專利名稱：：一種紅細(xì)胞快速冰箱凍存和解凍方法及其使用的冰凍保護(hù)液和洗滌液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種紅細(xì)胞的長期保存技術(shù)。技術(shù)背景現(xiàn)有技術(shù)均是將紅細(xì)胞先懸浮在高滲透壓凍存保護(hù)液中，其中主要有效成分是甘油或DMS0(二甲基亞砜)。例如Meryman液:57%甘油，3%乳酸鈉，0.2%Na2HP04，0.03%KC1。Huggins液:79%甘油，8%葡萄糖，1%果糖，0.3%EDTA-2Na。Krijnen液:35%甘油，2.9%山梨醇，0.63%NaCl。Valeri液35%甘油，2.88%甘露醇，0.65%NaCl。其工作原理是讓高滲透壓甘油滲入紅細(xì)胞內(nèi)部，置換出其中的水份，從而減少在凍存過程中紅細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，保護(hù)紅細(xì)胞不被破壞。在紅細(xì)胞解凍的過程中，由于紅細(xì)胞內(nèi)部的高滲狀態(tài)，必須通過逐步降低紅細(xì)胞洗滌液滲透壓的方法，用滲透壓逐漸降低的洗滌液，將紅細(xì)胞內(nèi)部的甘油或DMSO重新置換出來，以防止紅細(xì)胞內(nèi)部滲透壓相對(duì)過高而造成的紅細(xì)胞漲破。整個(gè)過程需要2—3小時(shí)左右。紅細(xì)胞的回收率大約在70%-85%。如果將融解的冰凍紅細(xì)胞直接置于生理鹽水溶液中解凍，則紅細(xì)胞將基本完全溶血。例如Meryman液保存方法在1單位紅細(xì)胞(約50ml)中加入160ml甘油保護(hù)劑，20分鐘加完，室溫放置30分鐘后，直接放入-8(TC冰箱。解凍時(shí)先在37-4(TC快速融化，離心去除甘油，10分鐘內(nèi)緩慢加入9。/。高滲NaCl溶液80ml，靜置3分鐘后加入300ml羥乙基淀粉，混勻后，離心10分鐘去上清，再加入150ml羥乙基淀粉和100ml生理鹽水，1500g離心10分鐘。去上清，加200ml生理鹽水，1500g離心10分鐘。去上清。冰凍和溶解洗滌總耗時(shí)約3小時(shí)。紅細(xì)胞回收率約85%。Huggins液保存方法冷凍方法同上。解凍方法使用和紅細(xì)胞等體積(50ml左右)的50%葡萄糖溶液和1000ml5。/。果糖，離心10分鐘。去上清，再加入5y。果糖500ml，混勻后離心IO分鐘。去上清。同樣方法再洗滌1—2次，至上清液中無明顯溶血。耗時(shí)和回收率大體同上。這種將紅細(xì)胞先懸浮在高滲透壓凍存保護(hù)液中再用不同滲透壓的洗滌液逐次洗漆的方法，其主要缺點(diǎn)是過程比較復(fù)雜，且耗時(shí)。因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)簡單、省時(shí)的細(xì)胞保存方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種新的長期冰凍保存紅細(xì)胞的簡單方法，該方法解決了現(xiàn)有試劑紅細(xì)胞凍存技術(shù)繁瑣、耗時(shí)等問題。本發(fā)明的目的之二是提供一種與上述冰凍保存紅細(xì)胞的方法相適應(yīng)的紅細(xì)胞解凍方法。同時(shí)，本發(fā)明還提供了上述方法所使用的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液和洗滌液。本發(fā)明利用含有DMSO(二甲基亞砜)的高滲的保存液，配置成紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液。該冰凍保護(hù)液懸浮紅細(xì)胞時(shí)，可以使紅細(xì)胞進(jìn)入高滲狀態(tài)。同時(shí)由于冰凍保護(hù)液中含有大分子膠體物質(zhì)，可以相對(duì)鎖住水份，降低溶質(zhì)擴(kuò)散速度，因此當(dāng)紅細(xì)胞與高濃度DMSO快速混合時(shí)，不會(huì)大量溶血。另外大分子膠體物質(zhì)還可以抑制紅細(xì)胞外冰晶對(duì)紅細(xì)胞膜的破壞作用。整個(gè)冰凍過程大約l分鐘在解凍時(shí)，含有大分子膠體物質(zhì)的洗漆溶液可以減慢紅細(xì)胞脫DMSO的速度，因此可以使用不含DMSO的洗滌液直接洗滌融解的紅細(xì)胞，而不會(huì)導(dǎo)致快速溶血。然后通過離心去除大分子膠體物質(zhì)，即可配成紅細(xì)胞鹽水懸液用于相關(guān)試驗(yàn)，整個(gè)融解過程大約15分鐘。紅細(xì)胞的最終得率可達(dá)到90%左右。