專利名稱：：積雪草苷在抗肺纖維化遷延期中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及積雪草苷的藥物用途，特別涉及一種積雪草苷在抗肺纖維化遷延期中的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：本申請人公開號為CN1439376A的專利申請中公開了積雪草苷在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用。其中顯示積雪草苷在肺纖維化前4周，即肺纖維化的炎癥期及纖維化初期的應(yīng)用具有一定的抗纖維化作用。然而，肺纖維化的病理過程是個遷延、漸進的過程，其通常分為四個階段I期急性肺泡炎，II期急性肺泡炎演變?yōu)槁?，III期病變進行性加重、間質(zhì)內(nèi)膠原組織紊亂、大量纖維組織增生，IV期為本病晚期、肺泡結(jié)構(gòu)完全損害、囊性變形成蜂窩肺。現(xiàn)有大量研究發(fā)現(xiàn)，有許多的細胞因子在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，其中促纖維化的主要有兩類1)參與局部損傷和炎癥反應(yīng)的細胞因子腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、白細胞介素(IL)、單核細胞趨化因子(MCP-1)等，2)參與纖維化進展的細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-e(TGF-e)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、內(nèi)皮素-l(ET-l)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)等(韋小瑜、何云、程明亮.細胞因子與肺纖維化.西南軍醫(yī)，2006年4月)。因此，這些細胞因子在肺纖維化的炎癥期及纖維化初期的進展期中含量較高，而在纖維化的中、晚期纖維化的病理活動漸趨平緩、乃至靜止，上述各種促纖維化的細胞因子含量也逐漸恢復(fù)，進入了肺纖維化的遷延期。目前治療肺纖維化的藥物大多針對肺纖維化的炎癥期和纖維化進展期，如糖皮質(zhì)激素、N-乙酰半胱氨酸等，而對于纖維化遷延期，這些藥物無明顯療效且副反應(yīng)大，目前尚無有效藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題即是上述課題，提供積雪草苷在抗肺纖維化中的新應(yīng)用，即在制備抗肺纖維化遷延期的藥物中的新應(yīng)用。本發(fā)明所說的積雪草苷(Asiaticoside)，又稱亞細亞皂苷，積雪苷，積雪草武等，其是從中草藥積雪草[Centdlaasiatica(L.)Urb.]中提取的一種苷類化合物，分子式為C48H78019。其提取方法可參見上述本申請人的專利申請文件，也可商業(yè)購得。本發(fā)明人在進一步以博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化鼠的動物試驗研究中發(fā)現(xiàn)，在博萊霉素給藥(造模)28天后模型組測得腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、轉(zhuǎn)化生長因子-e(TGF-e)、內(nèi)皮素-l(ET-l)等細胞因子還處于較高水平；而在博萊霉素給藥第50天時，測得上述細胞因子TNF-a、TGF-P已恢復(fù)正常(模型組與正常組統(tǒng)計學(xué)上無差別意義)，而ET-1也較第28天時明顯下降，說明博萊霉素給藥第28天后，進入了肺纖維化的遷延期，特別是至第50天時，纖維化活動基本靜止。另外，動物模型顯示博萊霉素給藥第50天時大鼠肺纖維化有所自行恢復(fù)，而藥物組在給予積雪草苷用藥28天后，繼續(xù)用藥至49天，第50天的病理顯示較模型組炎癥及纖維增生程度更輕。更令人驚奇地是在造模第50天始分別給予積雪草苷、積雪草苷+外源性細胞因子(TNF-oubFGF、ET-1)治療28天，第78天時發(fā)現(xiàn)積雪草苷+外源性細胞因子給藥組的病理示肺間隔呈輕度局灶性增厚，增生灶內(nèi)只有少量成纖維細胞增生，較單給予積雪草苷組增生范圍和程度均較輕?？梢?，積雪草苷在促纖維化的細胞因子，不管內(nèi)源性還是外源性的協(xié)同作用下，具有治療遷延期的肺纖維化的作用；特別是對于細胞因子水平低的纖維化靜止期，當(dāng)同時給予外源性'促纖維化的細胞因子時，積雪草苷還能發(fā)揮抗纖維化的治療效果。因此，對于發(fā)現(xiàn)時已處于肺纖維化遷延期的眾多患者的治療，無疑具有重要的意義；而且由于積雪草苷是中草藥來源的天然化合物，眾所周知其較激素和免疫抑制劑的副作用更小、安全性更佳。故而，本發(fā)明還提供一種抗肺纖維化遷延期的藥物組合物，其活性成分包括積雪草苷和外源性的促纖維化的細胞因子。根據(jù)本發(fā)明，所說的"肺纖維化遷延期"是指肺纖維化炎癥期后，纖維增生趨緩，乃至可能靜止的疾病階段，此階段纖維化細胞因子水平已從高峰逐漸回落乃至恢復(fù)正常。本發(fā)明所述"外源性"是指非被給藥者自身體內(nèi)產(chǎn)生，而由體外給予的，其包括天然提取或重組等方法制得。所說"促纖維化的細胞因子"如
