專利名稱：：治療性hbvdna疫苗、制備方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類新型治療性疫苗的構(gòu)建、制備及應用。具體的說，本發(fā)明涉及治療性hbvdna疫苗的構(gòu)建、制備及應用。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(HBV)的持續(xù)感染呈全球范圍廣泛流行。HBV感染可引起急、慢性肝炎和重型肝炎，并與肝硬化、肝癌的發(fā)病密切相關(guān)，是嚴重危害人類健康的感染性疾病。目前全球約有3.5億慢性乙型肝炎病毒感染者，其中75%分布在亞太地區(qū)，我國的慢性無癥狀感染者超過1.2億，且慢性乙型肝炎預后不良。目前的抗病毒藥物主要是核苷類似物和重組干擾素類藥物，但效果不十分理想。因此，急需一種更有效的治療性疫苗，不僅能夠預防HBV的感染，而且能夠打破慢性乙肝患者的免疫耐受狀態(tài)，使其產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，清除肝細胞的病毒，使患者痊愈。DNA疫苗是20世紀末開發(fā)出來的新型疫苗，1990年Wolff等發(fā)現(xiàn)DNA免疫后，標志著新的疫苗革命。DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有諸多優(yōu)點，尤其是其可誘導特異性CTL反應的能力，使它在抗細胞內(nèi)感染中獨具優(yōu)勢。它將編碼外源性抗原蛋白的基因表達載體直接導入機體，通過宿主細胞攝取外源DNA，進入核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄，然后在胞質(zhì)中翻譯，翻譯產(chǎn)物進一步與MHC-1類分子結(jié)合，提呈至細胞表面，被CD8+T細胞識別，產(chǎn)生較強的CTL的細胞免疫。同時，有一部分短肽可進入溶酶體/內(nèi)體與MHC-II類分子結(jié)合，被CD4+T細胞識別，產(chǎn)生CD4+T細胞介導體液免疫應答。CD4+T細胞介導的免疫應答偏向Thl，產(chǎn)生高水平的IFN-y，并刺激產(chǎn)生IgG2同種型抗體。這種HBVDNA疫苗在宿主體內(nèi)表達的抗原的免疫過程與自然免疫相似，可以提呈天然構(gòu)象的乙肝表面抗原HBsAg，無抗原表位的改變，并且具有長期記憶免疫反應，不但能用于預防，且可用于治療。因此，乙肝HBVDNA疫苗已經(jīng)成為當前研究的熱點。1993年Davis等開展了HBV基因免疫的研究，但由于安全性、耐受性及有效性等顧慮而僅限于動物實驗。1999年Tacket等率先報道HBVDNA疫苗I期臨床試驗獲得較好的結(jié)果，標志著HBVDNA疫苗己從實驗研究逐步走向臨床應用。2004年法國巴斯德研究所報道的HBVDNA疫苗的I期臨床試驗取得較好結(jié)果，同年，英國和贊比亞的報道臨床42例患者耐受性良好。2006年韓國Dong-A藥廠的多聯(lián)疫苗亦取得較好的臨床試驗結(jié)果。雖然DNA疫苗的初步臨床試驗結(jié)果令人鼓舞，但其免疫效果遠未達到理想水平，因此如何增強免疫效果己成為DNA疫苗研究的關(guān)鍵，增強的途徑有提高細胞轉(zhuǎn)染率，增加抗原表達及提高機體對抗原的免疫反應性等。其中細胞因子表達質(zhì)粒作為基因佐劑，克服了細胞因子基因工程蛋白的半衰期短、價格昂貴和毒副作用大等缺點，可顯著增強DNA疫苗的免疫效果，而且由于其作用短暫，不會導致全身細胞因子水平增高，不會改變機體對不相關(guān)抗原的免疫反應，亦不會促進或誘導病理性自身抗體產(chǎn)生，因此安全性良好?；蛎庖咦畛Ｓ玫耐緩绞墙?jīng)肌肉或皮膚，其他途徑如腹腔、口腔、直腸及陰道，基因槍和肌肉注射是公認的DNA免疫有效導入方式。在HBVDNA疫苗的臨床實驗中，采用基因槍將包被質(zhì)粒DNA的金顆粒轟擊至皮內(nèi)，能使有效的抗原提呈和識別相結(jié)合，但基因槍接種存在諸如免疫應答持續(xù)時間短、金顆粒制備繁瑣及隨溫度增加包被的DNA會脫落等缺點。目前構(gòu)建DNA疫苗通常包括選取表達抗原的目的基因和細菌質(zhì)粒真核表達載體。在構(gòu)建臨床應用的質(zhì)粒時，選用pWRG7077類似的載體，關(guān)鍵的啟動子和調(diào)控元件為HCMV早期啟動子/SV40早期啟動子、外顯子l、內(nèi)含子A，加牛生長激素polyA尾(BGHpA)，插入抗生素抗性基因，如氨芐青霉素、卡那霉素，也有選擇新霉素或潮霉素的抗性基因，還含pUCori的ColEI或pMBl復制起點便于在大腸桿菌復制。為了防止DNA在宿主細胞中復制并整合到染色體中去，載體中不能含有SV40等病毒復制基因，由于人類對青霉素的過敏反應要比卡那霉素頻繁，因而用于臨床的DNA疫苗載體最好只選擇卡那抗性基因，盡管它比氨芐青霉素抗性基因含有的CpG核苷酸序列要少，(CpG核苷酸序列有顯著增強免疫作用，有佐劑效果)。經(jīng)過改構(gòu)的pVAXl真核表達載體符合以上特點，而且含有增強目的基因表達的KOZAK序列，是美國FDA批準的唯一可用于臨床試驗的DNA疫苗載體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用基因重組技術(shù)構(gòu)建的HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗，包括疫苗質(zhì)粒pS2.S和其佐劑質(zhì)粒pIIF。本發(fā)明的另一目的在于提供一種HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗的制備方法。治療性HBVDNA疫苗包括以HBV包膜中蛋白preS2+S為目的基因的DNA疫苗質(zhì)粒(簡稱為pS2.S)和以人IL2和IFN-Y為目的基因的佐劑質(zhì)粒(簡稱為pIIF)。一種HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗的構(gòu)建方法疫苗質(zhì)粒pS2.S構(gòu)建本發(fā)明采用真核表達載體pVAXl，根據(jù)載體的要求，設(shè)計上游引物時加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3為A，+4為G，以增強目的基因的表達。