專利名稱：細(xì)薄星芒海綿中的一種三萜類抗腫瘤化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為從海洋動(dòng)物細(xì)薄星芒海綿中分離到新的抗腫瘤化合物Stellettin L和Stellettin M及其制備方法。

背景技術(shù)：
細(xì)薄星芒海綿(Stelletta tenuis Lindgren)屬尋常海綿綱(Demospongiae)星骨海綿目(Astrophorida)星芒海綿科(Stellettidae)星芒海綿屬(Stelletta)動(dòng)物。該種海綿在中國(guó)南海海域分布廣泛，數(shù)量眾多，易于采集，且一般生長(zhǎng)在裸露的巖石上(黃宗國(guó)編著，中國(guó)海洋藥物種類與分布[M].北京海洋出版社，1994)。已從該種海綿動(dòng)物中分離得到三萜類化合物stellettin A、B、C、D、E、H，geoditinA、B，isogeoditin A、B，22，23-dihydrostellettin B及rhabdastrellic acid(Su JY，MengYH，Zeng LM，et al.Stellettin A，a new triterpenoid pigment from the marine spongeStelletta tenuis[J].JNat Prod，1994，57(10)1450；張紅軍等，中國(guó)南海細(xì)薄星芒海綿抗腫瘤活性成分研究(I)[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2004，4(2)104；王增蕾等，南海細(xì)薄星芒海綿抗腫瘤活性成分研究(II)[J].中國(guó)海洋藥物，2006，25(4)11)，但未見(jiàn)有關(guān)從該種海綿動(dòng)物中提取分離到三萜類成分Stellettin L和Stellettin M及其抗腫瘤活性的報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供從生長(zhǎng)于我國(guó)南海海域的細(xì)薄星芒海綿中提取分離到的新三萜類化合物C30H42O4，分反式和順式兩種結(jié)構(gòu)存在，分別命名為Stellettin L和Stellettin M，化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下 其中R基團(tuán)表示

當(dāng)R為

反式結(jié)構(gòu)時(shí)，該化合物為Stellettin L，當(dāng)R為
順式結(jié)構(gòu)時(shí)，該化合物為Stellettin M。
Stellettin L為黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)237-239℃，分子式C30H42O4；在電噴霧離子質(zhì)譜(ESI-MS)中出現(xiàn)466[M-H]+和931[2M-H]+準(zhǔn)分子離子峰；紅外光譜3357(OH)，2946(CH3，CH2)，1709(C＝O)，1698(C＝O)；1H和13C核磁共振數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。
Stellettin M為黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)232-234℃，分子式C30H42O4；在電噴霧離子質(zhì)譜(ESI-MS)中出現(xiàn)466[M-H]+和931[2M-H]+準(zhǔn)分子離子峰；紅外光譜3382(OH)，2934(CH3，CH2)，1709(C＝O)，1691(C＝O)；1H和13C核磁共振數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。
表1.Stellettin L和Stellettin M的1H和13C核磁共振數(shù)據(jù) J值偶合常數(shù) 本發(fā)明還提供了從細(xì)薄星芒海綿中提取分離Stellettin L和Stellettin M的方法，其步驟如下 (1)制備總?cè)铺崛∥飳⑿迈r的細(xì)薄星芒海綿洗凈，剪碎，用重量比為5～10倍的50％～95％乙醇滲漉提取，減壓回收乙醇，加入二氯甲烷萃取，減壓回收二氯甲烷，得總浸膏，將總浸膏溶于80％～95％的甲醇，用石油醚萃取，棄去石油醚層，調(diào)整甲醇濃度至65％～75％，用四氯化碳萃取，回收四氯化碳，將所得藥膏濃縮至干，過(guò)Sephandex LH20凝膠柱，用體積比為0～1∶1～0的二氯甲烷/甲醇或體積比為10～4∶10～5∶1的正己烷/二氯甲烷/甲醇洗脫，柱上顯示深棕色和淺黃色兩段顏色部分，收集淺黃色部分，回收溶劑濃縮至干，過(guò)200～400目正相硅膠柱，以體積比為1∶0～0∶1石油醚/乙酸乙酯或體積比為1∶0～0∶1的石油醚/丙酮梯度洗脫，收集淺黃色部分，回收溶劑濃縮至干，得細(xì)薄星芒海綿總?cè)铺崛∥铮? (2)分離純化上述總?cè)铺崛∥镞M(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚乙酸乙酯的體積比為20∶1～1∶1的混合溶劑洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)，收集含Stellettin L和Stellettin M的流份，再經(jīng)正相高效液相色譜分離，以正己烷異丙醇的體積比為60～80∶40～20的混合溶劑進(jìn)行洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)，分別收集含StellettinL和Stellettin M的流份，濃縮至干，得Stellettin L和Stellettin M。
