專利名稱：一種含有雷帕霉素的用于治療大腸癌的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及組合物，特別是一種含有雷帕霉素的用于治療大腸癌的藥物組合物。

背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，用于治療大腸癌的藥物組合物的作用均不理想。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含有雷帕霉素的用于治療大腸癌的藥物組合物，所述的這種含有雷帕霉素的用于治療大腸癌的藥物組合物要解決現(xiàn)有技術(shù)中用于治療大腸癌的藥物組合物的作用不理想的技術(shù)問題。
本發(fā)明一種含有雷帕霉素的用于治療大腸癌的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物由2-氨基-4-異氧黃酮和雷帕霉素組成。
進一步的，所述的2-氨基-4-異氧黃酮和所述的雷帕霉素的質(zhì)量比在292.4∶1到1462∶1范圍內(nèi)。
進一步的，在所述的藥物組合物中，還含有藥學(xué)上可接受的載體。
進一步的，所述的藥物組合物的劑型為藥學(xué)上可接受的任何一種劑型。
本發(fā)明的作用原理2-氨基-4-異氧黃酮(2′-amino-3′-methoxyflavone，2-氨基-4-異氧黃酮，分子式C16H13NO3，相對分子質(zhì)量267.3，代號PD98059)是MEK(mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinasekinase)的選擇性抑制劑，作用在MEK1/2絲氨酸217/221位殘基上，可抑制其磷酸化，進而抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號傳導(dǎo)通路的激活，從而抑制細胞增值，調(diào)控細胞分化和凋亡。
雷帕霉素(rapamycin，RPM，商品名Sirolimus)是美國HOME PRODUCTS公司研制開發(fā)的抗移植排異反應(yīng)的藥物，1999年9月經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市。RPM是從吸水性鏈霉菌(streptomyces hygroscopicus)發(fā)酵液中提取出來的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(分子式C51H79NO13，相對分子質(zhì)量914.2)，具有親脂性，易溶于乙醇、氯仿、丙酮等有機溶劑，微溶于水，不溶于乙醚。最初RAPA被研究作為低毒性的抗真菌藥物，1977年發(fā)現(xiàn)雷帕霉素具有免疫抑制作用，1989年開始把雷帕霉素作為治療器官移植排斥反應(yīng)的新藥進行試用，近年來又發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤作用。從目前動物實驗及臨床應(yīng)用的效果看，雷帕霉素是一種療效好、低毒、無腎毒性的新型免疫抑制劑，能抑制多種細胞的增生，臨床用于治療器官移植后免疫排斥反應(yīng)，以及心血管支架術(shù)后的血管再狹窄。RPM在哺乳動物細胞內(nèi)的靶點是mTOR(mammaliantarget of rapamycin，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)，兩者的結(jié)合可阻斷mTOR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路。
本發(fā)明將2-氨基-4-異氧黃酮和雷帕霉素組合，可下調(diào)大腸癌細胞mTOR及其下游p70s6K、4E-BP1蛋白磷酸化水平，從而抑制了大腸癌細胞增殖活力，同時阻滯了大腸癌細胞生長周期，進而起到抑制人大腸癌細胞生長，減低小鼠大腸癌的發(fā)生率和減小腫瘤體積的作用。
本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明將2-氨基-4-異氧黃酮和雷帕霉素組合，與單獨使用2-氨基-4-異氧黃酮或雷帕霉素來治療大腸癌相比，能夠明顯抑制人大腸癌細胞生長，能夠顯著的減低小鼠大腸癌的發(fā)生率和減小腫瘤體積。



圖1是本發(fā)明的實施例中的SW480細胞周期檢測圖譜。
圖2是本發(fā)明的實施例中的另一個SW480細胞周期檢測圖譜。
圖3是本發(fā)明的實施例中的另一個SW480細胞周期檢測圖譜。
圖4是本發(fā)明的實施例中的另一個SW480細胞周期檢測圖譜。
圖5是本發(fā)明的實施例中的HCT116細胞周期檢測圖譜。
圖6是本發(fā)明的實施例中的另一個HCT116細胞周期檢測圖譜。
