專利名稱：組織工程肌腱及其體外構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，更具體地涉及應(yīng)用真皮成纖維細(xì)胞 和(或)脂肪來源細(xì)胞在體外構(gòu)建組織工程肌腱的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
肌腱是連接骨骼肌肌腹與骨之間的致密膠原纖維結(jié)締組織束，是骨骼肌的 組成部分。肌腱的結(jié)構(gòu)可以看成是肌肉的延續(xù)、退化部分。新鮮標(biāo)本的肌腱呈 銀白色、索帶狀，質(zhì)地堅(jiān)韌。在松弛狀態(tài)下表面有波紋，如果牽拉超過松弛狀態(tài)的4%時(shí)，這波紋便消失，張力取消后波紋再現(xiàn)。在肌-腱聯(lián)接處，膠原纖維 進(jìn)入肌內(nèi)膜，附著在肌纖維的肌膜上在腱-骨連接處，腱束直接連續(xù)到骨和骨 膜上，其中絕大部分膠原纖維進(jìn)入骨，形成Sharpey穿纖維。肌腱傳導(dǎo)肌腹收 縮所產(chǎn)生的力，牽引骨骼，使之產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)。肌腱本身不具有收縮能力，但能抵 抗很大的張力。肌腱缺損是目前臨床工作中經(jīng)常遇到的問題，對(duì)于肌腱缺損的治療方法主 要是1、自體肌腱移植。2、同種異體肌腱移植。3、肌腱移植替代物。但以 上方法均存在著某些弊端，自體肌腱移植存在肌腱供區(qū)缺乏的問題。新鮮的異 體肌腱移植會(huì)引起嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)，經(jīng)過凍干處理后的同種異體肌腱保存 的僅僅是膠原纖維，將來仍需要自體肌腱細(xì)胞進(jìn)行替代。人工肌腱替代物雖然 近期生物力學(xué)強(qiáng)度較好，但遠(yuǎn)期終會(huì)發(fā)生降解，而且還會(huì)引起炎癥、纖維化和 肌腱粘連等反應(yīng)甚至替代物排出體外。上世紀(jì)80年代末期，組織工程學(xué)的興起和蓬勃發(fā)展為解決這一難題提供 了可能。曹誼林等于1994年首次報(bào)道了用聚羥基乙酸(PGA)短纖維在裸鼠皮 下構(gòu)建出了組織工程肌腱樣組織。劉永濤等則在有完善免疫功能的雞趾指屈肌 腱原位，應(yīng)用自體肌腱細(xì)胞構(gòu)建組織工程肌腱成功，但是，應(yīng)用自體肌腱細(xì)胞 作為組織工程肌腱的種子細(xì)胞仍需切取較大的肌腱組織，造成新的損傷。因此， 尋找新的種子細(xì)胞來源成為組織工程肌腱發(fā)展的首要問題。此外，目前國(guó)內(nèi)外組織工程肌腱的研究主要集中在動(dòng)物體內(nèi)的修復(fù)實(shí)驗(yàn)，即在體外擴(kuò)增出足夠數(shù)量的種子細(xì)胞，與生物材料復(fù)合后立即或僅在體外培養(yǎng) 一至兩周即植入體內(nèi)缺損部位，盡管獲得了一些初步的成功，但這種將接種細(xì) 胞后的支架材料直接回植入體內(nèi)形成肌腱的方式仍然存在一些重大缺陷包 括(1)植入的是細(xì)胞材料復(fù)合物而非肌腱移植物，導(dǎo)致種子細(xì)胞存活不佳， 從而引起移植失敗，無法獲取恒定的高成功率。(2)植入的支架為尚未降解 的材料，其分解產(chǎn)物多為酸性，可以直接導(dǎo)致炎性反應(yīng)，瘢痕形成和肌腱粘連， 從而直接影響了肌腱的修復(fù)效果。(3)由于植入的是非肌腱移植物，隨著材 料的降解，細(xì)胞-材料復(fù)合物的力學(xué)性能大大降低，無法修復(fù)高張力部位的肌 腱缺損。因此，雖然有較多的肌腱構(gòu)建和修復(fù)的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，但由于上述問 題的存在，離臨床應(yīng)用仍有相當(dāng)?shù)木嚯x。由此可見，采用組織工程技術(shù)構(gòu)建肌腱組織、修復(fù)肌腱組織缺損，并達(dá)到 產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的目的，關(guān)鍵之一是獲取大量有正常功能的肌腱細(xì)胞。但是肌腱細(xì) 胞經(jīng)多次傳代后喪失分泌基質(zhì)的能力，難以獲得大量有功能活性的肌腱細(xì)胞來 修復(fù)大塊缺損組織。關(guān)鍵之二是要構(gòu)建出具有一定力學(xué)性能、大部分材料已發(fā) 生降解的相對(duì)成熟的肌腱組織。因此，探索更廣泛的種子細(xì)胞來源、更優(yōu)化的 體外構(gòu)建技術(shù)已成為組織工程肌腱研究的焦點(diǎn)。針對(duì)關(guān)鍵問題一，許多學(xué)者作了大量研究工作，試圖拓展肌腱組織工程種 子細(xì)胞來源，并促進(jìn)其增殖。第一，尋找可替代細(xì)胞例如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell MSC)、 真皮成纖維細(xì)胞(Dermal Fibroblast DF) 。 MSC是一群具有多相分化潛能的 細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為多種間充質(zhì)組織細(xì)胞，Awad等分離、培養(yǎng) MSC后與膠原復(fù)合形成細(xì)胞膠原復(fù)合物植入人工缺損髕韌帶處，與對(duì)照組(單純 應(yīng)用膠原)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組組織的彈性模量、最大張力、硬度等較對(duì)照 組大，而在組織學(xué)和形態(tài)學(xué)方面兩者并沒有很大差別。然而，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 的來源有限，分離較為復(fù)雜。陳兵等人用豬的自體成纖維細(xì)胞成功構(gòu)建組織工 程肌腱并修復(fù)趾淺屈肌腱缺損，證明了真皮成纖維細(xì)胞作為組織工程肌腱或韌 帶構(gòu)建的種子細(xì)胞的可行性。