本發(fā)明對(duì)Stellettin L和Stellettin M進(jìn)行了體外抗腫瘤試驗(yàn)，表明其具有明顯的抑制腫瘤的效果。試驗(yàn)所用的腫瘤細(xì)胞株為上海天甲生物有限公司提供的A549(人肺癌細(xì)胞)，SMMC-7721(人肝癌細(xì)胞)，AGS(人胃癌細(xì)胞)和HT-29(人結(jié)腸癌細(xì)胞)。
試驗(yàn)方法選用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，臺(tái)盼蘭排染法(詳見(jiàn)Monks，A.；Scudiero，D.；Skehan，P.et al.J.Natl.Cancer. Inst.1991，83，757-66)。試驗(yàn)分4組空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組為5-氟尿嘧啶組，以及本發(fā)明化合物Stellettin L和Stellettin M組。將本發(fā)明化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥物分別用DMSO溶解，配成100，30，10，3，1(毫克/毫升)5種濃度。細(xì)胞先按常規(guī)以10％的小牛血清培養(yǎng)，傳代時(shí)貼壁細(xì)胞以0.2％的胰酶消化液消化，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。試驗(yàn)時(shí)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種180微升，濃度為5×104個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液。于37℃的CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜。預(yù)培養(yǎng)后，每孔加20微升藥物溶液，空白對(duì)照組溶液加20微升DMSO，每種濃度重復(fù)5孔。藥物作用細(xì)胞3天后進(jìn)行MTT法測(cè)定，于96孔培養(yǎng)板每孔加入濃度為5毫克/毫升的MTT工作液10微升，37℃孵育4小時(shí)，棄上清液，加100微升DMSO，在570納米波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。臺(tái)盼蘭排染法，加入臺(tái)盼蘭工作液，計(jì)數(shù)活細(xì)胞。按下列公式計(jì)算被測(cè)物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率
半數(shù)有效抑制濃度IC50值采用Logit法計(jì)算，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2.Stellettin L和Stellettin M對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度(摩爾/升) 上述試驗(yàn)結(jié)果表明，Stellettin L和Stellettin M對(duì)四種不同的腫瘤細(xì)胞株均顯示明顯的抑制作用。
本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，為開(kāi)發(fā)利用中國(guó)的海洋藥用生物資源具有重要意義。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但不局限于實(shí)施例。
