專利名稱：1-O-咖啡?；?6-O-(S)-云實(shí)?；?β-D-吡喃葡萄糖及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種含有咖啡?；倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)。
技術(shù)背景鞣質(zhì)，又稱為植物單寧，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的復(fù)雜多元酚類化合物，其中可水 解鞣質(zhì)是酚酸與多元醇形成的酯或苷。Zhi-hong Jiang禾卩Yoko Hirose等人于2001年在蛇菰(/&/a"o/ /zora/apom'cor Makino)中發(fā)現(xiàn)了多種含有咖啡?；蜎]食子?；倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)，如1-0-^>咖啡?；?3-0-沒食子?；?P-D-吡喃葡萄糖，該化合物是一種黃色無定形粉末，[a]D15-48.9° (c=0.8, MeOH)， 在鞣酸酶的作用下可水解為沒食子酸和⑧-咖啡?；?(3-0-吡喃葡萄糖；3-<9-陶-咖啡酰 基-4-0-沒食子?；?D-吡喃葡萄糖，該化合物是一種黃色無定形粉末，[tx]D15-144.2° (C=0.7, MeOH)，在鞣酸酶的作用下可水解為沒食子酸和3-0- r巧-咖啡?；?D-吡喃葡萄糖[Caffeoyl， Coumaroyl， Galloyl, and Hexahydxydiphenoyl Glucoses from萬"/o"o/ Aor"_/"/>o"/co. Zhi-hong Jiang, Yoko Hirose et. Chem. Pharm. Bull. 49(7)887-892(2001)]。但上述文中沒有公開這類化合 物的用途，也未見其他報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新的含有咖啡?；倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)。 本發(fā)明的另一目的在于提供該新的含有咖啡酰基的吡喃葡萄糖類可水解鞣質(zhì)在制藥中的 應(yīng)用。本發(fā)明新的含有咖啡?；倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)是 l-0咖啡酰基-6-0-(S)-云實(shí)?；?p-D-吡喃葡萄糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為咖啡?；?6-0-(S>云實(shí)?；?P-D-吡喃葡萄糖是從蛇菰(免/a"op/ ora ya;wm'ca Makino，主要分布于我國南部和日本)中分離出來的一種可水解鞣質(zhì)，該鞣質(zhì)為褐色無定型粉 末，分子式為<:33&6021，薄層(TLC)FeCl3反應(yīng)成深藍(lán)色，[oc]D16-62.5° (c=0.2， MeOH)。 l-O-
咖啡?；?6-CM5)-云實(shí)酰基-fi-D-吡喃葡萄糖甲基化后經(jīng)堿水解的主要產(chǎn)物為三甲基化短葉蘇 木酚酸，反應(yīng)過程如(II)所示。本發(fā)明化合物可以通過下述方法從蛇菰中提取獲得(1) 取蛇菰，切碎，在室溫下用70%甲醇或乙醇浸泡24小時(shí)，過濾，濾液減壓除醇， 得總提取物；(2) 總提取物用適量水稀釋，然后依次用乙醚、乙酸乙酯萃取，取水溶部分；(3) 將水溶性部分經(jīng)MCI-gel CHP20P柱層析，先用水洗去糖類化合物，然后用10% 40%甲醇梯度洗脫，收集甲醇洗脫物；(4) 步驟(3)所得的洗脫物經(jīng)ChromatorexODS，以水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫， 收集40 80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；再上MCI-gel CHP20P,以 水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫，收集40 80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S 甲醇溶解；然后上Sephadex LH-20層析，以水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫，收集40 80% 甲醇洗脫物，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；最后上TSK gel Toyopeari HW-40F柱層 析，以水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫，收集60 80%甲醇洗脫物中TLC上對(duì)FeCl3溶液 顯深藍(lán)色斑點(diǎn)的流分，合并含單一斑點(diǎn)的柱層析的洗脫流分，揮盡溶劑，即可。本發(fā)明化合物具有抗腫瘤活性，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，可以用于制備治療腫瘤的藥物， 該藥物由l-0-咖啡?；?6-6K5)-云實(shí)?