pS2.S的上游引物Pl:5、-GGAAGCT、TAGGATGGGCTGGCTGCAGAGCCTG-3、，下游引物P2:5'-GGGAATT、CTTAAATGTATACCCAAAGACAA-3、，于兩引物分別引入HindIII和EcoRI位點。以pcDNA3.1/preS2.S質(zhì)粒為模板，采用pfu高保真聚合酶，按95。C5min，94。C50sec，55。C30sec，72。C90sec，30cycles，72。C10minPCR擴增出目的片段，電泳檢測大小約為卯0bp，見圖l-l所示?；厥誔CR片段，以HindIII和EcoRI進行雙酶切，同時雙酶切真核表達載體pVAXl，分別回收酶切片段并進行連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌，篩選Kana抗性的陽性克隆，按試劑盒說明提取質(zhì)粒并進行酶切測序鑒定，見圖2-2所示。佐劑質(zhì)粒pIIF的構(gòu)建設(shè)計上游引物時加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3為A，十4為G，以增強目的基因的表達。pIIF的上游引物P1:5'隱GGAAGCT'TAGGATGGGCTACAGGATGCAACTC-3、，P2:5、-GGGAATT、CTTACTGGGATGCTCT-3、，于兩引物分別引入HindIII和EcoRI位點。以pcDNA3.1/prelL2IFN汀質(zhì)粒(目的基因人IL2和IFN-y以AGSGGGGS這一韌性連接肽融合而成)為模板，采用pfu高保真聚合酶，按95。C5min，94。C50sec，55。C30sec，72。C90sec，30cycles，72。C10minPCR擴增出目的片段，電泳檢測大小約為920bp，見圖l-2所示。按前述的方法進行雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化，挑取克隆酶切測序鑒定，見圖2-3所示。治療性hbv;dna疫苗雙質(zhì)粒的體外鑒定采用體外轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細胞(cos-7)，檢測到目的蛋白的較高水平表達。按EndofreePlasmidMegaKit說明書分別提取疫苗質(zhì)粒pS2.S和佐劑質(zhì)粒pIIF，參照Invitrogen公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000操作說明進行。按常規(guī)方法培養(yǎng)COS-7細胞株于含10%新生小牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶消化貼壁細胞，重懸于含血清RPMI1640培養(yǎng)液，按3X105細胞/孔轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中，37°C、5%C02培養(yǎng)，待貼壁細胞生長達90-95%融合度，分別取4pg質(zhì)粒pS2.S、佐劑pIIF、pcDNA3.1/preS2.S質(zhì)粒、pcDNA3.1/hlL2IFNY質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染細胞組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞組為對照。繼續(xù)培養(yǎng)并于轉(zhuǎn)染后48h收集上清，按"立可讀"乙肝表面抗原試劑盒和人IL-2和IFN-Y檢測試劑盒定量檢測目的基因的表達量。結(jié)果顯示，對照組的未轉(zhuǎn)染細胞組和空載體轉(zhuǎn)染細胞組均未檢測到目的產(chǎn)物，以pVAXl構(gòu)建的真核表達載體pS2.S、pIIF均能在COS-7細胞進行目的基因的表達，檢測HBsAg、hlL2、WFNy的表達量分別為45.1、10.03、11.5ng/ml，而由pcDNA3.1載體構(gòu)建的pcDNA3.1/preS2.S質(zhì)粒和pcDNA3.1/hlL2IFN"/質(zhì)粒表達的目的蛋白HBsAg、hIL2、hIFNY的表達量分別為26.3、6.3、5.4ng/ml，顯然比pVAXl載體構(gòu)建的質(zhì)粒的目的蛋白表達量低些，這可能是因為pVAXl載體含有KOZAK序列，該序列能顯著增強目的基因的表達。同時收集含目的基因的表達產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染上清，濃縮后行常規(guī)SDS-PAGE，并按ECL試劑盒操作說明書進行ECLWesternblotting分析，見圖3-4、4-3。HBVDNA疫苗質(zhì)粒pS2.S的表達產(chǎn)物具有較強的HBsAg生物學活性，分子大小約為30Kd，佐劑質(zhì)粒pIIF表達產(chǎn)物具有較強的IL2生物學活性和IFN-Y，分子大小約為110Kd，推測是融合蛋白hIL2/IFNY形成四聚體的緣故，因為天然IL2常以二聚體或四聚體的形式存在。為了評價佐劑質(zhì)粒表達的融合蛋白WL2IFNy的生物學活性，采用CombinatorialExtension(CE)軟件對融合蛋白hlL2IFNy序列進行模建分析，并和天然的IL2、IFNy進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以AGSGGGGS這一韌性結(jié)構(gòu)為連接肽的融合hlL2IFNY蛋白，其空間結(jié)構(gòu)能夠和天然IL2、IFNy基本吻合，空間模擬其活性部位完全裸露在外，無任何屏蔽結(jié)構(gòu)，見圖5，可見融合蛋白WL2IFNY同時具有天然IL2、IFNY的生物學活性，且二者有協(xié)同作用，這為質(zhì)粒pIIF作為HBVDNA疫苗的佐劑而發(fā)揮作用奠定堅實結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的還在于提供一種疫苗的制備方法。