第二，促進(jìn)種子細(xì)胞增殖與基質(zhì)合成。生長(zhǎng)因子是通過細(xì)胞間信號(hào)傳遞影 響細(xì)胞活動(dòng)的一類多肽因子，在體內(nèi)或體外可促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖。許多學(xué)者 直接使用生長(zhǎng)因子研究并證實(shí)其在體內(nèi)體外對(duì)肌腱損傷修復(fù)的促進(jìn)作用。此 外，還有人利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將基因信息傳遞給細(xì)胞以此來改變細(xì)胞功能。利用此種技術(shù)使靶細(xì)胞增加或抑制合成和分泌蛋白質(zhì)(如生長(zhǎng)因子)，調(diào)控細(xì)胞的 生長(zhǎng)，參與組織修復(fù)過程。成功應(yīng)用這一方法可使細(xì)胞、組織按要求合成分泌細(xì)胞因子以調(diào)控其生長(zhǎng)。已有學(xué)者成功地用不同方法將基因轉(zhuǎn)入肌腱中，LacZ 標(biāo)記基因被應(yīng)用于髕韌帶后持續(xù)表達(dá)了 6周，在雞趾屈肌腱的實(shí)驗(yàn)中，Lou等 運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將LacZ標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入肌腱中，75天后還可以檢測(cè)到該基因， 并提出了減少和阻止肌腱損傷后的粘連形成的一些方法。雖然經(jīng)過上述各種研究，仍沒有徹底解決肌腱種子細(xì)胞來源缺乏的難題。 針對(duì)關(guān)鍵問題二，有學(xué)者嘗試在體外應(yīng)用多種生物材料進(jìn)行肌腱組織的構(gòu) 建。曹德君等人利用可吸收生物材料聚羥基乙酸(polyglycolic acids ， PGA)和 肌腱細(xì)胞在體外構(gòu)建組織工程肌腱，用U形彈簧給予細(xì)胞-PGA復(fù)合物持續(xù)張力 后體外培養(yǎng)，6周后形成與正常肌腱結(jié)構(gòu)相似、具有一定力學(xué)性能的肌腱樣組 織，但此種方法無法精確計(jì)量所施加的張力大小及頻率等參數(shù)，所構(gòu)建的組織 的力學(xué)性能極為薄弱。體外模擬體內(nèi)微環(huán)境仍需要進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化。因此，本領(lǐng)域迫切需要一種用新的種子細(xì)胞并在體外構(gòu)建的組織工程化人 肌腱，而且所述的組織工程化肌腱具有良好的力學(xué)性能。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種組織工程化人肌腱移植物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的組織工程化肌腱移植物的體外制備方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述組織工程化肌腱移植物的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種組織工程化肌腱移植物，它包括(a) 藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；和(b) 種子細(xì)胞，所述的種子細(xì)胞接種于所述的生物可降解材料，且種子細(xì) 胞選自下組(i)成纖維細(xì)胞，(ii)脂肪來源細(xì)胞，或(iii) 1:10000 — 10000:1的成纖維細(xì)胞和脂肪來源細(xì)胞的混合物。在另一優(yōu)選例中，所述組織工程化肌腱移植物的最大張力為10 — 80N。 在另一優(yōu)選例中，所述的種子細(xì)胞是成纖維細(xì)胞或成纖維細(xì)胞和脂肪來 源細(xì)胞的混合物。在另一優(yōu)選例中，所述的種子細(xì)胞的含量為lX105個(gè)細(xì)胞/ml-5X108個(gè)細(xì)胞/ml。在另一優(yōu)選例中，所述的生物可降解材料為條索狀。在另一優(yōu)選例中，所述的成纖維細(xì)胞和脂肪來源細(xì)胞來源于自體或同種 異體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚 乳酸、聚羥基乙酸、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基 酸、聚原酸酯、聚酯尿垸、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六 環(huán)酮、膠原、明膠、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、藻酸l丐凝膠、 脫細(xì)胞基質(zhì)，及其各種類型和比列的混合物。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備上述的組織工程化肌腱移植物的 方法，包括步驟將種子細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，得到種子細(xì)胞一生 物材料復(fù)合物，其中所述的種子細(xì)胞接種于所述的生物可降解材料，且種子細(xì)胞選自下組(i)成纖維細(xì)胞，(ii)脂肪來源細(xì)胞，或(iii) 1:10000 10000:1的成纖維細(xì)胞和脂肪來源細(xì)胞的混合物； 在另一優(yōu)選例中，它還包括步驟將種子細(xì)胞一生物材料復(fù)合物在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)得到如上所述的組織 工程化肌腱移植物。在另一優(yōu)選例中，所述的生物反應(yīng)器是申請(qǐng)?zhí)枮?00510110037.0中所公 開的一種牽拉式肌腱生物反應(yīng)器。在另一優(yōu)選例中，移植物中種子細(xì)胞的含量為lXl()5個(gè)細(xì)胞/ral-5X108 個(gè)細(xì)胞/ml。在另一優(yōu)選例中，生物反應(yīng)器中加載在種子細(xì)胞一生物材料復(fù)合物上的 牽引力為2 — 20N。在另一優(yōu)選例中，所述的生物可降解材料為條索狀。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種如上所述的組織工程化肌腱移植物的 用途，它可用于制備修復(fù)肌腱缺損的移植物。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種用新的種子細(xì)胞并在體外構(gòu)建的組織工程化人肌腱，而且所述的組織工程化肌腱具有良好的力學(xué)性能。


