專利名稱：由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖類載體及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，內(nèi)容與由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖類納米載體相關(guān)，具體的講，涉及了將葉酸交聯(lián)在殼聚糖及其衍生物上靶向腫瘤細(xì)胞的方法，尤其涉及了這類殼聚糖(或殼聚糖衍生物)-葉酸載體與反義核酸及阿霉素等抗癌藥物形成藥物組合物的制備方法、性質(zhì)及其在抗腫瘤治療上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著生物材料科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和藥劑學(xué)的發(fā)展，載體藥物成為一種新興的給藥形式。該技術(shù)的關(guān)鍵在于如何選擇載體材料。
目前，基因治療常用的載體系統(tǒng)主要分為兩大類病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。
所說的病毒載體系統(tǒng)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體等。病毒載體系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)都很明顯，其優(yōu)點(diǎn)在于基因傳遞效率非常高，有的甚至達(dá)到90％以上，但該載體系統(tǒng)也存在著很多不易克服的缺點(diǎn)，比如病毒載體難以長期穩(wěn)定表達(dá)，有時會從質(zhì)粒中丟失，更有甚者引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，有潛在的致瘤性。于是最新的研究重點(diǎn)集中在相對安全并且免疫原性低的非病毒載體上。
傳統(tǒng)的非病毒載體包括裸DNA、脂質(zhì)體等，雖然無毒，但基因傳遞效率非常低，相關(guān)基因表達(dá)不佳。
通過分析，可以確定選擇基因治療載體的三個原則為安全、有效、特性優(yōu)良。而近年來發(fā)展起來的一種新型非病毒基因載體殼聚糖，除了具有低細(xì)胞毒性和優(yōu)良的生物相容性之外，還因?yàn)槠渚哂歇?dú)特的跨膜能力，基因傳遞效率相對較高而引起人們廣泛關(guān)注。
殼聚糖(Chitosan)又名脫乙酰甲殼素、可溶性甲殼素和聚氨基葡萄糖等，是甲殼素的一種衍生物，通過用濃堿處理甲殼素使其脫去乙酰基而得到。通常甲殼素的脫乙酰度超過55％時就叫殼聚糖，而作為工業(yè)品的殼聚糖，N-脫乙酰度至少在70％以上。殼聚糖的分子量一般分布在幾萬至幾十萬，是天然高分子中少有的堿性聚氨基多糖。殼聚糖是一種弱堿，不溶于水和有機(jī)溶劑，可溶于pH＜6.5的稀酸。它帶正電荷的原理在于在稀酸中，其葡萄糖氨基轉(zhuǎn)化為R-NH3+，形成了聚陽離子凝膠溶液。腫瘤細(xì)胞表面一般帶負(fù)電荷，帶正電荷的殼聚糖納米粒通過電性之間相互作用，吸附到腫瘤細(xì)胞的表面，中和電荷，抑制其生長。殼聚糖本身具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性，在體內(nèi)，它可被包括溶菌酶、胃蛋白酶在內(nèi)的多種酶生物降解，產(chǎn)物無毒，可被生物體完全吸收。殼聚糖還具有很低的免疫原性，不會對人體構(gòu)成潛在的危害。另外，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，納米級的殼聚糖載體易于進(jìn)行表面共價修飾、靶細(xì)胞配體的修飾，從更易于穿透細(xì)胞膜，定位在細(xì)胞核?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，殼聚糖在可控、靶向、抗腫瘤的藥物載體研究中得到廣泛的應(yīng)用。有人對殼聚糖納米粒及包埋Cu(II)的殼聚糖納米粒進(jìn)行了研究，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩種納米粒對BEL7402，BGC823，Colo320等腫瘤細(xì)胞都有顯著的細(xì)胞毒活性，抑制腫瘤細(xì)胞的生長，殼聚糖溶液本身的細(xì)胞毒性很小，形成納米粒后部分生物學(xué)性質(zhì)可能改變。包埋Cu(II)的殼聚糖納米粒有更高的腫瘤細(xì)胞親和力，加速抑制其生長。然而，兩種納米粒對人體正常肝細(xì)胞的生長幾乎都不產(chǎn)生影響。這恰恰證明了殼聚糖作為藥物載體可以降低對正常組織的毒副作用和優(yōu)良的腫瘤靶向性。另外，Kamiyama等發(fā)現(xiàn)水溶性殼聚糖衍生物(如丁二酰殼聚糖)能夠增加藥物對病灶區(qū)血管壁的通透性，使藥物向周圍組織有選擇的滲透，最終，藥物集中在腫瘤組織上，大大提高了藥物的靶向性。這些衍生物還減慢了藥物被降解的速度，拉長了給藥的間隔時間，為臨床使用打下了基礎(chǔ)。綜上所述，殼聚糖及其衍生物可作為抗腫瘤藥物的靶向載體，目前它已成為抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