本發(fā)明一方面公開了一種紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液，為含有生物相容性大分子物質(zhì)和DMSO的高滲溶液，大分子物質(zhì)的分子量在20000-400000道爾頓之間，單一大分子物質(zhì)的重量比體積百分比濃度(W/V)為2-10%。高滲溶液是指溶液中的溶質(zhì)顆粒(包括未離解的分子和巳離解的離子)總濃度明顯高于正常人血槳滲透壓的溶液，例如明顯大于300mMol/L(滲透壓單位300mOsm/L)，稱為高滲透溶液。DMSO—般濃度(W/V)為10%—40%，一20。C冰箱凍存優(yōu)選15%—25%，—80°C冰箱凍存優(yōu)選20%_30%，25%最佳。本發(fā)明另一方面公開了一種紅細(xì)胞冰凍洗滌液，為含有生物相容性大分子物質(zhì)的基本等滲的溶液，生物相容性大分子物質(zhì)的分子量在20000-400000道爾頓之間，單一大分子物質(zhì)的重量體積百分比濃度為2-10%。本發(fā)明中，生物相容性大分子物質(zhì)是指不會(huì)造成紅細(xì)胞明顯損害，不會(huì)明顯改變紅細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)的大分子物質(zhì)，一般無明顯生物毒性和活性。例如聚乙烯基吡咯垸酮(PVP)、羥乙基淀粉、聚乙二醇、右旋糖苷、明膠、白蛋白等。上述生物相容性大分子物質(zhì)優(yōu)選聚乙烯基吡咯垸酮、羥乙基淀粉、聚乙二醇或右旋糖苷中的一種或多種，配置冰凍保存液或洗滌液時(shí)的濃度(W/V)優(yōu)選2-10%。上述基本等滲的溶液可以是市售的各種試劑紅細(xì)胞保存液，也可以根據(jù)試劑紅細(xì)胞保存液的配方自行配置，滲透壓要求在250-400m0sm/L(毫滲)范圍內(nèi)(血漿的滲透壓約為313mOsm/L，約相當(dāng)于7個(gè)大氣壓或5330毫米汞柱)。例如乳酸鈉緩沖溶液，建議配方乳酸鈉3%(W/V)、磷酸二氫鈉0.2。/。(W/V)。本發(fā)明第三方面，公開了一種快速紅細(xì)胞凍存方法首先將新鮮紅細(xì)胞壓積或配成懸浮液，然后與前述的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液混勻，移入低溫冰箱保存。低溫冰箱是指一20。C或更低溫度如一8(TC的冰箱。較佳的，壓積紅細(xì)胞與紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液以體積比不超過1:3(等于或小于1:3)混勻，優(yōu)選l:3混勻。本發(fā)明第四方面，公開了與上述快速紅細(xì)胞凍存方法對(duì)應(yīng)的解凍方法從冰箱中取出冰凍紅細(xì)胞，立即加入前述紅細(xì)胞洗滌液，待冰凍紅細(xì)胞融化后，輕搖混勻，離心去除上清液，再加入相對(duì)壓積紅細(xì)胞5倍或5倍以上體積的上述洗滌液，充分混勻，離心去除上清液，將紅細(xì),胞直接配制成紅細(xì)胞鹽水懸液即可。優(yōu)選的，首次加入紅拜胞洗滌液與冰凍紅細(xì)胞等體積。融化冰凍紅細(xì)胞的溫度一般為20°C_37°C，優(yōu)選室溫或37。C。本發(fā)明中的重量體積百分比均為以克(g)為單位的重量除以以100毫升(1OOmL)為單位的體積獲得的百分比，例如1%即為1OOml溶液中含1g。本發(fā)明的關(guān)鍵在于紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液及洗滌液中加入了生物相容性大分子，正是由于生物相容性大分子的加入，使得凍存及解凍快速、簡易的目的得以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明和現(xiàn)有方法的最大區(qū)別在于冰凍的方法。在冰凍過程中，直接將壓積紅細(xì)胞置于凍存液中，混勻后即可放入低溫冰箱中。將經(jīng)典方法30分鐘左右的操作縮短到1分鐘左右。本發(fā)明的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液，可用于長期冰凍保存紅細(xì)胞，保存時(shí)間可達(dá)一年以上。本發(fā)明和現(xiàn)有方法的第二點(diǎn)區(qū)別在于洗滌液的成份。洗滌液即用于使融解后紅細(xì)胞脫離高滲狀態(tài)的溶液。其作用在于保護(hù)紅細(xì)胞在脫離高滲狀態(tài)時(shí)不受傷害。本發(fā)明的洗滌液中沒有使用高滲的鹽、葡萄糖等藥品，而是添加了高分子膠體物質(zhì)。本發(fā)明和現(xiàn)有方法的第三點(diǎn)區(qū)別在于紅細(xì)胞融解和洗滌的方法。