圖1顯示了第二代人皮膚成纖維細(xì)胞。圖2顯示了第二代人肌腱細(xì)胞。 圖3顯示了原代脂肪來源細(xì)胞。圖4顯示了對(duì)脂肪來源細(xì)胞各種表型的鑒定結(jié)果；其中A表示Vimentin+的鑒定結(jié)果，B表示CD106+的鑒定結(jié)果，C表示CD34—的鑒定結(jié)果，D表示CD297CD49D+的鑒定結(jié)果，E表示CD447CD49D+的鑒定結(jié)果。 圖5顯示了脂肪來源細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)后，II型膠原的表達(dá)情況。 圖6顯示了脂肪來源細(xì)胞成脂肪誘導(dǎo)后，由紅染色，觀察細(xì)胞槳內(nèi)脂滴形成的情況。圖7顯示了脂肪來源細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后，鈣結(jié)節(jié)形成的情況。 圖8顯示了脂肪來源細(xì)胞的免疫抑制調(diào)控功能檢測(cè)結(jié)果。 圖9顯示了預(yù)塑形后的束狀PGA纖維支架。圖IO顯示了預(yù)塑形的束狀纖維固定在"U"形彈簧上的PGA支架。 圖11顯示了生物反應(yīng)器外觀。圖12顯示了人真皮成纖維細(xì)胞和/或脂肪來源干細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建肌腱 方法。圖13顯示了應(yīng)用人真皮成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞，靜態(tài)牽拉2周+動(dòng)態(tài)牽拉IO周后的組織工程化肌腱組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果；其中 A表示皮膚成纖維細(xì)胞+PGA; B表示肌腱細(xì)胞+PGA 圖14顯示了不同張力下體外構(gòu)建組織工程肌腱的生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果。 圖15顯示了應(yīng)用人脂肪來源干細(xì)胞為種子細(xì)胞，靜態(tài)牽拉2周+動(dòng)態(tài)牽拉5周后的組織工程化肌腱組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)可以將人的真皮成纖維細(xì)胞、脂 肪來源細(xì)胞或其混合物作為構(gòu)建組織工程化肌腱移植物的種子細(xì)胞，并將種子細(xì)胞 和生物可降解材料的混合物放置在生物反應(yīng)器中進(jìn)行體外培養(yǎng)，能獲得具有良好生 理力學(xué)性能的組織工程化人肌腱。術(shù)語術(shù)語"純化的或分離的"指純化的或分離的物質(zhì)基本上不含有其他細(xì)胞、 蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語"異種移植"指將所需生物材料(如肌腱)從某一物種中取出并再施 用于另一物種對(duì)象的方法。術(shù)語"自體移植"指將所需生物材料(如肌腱)從某病人中取出并再施用 于同一病人的方法。術(shù)語"異體移植"指將所需生物材料(如肌腱)從同一物種的某個(gè)體中取出 并再施用于另一不同病人的方法。如本文所用"藥學(xué)上可接受的生物可降解材料"、"醫(yī)學(xué)上可接受的生 物可降解材料"、"生物可降解材料"、"生物材料"和"材料"是同樣的 含義，都表示可給細(xì)胞及生長(zhǎng)因子提供一個(gè)載體，與細(xì)胞或機(jī)體組織具有良 好的生物相容性，而且具有與組織生長(zhǎng)相匹配的降解速率的材料。如本文所用，"組織工程化肌腱移植物"、"組織工程化肌腱"和"組 織工程肌腱"可互換使用，只要它們都表示一種含有種子細(xì)胞一生物材料復(fù) 合物并能修補(bǔ)體內(nèi)肌腱缺損的移植物即可。種子細(xì)胞可用于本發(fā)明肌腱移植物的種子細(xì)胞是成纖維細(xì)胞和(或)脂肪來源細(xì)胞， 這兩種細(xì)胞可以來自自體，也可以來自異體，成纖維細(xì)胞取自自體更佳。若為兩者的混合物，則成纖維細(xì)胞和脂肪來源細(xì)胞的數(shù)量之比為1:10000-10000:1， 較佳地為1:5-100:1，更佳地為1:2-10:1 。本發(fā)明的成纖維細(xì)胞的來源沒有特別限制，可以是任何來源的成纖維細(xì) 胞，通常，本發(fā)明的成纖維細(xì)胞是自體的(如真皮、皮下組織以及其他組織中 的成纖維細(xì)胞)、或同種異體的成纖維細(xì)胞(如人胎兒來源的成纖維細(xì)胞)。成 纖維細(xì)胞還可以是衍生自脂肪干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、或其他干細(xì)胞的成 纖維細(xì)胞。可用于本發(fā)明的成纖維細(xì)胞來自人體。盡管自體的成纖維細(xì)胞是優(yōu)選的，但異體的成纖維細(xì)胞的來源也可使用。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的種子細(xì)胞是人自體真皮成纖維細(xì)胞。 分離和獲得真皮成纖維細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中熟知的。