專利名稱：：防治幽門螺桿菌感染的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種能防治幽門螺桿菌感染作用的組合物，以及該組合物在制備用于防治與幽門螺桿菌感染相關(guān)的疾病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：1983年Warren和Marshall發(fā)現(xiàn)了幽門螺桿菌(//6//(^&"^p_y/oh)?，F(xiàn)已證實(shí)，幽門螺桿菌是引起胃炎(如慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎等)、消化性潰瘍(如十二指腸潰瘍及胃潰瘍)的主要病因，與胃癌的發(fā)生也密切相關(guān)。據(jù)信感染幽門螺桿菌的個(gè)體發(fā)生胃腫瘤和MALT(粘膜相關(guān)淋巴樣)淋巴瘤的風(fēng)險(xiǎn)高2-8倍。世界衛(wèi)生組織己于上世紀(jì)九十年代將幽門螺桿菌列為I級(jí)致癌原。幽門螺桿菌的根除對(duì)于上述疾病的預(yù)防、治療以及預(yù)后都有重要的意義。因此，對(duì)慢性胃病的治療，除使用傳統(tǒng)的藥物外，還應(yīng)給予抗幽門螺桿菌藥物。2005年Warren和Marshall因此獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)。我國(guó)成人幽門螺桿菌感染率高達(dá)60%以上。幽門螺桿菌可通過污染水和食物經(jīng)糞-口或口-口途徑感染后進(jìn)入胃內(nèi)。胃內(nèi)幽門螺桿菌大部分游離于黏液層內(nèi)，只有少數(shù)可通過其分泌的黏附素結(jié)合于胃上皮細(xì)胞。幽門螺桿菌的黏附性是其定植于胃粘膜上皮的必要條件。幽門螺桿菌與胃上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，引發(fā)一系列下游事件，導(dǎo)致胃粘膜病變。因此通過抑制或阻斷幽門螺桿菌與胃上皮細(xì)胞的黏附可以防治幽門螺桿菌感染。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)部分患者只產(chǎn)生一過性急性感染而被機(jī)體自然清除，說明感染者自身特異性免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱對(duì)于幽門螺桿菌感染的清除也是至關(guān)重要的。目前臨床上常用的幽門螺桿菌根除方法主要是藥物治療，由制酸劑加兩種抗菌藥物組成。作用機(jī)制是利用抗菌藥物的殺菌作用，通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成等機(jī)制將細(xì)菌殺滅。這些藥物治療雖可獲得一定的療效，但不能預(yù)防幽門螺桿菌感染及其引起的胃炎，而且治療上也存在很大的弊端，如藥物副作用較大、患者依從性差、特別是耐藥菌株出現(xiàn)及治療后復(fù)發(fā)等。尤其值得說明的是，隨著抗菌藥物的普遍使用甚至是濫用，原發(fā)或繼發(fā)耐藥性幽門螺桿菌菌株的發(fā)生率正逐年上升，例如上海市幽門螺桿菌對(duì)甲硝唑的耐藥率由1995年的30%上升至1999年的70%。目前耐藥菌株的出現(xiàn)是臨床根除幽門螺桿菌失敗最主要的原因之一。我國(guó)有著天然的中草藥資源，研究表明許多中草藥對(duì)幽門螺桿菌都有直接抑制作用，目前的抗幽門螺桿菌中藥制劑也是針對(duì)這一作用機(jī)制開發(fā)的，但是始終沒有獲得療效理想的制劑。因此，本領(lǐng)域中仍然需要開發(fā)出新的抗幽門螺桿菌中藥制劑。
發(fā)明內(nèi)容開發(fā)具有不同作用機(jī)理的天然植物，尤其是中草藥或其提取物將是未來抗幽門螺桿菌研究的方向。這類天然植物或其提取物的優(yōu)點(diǎn)在于1.副作用小；2.不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。天然植物提取物的機(jī)理可以為阻斷幽門螺桿菌與胃上皮細(xì)胞之間的黏附和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等。本發(fā)明者通過研究發(fā)現(xiàn)，將茯苓多糖和蒲公英這兩種可以調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫的中藥或提取物添加到原花青素(或蔓越莓果汁)中，可以顯著地提高對(duì)幽門螺桿菌的防治作用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種組合物，其特征在于，所述組合物包含治療和/或預(yù)防幽門螺桿菌感染有效量的原花青素、茯苓多糖和蒲公英。在一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。在另一較優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述組合物中，所述原花青素的含量為0.02-100重量份，所述茯苓多糖的含量為0.1-100重量份，所述蒲公英的含量為1-100重量份，所述原花青素、茯苓多糖和蒲公英的總重量為組合物重量的0.01-99.9%重量。