；?P-D-吡喃葡萄糖和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成，其中 l-0-咖啡酰基-6-0-問-云實(shí)酰基-(3-D-吡喃葡萄糖的質(zhì)量百分比含量為5 20%。下面將通過體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)來證明本發(fā)明化合物具有抗腫瘤活性。 一、采用人肝癌細(xì)胞株HepG2為模型進(jìn)行本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性檢測(cè)。1、 實(shí)驗(yàn)方法1) H鄰G2細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，即以0.25%胰蛋白酶消化，1000Xg離心3min， 細(xì)胞沉淀以10。/。FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整至6X 104個(gè)/1111， 96孔培養(yǎng)板每孔接種190 u 1, 置于37°C、 5%(:02及飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)。2) 每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔中加入10nl本發(fā)明化合物，上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。3) 細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入10u 1的CCK-8 (cell counting kit 8)試劑，37。C， 5%032及飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)1. 5小時(shí)。4) 用酶標(biāo)儀測(cè)定在波長(zhǎng)為450nm處的吸光度值(OD)， 650nm作為參考波長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑 制率按公式抑制率=(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值)/對(duì)照孔0D值)X 100%計(jì)算，并用coinpusyn 軟件計(jì)算各組分的IC5。。2、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表l本發(fā)明化合物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響抑加 \濃 制率\度終濃度(ug/ml)ic50 <ug/ml)502512.56.253.125本發(fā)明化合物55.38±6.4256.17±3.8442.37±5.4227.80±2.7213.52±6.0013.2正常培養(yǎng)HepG2細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，細(xì)胞密度均勻分布，細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng)良好。在培養(yǎng)細(xì) 胞中加入蛇菰組分48小時(shí)后，細(xì)胞出現(xiàn)回縮、變圓，漂浮，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，漂浮的細(xì)胞增加。 各劑量的本發(fā)明化合物對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率如表1所示，當(dāng)本發(fā)明化合物劑量低于25 ug時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制程度與劑量的遞增成正相關(guān)；當(dāng)本發(fā)明化合物劑量為25 ug 時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率已超過5(^;當(dāng)本發(fā)明化合物劑量高于于25ug時(shí)，劑量的遞 增對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制沒有顯著改變。可見本發(fā)明化合物具有較好的抗腫瘤活性。二、本發(fā)明化合物對(duì)荷S180小鼠腫瘤大小的影響1、 將S180瘤源小鼠于傳代接種后IO天在無菌條件下從腹腔抽出瘤液，用無菌生理鹽水 調(diào)整瘤細(xì)胞數(shù)至5X 106個(gè)/011。2、 取21只小鼠(18-22g/只)，分別接種歩驟1所得的瘤液0. 2ml于右大腿皮下后被隨機(jī) 分為以下5組(1)本發(fā)明化合物低劑量組:給予本發(fā)明化合物治療，5.0mg/kg;
