專利名稱：一種組織工程化雄激素分泌組織移植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，更具體地涉及睪丸體細(xì)胞構(gòu)建的 組織工程化雄激素分泌組織。
背景技術(shù)：
雄激素是男性特征性內(nèi)分泌激素，主要由睪丸間質(zhì)內(nèi)的萊迪希細(xì)胞(Leydig cells, IX)合成和分泌，參與體內(nèi)多種組織和細(xì)胞的代謝過程。各 種原因?qū)е碌牟G丸缺失或功能障礙，都會造成雄激素水平低下，對男性不同發(fā) 育階段生理及心理造成重要影響，最終導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。近年來， 隨著生活節(jié)奏加快，工作壓力增加，以及老齡化人口的增多，此類疾病的發(fā)病 率有逐漸上升趨勢。遺憾的是，針對雄激素缺乏性疾病，臨床尚無安全有效的 治療措施。目前，較常用的方法是補充外源性睪酮。由于睪酮補充治療無法達(dá) 到人體有節(jié)律睪酮分泌的生理要求，最終常會引起紅細(xì)胞增多、高血壓、骨密 度異常等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥。也有學(xué)者嘗試同種異體睪丸移植和LC細(xì)胞治療。 但前者因移植物排斥反應(yīng)、功能喪失及生精細(xì)胞倫理學(xué)等問題而無法廣泛應(yīng) 用；后者則因LC來源有限、睪酮分泌功能迅速喪失以及缺乏適宜的生長載體 和特異組織微環(huán)境等原因而限制其臨床推廣。組織工程技術(shù)為重建雄激素分泌 組織提供了新途徑。組織工程技術(shù)能夠?qū)⒂泄δ艿姆N子細(xì)胞與可降解生物材料復(fù)合，形成具有 --定形態(tài)和生物學(xué)功能的細(xì)胞-材料復(fù)合物，隨著細(xì)胞增殖和材料降解，發(fā)生 組織重構(gòu)，最終形成具有近似正常形態(tài)、組織學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能的組織，完成 組織器官的生理性重建。然而，目前國內(nèi)外有關(guān)組織工程技術(shù)構(gòu)建雄激素分泌 組織的研究顯示，組織工程方法構(gòu)建雄激素分泌組織雖然在技術(shù)上可行，但構(gòu) 建組織移植體內(nèi)后激素水平維持短暫，無法達(dá)到長期穩(wěn)定的治療效果?？梢?，本領(lǐng)域迫切需要建立一種新的雄激素分泌組織構(gòu)建技術(shù)，使新構(gòu)建 的雄激素分泌組織在體內(nèi)可以長期穩(wěn)定地發(fā)揮雄激素分泌功能。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種組織工程化雄激素分泌組織移植物。本發(fā)明的另一個目的是提供一種構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織的種子 細(xì)胞。本發(fā)明的再一個目的是提供上述組織工程化組織移植物和種子細(xì)胞的制 備方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種組織工程化雄激素分泌組織移植物，它 包括(i)生物材料；和(ii)接種于所述生物材料的種子細(xì)胞，所述的種子細(xì)胞包括萊迪希細(xì)胞(Leydig cells, LC)或含有LC的睪丸體細(xì)胞群。在另一優(yōu)選例中，所述的睪丸體細(xì)胞群中包含LC和謝爾托利細(xì)胞(Sertoli cells, SC)，其數(shù)量比為1 : 0. 01 — 30;其中LC和SC占細(xì)胞群總量的50 —100%。在另一優(yōu)選例中，LC和sc的數(shù)量比為i: o. i—i。在另一優(yōu)選例中，睪丸體細(xì)胞群中還包括數(shù)量為0-50%的肌樣細(xì)胞。 在另一優(yōu)選例中，所述的LC和SC占細(xì)胞群總量的90—100%。 在另一優(yōu)選例中，所述的睪丸體細(xì)胞群取自哺乳動物。 在另-一優(yōu)選例中，所述的睪丸體細(xì)胞群取自小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、 羊、豬、牛、人。在本發(fā)明的第二方面，提供了上述移植物的制備方法，即將(i)生物材料； 和(ii)種子細(xì)胞混合得到本發(fā)明提供的組織工程化雄激素分泌組織移植物，所 述的種子細(xì)胞包括LC或含有LC的睪丸體細(xì)胞群。在另一優(yōu)選例中，所述的生物材料包括(但并不限于)(1)可降解生物 材料；(2)不可降解生物材料。在另一優(yōu)選例中，所述的制備方法包括步驟a. 將(ii)種子細(xì)胞，接種于(i)生物材料上；b. 待(ii)種子細(xì)胞良好地粘附于(i)生物材料上后，體外培養(yǎng)或體內(nèi)移 植，得到如權(quán)利要求1所述的組織工程化雄激素分泌組織移植物，所述的種子 細(xì)胞包括LC或含有LC的睪丸體細(xì)胞群。在另-一優(yōu)選例中，所述的制備方法為將種子細(xì)胞接種于可降解生物材料上， 待種子細(xì)胞良好地粘附于生物可降解材料上后，即刻或體外培養(yǎng)一定時間后包裹于 可降解或不可降解生物材料內(nèi)核表面，形成具有一定形態(tài)的組織移植物，體外培養(yǎng) 或體內(nèi)移植。
在另一優(yōu)選例中，體外培養(yǎng)時間為0小時-15天，優(yōu)選7-15天，更優(yōu)選7天。 在另一優(yōu)選例中，體內(nèi)移植前先行體外培養(yǎng)O小時-15天后體內(nèi)移植，優(yōu)選體
外培養(yǎng)2小時-7天后體內(nèi)移植，更優(yōu)選體外培養(yǎng)2小時-4小時后體內(nèi)移植。
在另一優(yōu)選例中，體內(nèi)移植優(yōu)選同種異體移植，再優(yōu)選同基因個體移植，更
優(yōu)選自體移植。
在另一優(yōu)選例中，所述的雄激素分泌組織移植物的體內(nèi)移植部位包括(但