但是，尋找合適的載體還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，關(guān)于基因藥物如何被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化的方法，國內(nèi)外也開展了各式各樣的研究。許多基因藥物，如反義核酸，不能穿過細(xì)胞膜，即使藥物載體將藥物載至腫瘤細(xì)胞表面，仍因缺乏有效的內(nèi)化機(jī)制而不占優(yōu)勢。傳統(tǒng)的導(dǎo)入方法如直接導(dǎo)入、脂質(zhì)體導(dǎo)入、病毒介導(dǎo)或者因?yàn)閷?dǎo)入效率低，或者因?yàn)榘邢蛐缘?，生物半衰期短和潛在的機(jī)體危害性而不被研究者所看好。逐漸地，研究集中在受體介導(dǎo)的藥物投遞系統(tǒng)，隨著在分子水平上對腫瘤細(xì)胞研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞具有一系列過量表達(dá)的受體，因此可將與受體相關(guān)的配體或抗體連接在藥物或藥物載體表面，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將所藥物靶向轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的組織和腫瘤細(xì)胞上，這個方法的特異性和對腫瘤細(xì)胞的親和性都非常高，大大提高了藥物的靶向性和轉(zhuǎn)運(yùn)效率。
在受體介導(dǎo)的藥物投遞系統(tǒng)中，葉酸受體是比較著名的受體之一。隨著研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)缺少葉酸，無法進(jìn)行受體配體間的配對，多種腫瘤細(xì)胞膜表面上的葉酸受體的數(shù)量和活性都比一般正常細(xì)胞高，此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)為開展葉酸受體介導(dǎo)藥物投遞的研究奠定了基礎(chǔ)。葉酸(folate acid，F(xiàn)A，維生素B11)即葉酸受體的配體，是一種廣泛存在于綠色蔬菜中的維生素。由于它一開始是從植物的葉子中提取出來，故稱之為“葉酸”。葉酸的化學(xué)名稱為“蝶酰谷氨酸”，是由喋啶酸、對氨基苯甲酸與氨酸結(jié)合而成的，其活性集團(tuán)為氨基和末端的兩個羧基，一般都通過羧基與載體或藥物上的氨基相連，輔助藥物的投遞。葉酸屬于人體必需的維生素，但人體本身不能合成葉酸，因此一般是從綠色蔬菜中攝取適量葉酸，以保證體內(nèi)細(xì)胞的增殖與生長。但是，葉酸在生理?xiàng)l件下很難自由透過細(xì)胞膜，必須進(jìn)行內(nèi)化才能被人體所吸收。目前，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了兩種內(nèi)化葉酸的機(jī)制一是低親和力的跨膜蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)四氫葉酸、二氫葉酸(葉酸的還原態(tài))進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；二是高親和力的葉酸受體，可吸收葉酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。葉酸受體(folate acid receptor，F(xiàn)R)是細(xì)胞膜表面的一種糖蛋白，分子量為38～40KD，在脈絡(luò)叢、胎盤中有一定表達(dá)，在肺、胸腺、腎中呈低水平表達(dá)，而在一些腫瘤組織中呈高水平表達(dá)，它對于葉酸或葉酸的偶聯(lián)物都有高度的親和力，因此可介導(dǎo)含有葉酸及其偶聯(lián)物的載體藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)。目前已鑒定出的三種葉酸受體異構(gòu)體分別為α-FR、β-FR、γ-FR。α-FR在一些上皮細(xì)胞系腫瘤，如卵巢癌、腎癌、子宮癌、睪丸癌、腦瘤、結(jié)腸癌、肺腺癌等高水平表達(dá)；β-FR在其他許多腫瘤，如乳腺癌、腦瘤、睪丸癌、頭頸部腫瘤、粒系白血病等高水平表達(dá)；γ-FR則在許多組織中難以檢測到；轉(zhuǎn)移瘤比原位、惡性程度低的腫瘤表達(dá)更多葉酸受體?？梢姡~酸受體介導(dǎo)的投遞系統(tǒng)主要就是針對腫瘤細(xì)胞的，在抗腫瘤的治療中，葉酸由于無害，免疫原性弱，穩(wěn)定，與葉酸受體的結(jié)合力強(qiáng)，對腫瘤有高度的選擇性而成為新一代靶向劑。利用葉酸受體介導(dǎo)的基因藥物投遞的大體步驟為將靶向劑葉酸與載體化學(xué)交聯(lián)，再通過電性作用使基因藥物被載體葉酸二元體包埋，形成三元復(fù)合物，通過受體-配體的作用的介導(dǎo)，將基因藥物導(dǎo)入腫瘤靶細(xì)胞。