(2) 本發(fā)明化合物中劑量組給予本發(fā)明化合物治療，10.0mg/kg;(3) 本發(fā)明化合物高劑量組組給予本發(fā)明化合物治療，20.0mg/kg;(4) 陽性對(duì)照組給予表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)治 療，20mg/kg;(5) 空白對(duì)照組生理鹽水灌胃。接種次日同時(shí)灌胃給藥，給藥量0.2ml，每日給藥一次，連續(xù)10天，停藥次日稱重，解 剖后剝離皮下瘤體，稱瘤重。按下式計(jì)算抑瘤率(％)=(對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重) /對(duì)照組平均瘤重X 100%。表2本發(fā)明化合物對(duì)荷S180小鼠腫瘤大小的影響組別劑量瘤質(zhì)量(g)抑瘤率(％)空白對(duì)照組01.28±0. 11陽性對(duì)照組20mg/kg0.70 ±0. 3345.31本發(fā)明化合物低劑量組5.0mg/kg1.21 ±0. 095.46本發(fā)明化合物中劑量組10.0 mg/kg0.99±0. 1822.66本發(fā)明化合物高劑量組20.0mg/kg0.67 ±0. 1047.66結(jié)果如表2所示，本發(fā)明化合物對(duì)荷S180小鼠腫瘤的抑制作用隨劑量增加而增大，其效 果與EGCG相當(dāng)。
具體實(shí)施方式
制備例1、取日本產(chǎn)的蛇菰，切碎，在室溫下用70%甲醇浸泡2411,過濾，濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 濃縮除去甲醇，濃縮液為總提取物。甲醇提取液分別用乙醚、乙酸乙酯萃取，分為乙醚層、 乙酸乙酯層和水層三個(gè)部位。水層即為水溶性部位，含可水解鞣質(zhì)。將水溶性部位經(jīng)MCI-gel CHP20P柱層析，用水洗脫后用10%-40%甲醇洗脫，收集甲醇洗脫物經(jīng)Chromatorex ODS，以 水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫，收集40-80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲 醇溶解；再上MCI-gel CHP20P,以水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫，收集40-80%甲醇洗 脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；然后上Sephadex LH-20層析，以水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫，收集40-80%甲醇洗脫物，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；最后上 TSK gel Toyopearl HW-40F柱層析，以水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫，收集60 80%甲醇 洗脫物中TLC上對(duì)FeCl3溶液顯深藍(lán)色斑點(diǎn)的流分，合并含單一斑點(diǎn)的柱層析的洗脫流分， 揮盡溶劑，可得該化合物l-0-咖啡酰基-6-6K5)-云實(shí)?；?P-D-吡喃葡萄糖，其純度大于95%。2、化合物的鑒定分析1) 旋光度由JASCO DIP-370 digital polarimeter測(cè)定；2) !H和13C-NMR由Varian Unity plus 500和Varian Gemini 300 spectrometers測(cè)定； 耦合常數(shù)(力用Hz表示，化學(xué)位移用S(ppm)表示，四甲基硅垸為內(nèi)標(biāo)，高分辨ESI質(zhì)譜由Q-TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, MA， USA)測(cè)定，EI和FAB質(zhì)譜由JEOL JMS DX-303 spectrometer測(cè)定，甘油為FAB質(zhì)譜的基質(zhì)。3) 柱層析填料由硅膠Kieselgel 60 (70-230 mesh， Merck), Sephadex LH-20 (25-100 mm, Pharmacia Fine Chemical Co. Ltd.), MCI-gel CHP 20P (75-150 mm, Mitsubishi Chemical Co. Ltd.): TSK gel Toyopearl HW-40F (Tosoh), Chromatorex ODS (100-200 mesh, Fuji Silysia Chemical), Bondapak C18 (125 um， Waters).薄層層析用Kieselgel 60 F254預(yù)鋪板(0.2 mm thick, Merck), 斑點(diǎn)由紫外燈和2% FeCl3和10 %硫酸噴霧顯色。4) 鑒定分析結(jié)果(1 )數(shù)據(jù)分析[a]D16-62.5° (c=0.2， MeOH).