專利名稱：反義miRNA－210的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種RNA小分子的用途，尤其是涉及反義miRNA-210的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近幾年來，從植物、線蟲到人的細(xì)胞中廣泛存在一種非編碼的單鏈RNA小分子(microRNA，miRNA)，它們能以不完全互補(bǔ)的方式與其靶mRNA的3’非翻譯端特定區(qū)域相互作用，抑制蛋白質(zhì)的合成。1993年Lee等采用經(jīng)典克隆方法在線蟲中首次克隆了lin-4基因，通過點(diǎn)突變的方法證實(shí)小分子RNA的存在。2000年Reinhart等在人和果蠅中發(fā)現(xiàn)了let-7基因的存在，于是推測這類小分子可能是一類進(jìn)化上保守，在生命過程中起重要作用的調(diào)節(jié)分子。隨后人們在植物、線蟲、果蠅和哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)了一千多個miRNA基因。小RNA的研究給我們帶來重要的啟迪是基因組非組蛋白編碼區(qū)蘊(yùn)含著重要的生命功能活動信息?，F(xiàn)有研究表明生命的一些重要活動如幼蟲的生長發(fā)育、細(xì)胞的發(fā)生和分化、神經(jīng)系統(tǒng)的分化等都被一些非蛋白編碼小RNA的調(diào)控；而除miRNA、siRNA以外的小RNA我們更是知之甚少。長期以來，有關(guān)基因的研究重點(diǎn)都在蛋白編碼基因上，而小RNA的發(fā)現(xiàn)和研究對揭示基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，讓我們更為深入的了解生命之奧秘?zé)o疑具有重大的科學(xué)價(jià)值。
據(jù)統(tǒng)計(jì)，miRNA在人類基因組中約占1％的數(shù)量，在不同的時空發(fā)育階段表達(dá)量存在顯著差異。Bartel等(Ambros V，Bartel B，Bartel DP，Burge CB，Carrington JC，Chen X，Dreyfuss G，Eddy SR，Griffiths-Jones S，Marshall M，Matzke M，Ruvkun G，Tuschl T.)提出，由于miRNA與靶mRNA互補(bǔ)程度不同，起著切割或微弱抑制作用。由于其作用靶點(diǎn)的多寡，miRNA表達(dá)量亦不同，通過基因芯片技術(shù)，可以同時檢測所有miRNA時空表達(dá)的狀況。在此基礎(chǔ)上，尋找miRNA靶基因，揭示其作用機(jī)制是目前研究的重點(diǎn)，也是后基因組時代需要解決的問題之一。全部miRNA基因功能的揭示可能會給人們對生命現(xiàn)象的理解帶來一場深刻的革命。
近幾年有關(guān)miRNA在機(jī)體生長發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用研究已積累了大量的資料。研究表明，miRNA在細(xì)胞生長和調(diào)亡，血細(xì)胞分化，神經(jīng)元的極性，胰島素分泌，大腦形態(tài)形成，心臟發(fā)生，胚胎后期發(fā)育等過程中發(fā)揮重大作用。而miRNA突變或者異位表達(dá)又與多種人類癌癥相關(guān)，具有腫瘤抑制基因或者癌基因的作用。一個起腫瘤抑制基因作用的miRNA表達(dá)下降或者缺失會導(dǎo)致腫瘤形成。成熟miRNA水平下降導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)陌械鞍椎谋磉_(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖、侵入、凋亡的減少、不能正常分化或去分化，引起腫瘤的形成。具有癌基因功能的miRNA的過表達(dá)也將導(dǎo)致腫瘤的形成，如miRNA-21在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)增加表達(dá)量比正常組織高5-100倍，miRNA-155前體，miRNA-15，miRNA-16在惡性淋巴瘤中亦異常表達(dá)。
腦膠質(zhì)瘤源自神經(jīng)上皮，也稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤，占顱腦腫瘤的40-50％，是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤。膠質(zhì)瘤最主要的生物學(xué)特性是腦組織的終位性增殖和不斷增殖，根據(jù)病理又可分為星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、多形膠母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、少枝膠母細(xì)胞瘤等。目前，腦腫瘤的流行病學(xué)和病因?qū)W尚不完全清楚，但有證據(jù)表明膠質(zhì)瘤的形成可能與一定的內(nèi)環(huán)境改變和基因變異有關(guān)，是一個多因素、多步驟的多種癌基因和/或抑癌基因參與的協(xié)同積累過程。發(fā)病男性多于女性，大多在20-50歲發(fā)病，以30-40歲多見，10歲左右兒童為另一高發(fā)期。膠質(zhì)細(xì)胞瘤的生長特點(diǎn)為浸潤性生長，與正常腦組織無明顯界限，多數(shù)不限于一個腦葉，向腦組織外呈指狀深入破壞腦組織，偏良性者生長緩慢，病程較長，自出現(xiàn)癥狀至就診時間平均兩年，惡性者瘤體生長快，病程短，自出現(xiàn)癥狀到就診時多數(shù)在3個月之內(nèi)，70-80％多在半年之內(nèi)。