由于在洗滌液中添加了生物相容性大分子物質(zhì)，因此只需洗滌兩次，每次無需緩慢加入洗滌液，也無需放置很長時(shí)間，即可以獲得紅細(xì)胞鹽水懸浮液用于試驗(yàn)。所需時(shí)間由經(jīng)典方法的2個(gè)小時(shí)以上縮短到15分鐘左右，紅細(xì)胞的最終得率最高可大于90%，超過經(jīng)典方法。本發(fā)明最大的特點(diǎn)是使用了大分子膠體物質(zhì)作為紅細(xì)胞冰凍保存和解凍洗滌的保護(hù)劑，因此在冰凍和解凍的操作中，對(duì)操作的要求較低，可以快速完成整個(gè)操作。試劑紅細(xì)胞屬于珍稀資源，在輸血領(lǐng)域有著十分重要的作用。免疫血液學(xué)試驗(yàn)的水平高低，在很大程度上依賴試劑紅細(xì)胞品種的多少和質(zhì)量的高低。但由于保存和溶解方法復(fù)雜，耗時(shí)，使得臨床發(fā)現(xiàn)的許多珍稀紅細(xì)胞資源難以得到有效的保存和充分的利用。本發(fā)明使得稀有試劑紅細(xì)胞資源的保存和應(yīng)用變得十分方便，快捷。因此將有效的提高稀有紅細(xì)胞資源的利用率，節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間，進(jìn)而間接提高免疫血液學(xué)試驗(yàn)的水平，對(duì)輸血的有效性和安全性的提高以及血液免疫學(xué)研究提供有力的支持。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1不同DMS0濃度下紅細(xì)胞冰凍保存方法的效果(一2(TC冰箱)實(shí)驗(yàn)方法1.配置紅細(xì)胞凍存液及洗滌液。2.冰凍方法將lml壓積紅細(xì)胞和3ml冰凍保護(hù)劑分別加入10ml試管中，緩慢顛倒試管數(shù)次混勻，置一2(TC冰箱保存4小時(shí)。3.解凍方法取出冰凍紅細(xì)胞(共4ml)加入4ml解凍洗滌液，置室溫或37°C解凍。待完全融解后緩慢顛倒試管數(shù)次混勻，4000rpm離心3分鐘，去盡上清液。另加解凍洗滌液5ml，緩慢顛倒試管數(shù)次，直至將試管底部的壓積紅細(xì)胞完全懸浮。4000rpm離心3分鐘，去上清液，加生理鹽水7ml配制成紅細(xì)胞懸液，混勻，解凍記錄時(shí)間。4.測(cè)定紅細(xì)胞得率將上述紅細(xì)胞鹽水懸液經(jīng)3000rpm離心2分鐘后去盡上清液，剩余的壓積紅細(xì)胞即為試驗(yàn)組，另取lml未經(jīng)冰凍的壓積紅細(xì)胞為對(duì)照組，兩組均加生理鹽水至2ml，用反復(fù)凍融法使紅細(xì)胞完全溶血，4000rpm離心3分鐘去除細(xì)胞膜，取溶血液待檢。用多功能分光光度計(jì)檢測(cè)540nm光吸收值，用鹽水將對(duì)照組倍比稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線將試驗(yàn)組溶血液中檢測(cè)到的光吸收值(OD值)換算成紅細(xì)胞濃度。紅細(xì)胞凍存液配方(以下百分比均為W/V%)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>紅細(xì)胞洗漆液配方(以下百分比均為W/V%)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表l所示表l不同畫S0濃度，存一2(TC冰箱，各步驟損失的紅細(xì)胞比例和紅細(xì)胞回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*所有試驗(yàn)解凍時(shí)間均在20分鐘之內(nèi)。實(shí)施例2不同DMSO濃度下紅細(xì)胞冰凍保存方法的效果(一8(TC冰箱)實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例1，僅將冰箱換為_80°C冰箱。紅細(xì)胞凍存液及洗滌液配方也與實(shí)施例1相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示表2不同DMS0濃度，存一8(TC冰箱，各步驟損失的紅細(xì)胞比例和紅細(xì)胞回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*所有試驗(yàn)解凍時(shí)間均在20分鐘之內(nèi)。實(shí)施例3不同大分子物質(zhì)冰凍紅細(xì)胞方法的影響實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例1。紅細(xì)胞凍存液配方(以下百分比均為W/W。)