常用的分離方案包括(a) 膠原酶消化、分離法在無菌條件下取皮膚組織，切成2X2X2mm3大 小組織塊，磷酸緩沖液(PBS，含青、鏈霉素各100U/ml)沖洗2遍，加入二倍體 積的lmg/ml II型膠原酶(Worthington， Freehold, NJ, USA)，置于37。C恒溫?fù)u 床消化4h后用150目尼龍網(wǎng)篩過濾離心，沉淀細(xì)胞用PBS洗2次計(jì)數(shù)，臺(tái)盼 藍(lán)染色檢查真皮成纖維細(xì)胞活力，以1X107盤密度(培養(yǎng)皿直徑100mm)培養(yǎng)細(xì) 胞。(b) 組織塊培養(yǎng)法在麻醉無菌條件下取皮膚組織，切成2X2X2mm3大小 組織塊，磷酸緩沖液(PBS,含青、鏈霉素各100U/ml)沖洗2遍。將組織塊在培 養(yǎng)皿表面均勻擺置，將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中放置2-4小時(shí)，輕輕加入培養(yǎng)液 讓液體緩慢覆蓋組織小塊，等待細(xì)胞游出。真皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液也是本領(lǐng)域中熟知的。 一種優(yōu)選的方 法是將真皮成纖維細(xì)胞在飽和濕度、5。/。C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)液包括(但 并不限于)l)DMEM培養(yǎng)基((Gibco公司)+10%胎牛血清；2)DMEM培養(yǎng)基+20% 小牛血清；3)DMEM培養(yǎng)基+10-20%自體(異體)人血清。此外，上述培養(yǎng)液中添 加各種生長(zhǎng)因子(例如促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子等)、各種轉(zhuǎn)基因成分、 各種細(xì)胞成分。適用于本發(fā)明的真皮成纖維細(xì)胞應(yīng)能在體內(nèi)或體外增殖。 一種優(yōu)選的真皮 成纖維細(xì)胞是體外培養(yǎng)的原代至第五十代細(xì)胞，且免疫組織化學(xué)染色證明I型 膠原表達(dá)，原位雜交檢測(cè)證明I型膠原mRNA表達(dá)。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中獲得的脂肪來源細(xì)胞(adipose derived cells, ADCs)也屬于一種間充質(zhì)干細(xì)胞，與BMSC —樣具有多向分化潛能，能 夠在誘導(dǎo)條件下向骨，軟骨，肌腱等方向分化。與BMSC相比ADC還具有其它 優(yōu)點(diǎn)。1、來源豐富，易于獲取，且獲取量要遠(yuǎn)高于BMSC，而且ADC細(xì)胞增殖 能力也遠(yuǎn)大于BMSC，能夠?yàn)榻M織工程化構(gòu)建提供充足的細(xì)胞量。2、膠原分泌 能力較強(qiáng)，而肌腱組織中需要大量的I型膠原維持其良好的抗拉強(qiáng)度，更適合 作為肌腱種子細(xì)胞，更容易形成功能性肌腱組織。3、具有低免疫原性和免疫 調(diào)節(jié)功能，更適合應(yīng)用于同種異體間的移植，具有更廣泛的臨床應(yīng)用前景。因此，脂肪來源細(xì)胞(ADC)不僅能夠作為組織工程肌腱的種子細(xì)胞，而且具有相當(dāng)大的實(shí)用價(jià)值，開展相關(guān)的研究將有可能形成被不同個(gè)體接受的組 織工程肌腱產(chǎn)品，突破組織工程肌腱產(chǎn)品個(gè)體化治療的瓶頸問題。分離和獲得脂肪來源細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。 一種優(yōu)選的方法是 在無菌條件下取吸脂術(shù)后廢棄的人脂肪組織，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，用生理鹽 水反復(fù)沖洗，加入等體積的0. 075%的I型膠原酶(Worthington， Freehold, NJ， USA)，置于37。C恒溫?fù)u床消化，分別于l小時(shí)后，300g離心10分鐘，獲得高 密度的細(xì)胞沉淀物，棄上清和漂浮的脂肪組織，細(xì)胞振勻，計(jì)數(shù)后以1X107 盤密度(培養(yǎng)皿直徑100mm)培養(yǎng)細(xì)胞。脂肪來源細(xì)胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液也是本領(lǐng)域中熟知的。 一種優(yōu)選的方法 是將脂肪來源細(xì)胞在飽和濕度、5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)液包括(但并 不限于).-l)DMEM培養(yǎng)基((Gibco公司)+10%胎牛血清;2)DMEM培養(yǎng)基+20%小牛 血清；3)DMEM培養(yǎng)基+ 10-20%自體(異體)人血清。此外，上述培養(yǎng)液中添加各 種生長(zhǎng)因子(例如促進(jìn)脂肪來源細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子等)、各種轉(zhuǎn)基因成分、各 種細(xì)胞成分。適用于本發(fā)明的脂肪來源細(xì)胞應(yīng)能在體內(nèi)或體外增殖。 一種優(yōu)選的脂肪來 源細(xì)胞是體外培養(yǎng)的原代至第三十代細(xì)胞。如果必要，可以在種子細(xì)胞中加入一些肌腱細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。 分離和獲得肌腱細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。 一種優(yōu)選的方法是通過胰酶、 膠原酶消化進(jìn)行分離，即用無血清DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)將胰酶或膠原酶 濃度調(diào)整至0. 1-5mg/ml(較佳地約為lmg/ml)，37。