Chan等(Chan JA，Krichevsky AM and Kosik KS.MicroRNA-21 Is anAntiapoptotic Factor in Human Glioblastoma Cells.Cancer Res 2005；656029-6033)的研究顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤強(qiáng)烈表達(dá)miRNA-21。與非腫瘤胚胎、成人腦組織以及培養(yǎng)的非腫瘤細(xì)胞相比，miRNA-21在人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織以及六個膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系(A172，U87，U373，LN229，LN428以及LN308)的表達(dá)顯著升高。研究表明miRNA-2 1在培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的抑制性表達(dá)導(dǎo)致了caspases的激活，進(jìn)而凋亡性細(xì)胞死亡增加。這些結(jié)果顯示，通過抑制關(guān)鍵的與凋亡相關(guān)的基因表達(dá)，異常表達(dá)的miRNA-21可能與導(dǎo)致惡性腫瘤表型有關(guān)。Ciafre(Ciafre SA，Galardi etal，Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma，BBRC，2005，1351-1358)等采用miRNA芯片(含245個人和鼠miRNA探針)對9例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和10種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株進(jìn)行分析表明miRNA-221在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中顯著上調(diào)，而一組腦中富有的miRNAs，如miRNA-128，miRNA-181a，miRNA-181b，miRNA-181c則在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)量顯著下調(diào)。
由于miRNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍認(rèn)為miRNA的功能是參與生命的一些基本過程，如發(fā)育過程中的細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、應(yīng)激反應(yīng)和脂肪代謝等。腫瘤是一種遺傳物質(zhì)改變導(dǎo)致的惡性疾病，它嚴(yán)重地威脅人類的健康。為了研究參與腫瘤的miRNA分子，首先就要確定miRNA究竟在那些腫瘤細(xì)胞或組織中表達(dá)及其表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步揭示異常表達(dá)的miRNA在腫瘤細(xì)胞中所起的生物學(xué)功能。但是到目前為止還沒有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)關(guān)于反義miRNA-210作為制備治療人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株侵襲的藥物的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過miRNA芯片技術(shù)提供反義miRNA-210的新用途。
本發(fā)明提供反義miRNA-210作為制備治療人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株侵襲的藥物的用途。
雖然miRNA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)研究已有報(bào)道，但本發(fā)明所采用的miRNA芯片整合了476個人和鼠的miRNA探針，遠(yuǎn)比2005年Ciafre等采用的254個miRNA芯片數(shù)量多。本發(fā)明采用同樣的方法對大量恒河猴腦組織及人神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行對照研究，有助于探尋年齡相關(guān)表達(dá)miRNA基因在腦腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的特點(diǎn)與規(guī)律，為蛋白組學(xué)研究提供更為深層次的研究資料。本發(fā)明采用miRNA芯片研究了三例腦膠質(zhì)瘤miRNA表達(dá)情況，并用Northern和q-PCR等方法對芯片結(jié)果對9例腦膠質(zhì)瘤樣品和四株腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。本發(fā)明還從Ambion公司購買有人正常腦RNA(成人腦總RNA混合樣品)作為對照。本發(fā)明研究結(jié)果表明，miRNA-210不僅在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，也在人神經(jīng)干細(xì)胞中高表達(dá)。為了驗(yàn)證芯片檢測結(jié)果，本發(fā)明采用Northern和q-PCR方法對上述結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。本發(fā)明在Northern分析的基礎(chǔ)上，采用q-PCR方法進(jìn)一步確證miRNA-210在人腦膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中呈高表達(dá)。