不限于)全身皮下、肌肉組織內(nèi)、腹腔內(nèi)、大網(wǎng)膜內(nèi)、腎包膜內(nèi)、睪丸鞘膜
腔內(nèi)、睪丸原位皮下、腹股溝內(nèi)。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種睪丸體細(xì)胞群，它包含LC和SC，其數(shù)量 比為1 : 0. 01 — 30;其中LC和SC占細(xì)胞群總量的50—100%。
在本發(fā)明的第四方面，提供了上述的睪丸體細(xì)胞群的制備方法，它包括步驟
將LC和SC混合，混合時的數(shù)量比為1 : 0. 01 — 30。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法中ix和sc混合時的數(shù)量比為i :o.i — i。
在另--優(yōu)選例中，所述的方法中還包括步驟含有數(shù)量為細(xì)胞總數(shù)0-50%的肌
樣細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的制備上述睪丸體細(xì)胞群的方法包括步驟
a. 將用復(fù)合膠原酶消化的睪丸組織通過100-600目過濾網(wǎng)得到睪丸間質(zhì)組織 內(nèi)細(xì)胞，所述的復(fù)合膠原酶含有I型膠原酶、n型膠原酶和中性蛋白酶；
b. 將獲得的睪丸間質(zhì)組織內(nèi)細(xì)胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)10分鐘-72小時，取貼壁細(xì) 胞得到共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，步驟a為獲得睪丸內(nèi)LC，純度為90-100%，同時獲得睪 丸內(nèi)SC,純度為90-100%;步驟b為以LC與SC的比例為1 : 0. 01-30進(jìn)行混合，
得到共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞，優(yōu)選LC與sc的比例為i : o. i — i。
在本發(fā)明的第五方面，提供了上述的睪丸體細(xì)胞群的用途，它可用作構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織的種子細(xì)胞；或用于構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組 織移植物。
在另一優(yōu)選例中，所述的睪丸體細(xì)胞群可用于細(xì)胞移植治療雄激素分泌不
足等病癥。
在另一優(yōu)選例中，所述的組織工程化雄激素分泌組織移植物可用于治療睪 丸形態(tài)異常、缺失或雄激素分泌障礙性疾病。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種新的雄激素分泌組織構(gòu)建技術(shù)，使新構(gòu)建的雄激 素分泌組織在體內(nèi)可以長期穩(wěn)定地發(fā)揮雄激素分泌功能。


圖1顯示了LC的分離純化及鑒定結(jié)果，其中，
A表示純化的LC; B表示HSD酶底物顯色結(jié)果；C表示3 P-HSD免疫 細(xì)胞化學(xué)結(jié)果；D表示3P-HSD免疫熒光激光共聚焦檢測結(jié)果；E表示流式細(xì) 胞學(xué)檢測純化細(xì)胞3P-HSD的結(jié)果；F表示空白對照。
圖2顯示了睪丸內(nèi)各種體細(xì)胞共培養(yǎng)及鑒定結(jié)果，其中，
A表示共培養(yǎng)全部貼壁細(xì)胞；B是透射電鏡結(jié)果；C表示謝爾托利細(xì)胞
(Sertoli cell, SC)情況；D表示除LC外的其它貼壁細(xì)胞；E表示純化的SC
形態(tài)；F表示SC油紅染色結(jié)果。
圖3顯示了雄激素分泌組織體外構(gòu)建及檢測結(jié)果，其中， A表示塑形PGA/PLA支架材料；B表示支架材料掃描電鏡結(jié)果；C表示細(xì)胞
-材料復(fù)合物大體觀；D表示倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果；E表示掃描電鏡結(jié)果；
F表示組織學(xué)切片結(jié)果。
圖4顯示了體內(nèi)移植模型、體內(nèi)構(gòu)建及組織學(xué)檢測結(jié)果，其中，
A表示移植動物模型；B表示體外構(gòu)建復(fù)合物體內(nèi)移植；C表示體內(nèi)植入
45天時的情況；D表示構(gòu)建組織剖面情況；E表示構(gòu)建組織組織學(xué)切片結(jié)果；F:
高倍鏡下構(gòu)建組織情況。
圖5顯示了去勢與移植大鼠體內(nèi)激素水平。
具體實施例方式
發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，LC與其它睪丸體細(xì)胞共培養(yǎng)可以明顯延長LC的體外存活時間和雄激素分泌功能，將含有LC的混合睪丸體細(xì)胞群接種到一定形狀 的支架材料后，經(jīng)體外培養(yǎng)或移植到動物體內(nèi)可形成特定形態(tài)的雄激素分泌組 織，該組織在動物體內(nèi)能夠長期存活并顯著提高動物的血睪酮水平，并且可進(jìn) 行同種異體移植而沒有排斥反應(yīng)。
根據(jù)這些研究結(jié)果，本發(fā)明人提出，含LC的混合睪丸體細(xì)胞群是構(gòu)建雄
激素分泌組織的優(yōu)良種子細(xì)胞，應(yīng)用該混合細(xì)胞構(gòu)建的雄激素分泌組織可持久 地內(nèi)源性生成雄激素，并可接受機(jī)體生理性調(diào)節(jié)，因而可以用于治療雄激素缺 乏和/或睪丸缺損等相關(guān)疾病。發(fā)明人在進(jìn)行了更廣泛而深入研究的基礎(chǔ)上完 成了本發(fā)明。
種子細(xì)胞
本發(fā)明提供的種子細(xì)胞包括睪丸體細(xì)胞群或體外分離純化得到的LC。 華為體鄉(xiāng)辨本發(fā)明提供的睪丸體細(xì)胞群中含有LC和SC，兩者的數(shù)量比為1 : 0.01 — 30，