近年來，基因藥物越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。由于化學(xué)藥物對人體的高毒性，往往使正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞同時死亡，這使人們轉(zhuǎn)而去尋找具有更高生物相容性、更佳針對性的藥物。而反義核酸所展現(xiàn)出的潛在的臨床前景讓研究者所矚目。1998年，Isis Pharmaceuticals公司的福米韋生(fomivirsen)被美國FDA第一個批準(zhǔn)上市，它由21個硫代脫氧核苷酸組成，可以有效抑制人類巨細(xì)胞病毒(CMV)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，用于治療艾滋病(AIDS)的并發(fā)癥的CMV視網(wǎng)膜炎。fomivirsen的特點(diǎn)是療效維持久，給藥次數(shù)少，不良反應(yīng)輕。從市場反饋來看，fomivirsen的藥效有其獨(dú)到之處，它的成功上市，不僅標(biāo)志著反義藥物在臨床上的正式應(yīng)用，而且?guī)恿舜笈戳x藥物進(jìn)入I期至III期的臨床研究。
時至現(xiàn)今，反義核酸已用于各種癌癥、病毒性疾病、心腦血管等疾病的研究和治療。尤其是在抗腫瘤的研究上，反義技術(shù)顯示出了強(qiáng)大的潛力。但是反義核酸的研究也存在許多丞正待決的問題。分子水平實(shí)驗(yàn)證明，反義寡核苷酸(AS-ODNs)主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生作用。因此，AS-ODNs要想發(fā)揮作用，必須穿過細(xì)胞膜進(jìn)入靶細(xì)胞的內(nèi)部，定位在細(xì)胞核。但由于AS-ODNs所帶電荷為負(fù)電荷，不易穿透細(xì)胞膜，無法發(fā)揮藥效。而且由于AS-ODNs在體內(nèi)易被降解，造成了藥效上的不穩(wěn)定。另外，AS-ODNs的靶向性不是非常強(qiáng)，需要大劑量連續(xù)給藥，治療起來很不方便。以上這些都限制了反義寡核苷酸在臨床中的應(yīng)用。因此，如何將AS-ODNs有效遞送進(jìn)入細(xì)胞是反義核酸研究領(lǐng)域面臨的一大難題。這在很大程度上取決于承載AS-ODNs進(jìn)入體內(nèi)的基質(zhì)的性質(zhì)。近年來，學(xué)者們也就這一方面進(jìn)行了許多研究。比如使用陽離子載體包裹AS-ODNs，使其容易進(jìn)入細(xì)胞膜；創(chuàng)造特異受體的配體導(dǎo)向、加大了AS-ODNs的靶向性；將AS-ODNs與其它藥物偶聯(lián)修飾，使其在體內(nèi)的穩(wěn)定性增強(qiáng)等。這些應(yīng)用都在一定程度上增強(qiáng)了AS-ODNs的作用效果，大幅度降低了AS-ODNs在人體內(nèi)的使用濃度。因此，AS-ODNs與其它載體或藥物的聯(lián)合使用成為AS-ODNs的新動向。
另一種對腫瘤細(xì)胞非常有效并且已經(jīng)臨床應(yīng)用的藥物是阿霉素(doxorubicin，DOX)。阿霉素是蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，對多種惡性腫瘤具有明顯療效，現(xiàn)在普遍運(yùn)用在臨床癌癥的化療治療中。阿霉素的鹽酸鹽易溶于水，水溶液呈弱酸性，最適pH值在5.5左右。DOX的作用原理是通過嵌入到DNA的雙螺旋鏈中，阻止雙鏈分離，影響DNA的復(fù)制及RNA的合成，從而起到抑制癌細(xì)胞生長的作用。但臨床上發(fā)現(xiàn)，阿霉素比較容易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性，其耐藥性產(chǎn)生的原因是由于癌細(xì)胞膜在經(jīng)由阿霉素給藥后發(fā)生變化，會抵制阿霉素進(jìn)入到細(xì)胞中，從而減少細(xì)胞對阿霉素的攝取，降低其毒性。另外，阿霉素對患者有著很強(qiáng)的心臟毒性，使心肌細(xì)胞受損，并且這種受損是不可逆的。這些都使阿霉素在臨床應(yīng)用中受到極大限制。
因此，賦予阿霉素靶向性是提高或維持其療效、降低其毒副作用的關(guān)鍵所在。近年來，國內(nèi)外學(xué)者就如何使阿霉素產(chǎn)生靶向性進(jìn)行了研究，殼聚糖由于本身的電荷特性，可以成功的將阿霉素載至腫瘤細(xì)胞表面，并且由于其高分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的生物黏附性，延長了停留時間，為阿霉素的吸收做了充足的準(zhǔn)備。