在一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含治療和/或預(yù)防幽門螺桿菌感染有效量的蔓越莓或其提取物、茯苓多糖和蒲公英。所述蔓越莓或其提取物宜為蔓越莓果汁。尤其是，所述組合物中各組分的比例為，每升蔓越莓果汁中含有0.1-100克茯苓多糖和1-100克蒲公英。本發(fā)明的組合物具有食品學(xué)或藥劑學(xué)上可以接受的任何劑型，例如包括，口服液、片劑、膠囊劑、沖劑、顆粒劑、丸劑、散劑、袋泡茶、飲料類或注射劑。本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明的組合物在制備用于治療和/或預(yù)防與幽門螺桿菌感染相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明的組合物在制備食品或保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明者將原在青素、以及天然的中草藥(茯冬多糖和蒲公英)或其提取物結(jié)合起來，獲得了顯著的治療和/或預(yù)防幽門螺桿菌感染的效果。而且，本發(fā)明的組合物為天然植物提取物與藥食同源的中草藥，因此還具有作用機(jī)制獨(dú)特、安全、療效好等優(yōu)點(diǎn)。圖1顯示了在750倍顯微鏡下觀察到的經(jīng)幽門螺桿菌感染后8周的對(duì)照組胃粘膜Giemsa染色情況。圖2顯示了在750倍顯微鏡下觀察到的幽門螺桿菌感染后經(jīng)蔓越莓果汁、茯苓多糖和蒲公英組合治療后4周的胃粘膜Giemsa染色情況。具體實(shí)施方案具體而言，本發(fā)明第一方面提供了一種組合物，其特征在于，所述組合物包含治療和/或預(yù)防幽門螺桿菌感染有效量的原花青素、茯苓多糖和蒲公英。適用于本發(fā)明的原花青素、茯苓多糖和蒲公英均是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。原花青素(Proanthocyanidins,PACs)是植物王國(guó)中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱，廣泛存在于天然植物中，如葡萄、沙棘、松樹皮及越橘類植物中。起初統(tǒng)歸于縮合鞣質(zhì)或黃烷醇類。隨著分離鑒定技術(shù)的提高和對(duì)此類物質(zhì)的深入研究與深刻認(rèn)識(shí)，現(xiàn)已成為獨(dú)樹一幟的一大類物質(zhì)并稱之為原花青素。PACs是黃烷醇的聚合物，也稱縮合鞣質(zhì)。即由不同數(shù)量的黃垸-3-醇(flavan-3-ols)或黃烷-3，4-二醇聚合而成。最簡(jiǎn)單的原花青素是兒茶素或表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體，此外還有三聚體、四聚體等直至十聚體以上。己證實(shí)原花青素有多種生物學(xué)功能，其中包括抗細(xì)菌黏附性的功能。一些植物中的原花青素由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，例如源自蔓越莓的原花青素所具有的A型鍵合(A-typelinkage)，而具有較強(qiáng)的抗泌尿道P-菌毛大腸桿菌黏附于尿道上皮細(xì)胞的作用。茯苓多糖已知是茯苓的一種成份。茯苓多糖可以明顯增加腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞功能，并可激活補(bǔ)體C3和B因子，有強(qiáng)烈的抗腫瘤作用。蒲公英又名黃花地丁，是菊科多年生草本植物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用現(xiàn)有技術(shù)從各種已知的天然植物來源如花生皮、松樹皮、葡萄籽等提取得到原花青素，或通過各種市售途徑來方便地獲得適合用于本發(fā)明組合物的原花青素。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用現(xiàn)有技術(shù)從茯苓的子實(shí)體或皮提取獲得茯苓多糖或通過各種市售途徑來方便地獲得適合用于本發(fā)明組合物的茯苓多糖。茯苓多糖可以是不同的提取比例。因此，本發(fā)明對(duì)于原花青素、蒲公英和茯苓多糖的具體獲得方式和來源并無特別的限制。然而，在一個(gè)特別佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明的原花青素可以從蔓越莓獲得。蔓越莓是原產(chǎn)于北美的一種具有保健作用的天然水果，1816年最早在麻薩諸塞洲、新澤西、維斯康新、華盛頓和俄勒岡的沼澤地或雨水浸過的草地中培育。近年的研究發(fā)現(xiàn)蔓越莓可抑制幽門螺桿菌與胃上皮細(xì)胞的黏附。本發(fā)明者推測(cè)是蔓越莓中存在的原花青素實(shí)現(xiàn)了這一抑制效果。因此，本發(fā)明中一個(gè)特別優(yōu)選的方法是，可采用蔓越莓的果汁或蔓越莓提取物。蔓越莓果汁或蔓越莓提取物可通過市售途徑購(gòu)得，或用常規(guī)手段得到(例如可按照Phytochemistry2005;66:2281-2291中描述的方法提取得到)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的原花青素可以從葡萄籽通過本領(lǐng)域常規(guī)方法來提取獲得。