HBVDNA疫苗的制備過程疫苗質(zhì)粒(pS2.S)和佐劑質(zhì)粒(pIIF)的制備方法相同，但分開生產(chǎn)，發(fā)酵、裂解、純化方法過程如下發(fā)酵采用BIOSTATDL70型發(fā)酵罐(德國B.Braun)，以YeastExtract8g/L、Tryptone16g/L、NaCL4g/L、甘油24ml/L、Na2HP04H207.08g/L、KH2P0412H201.58g/L;微量氨基酸適量為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以YeastExtract100g/L+Tryptone50g/L+甘油400ml/L+MgS042g/L+適量氨基酸為恒速流加的補料培養(yǎng)基，按10%接種量，37。C恒溫培養(yǎng)，p02控制在35%以下，在線檢測菌密度的0D600值，計算質(zhì)粒含量。發(fā)酵10h收菌，菌體量達50-70g/L，質(zhì)粒含量為50-70mg/g菌。裂解取檢測合格的發(fā)酵菌30-32g，加臨用前配置的P1緩沖液900ml混懸，冰浴10min;加臨用前配置的P2緩沖液卯0ml裂解細菌，冰浴4min;加P3緩沖液900ml中和，冰浴10min;離心，4°C，9,000g，15min，上清過G3細菌漏斗，收濾過液；濾過液再過G4細菌漏斗，真空抽濾，收濾過液；濾過液用0.7倍體積異丙醇沉淀，冰浴或放置(4。C)低溫冷柜2h，離心，4°C，9，000g，10min，收集沉淀；70%乙醇洗沉淀后用30mlBl溶解得質(zhì)粒初提液置4'C保存。裂解所用試劑組成如下參Pl:50mMTris，10mMEDTA，pH8.0*P2:200mMNaOH，1%SDS，臨用前配制參P3:3.0MKAC，pH5.5參BufferI:10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0純化質(zhì)粒初提液經(jīng)分子篩柱，收集洗脫峰上特異吸附超螺旋DNA的親和柱純化，最后上陰離子柱，收集質(zhì)粒峰并用有機溶劑沉淀，用緩沖液溶解質(zhì)粒DNA。其優(yōu)選方案如下質(zhì)粒初提液直接上樣Sepharose4FastFlow分子篩柱，始終用BufferI緩沖液，以去除雜蛋白、內(nèi)毒素、RNA、基因組DNA等，收集洗脫峰用2倍的BufferII稀釋上PlasmidSelect(PS柱)特異吸附超螺旋DNA的親和柱進一步純化，用BufferIII平衡，用BufferIV洗脫的超螺旋質(zhì)粒峰再用5倍體積的注射用水稀釋后上Source30Q陰離子柱，以達到有效去除內(nèi)毒素和濃縮質(zhì)粒。此柱用BufferV平衡，用BufferVI洗脫，收集質(zhì)粒峰并用0.7倍的異丙醇沉淀，用PBS溶解質(zhì)粒DNA。純化所用試劑的組成如下*BufferI:10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0*BufferII:3M(NH4)2S04，10mMEDTA，1OOmMTris-HCI，pH7.0*BufferIII:2M(NH4)2S04，10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0*BufferIV:2M(NH4)2S04，1.4MNaCl10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0*BufferV:0.4MNaCl，10mMEDTA，腦mMTris-HCl，pH7.0*BufferVI:0.6MNaCl，10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0*PBS溶液Na2HP04*12H204.86g，NaH2P04'2H200.5g，NaCl9g，定容1000ml質(zhì)粒DNA純度可達到95%。本發(fā)明治療性HBVDNA疫苗雙質(zhì)粒能誘導機體產(chǎn)生較高的HBsAg抗體水平和特異性的細胞免疫應答。雙質(zhì)粒疫苗聯(lián)合在體電脈沖技術(shù)(上海交通大學研制，國內(nèi)首次應用于基因?qū)?能顯著提高大體重動物即家兔和恒河猴的免疫效果，可顯著降低HBVTg(轉(zhuǎn)基因)小鼠的HBsAg、HBVDNA、ALT水平，并產(chǎn)生特異性細胞免疫。工具酶與主要試劑真核表達載體pVAXl購自Invitrogen公司(CATALOGNO.V260-20);pcDNA3.1/preS2.S和pcDNA3.1/prelL2IFNy質(zhì)粒由申請人構(gòu)建保存，具體構(gòu)建已在受理號為00107853.4中國發(fā)明專利申請文件中公開；限制性內(nèi)切酶，pfu聚合酶，T4DNA連接酶等均購自NEB公司；DH5a菌株購于上海博彩生物技術(shù)公司；引物合成由上海英駿生物公司完成；質(zhì)粒小量提取試劑盒為上海華舜生物公司產(chǎn)品；EndofreePlasmidMegaKit為QIAGEN公司產(chǎn)品；COS-7細胞株購自上海細胞研究所；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；"立可讀"乙肝表面抗原試劑盒購自上海實業(yè)科華生物技術(shù)有限公司；人白細胞介素(IL-2)和干擾素(IFN-Y)檢測試劑盒為晶美生物工程公司；抗人HBsAg單抗、抗人IL-2和IFN-y單抗體均購自BD公司；ELISpot試劑盒購自BD公司。下面結(jié)合附圖和具體實施例詳細描述本發(fā)明。圖1是本發(fā)明的目的基因的PCR產(chǎn)物1、3分別是目的基因S2.S和融合IIF的PCR產(chǎn)物；2為MarkerDL2000圖2雙質(zhì)粒的雙酶切圖譜1是MarkerDL15000;2.3為雙質(zhì)粒的EcoRI+Hind111的酶切圖3質(zhì)粒pS2.S轉(zhuǎn)染C0S-7細胞表達產(chǎn)物的ECLwesternblot分析1.分子量標準；2.未轉(zhuǎn)染組；3.空載體組；4.pS2.S.圖4質(zhì)粒pIIF轉(zhuǎn)染C0S-7細胞表達產(chǎn)物的ECLwesternblot分析1.未轉(zhuǎn)染組；2.空載體組；3.pIIF;4.分子量標準.