綜上，反義核酸藥物是近年來學(xué)者們研究的前沿生物藥物，而阿霉素是臨床上應(yīng)用較為成熟的傳統(tǒng)藥物，若能將此二者藥效結(jié)合并利用腫瘤表面葉酸受體的靶向作用成功導(dǎo)入人體，靶向癌細(xì)胞，將有重要的理論意義或?qū)嵱脙r值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖類載體及制備方法和應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，滿足有關(guān)領(lǐng)域發(fā)展的需要。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的臨床表明，反義藥物研制的難點(diǎn)在于體內(nèi)的穩(wěn)定性以及靶向性。本發(fā)明以解決此二者為目的，使用葉酸及其衍生物作為靶向劑，殼聚糖及其衍生物為載體，化療藥物阿霉素等協(xié)同反義核酸為作用藥物，增進(jìn)給藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性及靶向性。
本發(fā)明的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖類載體具有以下結(jié)構(gòu)A-BA代表殼聚糖或其衍生物，B代表可經(jīng)由葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的葉酸類物質(zhì)。
所說的代表殼聚糖或其衍生物的脫乙酰度為66～98％，分子量為10,000～2,000,000。
優(yōu)選的殼聚糖或其衍生物選自殼聚糖、羧甲基殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖。
所說的葉酸類物質(zhì)優(yōu)選自葉酸、二氫葉酸或四氫葉酸。
優(yōu)選的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖類載體結(jié)構(gòu)如下 (1)其中n＝40～20,000。
p-Aminobenzoate-Pterin代表對-氨基苯甲酸甲酯蝶呤。
本發(fā)明所說的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖類載體的制備方法，包括如下步驟(1)葉酸羰基的活化將葉酸在溶劑中，與亞胺類活化劑進(jìn)行活化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為5～40℃，反應(yīng)時間為0.5～3小時。
所說的亞胺類活化劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(以下簡稱EDC·HCl)、N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DDC)或N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)，優(yōu)選1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)。
所說的溶劑選自二甲基亞砜。
亞胺類活化劑的重量用量為葉酸的20～60％。
(2)葉酸與殼聚糖交聯(lián)
將殼聚糖或其衍生物在pH＝4.0～5.5，最佳為4.7的緩沖液中，5～40℃與步驟(1)的產(chǎn)物避光反應(yīng)10～20小時，用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)反應(yīng)后的混合液的pH值至8.0～10.0，最佳為9.0，然后獲得的混合物依次在磷酸緩沖液和水中進(jìn)行透析，冷凍真空干燥，得到殼聚糖-葉酸復(fù)合物。
所說的緩沖液選自醋酸-醋酸鈉體系。
所說的堿性物質(zhì)選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或醋酸鈉。
上述的葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖，可以作為載體，用于包埋基因藥物，包埋方法包括如下步驟(1)將所說的葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖溶于pH＝4.0～6.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，然后通過0.1～0.22μm的濾膜除去細(xì)菌。
(2)將基因藥物溶于水中，并加入水的重量的0.02～0.5％的硫酸鈉；將步驟(1)和步驟(2)所得溶液，分別在40～65℃，最佳55℃的溫度下預(yù)熱0.1～1小時，混合，攪拌，即得殼聚糖-葉酸-基因藥物納米液，包埋率可達(dá)到80％以上。