爿"a/. Calcd for C28H24016 5/4 H20: C， 52.63; H, 4.18. Found: C， 52.43; H, 4.19. Negative FAB-MS w/z: 615 [M-H]-. Negative HR-ESI-MS m々: 615.1002 [M-H]- (calcd. for C28H23016: 615.0986). ^-畫R (500 MHz, CD3OD): S 7.09 (1H， d， 7=2 Hz， caffeoyl (caf)-2)， 6.79 (1H, d， </=8 Hz, caf-5)， 7.00 (1H, dd， J=2， 8 Hz, caf-6), 7.70 (1H， d， 7=16 Hz, caf-7)， 6.31 (1H， d, /=16 Hz， caf-8), 5.53 (1H， d， J=8 Hz， glc-l)， 3.40 (1H, t, /=8 Hz， glc-2), 3.46 (1H， t, /=9 Hz， glc-3), 3.27 (1H, t， 7=9 Hz, glc-4), 3.68 (IH， m, glc-5)， 4.49 (IH， dd, 7=2， 12 Hz, glc-6a), 4.32 (1H， dd， 7=6， 12 Hz， glc-6b)， 7.29 (1H, s， brevifolin (brev)陽3'), 4.56 (1H, dd, /=2， 8 Hz， brev-2), 3.02 (1H， dd， J=8， 19 Hz, brev-3a)， 2.60 (1H， dd, J=2， 19 Hz, brev-3b). 13C-NMRdata見表2。表3 l-0-咖啡?；?6-0-(5)-云實(shí)?；?P-D-吡喃葡萄糖 13C-麗R (125 MHz) Spectral DataNO.13C- NMR (125固z、 S。ectral Datacaffeoyl-1127.6caffeoyl-2115.4caffeoyl-3146.7caffeoyl-4149.8caffeoyl-5116.5caffeoyl-6123.4caffeoyI-7148.7caffeoyl-8114.1catteoyi-yglucose-195.6glucose-273.9glucose-377.8glucose-471.4glucose-576.1glucose-665.14， 6-acyl-l140.54， 6-acyl-242.44, 6-acyl-338.44， 6-acyl-4195.54, 6-acyl-5147.64, 6-acyi-6174.44， 6-acyl-7-4， 6-acyl-l'115.04， 6-acyl-2，116.34， 6-acyl-3'109.44， 6-acyl-4'150.84， 6-acyl-5 ，141.34， 6-acyl-6'■ 144.64, 6-acyl-7'162.5(2)結(jié)果比旋光度[cc〗d16.62.5。 (c=0.2， MeOH); 薄層(TLC)FeCl3反應(yīng)成深藍(lán)色； 通過高分辨ESI質(zhì)譜確定分子式C28H24016;"H-NMR顯示了p構(gòu)型的1, 6-二酰化葡萄糖的H信號(hào)[S 5.53 (1H， d,戶8 Hz， glc-l)， 4.49 (1H， dd，聲2， 12 Hz， glc-6a)， 4.32 (1H, dd，《/=6,12 Hz， glc-6b)]， 一個(gè)典型的咖啡?；鶊F(tuán)信號(hào)[5 7.09 (1H， d， J=2 Hz， caffeoyl (caf)-2), 6.79 (1H, d, /=8 Hz， caf-5)， 7.00 (1H, dd， J=2， 8 Hz， caf-6), 7.70 (1H, d， J=16 Hz, caf-7)， 6.31 (1H， d， 《/=16 Hz， caf陽8)][11。除了葡萄糖和咖啡?；鶊F(tuán)外，"C-NMR數(shù)據(jù)(表3)顯示在化合物1中有一個(gè)13個(gè)碳的芳 香基團(tuán)。推斷該基團(tuán)是短葉蘇木酚酸基團(tuán)化合物，并用HMBC確證了這個(gè)推斷[式(III)]。 HMBC光譜中，糖端基質(zhì)子和咖啡酰中羰基碳的相關(guān)信號(hào)，糖6位H和短葉蘇木酚酸基團(tuán)的 羰基碳的相關(guān)信號(hào)，確定了葡萄糖上兩個(gè)?；倪B接方式。<formula>formula see original document page 9</formula>為了確定短葉蘇木酚酸基團(tuán)中C-2位的絕對(duì)構(gòu)型，對(duì)提取物進(jìn)行甲基化并堿水解，得到 三甲基化短葉蘇木酚酸(lb),對(duì)該羧酸采用PGME method方法確定C-2位構(gòu)型為S，反應(yīng) 式見式(IV)。因此，提取物的結(jié)構(gòu)可確定為l-0咖啡?；?6-0-(S)-云實(shí)?；?(3-D-吡喃葡萄糖。<formula>formula see original document page 9</formula>(IV )3、化合物的甲基化和水解取化合物300 mg溶于含3.0 g.K2C03的丙酮GO ml)，加入2.0 ml Dimethylsulfate，回流 3.5 hr。反應(yīng)產(chǎn)物硅膠柱純化(10。/。 MeOH in CHCl3)得到甲基化的化合物1 (90.2 mg)。用5 % NaOH堿水解，水解產(chǎn)物用硅膠柱分離純化(CHClrMeOH-H20: 9:1:0.1 8:2:0.2)得一化合物， 該化合物為褐色無定型粉末，[a]D23-507.6° (c=0.4, CHC13)。據(jù)EI-MS和^-NMR分析可知該 化合物為三甲基化短葉蘇木酚酸EI-MS附々:334 'H-NMR (300 MHz, CDC13): S 7.66 (1H, s, H-3')， 4.37 (1H， dd, J-2， 8 Hz， H-2), 3.03 (1H, dd， J=8, 19 Hz, H-3a), 2.67 (1H, dd,戶2， 19 Hz, H-3b)， 4.03,4.02, 3.97 (each 3H， s, methoxyls)。