本文所用的術(shù)語(yǔ)"含有"、"包含"、"包括"在用于表征本發(fā)明的組合物時(shí)可以互換使用，其含義表示該組合物中除了所列出的組分如原花青素、蒲公英和茯苓多糖之外，還可以含有沒有指出的其它某些組分，只要這些組分的存在對(duì)于本發(fā)明組合物所需要達(dá)到的效果沒有不利的影響。在一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物由原花青素、蒲公英和茯芬多糖組成。此處，術(shù)語(yǔ)"由……組成"則表示本發(fā)明的組合物由所指出的具體組分組成，沒有其他組分，但是其可以帶有含量在通常范圍內(nèi)的雜質(zhì)。本申請(qǐng)組合物中原花青素、蒲公英和茯苓多糖各自的含量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來確定。在一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物中含有，以組合物的重量計(jì)算，0.01-99%的原花青素、0.01-99%的蒲公英和0.01-99%的茯苓多糖(且三者的總和不超過100%)。在另一較優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物中含有，以組合物的重量計(jì)算，1-90%的原花青素、1-90%的蒲公英和1-90%的茯苓多糖(且三者的總和不超過100%)。另外，本發(fā)明組合物中各個(gè)組分的含量也可以通過各個(gè)組分之間的重量分?jǐn)?shù)關(guān)系來表示。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物中含有0.02-100重量份原花青素、0.1-100重量份茯苓多糖和1-100重量份蒲公英。在較優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物中含有2-80重量份原花青素、0.5-80重量份茯苓多糖和2-80重量份蒲公英。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物中含有5-50重量份原花青素、1-50重量份茯苓多糖和5-50重量份蒲公英。當(dāng)本發(fā)明的組合物中還含有除原花青素、茯苓多糖和蒲公英之外的其它組分(如藥學(xué)上可接受的載體或其它用于預(yù)防和/或治療幽門螺桿菌感染的活性成份)時(shí)，上述原花青素、茯苓多糖和蒲公英的總量(重量)為本發(fā)明組合物重量的0.01-99.9%(重量)，較優(yōu)選的為0.1-90%(重量)、更優(yōu)選的為0.5-80%(重量)、還〖要優(yōu)選的為1-50%(重量)。在采用蔓越莓果汁時(shí)，本發(fā)明的組合物宜為液體形式。蔓越莓果汁的濃度可在1-100%之間(較優(yōu)選的為5-80%)變化，也可以是其濃縮汁(濃縮50倍以內(nèi))。本發(fā)明的組合物可通過在每升蔓越莓果汁(濃度為10-50%)中加入0.1-100克茯苓多糖和1-100克蒲公英來方便地制得。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，每升蔓越莓果汁(濃度為10-50%沖宜含有0.5-80克茯苓多糖和2-80克蒲公英。在一個(gè)還要優(yōu)選的實(shí)施方案中，每升蔓越莓果汁(濃度為10-50%)中宜含有l(wèi)-50克茯苓多糖和5-50克蒲公英。該組合物可以采取濃縮物的形式，或可在服用前作進(jìn)一步的稀釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)在于發(fā)現(xiàn)原花青素(蔓越莓提取物或蔓越莓果汁)、茯苓多糖和蒲公英三個(gè)組分之間產(chǎn)生了顯著優(yōu)異的抵抗幽門螺桿菌的效果。因此，本發(fā)明的組合物中只需包含治療和/或預(yù)防幽門螺桿菌感染有效量的原花青素(蔓越莓提取物或蔓越莓果汁)、茯茶多糖和蒲公英。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠根據(jù)組合物的不同形式和不同用途來確定合適的用量，因此本發(fā)明的范圍不應(yīng)受各組分具體含量的限制。在一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的組合物用作藥物時(shí)，該組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。本文所用的"藥學(xué)上可接受的載體"應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明組合物中的各組分相容，即能與其共混而不會(huì)在通常情況下大幅度降低藥物組合物在治療和/或預(yù)防幽門螺桿菌方面的效果?？勺鳛樗帉W(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤(rùn)滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween;潤(rùn)濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等，其中較優(yōu)選的載體是生理鹽水、或磷酸鹽緩沖鹽水。