C士2-C恒溫振蕩器內(nèi)消化約 4-20h。肌腱細(xì)胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液也是本領(lǐng)域中熟知的。 一種優(yōu)選的方法是 將肌腱細(xì)胞在飽和濕度、5%〔02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限 于)l)DMEM培養(yǎng)基((Gibco公司)+10%胎牛血清；2)DMEM培養(yǎng)基+20%小牛血 清；3)DMEM培養(yǎng)基+ 10-20%自體(異體)人血清。此外，上述培養(yǎng)液中添加各種 生長(zhǎng)因子(例如促進(jìn)肌腱細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子等)、各種轉(zhuǎn)基因成分、各種細(xì) 胞成分。本發(fā)明中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的來源沒有特別限制， 一種優(yōu)選的來源是來自自體的骨髓。分離獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。一 種優(yōu)選的方法是麻醉下骨髓穿刺抽取自體骨髓，以密度梯度離心法分離出其中的有核細(xì)胞，加入適合的培養(yǎng)液(如含有10%胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml， 維生素C50ug/ml，青、鏈霉素各100U/ml，地塞米松5nM(Sigma)的DMEM(Gibco, Gland Island, NY， USA)條件培養(yǎng)液)，制成細(xì)胞懸液，以約1 X 107cm2的密度 接種于培養(yǎng)皿，于37。C、 5%C02、 100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)。48小時(shí)后首次 換液，加入條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)隔日換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)近匯合后，以0.25%胰 蛋白酶+0.02。/。EDTA消化，以lX107cr^的密度接種進(jìn)行細(xì)胞傳代。生物可降解材料可用于本發(fā)明的組織工程化肌腱的材料是藥學(xué)上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a) 可降解性合成高分子材料，例如聚a-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基 乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮 (polyphosphazenes)、 聚氨基酸(polyamino acid)、 假聚氨基酸 (pesudo—polyamino acid)、 聚原酸酉旨(polyorthoesters)、 聚酉旨尿院 (polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、 聚對(duì)二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；(b) 天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖 (glycosaminoglycan, GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸 鹽、藻酸鈣凝膠等；各種脫細(xì)胞基質(zhì)；(c) 上述材料的混合物或復(fù)合材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合 材料。其中優(yōu)選聚羥基乙酸PGA、聚乳酸PLA，或兩者共紡物PGLA等。 生物反應(yīng)器適用于本發(fā)明的生物反應(yīng)器沒有特別限制，可以使用本發(fā)明常用的各種生 物反應(yīng)器。優(yōu)選的生物反應(yīng)器具有以下特征1、大小、容量合適，利于細(xì)胞 或組織的培養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的排出，且不易污染。2、能夠模擬生物體內(nèi)肌腱的 生物力學(xué)等微環(huán)境，提供適于組織工程肌腱的生長(zhǎng)環(huán)境。3、拉力、頻率等參數(shù)可控，且便于操作。 組織工程肌腱本發(fā)明提供了一種新的組織工程化肌腱移植物，它包括(a)藥學(xué)上可接 受的生物可降解材料；和(b)真皮成纖維細(xì)胞和(或)脂肪來源細(xì)胞，所述的 兩種種子細(xì)胞分別或混合接種于所述的生物可降解材料。本發(fā)明提供的組織工 程化肌腱移植物具有良好的力學(xué)性能，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行測(cè)試，例如但不限于應(yīng)用Intron生物力學(xué)測(cè)定儀，BOSE生物力學(xué)測(cè)試儀等對(duì)肌腱移 植物的抗拉性能進(jìn)行測(cè)定。測(cè)試時(shí)本發(fā)明提供的組織工程化肌腱移植物的最大張力較佳的為10 — 80N，更佳的為40 — 80N。本發(fā)明的組織工程肌腱相對(duì)成熟，在體外培養(yǎng)一定時(shí)期后，生物材料大部 分降解，避免了早期回植入體內(nèi)時(shí)，因生物材料的大量降解產(chǎn)物引發(fā)的肌腱粘 連、斷裂等現(xiàn)象，能夠更有效的修復(fù)肌腱缺損。本發(fā)明的組織工程肌腱相對(duì)成熟，在體外培養(yǎng)一定時(shí)期后，種子細(xì)胞分泌 了充分的膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，使新生組織工程肌腱植入時(shí)已經(jīng)具備一定的生物 力學(xué)性能，避免了修復(fù)早期因受力導(dǎo)致肌腱斷裂等。