圖7是本發(fā)明的實施例中的另一個HCT116細胞周期檢測圖譜。
圖8是本發(fā)明的實施例中的另一個HCT116細胞周期檢測圖譜。
圖9是本發(fā)明的實施例中的HT29細胞周期檢測圖譜。
圖10是本發(fā)明的實施例中的另一個HT29細胞周期檢測圖譜。
圖11是本發(fā)明的實施例中的另一個HT29細胞周期檢測圖譜。
圖12是本發(fā)明的實施例中的另一個HT29細胞周期檢測圖譜。
圖13表示SW480細胞的一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖14表示SW480細胞的另一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖15表示SW480細胞的另一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖16表示SW480細胞的另一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖17顯示了HCT116細胞的一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖18顯示了HCT116細胞的另一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖19顯示了HCT116細胞的另一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖20顯示了HCT116細胞的另一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖21顯示了HT29細胞的一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖22顯示了HT29細胞的另一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖23顯示了HT29細胞的另一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖24顯示了HT29細胞的另一個Western Blot檢測結(jié)果。
圖25是DMSO作用組中小鼠大腸癌的大體在體示意圖。
圖26是DMSO作用組中小鼠大腸癌的大體離體示意圖。
圖27是DMSO作用組中腺癌及部分粘液腺癌病理圖(10×20)。
圖28是DMSO作用組中腺癌及部分粘液腺癌病理圖(10×40)。
圖29是PD98059作用組中小鼠大腸癌的大體離體示意圖。
圖30是PD98059作用組中小鼠大腸癌的另一個大體離體示意圖。
圖31是PD98059作用組中高-中分化腺癌(10×20)病理圖。
圖32是PD98059作用組中中分化腺癌病理(10×20)病理圖。
圖33是Rapamycin作用組中小鼠大腸癌的大體離體示意圖。
圖34是Rapamycin作用組中小鼠大腸癌的另一個大體離體示意圖。
圖35是Rapamycin作用組中的中分化腺癌(10×20)病理圖。
圖36是Rapamycin作用組中的中分化腺癌(10×20)病理圖。
圖37是5-aza-dC+RPM作用組中小鼠大腸癌的大體離體示意圖。
圖38是5-aza-dC+RPM作用組中小鼠大腸癌的另一個大體離體示意圖。
圖39是5-aza-dC+RPM作用組中LIN(10×20)病理圖。
圖40是5-aza-dC+RPM作用組中LIN(10×20)病理圖。

具體實施例方式 實施例1細胞培養(yǎng) SW480細胞(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，SIBC)的培養(yǎng)基為RPMI-1640完全培養(yǎng)液(10％胎牛血清，100U/ml青/鏈霉素)，HT29和HCT116細胞(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，SIBC)的培養(yǎng)基為McCOY’S 5A MEDIUM(Sigma，USA)完全培養(yǎng)液(10％胎牛血清，100U/ml青/鏈霉素)，三者的培養(yǎng)條件均為95％空氣、5％CO2、95％濕度、37℃恒溫。