其次探討了是否miRNA-210像miRNA-21一樣具有促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用，遺憾的是該項(xiàng)研究結(jié)果顯示，反義miRNA-210在這方面的作用不顯著。再次，本發(fā)明采用Invasion Assay kit(細(xì)胞侵襲檢測試劑盒)對U251和TJ905兩種細(xì)胞系進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義miRNA-210能顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的侵襲能力。轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的miRNA定量PCR和Northern驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明采用傳統(tǒng)的wound assay，進(jìn)一步驗(yàn)證了反義miRNA-210具有顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的作用。


圖1.miRNA芯片雜交2.miRNA芯片分析聚類結(jié)果。A顯示miRNA聚類總體情況。B顯示在腦膠質(zhì)瘤中顯著高表達(dá)的miRNA。C顯示在腦膠質(zhì)瘤中顯著下調(diào)的miRNA。
圖3.采用Northern和miRNA定量PCR方法檢測miR-210在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況。定量PCR發(fā)現(xiàn)miR-210的拷貝數(shù)在腦膠質(zhì)瘤中(glioma樣品1-3)較正常對照組(NHB1-3)顯著增高(A)。與癌旁組織的平均值比較，miR-210在腦膠質(zhì)瘤中的拷貝數(shù)增高2.00±0.10倍，表達(dá)顯著上調(diào)(B)。對更多的glioma樣品及癌旁組織進(jìn)行Northern分析結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)芯片結(jié)果的可靠性(C)。
圖4.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明反義miRNA-210能顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的侵襲能力。與正常對照組(U251NC和TJ905NC)及堿基錯配序列組(U251SC和TJ905SC)比較，反義miRNA-210能顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲作用(A)。定量PCR和Northern檢定細(xì)胞轉(zhuǎn)染合成的miRNA核苷酸結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
1.RNA抽提每100mg組織加入1ml Trizol，用液氮研磨充分研碎組織塊。加入約1/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。4℃，12,000rpm離心15分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清液入新的1.5ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4℃，12000rpm離心10分鐘后，去上清，向沉淀中加入2/5體積的70％乙醇，4℃，12000rpm離心洗滌沉淀5分鐘。去上清，將沉淀室溫晾干后加入適量無RNA酶的水充分溶解，測定OD260和OD280值。采用無RNA酶的DNA酶I處理，QIAGEN RNeasy試劑盒純化總RNA，詳細(xì)操作原理和方法見試劑盒說明書。瓊脂糖膠電泳評價(jià)總RNA質(zhì)量，在凝膠成像儀上觀測、拍照，保存圖像，一般認(rèn)為28S∶18S≥2可以初步判定總RNA質(zhì)量較好。
2.MicroRNA芯片的制備首先從miRNA信息登錄網(wǎng)站http://microrna.sanger.ac.uk(2005.09)上獲取制備miRNA探針的序列，其中包括313條人的及34條小鼠的miRNA序列對應(yīng)的探針序列。同時，我們也將XIE發(fā)表在2005年Nature上的文章(Xie X，Lu J，Kulbokas EJ，et al.Systematic discovery of regulatory motifs in humanpromoters and 3 UTRs by comparison of several mammals[J].Nature，2005，434(7031)338)中所提及的122條預(yù)測中的miRNA對應(yīng)的探針也整合到其中，最終在我們的miRNA芯片上集中了469種不同的miRNA對應(yīng)的探針。為了實(shí)現(xiàn)對芯片實(shí)驗(yàn)過程的質(zhì)量控制，本發(fā)明在芯片上設(shè)置了陰性及陽性對照。陰性對照我們設(shè)計(jì)了兩種，一種是空白點(diǎn)樣液體；另外一種就是沒有摻入Y2對應(yīng)的RNA，因此Y2就是一個最合適的陰性對照。陰性對照預(yù)期的雜交信號是很弱的，它們的信號值不足以進(jìn)入到后續(xù)的數(shù)據(jù)分析當(dāng)中。陽性對照分為三種(1)固定化陽性對照5’-GTCACATGCGATGGATCGAGCTCCTTTATCATC-3’。在芯片實(shí)驗(yàn)最后檢測雜交結(jié)果時，此序列應(yīng)該在cy3的激發(fā)波長下有較強(qiáng)的熒光信號，掃描信號值在8000以上，表明芯片上的核酸固定是沒有問題的。