本發(fā)明的組織工程肌腱移植物的形狀沒有特別限制，可以按照組織缺損的 形狀任意塑形，通常移植物為長(zhǎng)條形。體外培養(yǎng)擴(kuò)增的種子細(xì)胞接種到生物相容性良好并可被機(jī)體吸收的可降 解生物材料上形成種子細(xì)胞一生物材料復(fù)合物，將這一種子細(xì)胞一生物材料復(fù) 合物置于生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)一定時(shí)期后，隨著生物材料的逐漸降解吸收，種 子細(xì)胞繼續(xù)增殖并分泌基質(zhì)，替代大部分生物材料而形成相對(duì)成熟的組織工程 肌腱，植入到缺損部位時(shí)，可達(dá)到修復(fù)肌腱缺損的目的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域常用的生物反應(yīng)器，只要可以為細(xì)胞一材料復(fù)合物的體外 構(gòu)建提供必要的動(dòng)態(tài)牽引力，優(yōu)選牽拉式肌腱生物反應(yīng)器。將肌腱移植物的長(zhǎng) 度、直徑依照肌腱缺損長(zhǎng)度與直徑確定，然后在應(yīng)力條件(2-20牛頓)下體外 培養(yǎng)一周，每一至二天換液一次，以保證細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)，從而形成供移植的肌腱。本發(fā)明組織工程肌腱中的種子細(xì)胞濃度通常約為lX105/ml至5X107ml 或更高，較佳地為1X107ml至1X107ml，更佳地為5X 107ml至5X 107/ml。通常以培養(yǎng)液調(diào)整種子細(xì)胞濃度，然后與可降解材料混合。混合時(shí)培養(yǎng)液與可 降解材料的比例沒有特別限制，但是以該材料能夠吸附的培養(yǎng)液最大量為宜。此外，在本發(fā)明的組織工程肌腱移植物中，還可添加或復(fù)合其他各種細(xì)胞、 生長(zhǎng)因子、各種轉(zhuǎn)基因成分，從而保持肌腱細(xì)胞表型、促進(jìn)肌腱細(xì)胞生長(zhǎng)，以 及促進(jìn)組織工程肌腱在體內(nèi)的血管神經(jīng)化。用本發(fā)明方法形成的組織工程肌腱移植物或肌腱，可直接植入體內(nèi)肌腱缺 損處并修復(fù)肌腱缺損。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所 揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何 可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特 征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1) 真皮成纖維細(xì)胞和(或)脂肪來源細(xì)胞分布廣泛，取材容易，解決了 組織工程化肌腱構(gòu)建種子細(xì)胞來源不足的問題。(2) 脂肪來源細(xì)胞具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，有望解決同種異體移植修復(fù)的免疫排斥問題。(3) 可以按照組織缺損的形狀任意塑形形成的組織可以在生物體內(nèi)終生存活。(4) 利用新型的生物反應(yīng)器提供精確可調(diào)控的單向牽引力，進(jìn)行肌腱構(gòu)建，并利用excluded volume effect (EVE)效應(yīng)來加速肌腱的成熟。(5) 體外形成肌腱后，細(xì)胞處于自然細(xì)胞外基質(zhì)的包繞中，再回植體內(nèi)可 以避免細(xì)胞死亡，從而獲得相對(duì)恒定的高成功移植率。(6) 在體外構(gòu)建的肌腱再植入體內(nèi)時(shí)，由于支架材料已經(jīng)大部降解，避免 了酸性降解產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而可以防止肌腱纖維化和粘連。(7) 在體外構(gòu)建出具有一定生物力學(xué)性能的組織工程肌腱，回植后可以像 正常肌腱移植一樣開展早期的功能鍛煉，有助于防止肌腱粘連和促進(jìn)功能康 復(fù)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所 有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例l皮膚成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)在無菌條件下取術(shù)中廢棄的包皮組織，切成2X2X2inm3大小組織塊，磷酸 緩沖液(PBS，含青、鏈霉素各100U/ml)沖洗2遍，加入二倍體積的lmg/ml的 II型膠原酶(購自Worthington, Freehold, NJ， USA)，置于37。C恒溫?fù)u床消化 4h后用150目尼龍網(wǎng)篩過濾離心，沉淀細(xì)胞用PBS洗2次計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢 査成纖維細(xì)胞活力，以1X107盤密度(培養(yǎng)皿直徑100mm)培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液為 DMEM(購自Gibco， Gland， Island, NY， USA)含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺 300ug/ml，維生素C50ug/ml，青、鏈霉素各100U/ml，成纖維細(xì)胞傳至第二代， 經(jīng)0. 25%胰酶消化收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)(圖1)。