μmol/L降為約47％，40μmol/L為31％，80μmol/L為29％，100μmol/L為24％。因此，選定細胞活力在60％的Aβ濃度作為后續(xù)研究中誘導PC12細胞損傷的Aβ的濃度。
2.MTT法檢測中藥單體組方對PC12細胞活力的影響a.單體藥物單獨使用時最佳藥物濃度篩選由表2可以看出，Aβ陽性組(即人參皂甙均為0μmol/L)，MTT法測定的其細胞活力均低于Aβ陰性組(P＜0.05)，說明PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型復制成功。Rg1作用于對PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型，MMT法測定的細胞活力最高的兩組為1.21±0.15(Rg13.0μmol/L)、1.15±0.19μmol/L(Rg16.0μmol/L)；Rb1組細胞活力最高的兩組為0.99±0.16(Rb112.0μmol/L)、1.35±0.15μmol/L(Rb124.0μmol/L)；Re組細胞活力最高的兩組為1.53±0.13(Re3.0μmol/L)、1.31±0.21μmol/L(Rb16.0μmol/L)，以上各組的細胞活力最高的兩組均高于單純Aβ?lián)p傷的PC12細胞組(P＜0.05)。因此，確定人參皂甙2個濃度作為正交分析的藥物的2個水平，具體如下Rg1為3.0μmol/L、6.0μmol/L，Rb1為12.0μmol/L、24.0μmol/L，Re為3.0μmol/L、6.0μmol/L。
表2 人參皂甙Rg1、Rb1、Re對Aβ(10μmol/L)損傷模型細胞活力的影響(MTT法，x±s)

*P＜0.05，vs人參皂甙＝0μmol/L由表3可以看出，Aβ陽性組(即遠志皂苷元為0μmol/L)，MTT法測定的其細胞活力(0.89±0.14)低于Aβ陰性組(1.04±0.18，P＜0.05)，說明PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型復制成功。而加入遠志皂苷元Pre-Se的各組細胞活力均高于Aβ陽性組，其中遠志皂苷元Pre-Se作用于對PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型，細胞活力最高的兩組為1.13±0.20(Pre-Se14.8μmol/L)、1.14±0.23μmol/L(Pre-Se29.6μmol/L)。因此，確定遠志皂苷元的2個濃度作為正交分析的藥物的2個水平，分別為14.8μmol/L和29.6μmol/L。
表3 遠志皂苷元對Aβ?lián)p傷模型細胞活力的影響(MTT法，x±s)

*P＜0.05，vs Aβ陽性組(即遠志皂苷元＝0μmol/L)b.單體組方的正交分析見表4為單體組方對PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型作用的正交實驗結果，此結果用于后面一系列正交分析，根據(jù)正交實驗的結果最終確定中藥單體組方的各個藥物的最佳濃度(以藥物的正的貢獻率為準)。
表4 單體組方對NGF誘導PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型作用的正交實驗結果L8(24)正交表

注根據(jù)前一個實驗結果確定。
Rg1(1＝3.0μmol/L，2＝6.0μmol/L)；Rb1(1＝12.0μmol/L，2＝24.0μmol/L)Re(1＝3.0μmol/L，2＝6.0μmol/L)；Pre-Se(1＝14.8μmol/L，2＝29.6μmol/L)。
2.2.1單體組方對PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型作用正交結果的方差分析表表5 單體組方對PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型作用正交實驗結果的方差分析

表5為單體組方對PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型作用正交實驗結果的方差分析，此結果提示結果的變異來源于分組之間(P＜0.00001)，而不是來源于次間(每批次實驗的差別，P＞0.05)。說明此正交實驗正確有效，通過了正交實驗設計標準的檢驗。
2.2.2單體組方對PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型作用正交結果的析因分析表6 單體組方對PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型作用正交結果的析因分析

注小劑量＝1，大劑量＝-1表7 單體組方對PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型作用析因分析結果的方差分析

此兩表(表6、表7)為單體組方對PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型作用正交實驗結果的析因分析。由表中可以看出，在析因分析的方差分析中，Re的P＝0.0034＜0.01，其貢獻率值為0.9202，說明Re藥在實驗中是主因素，具有重要作用。因為本實驗要求的結果應為藥物的正的貢獻率為準，即細胞活力(MTT法)越高，說明藥物作用越好，可以有效減輕Aβ導致的細胞損傷，所以根據(jù)結果可知在本實驗中Re大劑量為佳，而其余藥物(Rg1、Rb1、Pre-Se)以小劑量為宜。
因此，此中藥單體組方各個藥物的配伍及最佳濃度為Rg1(1＝3.0μmol/L)，Rb1(1＝12.0μmol/L)，Re(2＝6.0μmol/L)，Pre-Se(1＝14.8μmol/L)。
c.單體組方正交分析結果的驗證采用正交分析得到的中藥單體組方最佳配伍和濃度，觀察其對PC12細胞分化后Aβ?lián)p傷模型的影響，由表8可知最佳濃度單體+Aβ組細胞活力(1.13±0.18)明顯高于模型組Aβ組(0.71±0.19，P＜0.001)，而最佳濃度單體組方的相反組方+Aβ組(0.73±0.21)則與模型組Aβ組差異無顯著性(P＞0.05)。
表8 驗證中藥單體組方的最佳濃度(MTT法，x±s)