較佳地為i : o. 1 —i，更佳地為i: o. 3-0.5。
所述的LC可以是本領(lǐng)域常用的，如通過Peixoll分離純化獲得的LC。優(yōu)選 使用如下方法獲得的以0.25%復(fù)合膠原酶消化睪丸組織至睪丸組織形狀剛好消 失，曲細(xì)精管間組織松散，但曲細(xì)精管連續(xù)而無明顯斷裂時，終止消化；以0二3'3um 不銹鋼濾網(wǎng)過濾，濾液離心；用沉淀進(jìn)行細(xì)胞接種，無血清畫EM/F12 (1:1)培養(yǎng) 液培養(yǎng)2小時，收集貼壁細(xì)胞即得LC。
所提供的睪丸體細(xì)胞群中可以含有干細(xì)胞和前體細(xì)胞，其中肌樣細(xì)胞已被證 實為LC干細(xì)胞和前體細(xì)胞的來源。
所提供的睪丸體細(xì)胞群中還可以含有維持或調(diào)節(jié)LC數(shù)量或功能的細(xì)胞外基 質(zhì)、細(xì)胞因子或細(xì)胞。例如但不限于，干細(xì)胞因子(SCF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、 成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、上皮生長因子(EGF)、白細(xì)胞抑制因子(LIF)、 胰島素樣生長因子I (IGFI)、胰島細(xì)胞、神經(jīng)元。
本發(fā)明提供的LC可以是本領(lǐng)域常規(guī)的方法獲得的LC，如通過Percoll分 離純化獲得的LC。優(yōu)選使用如下方法獲得的以0. 25%復(fù)合膠原酶消化睪丸組織至睪丸組織形狀剛好消失，曲細(xì)精管間組織松散，但曲細(xì)精管連續(xù)而無明顯斷裂時， 終止消化；以①33"m不銹鋼濾網(wǎng)過濾，濾液離心；用沉淀進(jìn)行細(xì)胞接種，無血清 DMEM/F12 (1:1)培養(yǎng)液培養(yǎng)2小時，收集貼壁細(xì)胞即得LC。
睪丸體細(xì)胞群制備
本發(fā)明提供的獲得上述睪丸體細(xì)胞群的方法是將LC和sc按數(shù)量比i: o.oi
一30的比例混合。
在該混合體系中還可以允許混有數(shù)量為0-50%的肌樣細(xì)胞。 一種優(yōu)選的制備方法，是將睪丸剪碎，經(jīng)0. 3%復(fù)合膠原酶消化至全部組織結(jié)
構(gòu)消失呈泥狀后，①10(^m濾網(wǎng)過濾，濾液離心，取沉淀細(xì)胞接種培養(yǎng)，無血清
DMEM/F12 (1: 1)培養(yǎng)24小時后收集全部貼壁細(xì)胞，即得共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞。
一種更為優(yōu)選的制備方法，是分別分離培養(yǎng)獲得LC和SC，兩者純度均在
90-薩，按照l : 0.01-30的比例進(jìn)行混合，得到共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞， 一種優(yōu)選的
lc與sc的比例為i : 0.1 — 1。
睪丸體細(xì)維群用途
本發(fā)明提供的睪丸體細(xì)胞群是一種新的種子細(xì)胞，可用于構(gòu)建組織工程化雄
激素分泌組織，后者是睪丸體細(xì)胞群與生物材料的復(fù)合體也可用于雄激素缺 乏癥病人的細(xì)胞移植治療。
可用于本發(fā)明的組織工程化雄激素分泌組織的材料是醫(yī)學(xué)上可接受的生
物材料，包括(但并不限于)
(l)可降解生物材料，包括(但并不限于)
(a) 可降解性合成高分子材料，例如聚a-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基 乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮 (polyphosphazenes)、 聚氨基酸(polyaraino acid)、 假聚氨基酸 (pesudo—polyamino acid)、 聚原酸酉旨(polyorthoesters)、 聚酉旨尿'院 (polyesterurethane)、聚碳酸酉旨(polycarbonate)、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、 聚對二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；
(b) 天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖 (glycosaminoglycan， GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸 鹽、藻酸鈣凝膠等；各種脫細(xì)胞基質(zhì)；(C)上述材料的混合物或復(fù)合材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合 材料。
(2)不可降解生物材料，包括(但并不限于)Medpore、生物陶瓷、羥 基磷灰石、硅橡膠、碳纖維、滌綸、真絲等。
移植物
本發(fā)明的移植物是指含有睪丸體細(xì)胞群及生物支架材料的復(fù)合物或此復(fù) 合物經(jīng)體外培養(yǎng)形成的類雄激素分泌組織。將本發(fā)明中體外培養(yǎng)擴(kuò)增的種子細(xì) 胞接種到生物相容性良好的可降解生物支架材料上即可形成"種子細(xì)胞一生 物材料"復(fù)合物，將這一復(fù)合物經(jīng)體外培養(yǎng)或植入到體內(nèi)，隨著生物材料的逐 漸降解吸收，種子細(xì)胞繼續(xù)增殖并分泌基質(zhì)，最終替代生物材料而形成相應(yīng)的 雄激素分泌組織。本發(fā)明中的移植物中還可含有不可降解生物材料，主要是與 上述可降解生物材料復(fù)合應(yīng)用，作為移植物的內(nèi)核，維持移植的外觀形態(tài)。
本發(fā)明的組織工程化雄激素分泌組織移植物制備方法簡便，將一定數(shù)量 的種子細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物材料混合即可。
