專利名稱：：一種新的可水解鞣質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種含有咖啡酰基的吡喃葡萄糖類可水解鞣質(zhì)。技術(shù)背景鞣質(zhì)，又稱為植物單寧，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的復(fù)雜多元酚類化合物，其中可水解鞣質(zhì)是酚酸與多元醇形成的酯或苷。Zhi-hongJiang禾口YokoHirose等人于2001年在蛇菰(&/a"opAora/a/om'aiMakino)中發(fā)現(xiàn)了多種含有咖啡?；蜎]食子酰基的吡喃葡萄糖類可水解鞣質(zhì)，如1-0-(^-咖啡?；?3-0-沒食子酰基-P-D-吡喃葡萄糖，該化合物是一種黃色無定形粉末，[a]D15-48.9°(c=0.8，MeOH)，在鞣酸酶的作用下可水解為沒食子酸和l-O-f￡j-咖啡?；?P-D-吡喃葡萄糖；3-0-f巧-咖啡?；?4-0-沒食子酰基-D-吡喃葡萄糖，該化合物是一種黃色無定形粉末，[a]D15-144.2°(c=0.7，MeOH)，在鞣酸酶的作用下可水解為沒食子酸和3-0-f巧-咖啡酰基-D-吡喃葡萄糖[Caffeoyl，Coumaroyl，Galloyl，andHexahydxydiphenoylGlucosesfrom5a/cmo^p/joro！_/a/7om'ca.Zhi-hongJiang,YokoHiroseet.Chem.Pharm.Bull.49(7)887-892(2001)]。但上述文中沒有公開這類化合物的用途，也未見其他報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新的含有咖啡酰基的吡喃葡萄糖類可水解鞣質(zhì)。本發(fā)明的另一目的在于提供該含有咖啡?；倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)在制藥中的應(yīng)用。本發(fā)明新的含有咖啡?；男碌倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)是一種可水解鞣質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(I)。該化合物從蛇菰(&to"o;^omya;wm'c"Makino，主要分布于我國南部和日本)中分離出來的一種可水解鞣質(zhì)，為褐色無定型粉末，分子式C29H24019K2，比旋光度[a]D16.47.7。(c=0.2,MeOH)，是一種?；咸烟腔衔?，在堿性條件下可被水解。本發(fā)明化合物可以通過下述方法從蛇菰中提取獲得(1)取蛇菰，切碎，在室溫下用70%甲醇或乙醇浸泡2411，過濾，濾液減壓除醇，得總提取物；(2)總提取物用適量水稀釋，然后依次用乙醚、乙酸乙酯萃取，取水溶部分；(3)將水溶部分先經(jīng)MCI-gelCHP20P柱層析，用水和10%甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液；(4)步驟(3)所得的洗脫物經(jīng)ChromatorexODS，以水洗脫后以1080%甲醇洗脫，收集4080%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘渣加少許甲醇溶解；再上MCI-gelCHP20P，以水洗脫后以1080%甲醇洗脫，收集4080%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘渣加少許甲醇溶解；然后上SephadexLH-20層析，以水洗脫后以1080%甲醇洗脫，收集4080%甲醇洗脫物，減壓回收甲醇，殘渣加少許甲醇溶解；最后經(jīng)MCI-gelCHP20P柱層析，用水洗脫后用1080%甲醇洗脫，收集TLC上對FeCl3溶液顯深藍(lán)色斑點的流分，合并含單一斑點的柱層析的洗脫流分，即可。本發(fā)明化合物具有抗腫瘤活性，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，可以用于制備治療腫瘤的藥物，該藥物由本發(fā)明可水解鞣質(zhì)和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成，其中本發(fā)明可水解鞣質(zhì)的含量為520%(W/W)。下面將通過體外抗腫瘤實驗來證明本發(fā)明化合物具有抗腫瘤活性。采用人肝癌細(xì)胞株HepG2為模型進(jìn)行本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性檢測。1、實驗方法1)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)生長至指數(shù)生長期時，即以0.25%胰蛋白酶消化，1000Xg離心3min，細(xì)胞沉淀以10%FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整至6Xl(^個/ml，96孔培養(yǎng)板每孔接種190u1，置于37'C、5。