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示表3不同大分子物質(zhì)在2%10%濃度間對(duì)冰凍紅細(xì)胞方法的影響(以下百分比均為W/V0/。)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*所有試驗(yàn)解凍時(shí)間均在20分鐘之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液，其特征在于，它是含有生物相容性大分子物質(zhì)和DMSO的高滲溶液，其中，生物相容性大分子物質(zhì)的分子量在20000-400000道爾頓之間，單一大分子物質(zhì)的重量體積百分比濃度為2-10％。2.如權(quán)利要求1所述的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液，其特征在于，所述DMSO的重量體積百分比濃度為10%—40%。3.如權(quán)利要求1所述的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液，其特征在于，所述生物相容性大分子物質(zhì)選自聚乙烯基吡咯烷酮、羥乙基淀粉、聚乙二醇或右旋糖苷中的一種或多種。4.一種紅細(xì)胞冰凍洗滌液，其特征在于，它是含有生物相容性大分子物質(zhì)的基本等滲的溶液，其中，基本等滲的溶液滲透壓為250-400mOsm/L，生物相容性大分子物質(zhì)的分子量在20000-400000道爾頓之間，單一大分子物質(zhì)的重量體積百分比濃度為2-10%。5.如權(quán)利要求4所述的紅細(xì)胞冰凍洗滌液，其特征在于，所述基本等滲的溶液為乳酸鈉緩沖溶液，配方為乳酸鈉重量體積百分比濃度為3%、磷酸二氫鈉重量體積百分比濃度為0.2%，余量為水。6.如權(quán)利要求4所述的紅細(xì)胞冰凍洗滌液，其特征在于，所述生物相容性大分子物質(zhì)選自聚乙烯基吡咯垸酮、羥乙基淀粉、聚乙二醇或右旋糖苷中的一種或多種。7.—種快速紅細(xì)胞凍存方法，步驟為首先將新鮮紅細(xì)胞壓積，然后與權(quán)利要求1_3中任一權(quán)利要求所述的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液混勻，壓積紅細(xì)胞與紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液體積比不超過1:3，移入一20。C或以下的環(huán)境中保存。8.如權(quán)利要求7所述的快速紅細(xì)胞凍存方法，其特征在于，所述壓積紅細(xì)胞與紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液以1:3體積比混勻。9.一種快速紅細(xì)胞解凍方法，步驟為從冰箱中取出經(jīng)權(quán)利要求7或8所述的方法冰凍保存的紅細(xì)胞，加入權(quán)利要求4_6中任一權(quán)利要求所述紅細(xì)胞洗滌液，待冰凍紅細(xì)胞完全融化后，輕搖混勻，離心去除上清液，再加入相對(duì)壓積紅細(xì)胞5倍或5倍以上體積的上述洗滌液，充分混勻，離心去除上清液，將紅細(xì)胞直接配制成紅細(xì)胞鹽水懸液。10.如權(quán)利要求9所述的快速紅細(xì)胞解凍方法，其特征在于，首次加入的紅細(xì)胞洗滌液與冰凍紅細(xì)胞等體積，第二次加入的紅細(xì)胞洗滌液體積是壓積紅細(xì)胞的5倍或以上，冰凍紅細(xì)胞融化的溫度為2(TC—37。C。全文摘要本發(fā)明涉及一種紅細(xì)胞在低溫冰箱中長期保存的技術(shù)。本發(fā)明所述的紅細(xì)胞冰凍保護(hù)液是一種高滲透壓的，含有生物相容性大分子物質(zhì)以及DMSO(二甲基亞砜)的溶液；洗滌液是由基本等滲的溶液和具有生物相容性的大分子物質(zhì)組成。本發(fā)明提供的凍存液，可以使紅細(xì)胞進(jìn)入高滲狀態(tài)而不致嚴(yán)重溶血。利用大分子膠體介質(zhì)，配置成紅細(xì)胞洗滌液，可以使紅細(xì)胞脫離高滲而不致嚴(yán)重溶血狀態(tài)。然后通過生理鹽水洗滌去除大分子物質(zhì)，即可以得到紅細(xì)胞鹽水懸液。用于相關(guān)試驗(yàn)，整個(gè)凍存過程大約1分鐘，而解凍洗滌過程大約15分鐘。紅細(xì)胞的得率高。文檔編號(hào)A61M1/02GK101333514SQ200710043239公開日2008年12月31日申請(qǐng)日期2007年6月29日優(yōu)先權(quán)日2007年6月29日發(fā)明者東向,范亮峰申請(qǐng)人:上海市血液中心