當(dāng)本發(fā)明的生物可降解材料為可注射性材料時，以該液體材料調(diào)整雄激 素分泌組織細(xì)胞濃度；當(dāng)本發(fā)明的生物材料為固體性材料時，以培養(yǎng)液調(diào)整 種子細(xì)胞懸液濃度，然后與可降解材料混合?；旌蠒r，培養(yǎng)液與可降解材料 的比例沒有特別限制，但是以該材料能夠吸附的細(xì)胞懸液最大量為宜，接種 密度按照每ml細(xì)胞懸液所含細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計算。本發(fā)明組織工程化雄激素分泌 組織中的種子細(xì)胞濃度通常約為1X10、5X107ml或更高，較佳地為 5X10"-5X107ml，更佳地為1X107-2X 107ml。
本發(fā)明移植物的體外培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液是本領(lǐng)域中熟知的。 一種優(yōu)選的方法 是將上述方法制備復(fù)合物在37° C培養(yǎng)2h-4h后加入無血清的DMEM培養(yǎng)液，隔曰 換液。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限于)DMEM，優(yōu)選DMEM/F-12 (1: 1)培養(yǎng)液。 培養(yǎng)液中添加的血清含量為0-5(v/v)%，優(yōu)選0-1%，更優(yōu)選不含血清。
此外，在本發(fā)明的組織工程化雄激素分泌組織移植物中，還可添加或復(fù) 合其他各種細(xì)胞、生長因子、各種轉(zhuǎn)基因成分，從而促進(jìn)種子細(xì)胞分化為雄 激素分泌細(xì)胞，以及保持雄激素分泌細(xì)胞的表型和/或促進(jìn)雄激素分泌細(xì)胞生 長。代表性的物質(zhì)包括(但并不限于)人絨毛膜促性腺激素(hCG)、黃體生 成素(LH)、轉(zhuǎn)移生長因子-e3、 BMP-2、 BMP-4、 BMP-7、 CDMP、血小板源性生長因子-BB (PDGF-BB)、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF) — 1和2、堿性 脂肪干細(xì)胞生長因子(bFGF)、角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)、神經(jīng)生長因子(NGF) 和肝細(xì)胞生長因子(HGF)和表皮生長因子(EGF)等。用本發(fā)明方法形成的組織工程化雄激素分泌組織，分為兩類， 一類是雄 激素分泌組織構(gòu)建細(xì)胞與可注射性生物材料形成的復(fù)合物，該復(fù)合物可直接 注射到體內(nèi)各種移植部位。另一類是雄激素分泌組織構(gòu)建細(xì)胞與非注射性材 料形成復(fù)合物，該復(fù)合物可直接植入到體內(nèi)各移植部位或經(jīng)體外培養(yǎng)后再植 入到體內(nèi)各移植部位。移植物制備方法本發(fā)明的組織工程化雄激素分泌組織的制備方法簡便，將一定數(shù)量的所 述種子細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物材料混合，再經(jīng)體外培養(yǎng)或體內(nèi)移植即可。本發(fā)明構(gòu)建雄激素分泌組織過程中，所用的生物支架材料可以是可降解生 物支架材料，也可以是可降解生物支架材料與不可降解生物支架材料的混合 物。當(dāng)支架材料為可降解生物材料時，將種子細(xì)胞直接接種到材料支架形成復(fù) 合物；當(dāng)支架材料為可降解生物材料與不可降解生物材料的混合物時，先將不 可降解生物材料制備成一定形狀的內(nèi)核，外敷可降解生物材料形成混合支架材 料，再將種子細(xì)胞接種到材料支架形成復(fù)合物，亦可將細(xì)胞-可降解生物材料 復(fù)合物直接或體外培養(yǎng)后外敷于預(yù)制形狀的不可降解生物支架表面。所用的種 子細(xì)胞優(yōu)選含有一定數(shù)量和比例的LC及SC的共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞群，并盡可能 保留有LC干細(xì)胞和前體細(xì)胞。所含有的SC細(xì)胞還可以為體內(nèi)構(gòu)建和移植組織 提供免疫豁免作用，以利于構(gòu)建的雄激素分泌組織同種異體內(nèi)移植后的存活和 功能發(fā)揮；體外持續(xù)培養(yǎng)7-15天后，能夠形成具有一定形態(tài)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)的 均質(zhì)組織；由于共培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)SC的免疫豁免作用和保留的LC干細(xì)胞和前體細(xì) 胞，保證體內(nèi)構(gòu)建組織在l-3個月后可以生長成為具有一定形態(tài)、組織學(xué)結(jié)構(gòu) 和雄激素分泌功能的組織；而且這種構(gòu)建的雄激素分泌組織可以在同種異體個 體內(nèi)維持較長時間(至少6個月)。本發(fā)明構(gòu)建雄激素分泌組織的過程，主要包括體外培養(yǎng)和體內(nèi)移植。體外 培養(yǎng)過程中也可以通過離心或振蕩的方式加入力學(xué)刺激，或通過生物反應(yīng)器模 擬體內(nèi)雄激素分泌組織的力學(xué)環(huán)境，對體外構(gòu)建的組織施加類似的力學(xué)刺激，的成熟與力學(xué)性質(zhì)的改進(jìn)。此外，體外培養(yǎng)過程中還可以 添加或復(fù)合其他各種細(xì)胞因子、生長因子、各種轉(zhuǎn)基因成分，從而促進(jìn)種子細(xì) 胞分化為雄激素分泌細(xì)胞，以及保持雄激素分泌細(xì)胞的表型和/或促進(jìn)雄激素 分泌細(xì)胞生長。應(yīng)用本發(fā)明確定的方法，可以成功構(gòu)建出具有良好組織學(xué)結(jié)構(gòu)、生物化學(xué) 組成的雄激素分泌組織。這種組織能夠在體內(nèi)持續(xù)分泌睪酮，并接受機(jī)體的生 理調(diào)節(jié)，使體內(nèi)雄激素水平保持在合理的生理水平，為雄激素分泌組織缺損的 修復(fù)重建提供了堅實的實驗基礎(chǔ)和技術(shù)基礎(chǔ)。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