應(yīng)用例 例l:制劑處方l-O咖啡?；?6-(9-0S)-云實(shí)酰基-p-D-吡喃葡萄糖20 g 微晶纖維素48 g 可溶性淀粉30 g 滑石粉 2g共制1000片，每片含該化合物20mg。制備方法稱取該化合物20g，加可溶性淀粉稀釋成50g，混勻，再稱取微晶纖維素48g，用95% 乙醇制軟材，過篩制粒，低溫5(TC干燥，整粒，加入滑石粉2g，混勻，壓片(每0.1g)，質(zhì) 檢、包裝，即得。用法用量
每次3片，每日3次。適用人群
適用各種腫瘤患者。例制劑處方l-0-咖啡?；?6-0-(5)-云實(shí)?；?p-D-吡喃葡萄糖10 g 微晶纖維素48 g 可溶性淀粉40 g 滑石粉 2g共制1000片，每片含該化合物10mg。制備方法稱取該化合物10g，加可溶性淀粉稀釋成50 g，混勻，再稱取微晶纖維素48g，用95% 乙醇制軟材，過篩制粒，低溫50。C干燥，整粒，加入滑石粉2g，混勻，壓片(每0.1g)，質(zhì) 檢、包裝，即得。用法用量每次3片，每日3次。
適用人群適用各種腫瘤患者。例制劑處方l-0-咖啡?；?6-6KS)-云實(shí)酰基-p-D-吡喃葡萄糖5 g 微晶纖維素48 g 可溶性淀粉45 g 滑石粉 2g共制1000片，每片含該化合物5mg。制備方法稱取該化合物5g，加可溶性淀粉稀釋成50 g,混勻，再稱取微晶纖維素48g，用95% 乙醇制軟材，過篩制粒，低溫50。C干燥，整粒，加入滑石粉2g，混勻，壓片(每0.1g)，質(zhì) 檢、包裝，即得。用法用量每次3片，每日3次。
權(quán)利要求
1、1-O-咖啡酰基-6-O-(S)-云實(shí)?；?β-D-吡喃葡萄糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為
2、 權(quán)利要求1所述的化合物的制備方法，該方法由以下步驟組成(1) 取蛇菰，切碎，在室溫下用70%甲醇或乙醇浸泡24小時(shí)，過濾，濾液減壓除醇， 得總提取物；(2) 總提取物用適量水稀釋，然后依次用乙醚、乙酸乙酯萃取，取水溶部分；(3) 將水溶性部分經(jīng)MCI-gel CHP20P柱層析，先用水洗去糖類化合物，然后用10% 40%甲醇梯度洗脫，收集甲醇洗脫物；(4) 步驟(3)所得的洗脫物經(jīng)ChromatorexODS，以水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫， 收集40-80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；再上MCI-gd CHP20P，以 水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫，收集40~80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S 甲醇溶解；然后上Sephadex LH-20層析，以水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫，收集40 80% 甲醇洗脫物，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；最后上TSK gel Toyopearl HW-40F柱層 析，以水洗脫后以10 80%甲醇梯度洗脫，收集60 80%甲醇洗脫物中TLC上對(duì)FeCl3溶液 顯深藍(lán)色斑點(diǎn)的流分，合并含單一斑點(diǎn)的柱層析的洗脫流分，揮盡溶劑，即可。
3、 權(quán)利要求1所述的化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
4、 權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述藥物由權(quán)利要求1所述的化合物(I )和醫(yī)學(xué)上可 接受的輔料組成。
5、 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物中l(wèi)-0-咖啡?；?6-0-(S)-云實(shí)?；?-p-D-吡喃葡萄糖的質(zhì)量百分比含量為5 20%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有咖啡酚基的吡喃葡萄糖類可水解鞣質(zhì)，具體是1－O－咖啡酰基－6－O－(S)－云實(shí)?；拢璂－吡喃葡萄糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(I)所示。本發(fā)明所述的化合物能抑制腫瘤的增殖，具有較好的抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/7042GK101108867SQ20071003011
公開日2008年1月23日 申請(qǐng)日期2007年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日
發(fā)明者劉中秋, 吳少瑜, 吳曙光, 姜志宏, 巖田弘美, 廣瀨小野, 文曉蕓, 河野高畑勛, 田中山中崇 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)