圖5融合蛋白中IL-2活性部位(橙色)與IFN-Y活性部位(粉色)圖6HBVDNA疫苗治療后血清HBsAg水平降低的HBVTg小鼠個體細胞免疫狀態(tài)具體實施例方式下面是本發(fā)明的實施例，所述的實施例用于描述本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。實施例1治療性HBVDNA疫苗的構(gòu)建治療性HBVDNA疫苗包括以HBV包膜中蛋白preS2+S為目的基因的DNA疫苗質(zhì)粒(簡稱為pS2.S)和以人IL2和IFN-Y為目的基因的佐劑質(zhì)粒(簡稱為pIIF)。我們采用購自Invitrogen公司的真核表達載體pVAXl，根據(jù)載體的要求，設(shè)計上游引物時加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3為A，+4為G，以增強目的基因的表達。pS2.S的上游引物P1:5'-GGAAGCT'TAGGATGGGCTGGCTGCAGAGCCTG陽3'，下游引物P2:5、-GGGAATT、CTTAAATGTATACCCAAAGACAA-3、，于兩引物分別引入HindIII和EcoRI位點。以pcDNA3.1/preS2.S質(zhì)粒為模板，采用pfti高保真聚合酶，按95。C5min，94。C50sec，55。C30sec,72。C90sec，30cycles，72°C10minPCR擴增出目的片段，電泳檢測大小約為900bp，見圖l-l所示?；厥誔CR片段，以HindIII和EcoRI進行雙酶切，同時雙酶切真核表達載體pVAXl，分別回收酶切片段并進行連接，轉(zhuǎn)化DH5(x感受態(tài)細菌，篩選Kana抗性的陽性克隆，按試劑盒說明提取質(zhì)粒并進行酶切測序鑒定，見圖2-2所示。佐劑質(zhì)粒pIIF的構(gòu)建設(shè)計上游引物時加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3為A，十4為G，以增強目的基因的表達。pIIF的上游引物P1:5、-GGAAGCT'TAGGATGGGCTACAGGATGCAACTC-3、，P2:5'-GGGAATT、CTTACTGGGATGCTCT-3'，于兩引物分別引入HindIII和EcoRI位點。以pcDNA3.1/prelL2IFN-y質(zhì)粒(目的基因人IL2和IFN-y以AGSGGGGS這一韌性連接肽融合而成)為模板，采用pfU高保真聚合酶，按95。C5min，94。C50sec，55。C30sec，72。C90sec，30cycles，72。C10minPCR擴增出目的片段，電泳檢測大小約為920bp，見圖l-2所示。按前述的方法進行雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化，挑取克隆酶切測序鑒定，見圖2-3所示。實施例2治療性HBVDNA疫苗雙質(zhì)粒的體外鑒定按EndofreePlasmidMegaKit說明書分別提取疫苗質(zhì)粒pS2.S和佐劑質(zhì)粒pIIF，參照Invitrogen公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000操作說明進行。按常規(guī)方法培養(yǎng)COS-7細胞株于含10%新生小牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶消化貼壁細胞，重懸于含血清RPMI1640培養(yǎng)液，按3乂105細胞/孔轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中，37°C、5%C02培養(yǎng)，待貼壁細胞生長達90-95%融合度，分別取4pg質(zhì)粒pS2.S、佐劑pIIF、pcDNA3.1/preS2.S質(zhì)粒、pcDNA3.1/hlL2IFNy質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染細胞組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞組為對照。繼續(xù)培養(yǎng)并于轉(zhuǎn)染后48h收集上清，按"立可讀"乙肝表面抗原試劑盒和人IL-2和IFN-Y檢測試劑盒定量檢測目的基因的表達量，見表1。結(jié)果顯示，對照組的未轉(zhuǎn)染細胞組和空載體轉(zhuǎn)染細胞組均未檢測到目的產(chǎn)物，以pVAXl構(gòu)建的真核表達載體pS2.S、pIIF均能在COS-7細胞進行目的基因的表達，檢測HBsAg、hlL2、hlFNy的表達量分別為45.1、10.03、11.5ng/ml，而由pcDNA3.1載體構(gòu)建的pcDNA3.1/preS2.S質(zhì)粒和pcDNA3.1/hlL2IFNY質(zhì)粒表達的目的蛋白HBsAg、hlL2、hlFNy的表達量分別為26.3、6.3、5.4ng/ml,顯然比pVAXl載體構(gòu)建的質(zhì)粒的目的蛋白表達量低些，這可能是因為pVAXl載體含有KOZAK序列，該序列能顯著增強目的基因的表達。同時收集含目的基因的表達產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染上清，濃縮后行常規(guī)SDS-PAGE，并按ECL試劑盒操作說明書進行ECLWesternblotting分析，見圖3-4、4-3。HBVDNA疫苗質(zhì)粒pS2.S的表達產(chǎn)物具有較強的HBsAg生物學活性，分子大小約為30Kd，佐劑質(zhì)粒pIIF表達產(chǎn)物具有較強的IL2生物學活性和IFN-Y，分子大小約為110Kd，推測是融合蛋白hIL2/IFNY形成四聚體的緣故，因為天然IL2常以二聚體或四聚體的形式存在。為了評價佐劑質(zhì)粒表達的融合蛋白hlL2IFNY的生物學活性，我們采用CombinatorialExtension(CE)軟件對融合蛋白WL2IFNy序列進行模建分析，并和天然的IL2、IFNY進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以AGSGGGGS這一韌性結(jié)構(gòu)為連接肽的融合hlL2IFNY蛋白，其空間結(jié)構(gòu)能夠和天然IL2、IFNy基本吻合，空間模擬其活性部位完全裸露在外，無任何屏蔽結(jié)構(gòu)，見圖5，可見融合蛋白WL2IFNY可同時具有天然IL2、IFNy的生物學活性，且二者有協(xié)同作用，這為質(zhì)粒pIIF作為HBVDNA疫苗的佐劑而發(fā)揮作用奠定堅實結(jié)構(gòu)基石出。