1、 將睪丸內(nèi)多種體細(xì)胞混合或共培養(yǎng)作為種子細(xì)胞，對各發(fā)育階段LC具 有支持、營養(yǎng)、功能調(diào)節(jié)及免疫保護(hù)等作用，同時，還盡可能最大限度地保留 了 LC的干細(xì)胞和前體細(xì)胞。因此，本發(fā)明構(gòu)建雄激素分泌組織的種子細(xì)胞可 以較長期地穩(wěn)定維持LC的數(shù)量和功能。
2、 本發(fā)明構(gòu)建的雄激素分泌組織移植物植入體內(nèi)后可較長期地維持一定 水平的雄激素分泌功能，而且由于含有的SC具有免疫保護(hù)等作用，使移植物 在同基因個體內(nèi)或同種異體體內(nèi)均可以存活并發(fā)揮功能。
3、 本發(fā)明構(gòu)建的雄激素分泌組織移植物具有一定的外觀形態(tài)，而且可以 根據(jù)需要進(jìn)行預(yù)制，因此能同時進(jìn)行功能和形態(tài)的完美重建。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所 有的百分比和份數(shù)按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實麄例l制備睪丸體細(xì)胞群I-直接貼壁共培養(yǎng)法將去除白膜的大鼠睪丸組織以0.25%膠原酶NB4 (Serva，德國)與組織量按1: 1比例，37°C、 100次/分震蕩消化至睪丸組織形狀完全消失，呈泥狀，加入3倍體積的PBS終止酶消化，以孔徑為100iM的不銹鋼濾網(wǎng)過濾，1500轉(zhuǎn) 離心5分鐘，棄上清，所得細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，以含1%胎牛血清的DMEM/F12、 37°C、 5%0)2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，24小時后首次換液，繼續(xù)原培養(yǎng)液和培 養(yǎng)條件培養(yǎng)至72小時，所得細(xì)胞即為直接貼壁共培養(yǎng)獲得的睪丸體細(xì)胞群。倒置相差顯微鏡下觀察可見此細(xì)胞群內(nèi)主要含有三種典型形態(tài)學(xué)特點的 細(xì)胞，LC、 SC和少量肌樣細(xì)胞[數(shù)量比約為1:(1-5):(0. 1-1)，因鼠齡不同， 此比例會有一定差異]。培養(yǎng)24-48小時后可見，LC相互連接成單層的鋪展細(xì) 胞群，其間分布有島樣聚集生長的SC細(xì)胞，細(xì)胞疊層聚集，以致界限不清， 細(xì)胞島內(nèi)可見大量折光性較強的脂滴分布，此兩類細(xì)胞之間夾雜有一定數(shù)量的 管周肌樣細(xì)胞。實施例2制備睪丸體細(xì)胞群II-LC與SC混合法(1) LC分離培養(yǎng)將去除白膜的大鼠睪丸組織以0.25%膠原酶NB4 (Serva，德國)與組織量 按1: 1比例，37'C、 100次/分震蕩消化至睪丸組織形狀剛好消失，曲細(xì)精管 間組織松散，但曲細(xì)精管連續(xù)而無明顯斷裂時，加入兩倍于消化懸液體積的培 養(yǎng)液或PBS終止消化，以O(shè)=30y m不銹鋼濾網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)1500轉(zhuǎn)/分鐘離 心5分鐘，所得沉淀按照每克睪丸組織所得細(xì)胞接種20cm2的密度進(jìn)行接種。 37°C、 5%C02、 95%02和100%濕度的條件下，無血清DMEM/F12 (1:1)培養(yǎng)液培 養(yǎng)2小時，棄除上清及未貼壁的懸浮細(xì)胞。所得貼壁細(xì)胞經(jīng)羥類固醇脫氫酶(3P-HSD)特異性酶底物反應(yīng)和免 疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行LC鑒定。見圖1。結(jié)果表明，經(jīng)差速貼壁法獲得的LC以兩種形態(tài)為主多角形和長梭形， 可見少量雙核細(xì)胞。3 0-HSD特異性酶學(xué)反應(yīng)、HSD免疫細(xì)胞化學(xué)、激光 共聚焦及流式細(xì)胞儀鑒定呈陽性反應(yīng)，證實所得細(xì)胞為LC，流失細(xì)胞儀鑒定細(xì) 胞陽性率>95%。(2) SC分離培養(yǎng)將去除白膜的大鼠睪丸組織以0.25%膠原酶NB4 (Serva，德國)與組織量 按1: 1比例，37°C、 100次/分震蕩消化至睪丸組織形狀剛好消失，曲細(xì)精管間組織松散，但曲細(xì)精管連續(xù)而無明顯斷裂時，加入兩倍于消化懸液體積的培養(yǎng)液或PBS終止消化，以O(shè)=30iim不銹鋼濾網(wǎng)過濾，棄除濾液，收集濾網(wǎng)上 曲細(xì)精管組織，再次去除以0.25%膠原酶冊4 (Serva，德國)與組織量按1: 1 比例，37°C、 100次/分震蕩消化至泥狀，1500轉(zhuǎn)5分鐘離心收集沉淀，接種 于培養(yǎng)皿中，加入含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，37°C、 5%C02及飽和濕 度條件下培養(yǎng)，2小時后收集懸浮細(xì)胞，至另一培養(yǎng)皿內(nèi)以相同條件高密度培 養(yǎng)(2X 107cm2) ， 24小時首次換液，48小時收集貼壁細(xì)胞進(jìn)行鑒定和純度分 析。經(jīng)油紅染色和透射電鏡觀察，所得細(xì)胞為SC，純度在90%以上。 結(jié)果表明，獲得的SC細(xì)胞呈典型的上皮樣細(xì)胞特點，三角形或多角形， 片狀連接形成"鋪路石"樣排列的特點。