本發(fā)明的原花青素(尤其是蔓越莓提取物或蔓越莓果汁)、茯茶多糖和蒲公英的組合還可以和其它藥物聯(lián)用。因此，在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物中還可含有其它具有防治幽門螺桿菌效果的藥物、抗生素和/或酸分泌抑制劑。當(dāng)本發(fā)明的組合物用作藥物時(shí)，本發(fā)明的組合物可以制成各種醫(yī)學(xué)上可接受的劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用。本發(fā)明所述制劑是指口服液、注射劑、舌下含服劑等多種液體劑型，或通過加以適當(dāng)?shù)馁x形劑制備成片劑、膠囊劑等多種其他劑型。在較優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以制成口服劑型，例如包括，但不局限于，口服液、片劑、膠囊劑、沖劑、顆粒劑、丸劑、散劑等。本發(fā)明組合物中的各個(gè)活性組分，如原花青素、茯苓多糖和蒲公英，可以存在同一制劑或劑型中，也可以分開存在于同一藥物的不同的劑型中，直至使用前由使用者混合后進(jìn)行給藥。在另一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中的原花青素、茯苓多糖和蒲公英的組合可加入食品中，因此本發(fā)明的組合物中還可含有其它食品組分。在這種情況下，本發(fā)明的組合物可以制成食品上能夠接受的任何固體或液體的形式，例如包括，但不局限于l)乳制品奶酪、黃油、牛奶和其它乳制飲料、涂在面包上的軟質(zhì)食品和乳制品混合物、冰淇淋和酸奶；2)以脂肪為基礎(chǔ)的制品如麥淇淋、涂在面包上的軟質(zhì)食品、蛋黃醬、起酥、烹飪和油炸用油和調(diào)味品；3)以谷物為基礎(chǔ)的制品如面包、面食、糕點(diǎn)、餅干等；4)糖果如巧克力、糖果、口香糖、甜點(diǎn)、果汁冰糕、糖衣和其它餡料；5)飲料酒精類或非酒精類飲料，包括可樂和其它軟飲料、果汁、飲食添加物；6)其它制品如蛋和蛋制品、加工的食品如湯、預(yù)制的面食沙司、預(yù)先制成的膳食、袋泡茶、動(dòng)物飼料等。本發(fā)明的組合物可用諸如混合、灌輸、注射、摻混、分散、乳化、浸泡、噴霧和捏和等方法不作進(jìn)一步變化而直接摻入食品中?；蛘?，該組合物可由消費(fèi)者在攝食前直接涂抹到食物上或加入飲料中。這些是簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)的輸送方式。在另一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中的原花青素、茯苓多糖和蒲公英的組合可加入保健品中，因此本發(fā)明的組合物中還可含有其它保健品組分。本發(fā)明的組合物可通過將各活性組分混合起來來方便地制備。例如，可將各個(gè)組分依次或同時(shí)加入藥學(xué)上可接受的載體(如水)中，然后攪拌均勻，制得均一的組合物。另外，在采用蔓越莓果汁的情況下，可直接將茯苓多糖和蒲公英直接加入蔓越莓果汁中。如上所述，適用于本發(fā)明組合物的原花青素(或蔓越莓果汁)、茯苓多糖和蒲公英均可通過市售途徑制得。為了便于吸收或其它目的，還可對(duì)各種活性組分原料進(jìn)行一些預(yù)處理。例如，用水對(duì)蔓越莓濃縮汁進(jìn)行稀釋，以調(diào)配成合適的濃度。蒲公英可預(yù)先經(jīng)過常規(guī)的烘干、粉碎等步驟。本發(fā)明另一方面涉及所述組合物的應(yīng)用，即，所述組合物可用來制備藥物、食品或保健品。如本申請(qǐng)實(shí)施例中所證實(shí)的，本發(fā)明的組合物能夠顯著的治療和預(yù)防幽門螺桿菌感染作用。因此，預(yù)計(jì)本發(fā)明的組合物能夠用來預(yù)防和/或治療與幽門螺桿菌感染相關(guān)的疾病，例如包括，但不局限于胃炎(如慢性胃炎、淺表性胃炎、活動(dòng)性和持續(xù)性慢性萎縮性胃炎)、消化性潰瘍(如十二指腸潰瘍及胃潰瘍)、胃癌等。本發(fā)明的組合物對(duì)抗幽門螺桿菌的效果可通過常規(guī)試驗(yàn)如快速尿素酶試驗(yàn)、切片培養(yǎng)以及組織學(xué)檢查等手段來確定。目前市場(chǎng)上的快速尿素酶試劑盒都是以酚紅作為指示劑，通過試劑由黃變紅來定性檢測(cè)幽門螺桿菌，大多是用于臨床，而且不能反映出胃黏膜內(nèi)幽門螺桿菌的量。當(dāng)用于科研工作，尤其是進(jìn)行藥物篩選等工作時(shí)，這些試劑盒顯然都不能滿足需要。本發(fā)明使用一種用酚藍(lán)作為指示劑，陽(yáng)性時(shí)試劑由黃變藍(lán)，不僅顏色變化更顯著，利于肉眼觀察，而且可通過測(cè)定特定波長(zhǎng)下的吸光度來定量反映出幽門螺桿菌感染量，不僅適用于科研工作，而且也可用于臨床。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)手段或根據(jù)試劑生產(chǎn)商所提供的說明書進(jìn)行。配制例1:原花青素根據(jù)文獻(xiàn)(Phytochemistry2005;66:2281-2291)的描述從蔓越莓中提取原花青素。