表1雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例3治療性HBVDNA疫苗雙質(zhì)粒的制備HBVDNA疫苗的制備過程疫苗質(zhì)粒(pS2.S)和佐劑質(zhì)粒(pIIF)的制備方法相同，但分開生產(chǎn)，發(fā)酵、裂解、純化方法過程如下發(fā)酵采用BIOSTATDL70型發(fā)酵罐(德國B.Braun)，以YeastExtract8g/L、Tryptone16g/L、NaCL4g/L、甘油24ml/L、Na2HP04H207.08g/L、KH2P0412H201.58g/L;微量氨基酸適量為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以YeastExtract100g/L+Tryptone50g/L+甘油400ml/L+MgS042g/L+適量氨基酸為恒速流加的補料培養(yǎng)基，按10%接種量，37匸恒溫培養(yǎng)，p02控制在35%以下，在線檢測菌密度的OD600值，計算質(zhì)粒含量。發(fā)酵10h收菌，菌體量達50-70g/L，質(zhì)粒含量為50-70mg/g菌。裂解取檢測合格的發(fā)酵菌30-32g加Pl緩沖液(臨用前配置)900ml混懸，冰浴10min加P2緩沖液(臨用前配置)900ml裂解細菌，冰浴4min加P3緩沖液900ml中和，冰浴10min，i離心，4°C，9,000g，15min上清過G3細菌漏斗，收濾過液I濾過液再過G4細菌漏斗，真空抽濾，收濾過液I濾過液用0.7倍體積異丙醇沉淀，冰浴或放置(4°C)低溫冷柜2h離心，4°C，9,000g，10min，收集沉淀70%乙醇洗沉淀后用30mlBl溶解得質(zhì)粒初提液置4'C保存裂解所用試劑組成如下參Pl:50mMTris，10mMEDTA，pH8.0*P2:200mMNaOH，1%SDS，臨用前配制參P3:3.0MKAC，pH5.5參BufferI:10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0純化方案如下質(zhì)粒初提液直接上樣Sepharose4FastFlow分子篩柱，始終用BufferI緩沖液，以去除雜蛋白、內(nèi)毒素、RNA、基因組DNA等，收集洗脫峰用2倍的BufferII稀釋上PlasmidSelect(PS柱)特異吸附超螺旋DNA的親和柱進一步純化，用BufferIII平衡，用BufferIV洗脫的超螺旋質(zhì)粒峰再用5倍體積的注射用水稀釋后上Source30Q陰離子柱，以達到有效去除內(nèi)毒素和濃縮質(zhì)粒。此柱用BufferV平衡，用BufferVI洗脫，收集質(zhì)粒峰并用0.7倍的異丙醇沉淀，用PBS溶液溶解質(zhì)粒DNA。純化所用試劑的組成如下參BufferI:10mMEDTA，lOOmMTris-HCl，pH7.0*BufferII:3M(NH4)2S04，lOmMEDTA，lOOmMTris-HCl，pH7.0*BufferIII:2M(NH4)2S04，lOmMEDTA，lOOmMTris-HCl，pH7.0*BufferIV:2M(NH4)2S04，1.4MNaCl10mMEDTA，lOOmMTris-HCl，pH7.0參BufferV:0.4MNaCl，lOmMEDTA,lOOmMTris-HCl，pH7.0*BufferVI:0.6MNaCl，lOmMEDTA,lOOmMTris-HCl，pH7.0*PBS溶液Na2HP04*12H204.86g，NaH2PO4'2H2O0.5g，NaC19g，定容1000ml質(zhì)粒DNA純度可達到95%。實施例4雙質(zhì)粒聯(lián)合電脈沖技術(shù)誘導健康BaLb/c小鼠的體液和細胞免疫實驗動物BALB/C小鼠購自廣州中醫(yī)藥大學，雌性，4-6周齡，19-21g，屬SPF(III)級動物，有合格證書。免疫接種和實驗分組腹腔注射戊巴比妥鈉先使實驗動物處于麻醉狀態(tài)，在注射部位(小鼠后腿或脛前肌)褪毛，消毒，垂直接種DNA疫苗?；蛟賹㈦娒}沖電極以注射孔為中心垂直插入，電極針插入略深于注射針深度，電場強度200v/cm，放電6次，10秒后拔電極針。健康小鼠60只，每組10只，共分為8組，前4組各5只，后4組各10只(1)pVAXl(100嗎/只);(2)pS2.S(100嗎/只);(3)pS2.S(50嗎/只);(4)pS2.S(10pg/只)；(5)pS2.S+pVAXl(5嗎+5嗎/只);(6)pS2.S+pIIF(10嗎+10嗎/只);(7)pS2.S+pIIF(5嗎+5嗎/只);(8)pS2.S+pIIF(5嗎+5嗎/只)+EP;分別在接種的0、2、4周采用眼球后靜脈叢穿刺法采血，分離血清并于-2(TC保存，待進行一次性抗-HBs的ELISA檢須U，并計算抗體出現(xiàn)的陽性小鼠數(shù)，四周后，處死小鼠取脾臟分離淋巴細胞進行ELISPOT實驗檢測。檢測方法(1)體液免疫檢測，取小鼠血清嚴格按說明書進行(上海實業(yè)科華生物技術(shù)限公司)；(2)細胞免疫檢測小鼠淋巴細胞制備，①頸椎脫臼法處死小鼠，置盛有75%乙醇的燒杯中，使小鼠體毛完全潤濕約3分鐘以上，然后切開小鼠腹腔，取出脾臟；②將分離的脾臟放于下置無菌燒杯的200目篩網(wǎng)上(有培養(yǎng)液滴)，用研磨棒(可用玻璃注射器內(nèi)芯代)輕輕捻碎脾組織，研磨擠壓出脾細胞，取5ml無血清1640培養(yǎng)液(IC)緩緩沖下細胞至燒杯中；③將5ml脾細胞懸液緩慢加入裝有2.5ml淋巴細胞分離液的14ml離心管中，2,000—2,500r/min離心20min，收集分離淋巴細胞后，用IC離心洗滌細胞2次，每次1500r/min離心6min;④用適量含5%FCS-1640完全培養(yǎng)液重懸分離的脾淋巴細胞，臺盼蘭染色計數(shù)每只小鼠分離淋巴細胞活細胞總數(shù)，調(diào)整細胞密度至3xl05/ml，37°C5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)以供ELISPOT檢測。ELISPOT檢測嚴格按BD公司試劑盒使用說明書方法操作。