(2)雜交的陽性對照我們選擇了組織內(nèi)源的，RNA堿基長度在100nt左右的U6和tRNA作為miRNA芯片的內(nèi)源陽性對照；U6對應(yīng)的探針序列是5’-ATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3’；tRNA對應(yīng)的探針序列是5’-GGGTTATGGGCCCAGCACGCTTCCGCTGCGCCACTCTGCT-3’；它們的雜交信號也應(yīng)該是比較高的，一般都超過5000信號值。
(3)芯片系統(tǒng)的陽性對照為了避免受到實(shí)驗(yàn)RNA樣品的干擾，在芯片上還點(diǎn)有與實(shí)驗(yàn)樣品沒有關(guān)系的核酸序列，以檢查芯片系統(tǒng)的有效性。本發(fā)明把這種對照稱為外標(biāo)(exogenous controls)。在miRNA芯片上，本發(fā)明設(shè)計(jì)了8條與所有的RNA序列不具同源性的寡核苷酸序列作為外標(biāo)，名字和序列見下表。經(jīng)過blast比較，這8個核酸序列和人的全部基因序列沒有同源性。本發(fā)明用Ambion公司的miRNA Probe Construction kit(Cat#.1550)合成了此8條探針對應(yīng)的長度類似miRNA的RNA序列(20-30nt)，然后在反應(yīng)的時候摻入到實(shí)際檢測的RNA樣品中去，一同進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)摻入RNA量的不同，這些外標(biāo)點(diǎn)可以呈現(xiàn)不同的雜交信號；除了Y2以外，一般信號值都在5000以上。芯片系統(tǒng)的陽性對照見表1。
表1.芯片系統(tǒng)的陽性對照

3.miRNA芯片檢測用于miRNA芯片檢測的RNA樣品制備先使用Trizol抽提方法得到總RNA，再使用Ambion公司的mirVana miRNA isolation kit(catalog#1560)試劑盒對樣品進(jìn)行純化，去除占總RNA主要成分的較大片段，留下包括miRNA在內(nèi)的小片段部分。具體純化步驟詳見試劑盒使用手冊。miRNA芯片檢測按常規(guī)方法進(jìn)行。
4.生物信息學(xué)分析由于microRNA也是通過基因芯片的手段進(jìn)行研究，所以將兩者并列說明。首先，采用的芯片是Affymetrix U133 Plus 2.0array，這種芯片是目前同類產(chǎn)品中覆蓋基因數(shù)目最多的一種在一張芯片上，覆蓋了47,000個轉(zhuǎn)錄本，代表38,500個明晰的人類基因，來自下列公共數(shù)據(jù)庫GenBank，dbEST，and RefSeq.其中的6,500個更新的基因來自最新的數(shù)據(jù)庫Build 159 of the UniGene database(2003年1月25日)。U133主要適用于研究基因的表達(dá)情況并了解基因發(fā)揮功能的網(wǎng)絡(luò)。包括1)基因表達(dá)的組織特異性和細(xì)胞特異性；2)誘導(dǎo)基因表達(dá)譜研究；3)基因表達(dá)分化和4)腫瘤表達(dá)譜研究。在基因芯片的結(jié)果中，采用T-Test的方法來檢驗(yàn)數(shù)據(jù)間的顯著性差異以求得其可信度，而用不同年齡階段的數(shù)據(jù)兩兩相比的方法來求得某些蛋白質(zhì)的表達(dá)是否具有年齡特異性，使用cluster3.0程序來進(jìn)行聚類分析。
5.Northern blotting分析使用Trizol抽提培養(yǎng)細(xì)胞或組織的總RNA，定量并質(zhì)檢。取30-50ug總RNA進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度為15％。電泳結(jié)束后進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，將樣品轉(zhuǎn)至帶正電荷的尼龍膜上。將所要檢測的miRNA對應(yīng)的探針用同位素進(jìn)行末端標(biāo)記，并在適宜條件下與膜進(jìn)行雜交。雜交完成后進(jìn)行壓片掃描。再以U6基因的探針與膜進(jìn)行雜交，得到U6的雜交信號，并以此作為上樣量的衡量標(biāo)準(zhǔn)。最后使用成像系統(tǒng)讀出雜交信號的強(qiáng)度，比較各組不同的樣品間的差異。
6.qPCR檢測方法miRNA的qPCR檢測使用invitrogen的Trizol抽提總RNA，定量并質(zhì)檢。取50-100ng總RNA為模板，使用針對特定miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物及invitrogen的SuperScriptIII First-Strand Synthesis System試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用針對目標(biāo)miRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R)Premix Ex TaqTM熒光定量PCR體系，在stratagen MX3000P定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并測得樣品的Ct值。將所得Ct值通過代入測定標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的公式，采用絕對定量的計(jì)算方法得出樣品中的目標(biāo)miRNA的含量。U6基因作為內(nèi)照對miRNA qPCR檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。