茯苓多糖(提取比例為10:1，即每公斤茯苓多糖由10公斤茯茶提取得到):購(gòu)自浙江方格藥業(yè)食用菌多糖有限公司。蒲公英將蒲公英烘干、粉碎，過100目篩。每升蒸餾水中加入0.2克原花青素或/和1.2克茯苳多糖或/和18克蒲公英，充分混勻，分別制得用于以下試驗(yàn)例1和試驗(yàn)例2的本發(fā)明的試劑和對(duì)照試劑。配制例2:原花青素根據(jù)文獻(xiàn)(Phytochemistry2005;66:2281-2291)的描述從蔓越莓中提取原花青素。茯苓多糖與配制例1所用的相同，購(gòu)自浙江方格藥業(yè)食用菌多糖有限公司。蒲公英將蒲公英烘干、粉碎，過100目篩。每升蒸餾水中加入0.2克原花青素或/和6克茯苓多糖或/和18克蒲公英，充分混勻，分別制得用于以下試驗(yàn)例1和試驗(yàn)例2的本發(fā)明的試劑和對(duì)照試劑。試驗(yàn)例l:小鼠幽門蠊桿菌感染治療實(shí)驗(yàn)一.材料和方法1.菌株和培養(yǎng)本研究所用的幽門螺桿菌菌株為悉尼株(SydneyStrain,SS1)。經(jīng)液體培養(yǎng)擴(kuò)增，5000rpm下離心10min，收集細(xì)菌。將菌體懸于改良布氏肉湯中，利用分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度，當(dāng)OD66。=l時(shí)，細(xì)菌濃度為1(Wml。將濃度調(diào)整至2xl08/ml，用于接種小鼠。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為無特殊病原菌(S.P.F)級(jí)C57BL/6小鼠，6~8周齡，18~20g，委托中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。3.治療實(shí)驗(yàn)經(jīng)口灌胃lxl08CFU幽門螺桿菌，隔日1次，共3次。最后1次灌胃后2周從各組中分別隨機(jī)處死l只小鼠，觀察幽門螺桿菌感染情況。然后將小鼠分為12組，經(jīng)口灌胃分別給予原花青素、茯苓多糖、蒲公英、茯苓多糖加蒲公英、原花青素加茯苓多糖、原花青素加蒲公英、原花青素加茯茶多糖與蒲公英(均為0.5ml，一日一次，共30天)。第l組為不治療對(duì)照組。各種處理后的24h和4周后分別處死小鼠，觀察幽門螺桿菌感染情況。4.幽門螺桿菌感染的檢測(cè)將實(shí)驗(yàn)鼠胃沿大彎縱向切開，縱向切成同樣大小的3份，l份直接進(jìn)行半定量尿素酶試驗(yàn)，1份放入無菌生理鹽水中，用于細(xì)菌培養(yǎng)，1份置于10%福爾馬林中固定，用于病理組織學(xué)(Giemsa和H&E染色)檢測(cè)。半定量尿素酶試驗(yàn):將其中l(wèi)份胃黏膜放入500pl尿素酶檢測(cè)試劑(50g尿素，0.3g酚藍(lán)，加0.1%磷酸二氫鉀溶液1000ml，pH值5.0)中，室溫放置5小時(shí)后，在630nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光度(OD)值。該值與Hp感染量成正相關(guān)，因此此結(jié)果可定量反映出胃黏膜Hp的感染量。在Hp未被完全清除的情況下也可顯示出防治效果。培養(yǎng)將l份胃黏膜黏膜面朝下，均勻涂布于血瓊脂平板上，37'C微氧環(huán)境中培養(yǎng)5-7天，經(jīng)涂片革蘭氏染色、尿素酶、觸酶、氧化酶試驗(yàn)確定是否為幽門螺桿菌。5.判斷標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)下列3點(diǎn)全符合為幽門螺桿菌陰性。(l)快速尿素酶試驗(yàn)OD630nnK未感染小鼠ODM0nm的均數(shù)(mean)+2倍標(biāo)準(zhǔn)對(duì)SD);(2)培養(yǎng)陰性；("組織學(xué)檢查未見細(xì)菌。治療效果以清除率(即治療后24h幽門螺桿菌清除的百分比)、根除率(即治療后4周的幽門螺桿菌根除的百分比)及半定量尿素酶試驗(yàn)結(jié)果(OD630nm)來綜合評(píng)價(jià)。預(yù)防效果以預(yù)防率及半定量尿素酶試驗(yàn)結(jié)果(OD630nm)來綜合評(píng)價(jià)。二.結(jié)果1.治療后24h小鼠幽門螺桿菌感染情況(清除率)見下表l。表l.治療后24h小鼠感染情況<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Fisher's精確概率檢驗(yàn))b與第2、3、4、5組相比，p幼.Ol(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)*與對(duì)照組相比，p<0.05(ANOVA，方差分析)**與對(duì)照組相比，pO.01，第11、12組與第2、3、4、5組相比，pO.05(AN0VA)治療后4周小鼠感染情況(根除率)見下表2。表2.