*P＜0.05，vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.001，vs Aβgroup注單體組方最佳濃度Rg1(1＝3.0μmol/L)，Rb1(1＝12.0μmol/L)，Re(2＝6.0μmol/L)，Pre-Se(1＝14.8μmol/L)。
單體組方最佳濃度的相反組方Rg1(1＝6.0μmol/L)，Rb1(1＝24.0μmol/L)，Re(2＝3.0μmol/L)，Pre-Se(1＝29.6μmol/L)。
3.中藥單體組方NGF誘導PC12細胞Aβ?lián)p傷模型作用機制的研究a.細胞凋亡檢測采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術表9 中藥單體組方對Aβ誘導PC12細胞凋亡率的影響(x±s，n＝5)

**P＜0.001，vs control；△P＜0.01，△△P＜0.001，vs NGF+Aβ組采用Annexin V/PI雙染流式細胞術，觀察中藥單體組方對Aβ誘導PC12細胞凋亡率的影響。結果見表9，NGF+Aβ組(陽性對照組)的細胞凋亡率為(34.86±6.83)％，明顯高于NGF培養(yǎng)組(陰性對照組)的(4.94±4.61)％，差異有顯著性(P＜0.001)，說明Aβ誘導PC12細胞發(fā)生了凋亡；中藥單體組方+NGF+Aβ組(藥物治療對照組)的細胞凋亡率為(13.56±4.44)％，明顯低于NGF+Aβ組，差異有顯著性(P＜0.01)，提示中藥單體組方可以抑制Aβ誘導PC12細胞凋亡，降低其凋亡率。
b.細胞線粒體膜電位變化DiOC6(3)染色流式細胞術采用DIOC6(3)染色流式細胞術，流式細胞儀檢測各組PC12細胞熒光激發(fā)的強度，觀察中藥單體組方對正常和凋亡的PC12細胞線粒體膜電位的影響，平均熒光強度越高，線粒體膜電位越高。結果見表10，NGF+Aβ組(陽性對照組)的平均熒光強度為7851.8±232.5，明顯低于NGF培養(yǎng)組(陰性對照組)的9732.3±347.8，差異有顯著性(P＜0.01)，說明Aβ誘導PC12細胞發(fā)生了凋亡后，其細胞線粒體膜電位明顯降低；中藥單體組方+NGF+Aβ組(藥物治療對照組)的平均熒光強度為9031.3±499.4，明顯高于NGF+Aβ組，差異有顯著性(P＜0.01)，提示中藥單體組方可以抑制Aβ誘導PC12細胞凋亡導致的線粒體膜電位明顯降低。
表10 中藥單體組方對Aβ誘導PC12細胞線粒體膜電位的影響(x±s，n＝4)

*P＜0.01，vs control；△P＜0.01，vs NGF+Aβ組c.細胞線粒體質量檢測(心磷脂含量變化)NAO染色流式細胞術表11 中藥單體組方對Aβ誘導PC12細胞線粒體質量的影響(x±s，n＝4)