實(shí)施例1從細(xì)薄星芒海綿動(dòng)物中制備Stellettin L和Stellettin M 選擇生長(zhǎng)于中國(guó)南海海域的細(xì)薄星芒海綿4200克，洗凈，剪碎，用6倍重量的75％的乙醇滲漉，減壓回收乙醇，加入二氯甲烷萃取三次，每次1000毫升，減壓回收二氯甲烷，得總浸膏，將總浸膏溶于1000毫升85％的甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，棄去石油醚層，調(diào)整甲醇濃度至65％，用四氯化碳萃取三次，每次1000毫升，回收四氯化碳，將所得藥膏濃縮至干，加入體積比1∶1的二氯甲烷/甲醇5毫升溶解，過(guò)Sephandex LH20凝膠柱，用流動(dòng)相體積比為1∶1的二氯甲烷/甲醇洗脫，收集淺黃色部分，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑濃縮至干，加入體積比為15∶1的石油醚/乙酸乙酯5毫升溶解，過(guò)200-300目正相硅膠柱，以體積比為15∶1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，棄去洗脫液，再以體積比為2∶1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，收集淺黃色部分，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑濃縮至干，得到總?cè)铺崛∥?8克。將總?cè)铺崛∥镞^(guò)300-400目正相硅膠柱進(jìn)行層析，以石油醚乙酸乙酯的體積比為10∶1～5∶1的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)，收集含Stellettin L和Stellettin M的流份，再經(jīng)正相高效液相色譜分離，以正己烷異丙醇的體積比為80∶20的混合溶劑進(jìn)行洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)，分別收集含Stellettin L和Stellettin M的流份，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得Stellettin L 3.6毫克和Stellettin M 2.7毫克。
實(shí)施例2從細(xì)薄星芒海綿動(dòng)物中制備Stellettin L和Stellettin M 選擇生長(zhǎng)于中國(guó)南海海域的細(xì)薄星芒海綿4200克，洗凈，剪碎，用7倍重量的80％的乙醇滲漉，減壓回收乙醇，加入二氯甲烷萃取三次，每次1000毫升，減壓回收二氯甲烷，得總浸膏，將總浸膏溶于1000毫升90％的甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，棄去石油醚層，調(diào)整甲醇濃度至70％，用四氯化碳萃取三次，每次1000毫升，回收四氯化碳，將所得藥膏濃縮至干，加入體積比10∶10∶1的正己烷/二氯甲烷/甲醇的混合物溶劑5毫升溶解，過(guò)Sephandex LH20凝膠柱，用流動(dòng)相體積比10∶10∶1的正己烷/二氯甲烷/甲醇的混合物溶劑洗脫，收集淺黃色部分，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑濃縮至干，加入體積比為10∶1的石油醚/乙酸乙酯5毫升溶解，過(guò)200-300目正相硅膠柱，以體積比為10∶1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，棄去洗脫液，再以體積比為3∶1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，收集淺黃色部分，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑濃縮至干，得到總?cè)铺崛∥?3克。將總?cè)铺崛∥镞^(guò)300-400目正相硅膠柱進(jìn)行層析，以石油醚乙酸乙酯的體積比為15∶1～2∶1的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)，收集含Stellettin L和Stellettin M的流份，再經(jīng)正相高效液相色譜分離，以正己烷異丙醇的體積比為78∶22的混合溶劑進(jìn)行洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)，分別收集含Stellettin L和Stellettin M的流份，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得Stellettin L 3.1毫克和Stellettin M 2.3毫克。
實(shí)施例3 從細(xì)薄星芒海綿動(dòng)物中制備Stellettin L和Stellettin M 選擇生長(zhǎng)于中國(guó)南海海域的細(xì)薄星芒海綿4200克，洗凈，剪碎，用8倍重量的70％的乙醇滲漉，減壓回收乙醇，加入二氯甲烷萃取三次，每次1000毫升，減壓回收二氯甲烷，得總浸膏，將總浸膏溶于1000毫升95％的甲醇，用石油醚萃取三次，每次1000毫升，棄去石油醚層，調(diào)整甲醇濃度至75％，用四氯化碳萃取三次，每次1000毫升，回收四氯化碳，將所得藥膏濃縮至干，加入體積比6∶4∶1的正己烷/二氯甲烷/甲醇的混合物溶劑5毫升溶解，過(guò)Sephandex LH20凝膠柱，用體積比6∶4∶1的正己烷/二氯甲烷/甲醇的混合物溶劑進(jìn)行洗脫，收集淺黃色部分，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑濃縮至干，加入體積比為15∶1的石油醚/丙酮5毫升溶解，過(guò)200-300目正相硅膠柱，以體積比為15∶1的石油醚/丙酮洗脫，棄去洗脫液，再以體積比為2∶1的石油醚/丙酮洗脫，收集淺黃色部分，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑濃縮至干，得到總?cè)铺崛∥?7克。