治療后4周小鼠感染情況小鼠數(shù)量尿素酶試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)根除%根(OD630nm)鼠鼠除率(平均值土SD)1感染對(duì)照10001.33±0.1142原花青素102200.80±0.306*3茯零多糖(1.2克)10001.13±0.2914茯苓多糖(6克)101101.14±0.452蒲公英10001.18±0.3486茯苓多糖(1.2克)+蒲公英10001.28±0.5617茯苓多糖(6克)+蒲公英101101.04±0.3768原花青素+茯茶多糖(1.2克)10呵a500.71±0.43**9原花青素+茯苳多糖(6克)106a600.62±0.493**10原花青素+蒲公英104400.74±0.487**11原+茯苓多糖(1.2克)+蒲公英109b，c900.29土0.282**12原+茯苓多糖(6克)+蒲公英109b，c卯0.24±0.204**a與對(duì)照組相比，p<0.05(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)b與對(duì)照組相比，p<0.01(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)c與第2組相比，p<0.05(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)與第3、4、5組相比，p<0.01(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)*與對(duì)照組相比，p<0.05(ANOVA)**與對(duì)照組相比，pO.01，第11、12組與第2、3、4、5組相比，p〈0.05(ANOVA)根據(jù)上述結(jié)果可以看出，與單用原花青素、茯苓多糖、蒲公英的結(jié)果相比，原花青素、茯苓多糖和蒲公英的組合具有更為顯著的治療幽門螺桿菌感染的效果。試驗(yàn)例2:小鼠幽門蠊桿菌感染預(yù)防實(shí)驗(yàn)一.材料和方法1—2.同試驗(yàn)例13.預(yù)防實(shí)驗(yàn)將小鼠分為12組，第l-60天分別給予原花青素、茯苓多糖、蒲公英、茯苓多糖加蒲公英、原花青素加茯苓多糖、原花青素加蒲公英、原花青素加茯苓多糖與蒲公英(均為0.5ml，一日一次)。第1組為不預(yù)防對(duì)照組。其中第42、44、46天給予幽門螺桿菌攻擊。第61天處死小鼠鑒定幽門螺桿菌感染情況。4一5.同試驗(yàn)例1。二.結(jié)果1.預(yù)防實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>a與對(duì)照組相比，p<0.05(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)b與對(duì)照組相比，p<0.01(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)c與第2組相比，p<0.05(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)與第3、4、5組相比，p<0.01(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)*與對(duì)照組相比，p<0.05(ANOVA)**與第l、3、4、5組相比，p<0.01，與第2組相比，p<0.05(ANOVA)從表3可以看出，與單用原花青素、茯苓多糖、蒲公英的結(jié)果相比，原花青素、茯苓多糖和蒲公英的組合具有更為顯著的預(yù)防幽門螺桿菌感染的效果。配制例3蔓越莓果汁濃度為17%(v/v)，由蓃越莓濃縮汁(購(gòu)于美國(guó)OceanSpray公司)加入水調(diào)配。茯苓多糖與配制例l相同，購(gòu)自浙江方格藥業(yè)食用菌多糖有限公司。蒲公英將蒲公英烘干、粉碎，過100目篩。在每升蔓越莓果汁或蒸餾水中不加入或加入1.2克茯苓多糖或/和18克蒲公英，充分混勻，分別制得用于以下試驗(yàn)例3和試驗(yàn)例4的本發(fā)明的試劑和對(duì)照試劑。配制例4蔓越莓果汁濃度為17%(v/v)，由蔓越莓濃縮汁(購(gòu)于美國(guó)OceanSpray公司)調(diào)配。茯苓多糖與配制例l相同，購(gòu)自浙江方格藥業(yè)食用菌多糖有限公司。蒲公英將蒲公英烘干、粉碎，過100目篩。在每升蔓越莓果汁或蒸餾水中不加入或加入6克茯茶多糖或/和18克蒲公英，充分混勻，分別制得用于以下試驗(yàn)例3和試驗(yàn)例4的本發(fā)明的試劑和對(duì)照試劑。試驗(yàn)例3:小鼠幽門蠊桿菌感染治療實(shí)驗(yàn)一.材料和方法1.菌株和培養(yǎng)本研究所用的幽門螺桿菌菌株為悉尼株(SydneyStrain,SS1)。經(jīng)液體培養(yǎng)擴(kuò)增，5000rpm，10min離心收集細(xì)菌。將菌體懸于改良布氏肉湯中，利用分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度，當(dāng)0066。=1時(shí)，細(xì)菌濃度為108/ml。將濃度調(diào)整至2xlOVml，用于接種小鼠。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為無特殊病原菌(8衛(wèi)？)級(jí)。578176小鼠，6~8周齡，18~20g，委托中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。3.