背景技術(shù)：
中所述，優(yōu)選自腫瘤壞死因子cu堿性成纖維細胞生長因子以及內(nèi)皮素-1中的一種或幾種。具體實施方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。其中所用的積雪草苷為根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，如上述CN1439376A的專利文獻中公開的方法來自行提取將積雪草總苷500g加水溶解，過濾，沉淀干燥，加丙酮回流，過濾，殘渣揮去丙酮，加乙酸乙酯、水混合液回流，過濾，殘渣70'C干燥，粉碎即得積雪草苷粉。用HPLC檢測，積雪草苷含量可達90%以上。上述積雪草總苷為常規(guī)市售產(chǎn)品。實施例1博萊霉素致大鼠肺纖維化模型的建立雄性SD大鼠，體重200g-250g。用3%速可眠麻醉，平放于手術(shù)臺上，固定。酒精消毒頸部后逐層暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向心端進針，以博萊霉素5mg/kg的劑量注入，將大鼠直立，隨即旋轉(zhuǎn)片刻使溶液均勻分布于肺內(nèi)，縫合。待大鼠清醒后，隨機分組。次日起給藥，積雪草苷組設(shè)3個劑量組，分別為4、12、36mg/kg口服X28天，另設(shè)模型對照組和正常組。模型組及正常組給予生理鹽水(NS)。在積雪草苷給藥的第28天，分別對各組大鼠進行血清細胞因子測定。結(jié)果如下:_表l、第28天時各組細胞因子含量的影響_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>"與模型組比較P<0.01"與正常組比較P<0.01可見造模第28天時，模型組的纖維化細胞因子含量明顯較正常組高，經(jīng)積雪草苷治療后，纖維化細胞因子含量有所降低。實施例2將實施例1中的各積雪草苷用藥組再分成a、b兩組，a組從第29天始停用藥物治療，給予相應(yīng)劑量生理鹽水，b組繼續(xù)給予藥物治療直至第49天，即積雪草苷用藥組分別為4、12、36mg^g口服X49天，模型組及正常組給予生理鹽水(NS)。在積雪草苷給藥的第50天，分別對各組大鼠進行血清細胞因子測定，并取大鼠的肺組織制作病理切片觀察病理變化。結(jié)果如下:表2、第50天時各組細胞因子含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>其中積雪草苷用藥a組細胞因子含量與b組相仿，在此不重復(fù)列出?？梢姡谠炷：蟮?0天，細胞因子TNF-a、TGF-P及ET-1已恢復(fù)正常(模型組與正常組統(tǒng)計學(xué)上無差別意義)，說明纖維化活動漸趨緩，進入遷延期。病理顯示正常對照組動物未見肺淤血或水腫，肺組織亦無炎細胞浸潤及纖維化。模型組動物的肺組織各切片散在局灶性中度肺泡隔增厚，其中見有以淋巴細胞為主炎細胞浸潤；并見纖維母細胞或成纖維細胞增生，并見肺泡內(nèi)脫落變性肺泡上皮細胞及炎細胞。伴有輕度小血管壁透明變性，偶見毛細血管微血管血栓形成。積雪草苷藥物組(a組)第50天動物的肺組織內(nèi)可見淋巴細胞為主的輕度炎癥和肺泡炎，肺泡間隔輕度增生，并可見肺膜下輕度肺泡萎陷或肺氣腫，但上述病變的程度和范圍較模型組明顯減輕。積雪草苷藥物組(b組)第50天各劑量組均未見肺淤血或肺水腫，肺泡隔輕度炎細胞浸潤，未見成纖維細胞伸入肺泡腔內(nèi)，亦未見有肺泡透明膜形成。未見呼吸性支氣管纖維化；亦未見彌漫性間質(zhì)纖維化。各切片均見輕度肺不張或代償性肺氣腫?？梢姡卫w維化的大鼠在第28天后未用藥也可自行部分修復(fù)；但積雪草苷藥物組的效果更明顯，其中，連續(xù)用藥49天后比用藥28天的效果更佳。實施例3造模試驗同實施例1,造模后第50天起給藥,積雪草苷組設(shè)3個劑量組,分別為4、12、36mg/kg，另設(shè)模型對照組和正常組。模型組及正常組給予生理鹽水。口服給藥周期為28天(即從造模開始至第77天)。第78天分別對各組大鼠進行血清細胞因子測定(結(jié)果如表3所示)及肺部病理檢查。