實施例2MTT比色實驗 完全培養(yǎng)液稀釋單細胞懸液至3×104/ml，以100μl/孔接種至96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24h后，在細胞處于對數(shù)生長期時，棄原培養(yǎng)液，加入各組干預(yù)藥物工作液，分別設(shè)以下藥物干預(yù)組 RPM 10nmol/L PD98059 10μmol/L PD98059 10μmol/L+RPM 10nmol/L(PD98059與RPM的質(zhì)量比為292.4∶1) PD98059 20μmol/L PD98059 20μmol/L+RPM 10nmol/L(PD98059與RPM的質(zhì)量比為584.8∶1) PD98059 40μmo l/L PD98059 40μmol/L+RPM 10nmol/L(PD98059與RPM的質(zhì)量比為1169.6∶1) PD98059 50μmo l/L PD98059 50μmol/L+RPM 10nmol/L(PD98059與RPM的質(zhì)量比為1462∶1)對照組加入完全培養(yǎng)液，以及0.5％PBS、0.5％二甲基亞砜(DMSO)。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，37℃溫育4h后棄上清，加入100μl/孔DMSO，避光室溫搖床振蕩20min。酶標(biāo)儀雙波長(570nm、630nm)測定各孔吸光度(A)值并記錄結(jié)果。每組復(fù)測5孔，重復(fù)試驗三次后取平均值(x)。結(jié)果見表1。
表1不同濃度PD98059單獨以及與RPM聯(lián)合作用對三種細胞活力的影響(x％)

RPM 10nmol/L+PD98059vs.RPM 10nmol/L◆p＜0.05，*p＜0.01 RPM 10nmol/L+PD98059vs.PD98059

p＜0.05，▲p＜0.01 由上表可知，PD98059和RPM聯(lián)合作用比單獨使用PD98059和RPM能夠明顯降低上述三種大腸癌細胞的活力。
實施例3 細胞周期檢測 對數(shù)生長期細胞以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使之同步化。更換培養(yǎng)液為含有不同藥物(RPM 10nmol/L、PD9805950μmol/L、RPM 10nmol/L+PD9805950μmol/L，在PD98059與雷帕霉素聯(lián)合作用組中，PD98059與雷帕霉素的質(zhì)量比為1462∶1)的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。以0.25％胰蛋白酶消化收集細胞，PBS洗滌，4℃無水乙醇固定后，制成約106個/ml的單細胞懸液，與含1％RNA酶的Tris-HCL緩沖液(pH7.4)共同孵育10min，以碘化丙啶(PI)染色后，進行流式細胞儀檢測。根據(jù)相對不同DNA含量的細胞分布圖，擬合各周期細胞的百分率。每組復(fù)測8個樣品，重復(fù)試驗三次，結(jié)果以x±SD表示。結(jié)果見表2，圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11和圖12。
表2細胞周期檢測結(jié)果(x±SD)
*p＜0.01，**p＜0.001 由表2可知PD98059與RPM聯(lián)合作用對SW480、HCT116、HT29三種細胞的生長周期均有顯著作用，可將SW480和HT29細胞阻滯于G1期(P＜0.001)，將HCT116細胞阻滯于S期及G1期(P＜0.01)。
實施例4 免疫印跡 RPM 10nmol/L、PD9805950μmol/L、RPM 10nmol/L+PD9805950μmol/L作用48h后以RIPA裂解法抽提細胞總蛋白，在PD98059與雷帕霉素聯(lián)合作用組中，PD98059與雷帕霉素的質(zhì)量比為1462∶1。mTOR、p70s6K使用7％SDS-PAGE電泳；4E-BP1使用SDS-PAGE為12％。所用抗體如下兔抗人GAPDH抗體(1∶1000，Sigma)，兔抗人mTOR抗體(1∶1000，#2972，Cell Signaling，USA)，兔抗人磷酸化mTOR抗體(Ser2448，1∶1000，#2971，Cell Signaling，USA)，兔抗人p70s6K抗體(1∶500，#9202，Cell Signaling，USA)，兔抗人磷酸化p70s6K抗體(Thr421/Ser424，1∶1000，#9204S，Cell Signaling，USA)，兔抗人4E-BP1抗體(1∶500，#9452，Cell Signaling，USA)，兔抗人磷酸化4E-BP1抗體(Thr70，1∶500，#9455S，Cell Signaling，USA)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶2000，#7404，Cell Signaling，USA)。每組實驗重復(fù)三次。蛋白條帶以Smart View生物電泳圖像分析軟件進行密度掃描，以磷酸化蛋白(Pho-4E-BP1、Pho-p70s6K、Pho-mTOR)與相應(yīng)總蛋白(Pan-4E-BP1、Pan-p70s6K、Pan-mTOR)條帶密度的比值進行磷酸化蛋白相對定量，結(jié)果以x±SD表示。結(jié)果見圖13到圖24。