步驟(1)和步驟(2)的溶液的體積比為0.5～2。
所說的基因藥物包括反義核酸或寡核苷酸片斷或反義核酸。
上述的葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖，可以作為載體，用于包埋抗腫瘤藥物，包埋方法包括如下步驟將所說的葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖溶于pH＝3.0～5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，獲得溶液A，然后與濃度為0.03～0.1mg/ml的抗腫瘤藥物的水溶液B混合，攪拌，加入醛類物質(zhì)作為交聯(lián)劑，交聯(lián)1～3小時，然后加入NaAC，用來調(diào)節(jié)整個反應(yīng)體系的pH值至4.0～6.5，最佳為5.5，以增進(jìn)抗腫瘤藥物的包埋率，可得包埋了抗腫瘤藥物的納米懸液，包埋率可達(dá)到75％以上。
所說的抗腫瘤藥物選自鹽酸阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素或環(huán)孢菌素等。
所說的醛類物質(zhì)選自甲醛或戊二醛，基于濃度為0.03～0.1mg/ml的抗腫瘤藥物的水溶液的體積，醛類物質(zhì)的加入量為3～5mg/ml。
溶液A與溶液B的體積比為溶液A∶溶液B＝1∶0.02～0.08。
由上述公開的技術(shù)方案可見，本發(fā)明的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖，可作為載體，包埋反義核酸或抗腫瘤藥物，包埋率可達(dá)到75％以上。此由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖可制備成納米級顆粒，更易溶，生物利用度高，靶向性明顯；同時，成本較低，制備方法容易，便于工業(yè)化實(shí)施，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)前景。


圖1是實(shí)施例1的殼聚糖的紅外譜圖。
圖2是實(shí)施例1的殼聚糖-葉酸復(fù)合物的紅外譜圖。
圖3是實(shí)施例1中殼聚糖-葉酸-反義核酸納米液的粒度分析圖。
圖4是實(shí)施例2中殼聚糖-葉酸-阿霉素納米液的粒度分析圖。
圖5是實(shí)施例4的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式
下面通過一些非限制性實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明實(shí)施例1將0.2g分子量為200kDa、脫乙酰度為92％的殼聚糖溶入20ml pH＝4.7的HAC-NaAC緩沖液；將0.0044g葉酸溶解于3ml的無水DMSO(二甲基亞砜)加入0.0019gEDC·HCl，25℃下攪拌1小時，進(jìn)行葉酸羧基的活化；將上述的殼聚糖溶液與葉酸溶液混合，避光攪拌反應(yīng)15小時，用5mol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的混合液的pH值至9.0，將此混合物在pH＝7.4的磷酸緩沖液中透析3天，之后在去離子水中透析3天，冷凍真空干燥，得到殼聚糖-葉酸復(fù)合物。
所獲得的殼聚糖-葉酸復(fù)合物的結(jié)構(gòu)通式如式1，其中n＝1150；殼聚糖的紅外譜圖見圖1；殼聚糖-葉酸復(fù)合物紅外圖譜鑒定見圖2，在波數(shù)為1600處的-NH2峰在交聯(lián)后消失。
將0.0015g上述的殼聚糖-葉酸復(fù)合物溶于0.625ml pH＝5.5的HAC-NaAC緩沖溶液中，然后通過0.22μm的濾膜以除去細(xì)菌。
將330μg反義寡核苷酸片斷溶于無菌雙蒸水中，并加入0.0013g的硫酸鈉，將兩次操作所得溶液55℃下預(yù)熱30min，等體積混合，漩渦，室溫放置，即得殼聚糖-葉酸-反義核酸納米液。
包埋率的測定采用了紫外分光光度計(jì)測量法，將納米懸液離心。在260nm處測量上清液的吸光值，計(jì)算得反義核酸的包埋率為88％；采用激光粒度儀對其進(jìn)行粒度分析，結(jié)果見圖3，平均粒徑為273.1nm。
實(shí)施例2將0.2g分子量為200kDa、脫乙酰度為92％的殼聚糖溶入20ml pH＝4.7的HAC-NaAC緩沖液；將0.0044g葉酸溶解于3ml的無水DMSO，加入0.0019gEDC·HCl，25℃下攪拌1小時，進(jìn)行葉酸羧基的活化；將上述的殼聚糖溶液與葉酸溶液混合，避光攪拌反應(yīng)15小時，用5mol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的混合液的pH值至9.0，將此混合物在pH＝7.4的磷酸緩沖液中透析3天，之后在去離子水中透析3天，冷凍真空干燥，得到殼聚糖-葉酸復(fù)合物。