判斷標準參照文獻并結(jié)合本研究驗證結(jié)果，同時符合以下兩條者認定為ELISPOT檢測HBsAg特異性Thl細胞陽性①一定細胞密度條件下，ELISPOT檢測板中同一樣品HBsAg與非HBsAg刺激各3個復孔斑點均數(shù)(SFC)的比值應不小于2;②免疫實驗組樣品淋巴細胞密度為3X10V孔檢測時，HBsAg與非HBsAg刺激各3個復孔SFC均數(shù)的差值不小于5，作為小鼠特異性細胞免疫的陽性評價標準，HBVDNA疫苗免疫組的細胞免疫應答陽性率應不低于60%。統(tǒng)計學結(jié)果處理，組間均數(shù)及百分率差異顯著性統(tǒng)計分別采用Z檢驗及查統(tǒng)計簡表法。血清-HBs》10mlU被認為是機體保護性有效濃度。結(jié)果見表2，pVAXl空載接種正常小鼠后血清抗-HBs濃度均〈10mlU/ml，抗-HBs的小鼠陽性數(shù)為0。與之相比，pS2.S高(100pg/只)，中(50pg/只)、低(10pg/只)三組劑量一次性免疫健康小鼠均能在2周誘導抗-HBs產(chǎn)生(M0mlU/ml)。血清抗體水平比較，高劑量組(82.9±30.0)mlU/ml較中劑量組(42.2土25.6)mlU/ml、低劑量組(24.6±7.5)mlU/ml差異分別具顯著性(t=2.308，PO.05)及非常顯著性(^4.216，PO.01)。這表明疫苗pS2.S質(zhì)粒能誘導健康小鼠的保護性抗-HBs的產(chǎn)生，且具有劑量相關(guān)性。pS2.S+pVAXl空載以5+5pg/只的低劑量免疫組2周后陽性鼠數(shù)為1，而采用pIIF作為佐劑免疫質(zhì)粒且劑量相同情況下，2周后陽性鼠數(shù)為3，并產(chǎn)生較高的保護性抗體水平，4周后陽性鼠為50%，而增加劑量達10+10pg/只免疫組2周后陽性鼠為50。/。，4周后抗體陽性鼠為100%，比較此三組的細胞免疫結(jié)果，以pS2.S+pIIF按10+10嗎/只免疫組的ELISPOT陽性率達80%為最好，組間數(shù)據(jù)具顯著性差異(PO.Ol)，說明pIIF佐劑可增強pS2.S的免疫效果。在前幾組的基礎(chǔ)上，按pS2.S+pIIF+EP按5+5嗎/只的免疫組，2周保護性抗體陽性為80%,4周后檢測達100%，細胞免疫ELISPOT陽性率達100%。這充分表明，EP技術(shù)能顯著提高疫苗pS2.S和佐劑pIIF雙質(zhì)粒的體液和細胞免疫效果，差異具非常顯著性。分析其原因是EP技術(shù)可瞬間增加細胞膜的通透性，有效介導質(zhì)粒進入效應細胞表達目的抗原，通過MHC-II或MHC-I類抗原遞呈途徑誘導T細胞增殖并向Thl亞群分化，提高了IL2/IFNy的分泌水平，有效增強細胞免疫應答。表2佐劑pIIF質(zhì)粒和EP技術(shù)增強疫苗pS2.S的免疫效果免疫原動物數(shù)劑量血清抗HBs(2W)血清抗HBs(4W)HBsAg特異性Thl(4W)(n)^g)MlU/ml水平陽性數(shù)的陽性率(％)ELISPOT陽性率(％)pVAXl1000pS2.S10082,9±30.05/55042.2±25.63/51024.7±7.52/5pS2.S+pVAXl105+51/101010pS2.S十pIIF105+5115.4±21.93/1050501010+10162.1士42.35/1010080pS2.S+pIIF+EP105+5詣100100實施例5在體電脈沖技術(shù)顯著提高pS2.S/pIIF在大體重動物的免疫效果實驗動物新西蘭兔購自廣州市出入境檢驗檢疫局動物檢驗所，具廣東省動物監(jiān)測中心頒發(fā)的動物合格證書。靈長類動物食蟹猴及恒河猴，體重3-5kg，年齡2-5歲，由廣東省順德實驗動物所提供。健康家兔免疫實驗接種部位為兔兩小腿內(nèi)側(cè)腓腸肌，褪毛消毒后，先將DNA注入肌肉，再將3路6點電極中心對準DNA注射孔(DNA注射深度應略比電極針淺)插入肌肉，IO秒后放電拔針即可。電場強度200v/cm，放電6次。按接種pS2.S/pIIF不同劑量及是否采用電脈沖方法接種將動物分為4組，每組5只。各組pS2.S/pIIF劑量分別為A組(5+5)嗎/只；B組(25+25)嗎/只；C組(50+50)嗎/只；D組(1000+1000)pg/只，非在體電脈沖法接種，作對照組。于接種后第IO周各組均增強免疫I次，劑量與方法同初免，并分別于初免后第2、4、13周時采血留樣，ELISA法檢測血清抗體-HBs水平。健康猴免疫實驗接種部位為兩腿脛前肌，其他同家兔注射。按不同劑量及是否采用電脈沖方法接種將健康猴分為5組(3只/組)進行實驗。A組pS2.S/pIIF劑量為(1000+1000)嗎/只；B組(500+500)pg/只；C組(100+100)pg/只；D組(1000+1000)pg/只，非在體電脈沖法接種，作對照組。各組于接種后第4、10周均增強免疫1次，劑量與方法同初免，并分別于初免后第2、4、8、13周時采血留樣，ELISA法檢測血清抗體-HBs水平。統(tǒng)計學處理，組間均數(shù)及百分率差異顯著性統(tǒng)計分別采用t檢驗及査統(tǒng)計簡表法。采用電脈沖肌注雙質(zhì)粒DNA疫苗免疫新西蘭家兔2周時，在大劑量(50嗎)和中劑量(25嗎)組聯(lián)合免疫最早分別有3/5、1/5只血清抗HBs水平陽性，至4周時陽性動物數(shù)雖無變化，但兩組抗體水平明顯升高。較同期對照組(lmg)和小劑量組的差異具顯著性(P<0.05)。初免后的13周，在體電脈沖的三個劑量組動物血清均有抗-HBs出現(xiàn)，分別為4、4、5只，而對照組始終為陰性，差異具顯著性意義(P<0.05)，但免疫組間差異無顯著性。見表3。對于恒河猴的免疫結(jié)果與新西蘭家兔近乎相同。實驗結(jié)果表明，在體電脈沖技術(shù)對體重相對大的動物新西蘭家兔(表3)及恒河猴(表4)的免疫效果都有著質(zhì)的提高pS2.S聯(lián)合pIIF免疫接種二種動物在劑量為(1+1)mg的條件下均不能誘導血清抗-HBs的產(chǎn)生，而應用電脈沖技術(shù)肌肉給藥可促進恒河猴(500pg/只)及新西蘭兔(25pg/只)產(chǎn)生良好的免疫反應。說明電穿孔技術(shù)可從本質(zhì)上提高質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染率，從而降低質(zhì)粒有效接種劑量。