對于預(yù)測中的目標(biāo)基因的qPCR檢測使用invitrogen的Trizol抽提總RNA，定量并質(zhì)檢。取3ug總RNA為模板，以隨機(jī)寡核苷酸為引物，使用invitrogen的SuperScriptIII First-Strand Synthesis System試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用針對目標(biāo)基因的特異引物及Takara的SYBR(R)Premix Ex TaqTM熒光定量PCR體系，在stratagen MX3000P定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并測得樣品的Ct值。同時測定待測樣品中的看家基因(如B-actin、GAPDH)的Ct值，以此來校正各組樣品之間上樣量差別，將所得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行比較各組之間目的基因的變化(即相對定量法)。
7.細(xì)胞培養(yǎng)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TJ905(由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科饋贈)培養(yǎng)在含10％FBS(蘭州民海)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251MG(購自上海中科院細(xì)胞庫)培養(yǎng)在含10％FBS(蘭州民海)的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)箱、5％CO2，2天傳代一次。人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SHG-44(購自上海中科院細(xì)胞庫)培養(yǎng)在含10％FBS(蘭州民海)的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)箱、5％CO2，2天傳代一次。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y(ATCC號購自上海中科院細(xì)胞庫)培養(yǎng)在含15％FBS(蘭州民海)的MEM-F12培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)箱、5％CO2，3-4天傳代一次。
8.細(xì)胞轉(zhuǎn)染甲氧基寡核苷酸由上海吉瑪公司化學(xué)合成，microRNA前體購自美國Ambion公司(Ambion Pre-mirTMmiRNA precursor CaU No.17100)，轉(zhuǎn)染共設(shè)正常對照組，miRNA前體組，miRNA反義鏈組(anti sense)，miRNA堿基錯配序列組(scramble)和miRNA通用陰性對照組(EGFP)。細(xì)胞于鋪板18-24h后至70％-80％融合開始轉(zhuǎn)染，所用試劑為Lipofectamine 2000(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染按本室常規(guī)方法并參照說明書進(jìn)行。寡核苷酸的工作濃度均為50nmol/L。DDR1 siRNA組和siRNA通用陰性對照組(Negative)。細(xì)胞于鋪板18-24h后至70％-80％融合開始轉(zhuǎn)染，所用試劑為Lipofectamine 2000(Invitrogen).具體轉(zhuǎn)染方法參照說明書進(jìn)行，寡核苷酸及siRNA的工作濃度均為50nmol/L。細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用的核苷酸序列見表2。
表2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用核苷酸序列表

9.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)取無菌12孔板，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞TJ905培養(yǎng)在含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251MG培養(yǎng)在含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)箱、5％CO2，2天傳代一次。轉(zhuǎn)染miRNA 24h后，用200ul吸頭劃出兩條十字交叉細(xì)胞刮除帶。轉(zhuǎn)染miRNA 48h后開始觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
10.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)所用試劑盒為QCMTMCollagen Cell Invasion Assay kit(Chemicon Cat.#ECM551)。轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)至80％匯合，轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓18-24小時。用0.25％胰酶消化細(xì)胞并用含5％BSA的DMEM終止反應(yīng)。細(xì)胞離心后重懸于含5％BSA的DMEM中(0.5×106 cells/mL)。將250ul細(xì)胞懸液加入Boyden小室的上室中，下室加入500ul含10％FBS的DMEM，37C培養(yǎng)箱5％CO2培養(yǎng)。48h后將小室浸入400ul細(xì)胞染液中染色20min并漂洗，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，之后將膜剪下于200倍顯微鏡下成像。將聚碳酸酯微孔濾膜浸入染料提取液中反應(yīng)10min，100ul細(xì)胞染液轉(zhuǎn)入酶標(biāo)板在560nm處讀取吸光值。