由圖13到圖24可知，PD98059和RPM聯(lián)合作用比單獨使用PD98059和RPM能夠明顯下調(diào)大腸癌細胞mTOR及其下游p70s6K、4E-BP1蛋白磷酸化水平。
實施例5動物試驗 從中科院松江實驗動物基地購買S-ICR小鼠150只(SCXK(滬)2003-0003)，清潔級，雌性，近交系，體重18～20g。飼養(yǎng)一周后開始大腸癌造模試驗，給予0.4％二甲肼(DMH)0.05ml/10g，每周1次，頸后皮下注射，共22周。于第16周起給予各組干預(yù)藥物。每組動物25只。給藥方式 1)PD98059作用組PD980590.5mg/ml，0.1ml/只，每周2次，腹腔注射； 2)RPM作用組RPM 0.5μg/ml，0.1ml/只，每周3次(周一、周三、周五)，腹腔注射； 3)PD980590.5mg/ml+RPM 0.5μg/ml聯(lián)合作用組周一、周五給予PD980590.5mg/ml、RPM 0.5μg/ml共同溶解于DMSO中，0.1ml/只，腹腔注射；周三給予RPM 0.5μg/ml，0.1ml/只，腹腔注射；PD98059與雷帕霉素的質(zhì)量比為666.7∶1； 4)DMSO組DMSO 0.1ml/只，每周3次(周一、周三、周五)，腹腔注射。
其中DMH以生理鹽水溶解，PD98059、RPM以DMSO溶解，每次腹腔注射DMSO總量不超過0.1ml。至24周分批處死實驗動物，解剖后觀察大腸病變，按照公式[V＝長*寬*高/2]計算腫瘤體積。自病變明顯處取材，中性甲醛固定后制作石蠟切片，HE染色后觀察。結(jié)果見表3，圖25到圖40。
表3.24W各組小鼠大腸粘膜病理組織學(xué)變化
注 1.數(shù)據(jù)以病例數(shù)(病灶數(shù))表示。
2.WHO工作小組將上皮內(nèi)瘤變(Intraepithelial neoplasia，IN)分為兩級，即低級別(low grade)和高級別(high grade)。低級別上皮內(nèi)瘤變(LIN)指結(jié)構(gòu)和細胞學(xué)異常限于上皮的下半部，相當(dāng)于輕度和中度異型增生；高級別上皮內(nèi)瘤變(HIN)則指結(jié)構(gòu)和細胞學(xué)異常擴展到上皮的上半部，乃至全層，相當(dāng)于重度異型增生和原位癌。
3.高、中、低分化浸潤癌與腫瘤分級的1、2、3級相對應(yīng)。
4.組間比較采用卡方檢驗，△與DMSO組比較P＜0.05，▲與DMSO組比較P＜0.01，

與RPM組比較P＜0.05，◆與PD98059組比較P＜0.05。
由以上可知，本發(fā)明的由RPM和PD98059組成的藥物組合物能夠抑制人大腸癌細胞生長，RPM 10nmol/L+PD98059 50μmol/L的效果優(yōu)于RPM10nmol/L和PD9805950μmol/L單獨用藥。
本發(fā)明能夠減低小鼠大腸癌的發(fā)生率，減小腫瘤體積。
權(quán)利要求
1.一種含有雷帕霉素的用于治療大腸癌的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物由2-氨基-4-異氧黃酮和雷帕霉素組成。
2.如權(quán)利要求1所述的含有雷帕霉素的用于治療大腸癌的藥物組合物，其特征在于所述的2-氨基-4-異氧黃酮和雷帕霉素的質(zhì)量比在292.4∶1到1462∶1的范圍內(nèi)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的含有雷帕霉素的用于治療大腸癌的藥物組合物，其特征在于在所述的藥物組合物中，含有藥學(xué)上接受的載體。
4.如權(quán)利要求1或2所述的含有雷帕霉素的用于治療大腸癌的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物的劑型為藥學(xué)接受劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有雷帕霉素的用于治療大腸癌的藥物組合物，所述的藥物組合物由PD98059(2-氨基-4-異氧黃酮)和雷帕霉素組成，所述的PD98059和所述的雷帕霉素的重量比為292.4∶1～1462∶1。本發(fā)明能夠下調(diào)大腸癌細胞mTOR及其下游p70s6K、4E-BP1蛋白磷酸化水平，從而抑制了大腸癌細胞增殖活力，同時阻滯了大腸癌細胞生長周期，進而起到抑制人大腸癌細胞生長，減低小鼠大腸癌的發(fā)生率和減小腫瘤體積的作用。
文檔編號A61K31/352GK101292980SQ20071004017
公開日2008年10月29日 申請日期2007年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月28日
發(fā)明者房靜遠, 張燕捷 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院