將總?cè)铺崛∥镞^(guò)300-400目正相硅膠柱進(jìn)行層析，以石油醚乙酸乙酯的體積比為12∶1～3∶1的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)，收集含StellettinL和Stellettin M的流份，再經(jīng)正相高效液相色譜分離，以正己烷異丙醇的體積比為75∶25的混合溶劑進(jìn)行洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)，分別收集含Stellettin L和Stellettin M的流份，以真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得Stellettin L 2.9毫克和Stellettin M 2.1毫克。
權(quán)利要求
1.一種三萜類抗腫瘤化合物，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下
其中R基團(tuán)表示
當(dāng)R為
反式結(jié)構(gòu)時(shí)，該化合物為Stellettin L，當(dāng)R為
順式結(jié)構(gòu)時(shí)，該化合物為Stellettin M。
2.權(quán)利要求1所述抗腫瘤化合物的制備方法，步驟如下
(1)制備總?cè)铺崛∥飳⑿迈r的細(xì)薄星芒海綿用重量比為5～10倍的50％～95％乙醇滲漉提取，減壓回收乙醇，加入二氯甲烷萃取，減壓回收二氯甲烷，得總浸膏，將總浸膏溶于80％～95％的甲醇，用石油醚萃取，棄去石油醚層，調(diào)整甲醇濃度至65％～75％，用四氯化碳萃取，回收四氯化碳，將所得藥膏濃縮至干，過(guò)Sephandex LH20凝膠柱，用體積比為0～1∶1～0的二氯甲烷/甲醇或體積比為10～4∶10～5∶1的正己烷/二氯甲烷/甲醇洗脫，柱上顯示深棕色和淺黃色兩段顏色部分，收集淺黃色部分，回收溶劑濃縮至干，過(guò)200～400目正相硅膠柱，以體積比為1∶0～0∶1石油醚/乙酸乙酯或體積比為1∶0～0∶1的石油醚/丙酮梯度洗脫，收集淺黃色部分，回收溶劑濃縮至干，得細(xì)薄星芒海綿總?cè)铺崛∥铮?br> (2)分離純化上述總?cè)铺崛∥镞M(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚∶乙酸乙酯的體積比為20∶1～1∶1的混合溶劑洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)，收集含Stellettin L和Stellettin M的流份，再經(jīng)正相高效液相色譜分離，以正己烷∶異丙醇的體積比為60～80∶40～20的混合溶劑進(jìn)行洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)，分別收集含StellettinL和Stellettin M的流份并濃縮至干即可。
3.權(quán)利要求1所述的抗腫瘤化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為從細(xì)薄星芒海綿中分離到的一種三萜類抗腫瘤化合物C30H42O4，分反式和順式兩種結(jié)構(gòu)存在，分別命名為Stellettin L和Stellettin M，化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如上，經(jīng)多種現(xiàn)代光譜分析，特別是應(yīng)用多種先進(jìn)的二維核磁共振譜的綜合解析，確定了該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型。體外抗腫瘤試驗(yàn)表明，這兩種化合物對(duì)A549人胃癌細(xì)胞和SMMC-7721人肝癌細(xì)胞等4種腫瘤細(xì)胞株有明顯的抑制作用。本發(fā)明可為研制新的抗腫瘤藥物提供先導(dǎo)化合物，對(duì)開(kāi)發(fā)利用中國(guó)的海洋藥用資源具有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K35/56GK101113134SQ20071004265
公開(kāi)日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2007年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月26日
發(fā)明者林厚文, 王增蕾, 陳萬(wàn)生, 張紅軍, 樸淑娟 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)