這從技術(shù)上解決了文獻報道的HBVDNA疫苗對小動物有效而對大動物無效的問題，在疫苗使用方法上為其向臨床應用提供實驗依據(jù)。表3電穿孔法接種DNA疫苗誘導新西蘭家兔血清抗-HBs水平結(jié)果組免疫原(ng)電場強度動物數(shù)另!lpS2.S+pIIFV.cm一1(n)血清抗-HBs水平(MIU/ml)及陽性數(shù)2周4周13周(第10周100ng/只增強免疫一次)A5+5200/(0)0/(0)56.3±57.2/(4)25+2520068.5/(1)207.3/(1)231.4±102.8/(4)50+50200126.9±93.1/(3)87.0±115.3/(3)219.0±45.8/(5)D1000+1000/(0)0/(0)/(0)表4電穿孔法接種DNA疫苗誘導恒河猴血清抗-HBs水平結(jié)果血清抗-HBs水平(mlu.mr')及陽性例數(shù)(下限/上限)組免疫原(ng)電場別pS2.S+pIIF強度V.cm-1動物數(shù)(n)2周4周8周(第1次13周(第2次增強后)增強后3周)A1000+10002003陽3.0±-3.0(0)-1.7±-0.9(0)143.6±108.6(3)176.0±89.0(3)B500+5002003.1±-3.1(0)-3.0±-3.1(0)7.2±5.9(2)204.6±62.9(3)C100+100200-2.8±-2.9(0)-2.9±-2.9(0)-0.8±0.1(0)85.3±125.6(3)D1000+10000-2.6±-2.9(0)-2.0±-1.7(0)-1.0±0.6(0)-1.7±0.9(0)實施例6聯(lián)合電脈沖技術(shù)對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg)藥效學實驗實驗動物HBV轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠，由解放軍第458醫(yī)院全軍肝病中心轉(zhuǎn)基因動物實驗室提供，有廣東省實驗動物質(zhì)量合格證書，由HBV全基因(ayw型)隨機轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定傳至ll代，經(jīng)剪尾，組織DNA提取，PCR檢測HBVDNA呈陽性，再以固相放免及螢光定量PCR法分別定量檢測篩選血清HBsAg和HBVDNA陽性鼠備用。HBVTg小鼠60只，隨機分3組，每組20只，分別為單質(zhì)粒pS2.S直接肌注組(劑量為10(Hig/只)、pS2.S+pIIF+EP組(30+30|LigAR)及PBS+EP對照組。接種3次，每次間隔4周，接種期間和末次接種后每4周采血，一次性檢測觀察血清HBVDNA、HBsAg及ALT水平變化。ELISPOT檢測按實施例4方法進行。血清HBVDNA水平檢測結(jié)果末次免疫后4周，pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP組個體血清HBVDNA水平降低1個或以上數(shù)量級的有效數(shù)及有效率分別為3/20(15%)只、6/20(30%)只及1/20(5%)只，僅pS2.S+pIIF+EP與PBS+EP組比較差異具顯著性(p=0.037，x2=4.329)，見表5。血清HBsAg水平檢測結(jié)果末次免疫后4周，pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP組個體血清HBsAg水平降低差值》5ng/ml的有效數(shù)及有效率(％)分別為9/20(45%)只、10/20(50%)只及3/20(15%)只，pS2.S及pS2.S+pIIF+EP組均明顯較PBS+EP組高，差異具顯著性(p=0.018，x2=5.584;p=0.038,x2=4.286)，見表6。血清HBsAg水平降低(差值》5ng/ml)的HBVTg小鼠細胞免疫檢測pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及組ELISPOT檢測陽性數(shù)分別為5/5只，5/5只及2/3只；HBsAg特異性IFNiSFC計數(shù)依次為pS2.S+pIIF+EP組(47.5±26.2)最高，pS2.S(19.4±10.3)及PBS組(15.0±14.0)次之。三組中血清HBsAg無降低的HBVTg小鼠特異性IFN-YSFC計數(shù)均低于陽性標準。血清ALT水平檢測結(jié)果比較免疫前后及其過程中三組血清ALT水平檢測結(jié)果，pS2.S+pIIF+EP組水平較pS2.S及PBS+EP組偏高，第1次免疫后pS2.S+pIIF+EP組水平(39.65±10.96IU/L)較PBS+EP組(22.84±11.66IU/L)差異具顯著性(p<0.05，t=2.326)。血清ALT較各組免疫前平均水平升高2倍以上的動物數(shù)于pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP組分別為1/20只、8/20只及1/20只，其中pS2.S+pIIF+EP組升高例數(shù)較多，經(jīng)簡査表法檢驗較pS2.S組差異具顯著性(p<0.05)。pS2.S組1例血清ALT的升高與其血清HBsAg水平降低及ELISPOT結(jié)果陽性一致，見表7。以上研究結(jié)果表明，治療性雙質(zhì)粒HBVDNA疫苗能抑制HBVTg小鼠體內(nèi)HBVDNA的復制，有效降低其血清HBVDNA及HBsAg表達水平。本研究還發(fā)現(xiàn)HBVTg小鼠血清ALT水平升高個體與其ELISPOT檢測細胞免疫應答陽性以及血清HBVDNA和HBsAg水平降低有一定相關(guān)性，HBVDNA疫苗療效作用機理與其誘導Tg小鼠產(chǎn)生的特異性細胞免疫應答有關(guān)，在一定程度上近似臨床急性肝炎及動物HBV實驗感染病毒自然清除過程。受小鼠外周血淋巴細胞分離量少的限制，我們難以在HBVTg小鼠觀察雙質(zhì)粒HBVDNA疫苗誘導機體特異性免疫應答與其血清生化學、組織學及病原學指標的實時動態(tài)變化。本發(fā)明表明EP接種雙質(zhì)粒HBVDNA疫苗能更有效地誘導產(chǎn)生特異性細胞免疫應答，以提高對HBVTg小鼠體內(nèi)HBVDNA的復制和血清HBsAg的表達的抑制效果，這為尋找更有效的抗HBV感染基因免疫治療方法提供了依據(jù)。