/。C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時。2)每組設(shè)5個復(fù)孔，每孔中加入10ixl本發(fā)明化合物，上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時。實驗重復(fù)3次。3)細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，每孔加入10u1的CCK-8(cellcountingkit8)試劑，37'C，5%(:02及飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)1.5小時。4)用酶標(biāo)儀測定在波長為450nm處的吸光度值(0D)，650nm作為參考波長，細(xì)胞生長抑制率按公式抑制率=(對照孔0D值-實驗孔0D值)/對照孔0D值)X100%計算，并用compusyn軟件計算各組分的IC5。。2、實驗結(jié)果表1本發(fā)明化合物對HepG2細(xì)胞增殖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>正常培養(yǎng)HepG2細(xì)胞呈單層生長，細(xì)胞密度均勻分布，細(xì)胞呈梭形生長良好。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入蛇菰組分48小時后，細(xì)胞出現(xiàn)回縮、變圓，漂浮，隨著時間延長，漂浮的細(xì)胞增加。各劑量的本發(fā)明化合物對HepG2細(xì)胞生長的抑制率如表1所示，當(dāng)本發(fā)明化合物劑量低于25ug/ml時，對HepG2細(xì)胞增殖的抑制程度與劑量的遞增成正相關(guān)；當(dāng)本發(fā)明化合物劑量高于25ug/ml時，劑量的增加對HepG2細(xì)胞增殖的抑制沒有顯著改變。可見本發(fā)明化合物，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，具有抗腫瘤活性。二、本發(fā)明化合物對荷S180小鼠腫瘤大小的影響1、將S180瘤源小鼠于傳代接種后IO天在無菌條件下從腹腔抽出瘤液，用無菌生理鹽水調(diào)整瘤細(xì)胞數(shù)至5Xl(f個/ml。2、取21只小鼠(18-22g/只)，分別接種步驟1所得的瘤液0.2ml于右大腿皮下后被隨機(jī)分為以下5組(1)本發(fā)明化合物低劑量組給予本發(fā)明化合物治療，5.0mg/kg;(2)本發(fā)明化合物中劑量組給予本發(fā)明化合物治療，10.0mg/kg;(3)本發(fā)明化合物高劑量組組給予本發(fā)明化合物治療，20.0mg/kg;(4)陽性對照組給予表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)治療，20mg/kg;(5)空白對照組生理鹽水灌胃。接種次日同時灌胃給藥，給藥量0.211，每日給藥一次，連續(xù)10天，停藥次日稱重，解剖后剝離皮下瘤體，稱瘤重。按下式計算抑瘤率(％)=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重X100%。表2本發(fā)明化合物對荷S180小鼠腫瘤大小的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明化合物高劑量組20.0mg/kg_0.61±0.09_^￡_結(jié)果如表2所示，本發(fā)明化合物對荷S180小鼠腫瘤的抑制作用隨劑量增加而增大，其抑制腫瘤的效果比EGCG好。具體實施方式制備例1、本發(fā)明化合物的獲得(1)取蛇菰，切碎，在室溫下用70。/。甲醇或乙醇浸泡24h,過濾，濾液減壓除醇，得總提取物；(2)總提取物用適量水稀釋，然后依次用乙醚、乙酸乙酯萃取，取水溶部分；G)將水溶部分先經(jīng)MCI-gelCHP20P柱層析，用水和10%甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液；(4)步驟(3)所得的洗脫物經(jīng)ChromatorexODS，以水洗脫后以1080%甲醇洗脫，收集40-80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘渣加少許甲醇溶解；再上MCI-gelCHP20P,以水洗脫后以1080%甲醇洗脫，收集40-80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘渣加少許甲醇溶解；然后上SephadexLH-20層析，以水洗脫后以1080%甲醇洗脫，收集40-80%甲醇洗脫物，減壓回收甲醇，殘渣加少許甲醇溶解；最后經(jīng)MCI-gelCHP20P柱層析，用水洗脫后用1080%甲醇洗脫，收集TLC上對FeCl3溶液顯深藍(lán)色斑點的流分，合并含單一斑點的柱層析的洗脫流分，得本發(fā)明化合物。