實(shí)施例2肌腱細(xì)胞的分離與培養(yǎng)在無菌條件下取新鮮截肢術(shù)后廢棄的人肌腱組織，切成2X2X2mm3大小組 織塊，磷酸緩沖液(PBS，含青、鏈霉素各100U/ral)沖洗2遍，加入二倍體積的 0, 25mg/ml的II型膠原酶(購自Worthington， Freehold, NJ， USA)，置于37°C 恒溫?fù)u床消化，分別于4、 5、 7小時(shí)后，用150目尼龍網(wǎng)篩過濾離心，沉淀細(xì) 胞用PBS洗2次計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢查肌腱細(xì)胞活力，以1X107盤密度(培養(yǎng) 皿直徑100mm)培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液為DMEM(購自Gibco， Gland, Island, NY， USA) 含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，維生素C50ug/ml，青、鏈霉素各 100U/ml，肌腱細(xì)胞傳至第二代，經(jīng)O. 25%胰酶消化收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)(圖2)。實(shí)施例3脂肪來源細(xì)胞的分離與培養(yǎng)在無菌條件下取吸脂術(shù)后廢棄的人肌腱組織，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，用生理鹽水反復(fù)沖洗，加入等體積的O. 075%的1型膠原酶(購自Worthington， Freehold, NJ， USA)，置于37。C恒溫?fù)u床消化，分別于l小時(shí)后，300g離心10分鐘，獲 得高密度的細(xì)胞沉淀物，棄上清和漂浮的脂肪組織，細(xì)胞振勻，計(jì)數(shù)后以IX 107盤密度(培養(yǎng)皿直徑100mm)培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液為DMEM(購自 Gibco， Gland, Island, NY， USA)含10%胎牛血清，置于37°C、 5%C02、 100%飽 和濕度的條件下培養(yǎng)，24小時(shí)后首次換液，用PBS反復(fù)沖洗去除漂浮的細(xì)胞， 加入培養(yǎng)液，待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底時(shí)進(jìn)行傳代(圖3)。細(xì)胞傳至所需代次， 經(jīng)0. 25%胰酶消化收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 脂肪來源細(xì)胞的鑒定將原代脂肪來源細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞爬片上，至70%匯合時(shí)，4%多聚甲醛固定 15分鐘，加入各類待測(cè)表面抗原的抗體，37t:孵育1小時(shí)，PBS沖洗，加入FITC 連接的二抗(DAKO， Carpinteria,U.S,A) ， 37。C孵育30分鐘，PBS再次沖洗， 應(yīng)用Heochest33258 (購自Sigraa公司(美國(guó)))或Pr叩idiura Iodide (購自 Sigma公司(美國(guó)))進(jìn)行核襯染，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞表面抗原的 表達(dá)。脂肪來源細(xì)胞的多向分化潛能成軟骨誘導(dǎo)第三代細(xì)胞采用微團(tuán)塊培養(yǎng)法進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)因子終濃度為TGF-e l(購自腿D公司(美國(guó)))10ng/mL， IGF(購自R&D公司(美國(guó))M00ng/mL， Dex (購自Sigma公司(美國(guó)))0.1uraol/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白(購自Sigma公司(美國(guó))) 6. 25 ti g/mL。成脂肪誘導(dǎo)第三代細(xì)胞培養(yǎng)7天時(shí)進(jìn)行脂肪誘導(dǎo)，誘導(dǎo)液成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)液和 0. 5mmol/L IBMX(購自Sigma公司(美國(guó)))、ly mol/L Dex、 10 u mol/L insulin (購自Sigma公司(美國(guó)))、200umol/L indomethacin (購自Sigma公司 (美國(guó)))，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，誘導(dǎo)14天進(jìn)行相應(yīng)的 檢測(cè)。成骨誘導(dǎo) ' 第三代細(xì)胞培養(yǎng)7天時(shí)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)液成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入2. 16g/Lg-磷酸甘油、10nmol/L維生素D3。誘導(dǎo)20天，對(duì)礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行成骨 的相關(guān)特殊染色。實(shí)施例4生物材料支架的制備將材料纖維預(yù)塑形成束狀(圖9)，并固定在"U"形彈簧上給予支架持續(xù) 的靜態(tài)張力(圖10)，再在75%乙醇中浸泡消毒1小時(shí)后用PBS沖洗3 — 5遍， 紫外燈消毒、風(fēng)干后待用。實(shí)施例5組織工程肌腱的體外構(gòu)建皮膚成纖維細(xì)胞和/或脂肪來源細(xì)胞傳至第2 4代，經(jīng)0. 