鼠齡較小(<15天)的睪丸組織獲得 的SC含有大量脂滴，油紅染色陽性，透射電鏡可檢見衛(wèi)星小體。 (3) LC與SC混合將上述方法中得到的LC和SC計數(shù)后按2 : 1或1: 2的比例混合得到睪丸 體細(xì)胞群，可以直接用于雄激素分泌組織構(gòu)建。實施例3構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織I 材料與方法1. 動物模型制備(1) 制備去勢鼠模型經(jīng)雙側(cè)腹股溝上內(nèi)側(cè)切口，剪開鞘膜，完整取出 睪丸，保留附睪，分層對位縫合，以保持去勢后鞘膜腔的完整性、通暢性及封閉性。(2) 確定體內(nèi)移植動物模型分別于去勢后1周，2周，3周，4周，6 周，8周和12周心穿刺取血，檢測血清睪酮水平，監(jiān)測睪酮開始下降和低水平 維持的臨界點，選定血睪酮低水平穩(wěn)定維持的時間點作為體內(nèi)移植的最佳時 間，以此確定體內(nèi)移植動物模型。2. 種子細(xì)胞制備(1) LC分離培養(yǎng)按實施例2所述方法得到純化的LC。(2) 睪丸體細(xì)胞群分離培養(yǎng)按實施例1所述方法獲得共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞群。3. 生物支架材料制備可降解聚羥基乙酸(PGA) 10mg，預(yù)先塑性為直徑8誦，厚3mm的圓片狀結(jié) 構(gòu)，滴加少量0.線聚乳酸(PLA) (二氯甲烷為溶劑)固定形狀，形成PGA/PLA 生物支架材料，經(jīng)75%酒精浸潤及紫外線照射消毒備用。4. 雄激素分泌組織體外構(gòu)建和功能評價(1) 實驗分組①單純LC組；②共培養(yǎng)種子細(xì)胞組。(2) 細(xì)胞材料復(fù)合物構(gòu)建及體外培養(yǎng)將二組細(xì)胞分別以相同細(xì)胞密度(20Xl()6個細(xì)胞/ml)和總量(6X106個細(xì)胞/個)滴加于生物材料支架上，37。C、 5%C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)4小時后，加入無血清DMEM/F12 (1:1)培養(yǎng)液 常規(guī)培養(yǎng)，隔日換液。(3) 生物學(xué)檢測及功能評價每日收集細(xì)胞材料復(fù)合物上清液，檢測其 睪酮水平，觀察體外培養(yǎng)功能維持時間。分別于體外培養(yǎng)1周和2周時取材， 組織學(xué)檢測構(gòu)建組織的形態(tài)、材料降解情況，免疫組化鑒定各細(xì)胞成分、電鏡 觀察復(fù)合物內(nèi)各細(xì)胞成分超微結(jié)構(gòu)、功能狀態(tài)及其與材料支架的相容性，根據(jù) 檢湖ij結(jié)果確定體內(nèi)移植時間。5. 構(gòu)建組織同基因去勢鼠移植和功能評價(1) 體內(nèi)移植將同基因Wister大鼠體內(nèi)移植動物模型分為不同組別， 各組動物分別經(jīng)陰囊切口，剪開鞘膜，鈍性分離暴露鞘膜腔，將體外構(gòu)建的相 應(yīng)組別細(xì)胞-材料復(fù)合物植入，以附睪組織包裹使其與切口隔離，對位縫合鞘 膜及各層組織，注意保持鞘膜的封閉和完整性。(2) 組織學(xué)檢測、功能評價及體內(nèi)轉(zhuǎn)歸各組分別于移植后4周、6周、 9周、12周及24周取材，對體內(nèi)構(gòu)建組織的形成過程、材料降解過程、組織 學(xué)形態(tài)和血管形成情況進(jìn)行觀察。心穿刺取血，以Access全自動免疫分析細(xì) 胞群測定兩組移植鼠血清睪酮水平，結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩兩比較 行t檢驗。結(jié)果1.動物模型(1)去勢鼠模型Wister大鼠去勢后存活率為100%，雙側(cè)睪丸缺失，生 活習(xí)性無明顯改變。(2)確定體內(nèi)移植動物模型去勢后1周和2周血清睪酮水平與正常鼠 無統(tǒng)計學(xué)差異，去勢3周后，血清睪酮水平開始下降，此期內(nèi)，個體間血清睪 酮水平差異較大，至第4周，睪酮水平下降明顯，并維持于較低水平，第6周， 8周和12周血清睪酮水平與第4周相比無統(tǒng)計學(xué)差異。據(jù)此，取去勢4周動物 作為體內(nèi)移植的動物模型。2. LC培養(yǎng)和鑒定見圖1。結(jié)果表明，經(jīng)差速貼壁法獲得的LC以兩種形態(tài)為主多角形和長梭形， 可見少量雙核細(xì)胞。HSD特異性酶學(xué)反應(yīng)、HSD免疫細(xì)胞化學(xué)、激光 共聚焦及流式細(xì)胞儀鑒定呈陽性反應(yīng)，證實所得細(xì)胞為LC，流失細(xì)胞儀鑒定細(xì) 胞純度陽性率〉95%。3. 共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞形態(tài)學(xué)見圖2。結(jié)果表明，共培養(yǎng)狀態(tài)下睪丸內(nèi)各種貼壁體細(xì)胞能夠共生，電鏡和油紅染色證實Sertoli細(xì)胞呈島樣聚集生長，Sertoli細(xì)胞內(nèi)富含脂滴，且Sertoli 細(xì)胞間形成橋粒連接(箭頭所示)，細(xì)胞島周及島間分布大量IX和少量成纖維 細(xì)胞樣細(xì)胞。4. 細(xì)胞材料復(fù)合物生物學(xué)特性見圖3。結(jié)果表明，單純LC和共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞與生物材料PGA/PLA具有良好的 生物親和性，體外培養(yǎng)2周可以初步形成具有一定形態(tài)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)，倒置相 差顯微鏡下見細(xì)胞于材料上生長良好，基質(zhì)分泌旺盛；掃描電鏡見細(xì)胞混合生 長并與PGA具有良好的生物相容性；組織學(xué)切片可見組織初步形成及未降解PGA。5. 雄激素分泌組織形成見圖4。