11.Caspase-3/7酶活性檢測將細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)48小時。采用Apo-ONETMHomogeneous Caspase-3/7kit(Promega Cat No.G7790)試劑盒，按說明書操作。將caspase底物和Apo-ONETMcaspase3/7 buffer混合，配成Apo-ONETM試劑。按Apo-ONETM試劑和培養(yǎng)基體積比為1∶1的比例加入Apo-ONETM試劑，300rpm-500rpm搖至少30秒，使Apo-ONETM試劑和培養(yǎng)基充分混勻。使用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長485±20nm和發(fā)射波長530±25nm條件下讀取OD值。Caspase3酶活性檢測也可利用化學(xué)發(fā)光法(Calbiochem，Cat No.235400)的活性。細(xì)胞計(jì)數(shù)，收集培養(yǎng)細(xì)胞，PBS洗兩遍。加適量裂解緩沖液，液氮/37℃反復(fù)凍融三次，每次5分鐘。10,000xg，4℃離心10分鐘。吸取上清備用。準(zhǔn)備caspase3底物溶液(2mM，Calbiochem，Cat No.235400))，caspase3抑制劑溶液(500nM)，按照如下表格的量向96孔板中加入樣品，按說明書操作。、37℃預(yù)熱酶標(biāo)板，加入細(xì)胞裂解液和caspase3抑制劑，置于37℃孵育10分鐘。加入10ul caspase3底物開始反應(yīng)，0.5-2小時后在405nm下測OD值。
12.蛋白質(zhì)印跡分析在樣品中加入裂解液，置于液氮中反復(fù)凍融數(shù)次后，再超聲徹底破碎樣品，離心分離出蛋白質(zhì)，對取得的蛋白樣品進(jìn)行定量。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，煮沸3-5分鐘后，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒流20mA。待前沿指示劑恰好跑出凝膠后，停止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將樣品轉(zhuǎn)至膜上后，再與所要研究的蛋白的單抗共同孵育，最終進(jìn)行顯色，得到印跡信號。同時以beta-actin為參照，對信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，之后在成像系統(tǒng)中讀出信號密度，進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)miRNA-210的過度表達(dá)顯著。在芯片分析的基礎(chǔ)上，采用Northern，q-PCR方法進(jìn)一步確證miRNA-210在人腦膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中呈高表達(dá)。本發(fā)明采用Invasion Assay kit(細(xì)胞侵襲檢測試劑盒)對U251和TJ905兩種細(xì)胞系進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義miRNA-210能顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的侵襲能力。采用woundassay，進(jìn)一步驗(yàn)證了反義miRNA-210具有顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的作用。侵襲性和轉(zhuǎn)移性是癌細(xì)胞最主要的生物學(xué)特性，也是惡性腫瘤的重要標(biāo)志。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明miRNA-210可作為一種癌基因促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲作用。
權(quán)利要求
1.反義miRNA-210作為制備治療人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株侵襲的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種RNA小分子的用途，尤其是涉及反義miRNA－210的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用miRNA芯片研究了三例腦膠質(zhì)瘤miRNA表達(dá)情況，并用Northern和q－PCR等方法對芯片結(jié)果對9例腦膠質(zhì)瘤樣品和四株腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義miRNA－210能顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的侵襲能力。
文檔編號A61P35/00GK101091798SQ20071003954
公開日2007年12月26日 申請日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者賴立輝, 陳小娜, 戚艷婷, 李丹, 張智, 趙喻, 陳琳, 呂艷 申請人:華東師范大學(xué), 博奧生物有限公司