治療實(shí)驗(yàn)經(jīng)口灌胃lxl08CFU幽門螺桿菌，隔日1次，共3次。最后1次灌胃后2周從各組中分別隨機(jī)處死l只小鼠，觀察幽門螺桿菌感染情況。然后將小鼠分為12組，經(jīng)口灌胃分別給予蔓越莓汁、茯苓多糖、蒲公英、茯苓多糖加蒲公英、蔓越莓汁加茯苓多糖、蔓越莓汁加蒲公英、蔓越莓汁加茯苓多糖與蒲公英(均為0.5ml，一日一次，共30天)。第l組為不治療對(duì)照組。各種處理后的24h和4周后分別處死小鼠，觀察幽門螺桿菌感染情況。4.幽門螺桿菌感染的檢測(cè)將實(shí)驗(yàn)鼠胃沿大彎縱向切幵，縱向切成同樣大小的3份，l份直接進(jìn)行快速尿素酶試驗(yàn)，l份放入無菌生理鹽水中，用于細(xì)菌培養(yǎng)，1份置于10%福爾馬林中固定，用于病理組織學(xué)(Giemsa和H&E染色)檢測(cè)。半定量尿素酶試驗(yàn):將其中l(wèi)份胃黏膜放入500pl尿素酶檢測(cè)試劑(50g尿素，0.3g酚藍(lán)，加0.1%磷酸二氫鉀溶液1000ml，pH值5.0)中，室溫放置5小時(shí)后，在630nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光度(OD)值。該值與Hp感染量成正相關(guān)，因此此結(jié)果可定量反映出胃黏膜Hp的感染量。在Hp未被完全清除的情況下也可顯示出防治效果。培養(yǎng)將l份胃黏膜黏膜面朝下，均勻涂布于血瓊脂平板上，37'C微氧環(huán)境中培養(yǎng)5-7天，經(jīng)涂片革蘭氏染色、尿素酶、觸酶、氧化酶試驗(yàn)確定是否為幽門螺桿菌。5.判斷標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)下列3點(diǎn)全符合為陰性。(l)快速尿素酶試驗(yàn)OD630nnK未感染小鼠OD630nm的均數(shù)(mean)+2倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD);(2)培養(yǎng)陰性；(3)組織學(xué)檢查未見細(xì)菌。治療效果以清除率(即治療后24h幽門螺桿菌清除的百分比)、根除率(即治療后4周的幽門螺桿菌根除的百分比)及半定量尿素酶試驗(yàn)結(jié)果(OD630nm)來綜合評(píng)價(jià)。預(yù)防效果以預(yù)防率及半定量尿素酶試驗(yàn)結(jié)果(OD630nm)來綜合評(píng)價(jià)。二.結(jié)果治療后24h小鼠感染情況見下表4。表4.治療后24h小鼠感染情況_<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>a與對(duì)照組相比，p<0.01(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)b與第2組相比，p<0.05(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)與第3、4、5組相比，p<0.01(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)*與對(duì)照組相比，p<0.05(ANOVA)**與第1、3、4、5組相比，p<0.01(ANOVA)，與第2組相比，p<0.05(ANOVA)治療后4周小鼠感染情況見下表5、圖1和圖2。表5.治療后4周小鼠感染情況小鼠數(shù)量尿素酶試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)根除%根(OD630腿)鼠鼠除率(平均值土SD)1感染對(duì)照10001.44±0.0832蔓越莓汁103300.94±0.619*茯苓多糖(L2克)102201.48±0.3314茯苓多糖(6克)102201.37±0.4025蒲公英101101.45±0.3216茯苓多糖(1,.2克)+蒲公英103301.15±0.2947茯茶多糖(6克)+蒲公英103301.04±0.2568蔓越莓汁+茯苓多糖(1.2克)106a600.557±0.494**9蔓越莓汁+茯苓多糖(6克)106a600.509±0.478**10蔓越莓汁+蒲公英105a500.757±0.623*11蔓+茯苓多糖(1.2克)+蒲公英10900.333±0.404**12蔓+茯苓多糖(6克)+蒲公英109b，c900.297±0.386**a與對(duì)照組相比，p<0.05(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)b與對(duì)照組相比，p<0.01(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)c與第2組相比，p<0.05(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)與第3、4、5組相比，p<0.01(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)*與對(duì)照組相比，p<0.05(ANOVA)**與第i、3、4、5組相比，p<.01(ANOVA)，第11、12組與第2組相比，p<0.05(ANOVA)另外，從圖l可以看到，對(duì)照組在感染幽門螺桿菌8周后，胃黏膜中可見大量幽門螺桿菌定植(Giemsa染色)。