結(jié)果表明，大體觀察兩組細(xì)胞材料復(fù)合物在移植動物體內(nèi)2個月內(nèi)，均能 夠維持移植物形態(tài)和體積，3個月時，單純LC組移植物明顯較共培養(yǎng)細(xì)胞組為 小。共培養(yǎng)細(xì)胞組移植物仍保持移植時形態(tài)，質(zhì)地堅韌，剖面見內(nèi)部組織形成 良好，結(jié)構(gòu)均一，組織學(xué)切片顯示移植組織由纖維間隔及巢樣細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成，高 倍鏡下見組織內(nèi)部血管形成。至6個月時，單純LC移植組已很難找到移植組織，共培養(yǎng)組移植物形態(tài) 維持良好，體積略縮小。6. 血清睪覇水平檢測見圖5。結(jié)果表明，兩組動物血睪酮水平在移植后4周、6周、9周和12周均顯著 高于單純?nèi)菔?P<0.01)，共培養(yǎng)細(xì)胞材料移植組血睪酮升高可維持到移植 后24周。兩組移植鼠相比，共培養(yǎng)細(xì)胞移植組血睪酮水平顯著高于單純LC移 植組(P<0. 01)。Wister大鼠去勢4周后，血清睪酮水平降至穩(wěn)定水平(0. 56±0. 054ng/ml， n=ll);去勢4周以上大鼠移植單純LC后血睪酮水平在第6周開始上升，至9 到12周維持在一定水平，后開始回落，至24周與去勢鼠無統(tǒng)計學(xué)差異；共培 養(yǎng)細(xì)胞移植組睪酮水平在移植4周時即有顯著提高，第24周仍維持在一定的 睪酮水平；第4、 6、 9和12周兩移植組血睪酮水平具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異 (P<0.01)。實施例4構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織II參照實施例3的方法進(jìn)行構(gòu)建，其中所應(yīng)用的種子細(xì)胞來自于實施例2所 制得的睪丸體細(xì)胞群。結(jié)果與實施例3類似。實施例5構(gòu)建組織工程化雄撖素分泌組織III與實施例4應(yīng)用的種子細(xì)胞及體外構(gòu)建方法相同，但植入的動物模型為同 種異體動物模型。結(jié)果與實施例3類似，構(gòu)建組織可以在同種異動物體內(nèi)長期存活并分泌一 定水平的雄激素。實施例6構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織IV參照實施例3的方法構(gòu)建，所不同的是所用支架材料為含有不可降解材料 Medpore內(nèi)核的PGA/ Medpore復(fù)合支架。復(fù)合支架的制備方法先將Medpore預(yù)制成長1. 3cra，直徑0. 8cra的睪丸 形態(tài)支架作為內(nèi)核，再將15mg PGA纖維包繞Medpore內(nèi)核形成復(fù)合支架。種 子細(xì)胞直接接種于復(fù)合支架的外層PGA纖維上。結(jié)果與實施例3類似，新生雄激素分泌組織與Medpore內(nèi)核具有良好的界 面整合。對比例1構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織r將實施例2得到的LC和Sertoli細(xì)胞按數(shù)量比為1 : 0.005的比例混合得 到睪丸體細(xì)胞群。然后參照實施例3的方法構(gòu)建及測試。 結(jié)果-1. 共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞形態(tài)學(xué)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)含有極少量的SC，形成的細(xì)胞島小且不規(guī)則，島內(nèi)LC細(xì)胞的生長狀態(tài)與實施例3內(nèi)單純LC無顯著形態(tài)學(xué)差異。2. 細(xì)胞材料復(fù)合物生物學(xué)特性類似實施例3內(nèi)的單純LC組。3. 工程化組織形成類似實施例3內(nèi)的單純LC組。4. 血清睪酮水平檢測類似實施例3內(nèi)的單純LC組。對比例2構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織II'將實施例1得到的LC和Sertoli細(xì)胞按數(shù)量比為1 : 50的比例混合得到 睪丸體細(xì)胞群。然后參照實施例3的方法構(gòu)建及測試。 結(jié)果1. 共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞形態(tài)學(xué)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)含有少量的LC，隨培養(yǎng)時間延長， 細(xì)胞數(shù)量相對減少，不能形成優(yōu)勢生長，至1周后幾乎很難見到典型LC形態(tài) 的細(xì)胞，細(xì)胞群內(nèi)主要為SC。2. 細(xì)胞材料復(fù)合物生物學(xué)特性細(xì)胞與生物材料粘附良好，但雄激素分泌水平明顯低于LC組和實施3、實施4和實施5方法制備的各組復(fù)合物產(chǎn)生的雄 激素分泌水平，甚至為0。3. 工程化組織形成類似實施例3，能夠形成一定形態(tài)和結(jié)構(gòu)的均質(zhì)組織 結(jié)構(gòu)，并維持較長的時間，能夠血管化，但組織切片觀察形態(tài)學(xué)，組成細(xì)胞主 要為體積較大、團(tuán)狀分布的SC。4. 血清睪酮水平檢測移植組去勢大鼠的血睪酮水平無明顯改善，明顯低二單純LC組和實施3、實施4和實施5方法制備的各組復(fù)合物產(chǎn)生的雄激素分 泌水平。討論基于以上理由，發(fā)明人認(rèn)為睪丸內(nèi)多種體細(xì)胞混合移植有希望同時解決移 植物內(nèi)缺乏LC干細(xì)胞、移植LC缺乏生長微環(huán)境及同種異體免疫排斥等幾方面問題。