25%胰蛋白酶消 化收集細(xì)胞，制成2.0X107ml的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種到預(yù)制好的PGA 纖維支架上，先將細(xì)胞一材料復(fù)合物在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)放置4小時(shí)，然后加 入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液約30ral，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以后每二 天更換培養(yǎng)液一次，以保證細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)。大約2周后，細(xì)胞分泌足夠的細(xì)胞外基 質(zhì)，再轉(zhuǎn)移到牽拉式肌腱生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)牽拉培養(yǎng)，培養(yǎng) 一定時(shí)期(較佳的為3 10周)后形成能夠用于肌腱缺損修復(fù)的組織工程肌腱 移植物。生物反應(yīng)器中加載在種子細(xì)胞一生物材料復(fù)合物上的牽引力為2 — 20N，牽拉頻率為每日牽拉1 12小時(shí)，每次牽拉持續(xù)2 30秒，間隔5 60 秒，位移為移植物長(zhǎng)度的5 30%。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn) 被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申 請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求
1.一種組織工程化肌腱移植物，其特征在于，它包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；和(b)種子細(xì)胞，所述的種子細(xì)胞接種于所述的生物可降解材料，且種子細(xì)胞選自下組(i)成纖維細(xì)胞，(ii)脂肪來源細(xì)胞，或(iii)1∶10000-10000∶1的成纖維細(xì)胞和脂肪來源細(xì)胞的混合物。
2. 如權(quán)利要求l所述的移植物，其特征在于，最大張力為10 — 80N。
3. 如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的種子細(xì)胞是成纖維 細(xì)胞或成纖維細(xì)胞和脂肪來源細(xì)胞的混合物。
4. 如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的種子細(xì)胞的含量為1 X105個(gè)細(xì)胞/ra1-5Xl()8個(gè)細(xì)胞/ral。
5. 如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的生物可降解材料為 條索狀。
6. 如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的成纖維細(xì)胞和脂肪 來源細(xì)胞來源于自體或同種異體。
7. 如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的生 物可降解材料選自下組聚乳酸、聚羥基乙酸、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿垸、聚碳酸酯、聚乙二醇、 聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、 海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其各種類型和比列的混合物。
8. —種制備如權(quán)利要求1所述的組織工程化肌腱移植物的方法，其特征 在于，包括步驟將種子細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，得到種子細(xì)胞一生 物材料復(fù)合物，其中所述的種子細(xì)胞接種于所述的生物可降解材料，且種子 細(xì)胞選自下組(i)成纖維細(xì)胞，(ii)脂肪來源細(xì)胞，或(iii) 1:10000 10000:1的成纖維細(xì)胞和脂肪來源細(xì)胞的混合物；
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，它還包括步驟 將種子細(xì)胞一生物材料復(fù)合物在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)得到如權(quán)利要求1所述的組織工程化肌腱移植物。
10. —種如權(quán)利要求1所述的組織工程化肌腱移植物的用途，其特征在于， 它可用于制備修復(fù)肌腱缺損的移植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種組織工程化肌腱移植物，它包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；和(b)種子細(xì)胞，所述的種子細(xì)胞接種于所述的生物可降解材料，且種子細(xì)胞選自下組(i)成纖維細(xì)胞，(ii)脂肪來源細(xì)胞，或(iii)1∶10000-10000∶1的真皮成纖維細(xì)胞和脂肪來源細(xì)胞的混合物。所述的移植物是將種子細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，得到種子細(xì)胞-生物材料復(fù)合物后，將復(fù)合物在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)而得到。本發(fā)明的移植物可用于修復(fù)肌腱缺損。
文檔編號(hào)A61L27/38GK101332315SQ20071004301
公開日2008年12月31日 申請(qǐng)日期2007年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月29日
發(fā)明者偉 劉, 曹誼林, 宏 李, 鋒 許, 丹 鄧 申請(qǐng)人:上海國(guó)睿生命科技有限公司