表3、第78天時各組細胞因子含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>另外，設(shè)置積雪草苷+細胞因子藥物組，在造模后第50天給予積雪草苷(分為4、12、36mg/kg三個劑量組)的同時，分別給予TNF-a(中科院上海生物工程中心)12.5ug/kg靜脈給藥，每天一次X28天，在第78天對各組大鼠進行TNF-ct測定(結(jié)果如表4所示)及肺部病理檢査；或者腹腔注射bFGF(sigma公司)4800AU/2ml/只，每天一次X28天，在第78天對各組大鼠進行TGF-p測定(結(jié)果如表5所示)及肺部病理檢査;或者給予ET-l(sigma公司)2pg/kg靜脈給藥，每天一次X28天，在第78天對各組大鼠進行ET-1測定(結(jié)果如表6所示)及肺部病理檢査；另設(shè)細胞因子組(給予生理鹽水+上述劑量的細胞因子)，以及模型組和正常組(給予生理鹽水)作為對照。表4、積雪草苷+TNF-a對第78天各組TNF-a含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3與細胞因子組比較P<0.01"與正常組比較PO.Ol表5、積雪草苷+bFGF對第78天各組TGF-p含量的影響組別齊懂(mg/kg)Ni士SD(ng/ml)正常組生理鹽水100.079±0.008"模型組生理鹽水100.088±0.011**細胞因子組生理鹽水100.119土0.028"積雪草苷4100.085±0.071**積雪草苷12100.089±0.033**積雪草苷36100.084±0.057**"與細胞因子組比較P<0.05"與正常組比較PO.01表6、積雪草苷+ET-l對第78天各組ET-1含ii的影響組別劑量(mg/kg)Nx士SD(ng/ml)正常組生理鹽水10221.41±19.44**模型組生理鹽水10231.13±23,03**細胞因子組生理鹽水10269.91士31.35"積雪草苷'410239.39±22.81**積雪草苷1210231,43±31.04**積雪草苷3610227.86±22.18**與細胞因子組比較PO.Ol"與正常組比較PO.Ol可見，在造模后第78天，細胞因子組測定值均明顯升高，說明這些細胞因子對纖維化已經(jīng)產(chǎn)生了一定的影響，而此期單純積雪草苷藥物治療對細胞因子TNF-a、TGF-0影響不大(各藥物組與模型組統(tǒng)計學(xué)上無差別意義)。病理結(jié)果正常組動物肺組織結(jié)構(gòu)完好，未見出血、增生、水腫、炎癥及纖維化等表現(xiàn)。模型組動物肺組織內(nèi)炎癥已基本消退。僅有散在的少量灶性區(qū)域有少許淋巴細胞浸潤。肺間隔呈中度局灶性增厚。增生灶內(nèi)仍有成纖維細胞輕度至中度增生。纖維增生已累及終末細支氣管周圍，胸膜下尚可見輕度肺泡萎陷或肺氣腫。單純積雪草苷給藥組肺組織內(nèi)無明顯炎癥可見。僅有散在的灶性淋巴細胞輕度浸潤。肺間隔呈中度局灶性增厚。增生灶內(nèi)見少量成纖維細胞增生。纖維增生已累及終末細支氣管周圍，胸膜下尚可見輕度肺泡萎陷或肺氣腫。細胞因子組動物肺組織內(nèi)有炎癥。鏡下灶性淋巴細胞浸潤區(qū)域較為常見。肺間隔呈中度局灶性增厚，增生灶內(nèi)有中度的成纖維細胞增生。纖維增生已累及終末細支氣管周圍。胸膜下尚可見輕度肺泡萎陷或肺氣腫。聯(lián)合治療組(即積雪草苷+細胞因子)動物肺組織內(nèi)有輕度炎癥。鏡下灶性淋巴細胞浸潤區(qū)域較為常見。肺間隔呈輕度局灶性增厚。增生灶內(nèi)僅有少量成纖維細胞增生。胸膜下偶見輕度肺泡萎陷或肺氣腫。其范圍和程度遠較模型組、單純積雪草苷給藥組輕。可見，在肺纖維化遷延期，特別是細胞因子水平低時，給予外源性的纖維化細胞因子與積雪草苷聯(lián)合治療，可使肺間隔局灶性增厚、肺泡萎陷或肺氣腫等肺纖維化程度減輕。權(quán)利要求1.積雪草苷在制備抗肺纖維化遷延期的藥物中的應(yīng)用。2、一種抗肺纖維化遷延期的藥物組合物，其特征在于其活性成分包括積雪草苷和外源性的促纖維化的細胞因子。3、如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于所述的促纖維化的細胞因子選自腫瘤壞死因子a、堿性成纖維細胞生長因子以及內(nèi)皮素-1中的一種或幾種。全文摘要本發(fā)明公開了積雪草苷在制備抗肺纖維化遷延期的藥物中的新應(yīng)用。在肺纖維化遷延末期，積雪草苷在體內(nèi)可在促纖維化的細胞因子作用下產(chǎn)生抗肺纖維化作用，因此本發(fā)明還公開一種抗肺纖維化遷延期的藥物組合物，其活性成分包括積雪草苷和外源性的促纖維化的細胞因子。文檔編號A61K38/19GK101244072SQ20071003747公開日2008年8月20日申請日期2007年2月13日優(yōu)先權(quán)日2007年2月13日發(fā)明者英劉,劉全海,劉珉宇,沈龍海,王小晨,磷肖,賀興東申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院