2、該化合物的鑒定1)方法(1)旋光度由JASCODIP-370digitalpolarimeter測定；(2)和"C-NMR由VarianUnityplus500和VarianGemini300spectrometers測定；耦合常數(shù)(J)用Hz表示，化學(xué)位移用S(ppm)表示，四甲基硅垸為內(nèi)標(biāo)，高分辨ESI質(zhì)譜由Q-TOFmassspectrometer(BrukerDaltonics,MA,USA)測定，EI和FAB質(zhì)譜由JEOLJMSDX-303spectrometer測定，甘油為FAB質(zhì)譜的基質(zhì)。(3)薄層層析用Kieselgel60F254預(yù)鋪板(0.2mmthick,Merck)，斑點由紫外燈和2%FeCl3和10%硫酸噴霧顯色。2)結(jié)果[a]D16-47.7°(c=0.2,MeOH).CalcdforC29H24019K22H20:C，44.06;H，3.57.Found:C，44.08;H，3.52.NegativeFAB-MSw/z:753[M-H]-;PositiveFAB-MSw/z:755[M+H〗+.NegativeHR-ESI-MSw/z:677.1016[M-2K+H〗層(calcd.forC29H25019:677.1000).'H-NMR[500MHz,D20+C5D5N(2:1)]:S7.24(1H，d，>/=2Hz,caf-2),7.14(1H,d,/=8Hz,caf-5)，6.90(1H,dd,7=2,8Hz，caf-6)，7.66(1H,d，《7=16Hz，caf-7),6.26(1H,d，J=16Hz,caf-8),6.19(1H，d，《/=8Hz，glc-l)，4.15(1H，dd，>/=8，9Hz，glc-2),4.25(1H,t，7=9Hz,glc-3),4.20(1H，t,/=9Hz，glc-4),4.34(1H，m,glc-5)，5.18(1H，d，/=12Hz,glc-6a),4.94(1H，dd，/=4，12Hz,glc-6b),7.43(1H,s,6-acyl-3'),5.47(1H，d，《/=2Hz，6-acyl-4),5.24(1H，d,7=2Hz，6-acyl-5)，3.54(1H,d，Hz,6-acyl-2a)，3.48(1H,d，/=16Hz，6-acyl陽2b).13C-NMRdata見表2。表2本化合物的13C-NMR(125MHz)SpectralDataNO."C-NMR(125MHz)SpectralDataeaffeoyl-l127.7caffeoyl-2U6.7caffeoyl-3147.2caffeoyl-4150.6caffeoyl-5117.6caffeoyl-6124.3caffeoyl-7149.2caffeoyl-8114.6caffeoyl-9168.7glucose-196.4glucose-274.4glucose-377.7glucose-471.7glucose-576.6glucose-664.84,6-acyl-l177.24，6-acyl-243.14，6-acyl-391.54，6-acyl"454.04，6陽acyl-585.64，6-acyl-6176.34，6-acyl-7179.64,6-acyl-l'123.24，6-acyl-2,117.84，6-acyl-3，114.64，6-3cyl-4，148.24,6-acyl-5'137.44，6-acyl-6，148.8_4，6隱acyl-7，__iH-NMR確定所述化合物為?；咸烟腔衔镌摶衔锏?H-NMR中有咖啡酰基的質(zhì)子信號[S7.09(1H,d,/=2Hz,caffeoyl(caf)-2),6.79(1H，d,/=8Hz,caf-5),7.00(1H，dd，J=2，8Hz，caf-6)，7.70(1H,d,Hz，caf-7),6.31(1H,d，Hz,caf-8)]和1(3,6-二?；咸烟腔鶊F(tuán)的質(zhì)子信號[S5.53(1H,d，Hz，glc-l)，4.49(1H，dd，《/=2，12Hz,glc-6a)，4.32(1H，dd,^6,12Hz，glc-6b)]。正離子和負(fù)離子的FAB質(zhì)譜給出的分子離子峰分別是755和753，負(fù)離子的高分辨ESI質(zhì)譜給出677.1016的分子離子峰，對應(yīng)為[M-2K+H]'，因此可確定該化合物的分子式為C29H24019K2，并通過元素分析進(jìn)一步確定了。除了有一個咖啡酰基和一個P葡萄糖基團(tuán)，"C-NMR迸一步顯示有一個14個碳的芳香基團(tuán)的信號，包括有一個五取代的苯環(huán)、兩個羧酸羰基、一個酯羰基、一個亞甲基、兩個次甲基和一個季碳。這個酰化基團(tuán)的結(jié)構(gòu)通過HMBC的相關(guān)信號確定，見式(III):HMBC中糖6位H與羰基碳的明顯相關(guān)信號可以確定該酰化基團(tuán)連在葡萄糖的6位；咖啡?