所獲得的殼聚糖-葉酸復(fù)合物的結(jié)構(gòu)通式如式1，其中n＝1150；殼聚糖-葉酸復(fù)合物鑒定同實(shí)施例1。
將0.0075g上述的殼聚糖-葉酸復(fù)合物溶于PH＝4.0醋酸溶液中，與濃度為0.06mg/ml的阿霉素的水溶液混合，攪拌，加入4.5mg/ml的甲醛，交聯(lián)2小時，加入NaAC，調(diào)節(jié)整個反應(yīng)體系的pH值至5.5，可得包埋了阿霉素的納米懸液。
包埋率的測定采用了紫外分光光度計(jì)測量法，將納米懸液離心。在480nm處測量上清液的吸光值，計(jì)算得阿霉素的包埋率可達(dá)到75％以上；采用激光粒度儀對其進(jìn)行粒度分析，結(jié)果見圖4，平均粒徑為304.7nm。
實(shí)施例3將0.2g分子量為200kDa、脫乙酰度為92％的殼聚糖溶入20ml pH＝5.5的HAC-NaAC緩沖液；將0.0044g葉酸溶解于3ml的無水DMSO，加入0.0019gEDC·HCl，25℃下攪拌1小時，進(jìn)行葉酸羧基的活化；將上述的殼聚糖溶液與葉酸溶液混合，避光攪拌反應(yīng)20小時，用5mol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)后的混合液的pH值至9.0，將此混合物在pH＝7.4的磷酸緩沖液中透析3天，之后在去離子水中透析3天，冷凍真空干燥，得到殼聚糖-葉酸復(fù)合物。
所獲得的殼聚糖-葉酸復(fù)合物的結(jié)構(gòu)通式如式1，其中n＝1150；殼聚糖-葉酸復(fù)合物鑒定同實(shí)施例1。
將0.0011g上述的殼聚糖-葉酸復(fù)合物溶于0.625ml pH＝5.5的HAC-NaAC緩沖溶液中，然后通過0.22μm的濾膜以除去細(xì)菌。
將330μg反義寡核苷酸片斷溶于無菌雙蒸水中，并加入0.0013g的硫酸鈉，將兩次操作所得溶液55℃下預(yù)熱30min，等體積混合，漩渦，室溫放置，即得殼聚糖-葉酸-反義核酸納米液。
包埋率的測定采用了紫外分光光度計(jì)測量法，將納米懸液離心。在260nm處測量上清液的吸光值，計(jì)算得反義核酸的包埋率為83％；激光粒度分析同實(shí)施例1。
實(shí)施例4對反義寡核苷酸片斷和殼聚糖-葉酸-反義核酸納米液進(jìn)行酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。
將反義寡核苷酸片斷，殼聚糖-葉酸-反義核酸納米液分別稀釋成0.25μg/μl，取出20μl，加入到PCR反應(yīng)管中，將DNase I用配制成0.3U/μl，取出1μl加入到上述反應(yīng)管中。將管內(nèi)的反應(yīng)體系混合均勻，置于37℃的恒溫水浴中。在15min，30min，1h，2h時取樣進(jìn)行2.5％的瓊脂糖凝膠電泳。
酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)電泳圖見圖5(泳道1殼聚糖-葉酸-反義核酸納米液++2μl DNase I作用15min；泳道2反義寡核苷酸片斷無DNase I作用15min(對照樣)；泳道3反義寡核苷酸片斷+1μl DNase I作用15min；泳道4殼聚糖-葉酸-反義核酸納米液+1μl DNase I作用15min；泳道5殼聚糖-葉酸-反義核酸納米液+1μl DNase I作用30min；泳道6殼聚糖-葉酸-反義核酸納米液+1μl DNase I作用1h；泳道7殼聚糖-葉酸-反義核酸納米液+1μl DNase I作用2h；泳道8殼聚糖-葉酸-反義核酸納米液無DNase I作用2h)。
由圖5可以看出未被包埋的反義寡核苷酸片斷被核酸酶降解，無明顯條帶，而殼聚糖-葉酸復(fù)合物則有效保護(hù)了反義寡核苷酸片斷，并將其阻滯在加樣孔中。
權(quán)利要求
1.一種由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖，其特征在于，具有以下結(jié)構(gòu)A-BA代表殼聚糖或其衍生物，B代表可經(jīng)由葉酸受體途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的葉酸類物質(zhì)，所說的B代表殼聚糖或其衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖，其特征在于，殼聚糖或其衍生物的脫乙酰度為66～98％，分子量為10,000～2,000,000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖，其特征在于，所說的殼聚糖或其衍生物選自殼聚糖、羧甲基殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖，其特征在于，所說的葉酸類物質(zhì)選自葉酸、二氫葉酸或四氫葉酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖，其特征在于，結(jié)構(gòu)如下 其中n＝40～20,000；p-Aminobenzoate-Pterin代表對-氨基苯甲酸甲酯蝶呤。