由于睪丸內(nèi)的多種體細(xì)胞均可貼壁生長，因此，通過貼壁共培養(yǎng)便可得 到包括LC干細(xì)胞在內(nèi)的各級LC以及SC等多種體細(xì)胞，以這些共培養(yǎng)細(xì)胞作 為種子細(xì)胞進(jìn)行雄激素分泌組織構(gòu)建，盡可能保持類似生理狀態(tài)下這些細(xì)胞間 的相互聯(lián)系和相互影響，既能保證LC的生理性更新和補充(因為含有LC千細(xì) 胞)，又有利于LC較長期存活和生物學(xué)功能維持，有望從細(xì)胞數(shù)量、功能及 種類等多個方面滿足雄激素分泌組織構(gòu)建對種子細(xì)胞的要求，使構(gòu)建組織的細(xì) 胞組成及功能更接近于生理狀態(tài)。更重要的是，由于其中含有大量的SC及其 它多種體細(xì)胞，形成睪丸組織所特有的免疫豁免微環(huán)境，非常有利于構(gòu)建組織 移植后的免疫屏弊，從而在同種異體內(nèi)長期存活。本發(fā)明的結(jié)果表明，LS與SC的混合細(xì)胞或共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞能夠在體外 與可降解生物材料具有良好的生物相容性，細(xì)胞-材料復(fù)合物植入體內(nèi)后能明顯改善同基因及同種異體去勢鼠的血睪酮水平，并能保持原有的體積和形態(tài)。 更重要的是，組織學(xué)可見移植物內(nèi)有大量血管形成，這與組織工程技術(shù)構(gòu)建其 它組織的體內(nèi)形成過程基本一致，也是構(gòu)建組織長期存活并接受體內(nèi)生理調(diào)節(jié) 的重要保證。因此，應(yīng)用共培養(yǎng)的睪丸混合體細(xì)胞作為種子細(xì)胞，完全有可能 構(gòu)建出具有一定形態(tài)、組織學(xué)結(jié)構(gòu)和睪酮分泌功能的雄激素分泌組織。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù) 內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請的權(quán)利要求范圍中，任 何他人完成的技術(shù)實體或方法，若是與申請的權(quán)利要求范圍所定義的完全相 同，或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
權(quán)利要求
1. 一種組織工程化雄激素分泌組織移植物，其特征在于，它包括(i)生物材料；和(ii)接種于所述生物材料的種子細(xì)胞，所述的種子細(xì)胞包括萊迪希細(xì)胞或含有LC的睪丸體細(xì)胞群。
2. 如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的睪丸體細(xì)胞群中包含LC 和謝爾托利細(xì)胞，其數(shù)量比為1 : 0.01 —30;其中LC和SC占細(xì)胞群總量的50--100 %。
3. 如權(quán)利要求2所述的移植物，其特征在于，LC和SC的數(shù)量比為1 : 0. l — l。
4. 如權(quán)利要求2所述的移植物，其特征在于，睪丸體細(xì)胞群中還包括數(shù)量為 0-50%的肌樣細(xì)胞。
5. 如權(quán)利要求1所述的移植物的制備方法，其特征在于，將(i)生物材料； 和(ii)種子細(xì)胞混合得到如權(quán)利要求1所述的組織工程化雄激素分泌組織移植 物，所述的種子細(xì)胞包括LC或含有LC的睪丸體細(xì)胞群。
6. —種睪丸體細(xì)胞群，其特征在于，它包含LC和SC，其數(shù)量比為1 : 0.01 一30;其中LC和SC占細(xì)胞群總量的50—100%。
7. —種如權(quán)利要求6所述的睪丸體細(xì)胞群的制備方法，其特征在于，它包括 步驟將LC和SC混合，混合時的數(shù)量比為1 : 0.01 —30。
8. 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，混合時的數(shù)量比為1 : 0. l — l。 在另一優(yōu)選例中，還包括步驟含有數(shù)量為細(xì)胞總數(shù)0-50%的肌樣細(xì)胞。
9. 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，它包括步驟a. 將用復(fù)合膠原酶消化的睪丸組織通過100-600目過濾網(wǎng)得到睪丸間質(zhì)組織 內(nèi)細(xì)胞，所述的復(fù)合膠原酶含有I型膠原酶、II型膠原酶和中性蛋白酶；b. 將獲得的睪丸間質(zhì)組織內(nèi)細(xì)胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)10分鐘-72小時，取貼壁細(xì) 胞得到共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞。
10. —種如權(quán)利要求6所述的睪丸體細(xì)胞群的用途，其特征在于，用作構(gòu)建 組織工程化雄激素分泌組織的種子細(xì)胞；或用于構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組 織移植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種組織工程化雄激素分泌組織移植物，它包括(1)藥學(xué)上可接受的生物材料；(2)睪丸體細(xì)胞群，所述的睪丸體細(xì)胞群包括分離純化的萊迪希細(xì)胞(Leydig cells，LC)及LC與其它睪丸體細(xì)胞的混合物。本發(fā)明公開的雄激索分泌組織植入體內(nèi)后可有效地分泌各種生理活動所需的雄激素。本發(fā)明還提供了該雄激素分泌組織的具體制備方法和用途。
文檔編號A61L27/00GK101224312SQ20071003663
公開日2008年7月23日 申請日期2007年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月19日
發(fā)明者周廣東, 王曉云, 新 邢 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)