；苊黠@連在糖的端基上因為HMBC中有糖端基質(zhì)子與咖啡酰基羰基碳的相關(guān)信號。最后，H-2和H-4，H-2和H-5之間的NOE相關(guān)信號確定C-3,4,5的相對立體結(jié)構(gòu)，如式(IV)所示。綜上，該化合物可確定是分子結(jié)構(gòu)如式(I)所示的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>應(yīng)用例蛇菰片劑應(yīng)用例一制劑處方可水解鞣質(zhì)20g微晶纖維素48g可溶性淀粉30g滑石粉2g共制1000片，每片含該化合物100mg。制備方法稱取該化合物20g，加可溶性淀粉稀釋成50g，混勻，再稱取微晶纖維素48g，用95%乙醇制軟材，過篩制粒，低溫5(TC干燥，整粒，加入滑石粉2g，混勻，壓片(每0.1g),質(zhì)檢、包裝，即得。用法用量每次2-3片，每日3次。適用人群適用各種腫瘤患者。例二制劑處方可水解鞣質(zhì)10g微晶纖維素48g可溶性淀粉40g滑石粉2g共制1000片，每片含該化合物100mg。制備方法稱取該化合物IOg，加可溶性淀粉稀釋成50g，混勻，再稱取微晶纖維素48g，用95%乙醇制軟材，過篩制粒，低溫50。C干燥，整粒，加入滑石粉2g，混勻，壓片(每0.1g)，質(zhì)檢、包裝，即得。用法用量每次2-3片，每日3次。適用人群適用各種腫瘤患者。例三制劑處方可水解鞣質(zhì)5g微晶纖維素48g可溶性淀粉45g滑石粉2g共制1000片，每片含該化合物U)0mg。制備方法稱取該化合物5g，加可溶性淀粉稀釋成50g，混勻，再稱取微晶纖維素48g，用95%乙醇制軟材，過篩制粒，低溫5(TC干燥，整粒，加入滑石粉2g，混勻，壓片(每0.1g)，質(zhì)檢、包裝，即得。用法用量每次2-3片，每日3次。適用人群適用各種腫瘤患者。權(quán)利要求1、一種可水解鞣質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)為OH(I)。2、權(quán)利要求1所述的鞣質(zhì)的制備方法，該方法由以下步驟組成(1)取蛇菰，切碎，在室溫下用70。/。甲醇或乙醇浸泡24h,過濾，濾液減壓除醇，得總提取物；(2)總提取物用適量水稀釋，然后依次用乙醚、乙酸乙酯萃取，取水溶部分；(3)將水溶部分先經(jīng)MCI-gelCHP20P柱層析，用水和10%甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液；(4)步驟(3)所得的洗脫物經(jīng)ChroniatorexODS,以水洗脫后以1080%甲醇洗脫，收集4080%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘渣加少許甲醇溶解；再上MCI-gelCHP20P，以水洗脫后以1080%甲醇洗脫，收集4080%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘渣加少許甲醇溶解；然后上SephadexLH-20層析，以水洗脫后以1080%甲醇洗脫，收集4080%甲醇洗脫物，減壓回收甲醇，殘渣加少許甲醇溶解；最后經(jīng)MCI-gelCHP20P柱層析，用水洗脫后用1080%甲醇洗脫，收集TLC上對FeCl3溶液顯深藍(lán)色斑點的流分，合并含單一斑點的柱層析的洗脫流分，即可。3、權(quán)利要求l所述的鞣質(zhì)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。4、權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述藥物由權(quán)利要求I所述的可水解鞣質(zhì)化合物(I)和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成。5、如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物中化合物(I)的質(zhì)量百分比含量為520%。全文摘要本發(fā)明提供了一種新的含有咖啡酰基的吡喃葡萄糖類可水解鞣質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(I)所示。本發(fā)明所述的化合物能抑制腫瘤的增殖，具有較好的抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤的藥物。文檔編號A61K31/7042GK101121737SQ20071003011公開日2008年2月13日申請日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日發(fā)明者劉中秋,吳少瑜,吳曙光,姜志宏,巖田弘美,廣瀨小野,文曉蕓,河野高畑勛,田中山中崇申請人:南方醫(yī)科大學(xué)