6.制備權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖類載體的方法，包括如下步驟(1)葉酸羰基的活化將葉酸在溶劑中，與亞胺類活化劑進(jìn)行活化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為5～40℃，反應(yīng)時間為0.5～3小時。(2)葉酸與殼聚糖交聯(lián)將殼聚糖或其衍生物在pH＝4.0～5.5的緩沖液中，5～40℃與步驟(1)的產(chǎn)物避光反應(yīng)10～20小時，用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)反應(yīng)后的混合液的pH值至8.0～10.0，然后獲得的混合物依次在磷酸緩沖液和水中進(jìn)行透析，冷凍真空干燥，得到殼聚糖-葉酸復(fù)合物；所說的緩沖液選自醋酸-醋酸鈉體系；所說的堿性物質(zhì)選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、醋酸鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所說的亞胺類活化劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，所說的溶劑選自二甲基亞砜；亞胺類活化劑的重量用量為葉酸的20～60％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖類載體的應(yīng)用，其特征在于，作為載體，用于包埋基因藥物，包埋方法包括如下步驟(1)將所說的葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖溶于pH＝4.0～6.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，然后通過0.1～0.22μm的濾膜除去細(xì)菌。(2)將基因藥物溶于水中，并加入水的重量的0.02～0.5％的硫酸鈉。將步驟(1)和步驟(2)所得溶液，分別在40～65℃，最佳55℃的溫度下預(yù)熱0.1～1小時，混合，攪拌，即得殼聚糖-葉酸-基因藥物納米液；步驟(1)和步驟(2)的溶液的體積比為0.5～2；所說的基因藥物包括反義核酸或寡核苷酸片斷或反義核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖類載體的應(yīng)用，其特征在于，作為載體，用于包埋抗腫瘤藥物，包埋方法包括如下步驟將所說的葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖溶于pH＝3.0～5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，獲得溶液A，然后與濃度為0.03～0.1mg/ml的抗腫瘤藥物的水溶液B混合，攪拌，加入醛類物質(zhì)作為交聯(lián)劑，交聯(lián)1～3小時，然后加入醋酸鈉，用來調(diào)節(jié)整個反應(yīng)體系的pH值至4.0～6.5，最佳為5.5，以增進(jìn)抗腫瘤藥物的包埋率，可得包埋了抗腫瘤藥物的納米懸液；所說的抗腫瘤藥物選自鹽酸阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素或環(huán)孢菌素等；所說的醛類物質(zhì)選自甲醛或戊二醛，基于濃度為0.03～0.1mg/ml的抗腫瘤藥物的水溶液的體積，醛類物質(zhì)的加入量為3～5mg/ml；溶液A與溶液B的體積比為溶液A∶溶液B＝1∶0.02～0.08。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖類載體及制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明使用葉酸及其衍生物作為靶向劑，殼聚糖及其衍生物為載體，化療藥物阿霉素等協(xié)同反義核酸為作用藥物，增進(jìn)給藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性及靶向性，因此該納米載體在抗腫瘤治療上有廣泛的應(yīng)用前景。所述的由葉酸受體介導(dǎo)的靶向性殼聚糖。
文檔編號A61K38/12GK101032623SQ20071003951
公開日2007年9月12日 申請日期2007年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月16日
發(fā)明者任宇紅, 張宇飛, 魏東芝, 王佳琪 申請人:華東理工大學(xué)