而在圖2中，用本發(fā)明的蔓越莓果汁、茯苓多糖(6克)和蒲公英的組合治療后4周，沒有見到幽門螺桿菌(Giemsa染色)。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果可以知道，與單用蔓越莓果汁、茯茶多糖、蒲公英的結(jié)果相比，蔓越莓果汁、茯苓多糖和蒲公英的組合具有更為顯著的預(yù)防幽門螺桿菌感染的效果。試驗(yàn)例4:小鼠幽門螵桿菌感染預(yù)防實(shí)驗(yàn)一.材料和方法1一2.同試驗(yàn)例33.預(yù)防實(shí)驗(yàn)將小鼠分為12組，第l-60天分別給予蔓越莓汁、茯冬多糖、蒲公英、茯苓多糖加蒲公英、蔓越莓汁加茯苓多糖、蔓越莓汁加蒲公英、蔓越莓汁加茯苓多糖與蒲公英(均為0.5ml，一日一次)。第1組為不預(yù)防對(duì)照組。其中第42、44、46天給予幽門螺桿菌攻擊。第61天處死小鼠鑒定幽門螺桿菌感染情況。4一5.同試驗(yàn)例3二.結(jié)果預(yù)防實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表6。表6.預(yù)防小鼠感染情況<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>a與對(duì)照組相比，p<0.05(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)b與對(duì)照組相比，p<0.01(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)c與第2組相比，p<0.05(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)與第3、4、5組相比，p<0.01(two-tailedFisher'sExactProbabilityTest)*與對(duì)照組相比，p<0.05(ANOVA)**與對(duì)照組相比，pO.Ol(ANOVA)，第11、12組與第2、3、4、5組相比，p<0.05(ANOVA)從表6結(jié)果得知，與單用蔓越莓果汁、茯苓多糖、蒲公英的結(jié)果相比，蔓越莓果汁、茯冬多糖和蒲公英的組合具有更為顯著的預(yù)防幽門螺桿菌感染的效果。另外，除了上述實(shí)施例外，發(fā)明人還對(duì)按照上述配制例和試驗(yàn)例的相同方法配制了來自葡萄籽的原花青素市售產(chǎn)品(購(gòu)自上?？稻呕す?與茯苓多糖、蒲公英的組合物。試驗(yàn)結(jié)果證明，該來自葡萄籽的原花青素與茯苓多糖、蒲公英的組合也同樣獲得了比單用葡萄籽原花青素、茯苓多糖或蒲公英顯著優(yōu)異的治療和預(yù)防幽門螺桿菌感染的效果。盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均納入本文作參考。權(quán)利要求1.一種組合物，其特征在于，所述組合物包含治療和/或預(yù)防幽門螺桿菌感染有效量的原花青素、茯苓多糖和蒲公英。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述原花青素的含量為0.02-100重量份，所述茯苓多糖的含量為0.1-100重量份，所述蒲公英的含量為1-100重量份，所述原花青素、茯苓多糖和蒲公英的總重量為組合物重量的0.01-99.9%重量。4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含蔓越莓或其提取物、茯苓多糖和蒲公英。5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含蔓越莓果汁、茯苓多糖和蒲公英，所述組合物中各組分的比例為，每升蔓越莓果汁中含有0.1-100克茯苓多糖和1-100克蒲公英。6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物具有食品學(xué)或藥劑學(xué)上可以接受的任何劑型。7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物的劑型為口服液、片劑、膠囊劑、沖劑、顆粒劑、丸劑、散劑、袋泡茶、飲料類或注射劑。8.權(quán)利要求1所述的組合物在制備用于治療和/或預(yù)防與幽門螺桿菌感染相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所述與幽門螺桿菌感染相關(guān)的疾病是胃炎、消化性潰瘍或胃癌。10.權(quán)利要求1所述的組合物在制備食品或保健品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種包含原花青素、茯苓多糖和蒲公英的組合物。本發(fā)明還涉及所述組合物在制備用于治療和/或預(yù)防與幽門螺桿菌感染相關(guān)的疾病的藥物、以及食品或保健品中的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K9/10GK101239091SQ20071003724公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2007年2月7日優(yōu)先權(quán)日2007年2月7日發(fā)明者彤史申請(qǐng)人:上海華珠生物科技有限公司