表5HBVDNA疫苗免疫前后比較HBVTg小鼠個體血清HBVDNA水平降低1個或以上數(shù)量級的有效數(shù)及百分率分組劑量(tig/只)n有效數(shù)有效率(％)pS2.S10020315pS2.S+pIIF+EP30+30206(l)30PBS+EP201表6HBVDNA疫苗免疫前后比較HBVTg小鼠個體血清HBsAg水平降低差值25ng/ml的有效數(shù)及百分率分組劑量(fig/只)n有效數(shù)有效率(％)pS2.S100209(2)45pS2.S+pIIF+EP30+302010(1)50PBS+EP20315表7HBVDNA疫苗免疫前后HBVTg小鼠血清ALT檢測結(jié)果(IU/L,X±s)分組劑量(ng/只)動物數(shù)(n)ALT(IU/L)'免疫前1次免疫后2次免疫后3次免疫后2w3次免疫后4wpS2.S1002036.92±10.9626.翻.0042.02±13.03.45.95±16.8832.67±16.88pS2.S+pIIF+EP30+302034.54±10.5139.65±23.78(')48.35±22.8646.86±33.4636.22±15.94PBS+EP2027.42±11.6622.84±11.4639.60±8.4542.48±19.0029.27±16.7權(quán)利要求1、一種HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗，其特征是該疫苗含有疫苗質(zhì)粒pS2.S和佐劑質(zhì)粒pIIF。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗，其特征是該疫苗的疫苗質(zhì)粒pS2.S和佐劑質(zhì)粒pIIF的真核表達載體均為pVAXl。3、權(quán)利要求1或2任一所述HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗的制備方法，其特征在于，包括步驟采用將目的基因HBV的包膜中蛋白preS2.S基因插入載體pVAXl的啟動子pCMV下游，并在目的基因起始處引入-3為A，+4為G的KOZAK序列ANNATGG。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗制備方法，其特征在于，構(gòu)建pS2.S采用上游引物Ph5、-GGAAGCTTAGGATGGGCTGGCTGCAGAGCCTG-3、，下游弓I物P2:5'-GGGAATT'CTTAAATGTATACCCAAAGACAA-3、，并于兩引物分別引入HindIII和EcoRI位點。5、權(quán)利要求1和2所述的HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗制備方法，其特征在于，構(gòu)建中采用將融合的人IL2IFNy基因插入載體pVAXl的啟動子pCMV下游，并在目的基因起始處引入-3為A，+4為G的KOZAK序列ANNATGG。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗制備方法，其特征在于，構(gòu)建pIIF采用的上游引物為P1:5-GGAAGCTTAGGATGGGCTACAGGATGCAACTC-3'，P2:5、-GGGAATT、CTTACTGGGATGCTCT-3'，于兩引物分別引入HindIII和EcoRI位點。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗制備方法，其特征在于，融合的人IL2IFNy基因中的IL2和IFN-y通過AGSGGGGS連接肽融合而成。8、一種純化權(quán)利要求1所述的HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗的方法，其特征在于，質(zhì)粒初提液經(jīng)分子篩柱，收集洗脫峰上特異吸附超螺旋DNA的親和柱純化，最后上陰離子柱，收集質(zhì)粒峰并用有機溶劑沉淀，用緩沖液溶解質(zhì)粒DNA。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗的純化方法，其特征在于質(zhì)粒初提液直接上樣Sepharose4FastFlow分子篩柱，收集洗脫峰上PlasmidSelect特異吸附超螺旋DNA的親和柱進一步純化，最后上Source30Q陰離子柱，收集質(zhì)粒峰并用0.7倍的異丙醇沉淀，用PBS溶解質(zhì)粒DNA。10、權(quán)利要求1所述的HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗在制備預防和治療乙型肝炎藥物方面的應用。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗在制備預防和治療乙型肝炎藥物方面的應用，其特征在于注射時采用在體電脈沖技術(shù)。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用基因重組技術(shù)構(gòu)建的HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗、制備方法及應用。該HBV雙質(zhì)粒DNA疫苗包括疫苗質(zhì)粒pS2.S和其佐劑質(zhì)粒pIIF，其真核表達載體為pVAX1。質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細胞(COS-7)，檢測到目的基因的較高水平表達。經(jīng)裂解、純化后雙質(zhì)粒按1∶1配伍，聯(lián)合在體電脈沖技術(shù)注射Balb/c小鼠，檢測到HBVDNA疫苗能誘導機體產(chǎn)生較高的HBsAg抗體水平和特異性的細胞免疫應答。本發(fā)明還涉及該治療性HBVDNA疫苗在制備乙型肝炎治療藥物中的用途。文檔編號A61P1/00GK101095951SQ20071002911公開日2008年1月2日申請日期2007年7月11日優(yōu)先權(quán)日2007年7月11日發(fā)明者楊富強,羅顯榮,莫國玉,陳光明,陳陽述,饒桂榮申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院