*P＜0.05，**P＜0.01，vs control；△P＜0.05，vs NGF+Aβ組采用NAO染色流式細胞術，流式細胞儀檢測各組PC12細胞熒光激發(fā)的強度，觀察中藥單體組方對正常和凋亡的PC12細胞線粒體質量的影響，高熒光強度P3區(qū)的細胞比例越多，平均熒光強度越高，線粒體質量越好。結果見表11，NGF+Aβ組(陽性對照組)的高熒光強度的細胞比例為(61.46±6.88)％，平均熒光強度為8861.6±588.5，明顯低于NGF培養(yǎng)組(陰性對照組)的高熒光強度的細胞比例為(84.10±5.19)％，平均熒光強度為13795.0±612.3，差異有顯著性(P＜0.05)，說明Aβ誘導PC12細胞發(fā)生了凋亡后，其細胞線粒體心磷脂含量降低，線粒體質量較差；中藥單體組方+NGF+Aβ組(藥物治療對照組)的高熒光強度的細胞比例為(76.83±7.04)％，平均熒光強度為11394.7±902.8，明顯高于NGF+Aβ組，差異有顯著性(P＜0.05)，提示中藥單體組方可以抑制Aβ誘導PC12細胞凋亡導致的心磷脂含量降低，維持線粒體粒體質量及其正常功能。
d.中藥單體組方NGF誘導PC12細胞Aβ?lián)p傷模型作用機制的研究(細胞形態(tài)學變化凋亡細胞核的Hochest染色結果)1.Aβ?lián)p傷神經(jīng)細胞模型將PC12細胞用0.125％胰酶消化下來，進行細胞計數(shù)，調整細胞濃度為2.0-2.5×105cells/mL，吸取約180μL單細胞懸液加入96孔板，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；每孔加入10μg/L NGF溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)24h；96孔中均先加入1000μmol/L Aβ25-35溶液20μL，然后立即加入不同濃度的中藥單體溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
2.①NGF培養(yǎng)組(陰性對照組，結果見圖1)加入10μg/L NGF溶液(培養(yǎng)液中的NGF的終濃度為50ng/L)，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；②NGF+Aβ組(陽性對照組，結果見圖2)加入相應劑量的10μg/L NGF溶液(培養(yǎng)基NGF的終濃度為50ng/L)，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；加入相應劑量的1000μmol/L Aβ溶液(培養(yǎng)基Aβ的終濃度為10μmol/L)，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
③中藥單體組方+NGF+Aβ組(藥物治療對照組，結果見圖3)加入相應劑量的10μg/L NGF溶液(培養(yǎng)基NGF的終濃度為50ng/L)，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；加入相應劑量的1000μmol/L Aβ溶液(培養(yǎng)基Aβ的終濃度為10μmol/L)，然后立即加入最佳濃度的中藥單體組方(人參皂甙Rg13.0mol/L、人參皂甙Re 6.0mol/L、人參皂甙Rb1 12.0mol/L；遠志皂苷元Pre-Se 14.8mol/L)溶液，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
從圖1可見，藍色熒光下NGF培養(yǎng)組的正常的PC12細胞，細胞核熒光染色均勻，未見凋亡時致密濃染高熒光的細胞核。
從圖2可見，藍色熒光下NGF+Aβ組的PC12細胞，細胞核熒光染色明顯不均勻，可見到凋亡時因細胞核固縮引起的致密濃染的高熒光細胞核。
從圖3可見，藍色熒光下中藥單體組方+NGF+Aβ組的PC12細胞，細胞核熒光染色均勻，未見凋亡時致密濃染高熒光的細胞核。
4、實施例1的結果小結本研究結果證實中藥Q0409篩選方的單體組方可以有效拮抗Aβ對神經(jīng)細胞的損傷，提高細胞活力、抑制細胞凋亡，其作用機制與保護線粒體的質量和功能，發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用有關。
權利要求
1.一種用于治療阿爾采末氏病的中藥單體組方，其特征在于由以下配比的有效組分組成人參皂甙Rg1 1.0～50mol、人參皂甙Re 1.0～50mol、人參皂甙Rb11.0～50mol；遠志皂苷元Pre-Se 1.0～50mol。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于治療阿爾采末氏病的中藥單體組方，其特征在于由以下配比的組分組成人參皂甙Rg1 3.0mol、人參皂甙Re 6.0mol、人參皂甙Rb1 12.0mol；遠志皂苷元Pre-Se 14.8mol。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的用于治療阿爾采末氏病的中藥單體組方，其特征在于采用常規(guī)加工方法，制成注射劑、口服液、膠囊、片劑或提取物再混合劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療阿爾采末氏病的中藥單體組方，由以下配比的有效成分組成人參皂甙Rg1 1.0～50mol、人參皂甙Re 1.0～50mol、人參皂甙Rb1 1.0～50mol；遠志皂苷元Pre－Se 1.0～50mol?？刹捎贸Ｒ?guī)加工方法，制成上述中藥單體為主的注射劑、口服液、膠囊、片劑、提取物再混合等劑型。經(jīng)研究證明本發(fā)明的中藥單體組方可用于治療阿爾采末氏病。本發(fā)明具有單體組方成分少，易于分離提取的優(yōu)點，具有良好的市場前景，并且對于推動中藥現(xiàn)代化有一定現(xiàn)實意義。
文檔編號A61K36/258GK101040863SQ20071002762
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月19日 優(yōu)先權日2007年4月19日
發(fā)明者戚仁斌, 陸大祥, 王華東 申請人:暨南大學