專利名稱：：柴胡總多糖在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬中藥領域，涉及中藥柴胡總多糖新的藥用用途。具體涉及柴胡總多糖在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途。
背景技術：
：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus,SLE)是一種病因不甚明確的炎性結締組織病，主要發(fā)病在女性，也可累及兒童。一項多國多中心研究表明，目前系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病率為12.5/10萬39/10萬。SLE通常被視為代表性的自身免疫病，是一種難治的、反復發(fā)作、致死率高的嚴重自身免疫病。SLE自身免疫異常的表型具有高度多樣性，幾乎涉及整個免疫系統(tǒng)，包括免疫耐受缺損、淋巴細胞凋亡障礙、T或B細胞功能調節(jié)障礙、NK細胞功能缺損、補體缺陷、自身抗原抗體形成的免疫復合物清除障礙、細胞因子分泌調節(jié)障礙等。除皮膚、粘膜外，常累及腎臟、心臟、肝臟、肺以及神經系統(tǒng)等內臟器官，常伴有發(fā)熱、乏力、關節(jié)痛等全身癥狀，并在血液中存在多種抗自身抗體，是一種累及多系統(tǒng)、臨床表現(xiàn)復雜、病程遷延反復的自身免疫性疾病。補體系統(tǒng)在自身免疫性疾病的預防及疾病損傷中,起著所謂"雙刃劍〃的作用。一方面,補體系統(tǒng)功能的正常，可以有效地促進循環(huán)免疫復合物的運送及清除:另一方面，補體系統(tǒng)功能的缺陷,包括組分的缺失或功能的失常,又會參與對組織的損傷。SLE活動期患者體內B淋巴細胞活性增強，產生大量抗自身尤其是抗ds-DNA抗體，與自身抗原在體內形成大量免疫復合物，活化補體，消耗大量補體C3和C4成分，使C3，C4降低。而非活動期SLE患者B淋巴細胞活性基本正常，體內自身抗體水平也基本正常，補體消耗減少，使補體正常或輕度偏高。因此，血清中高Ig，低補體C3，C4是SLE活動性的重要指標。補體活化造成的III型變態(tài)反應的直接作用和對免疫細胞功能的影響可加重SLE的病理損害，影響SLE病程的發(fā)展和臨床表現(xiàn)。由于SLE患者體內產生大量的循環(huán)免疫復合物沉積于組織、器官等，尤其是腎臟，?？梢鹉I小球腎炎(即狼瘡性腎炎)。一旦免疫復合物沉積于腎組織內即激活補體系統(tǒng)，引起一系列的免疫損傷反應(in型變態(tài)反應)血管內凝血因子的激活，毛細血管通透性增加，中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞的浸潤，局部組織細胞的壞死，蛋白溶解或裂解酶的大量釋放，以及一系列調節(jié)腎小球細胞增殖、基質增生的細胞因子的釋放等等，從而產生腎臟的各種病理變化。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的腎臟病變稱為狼瘡性腎炎(L叩usN印hritis，LN)。LN是SLE的重要臨床組成部分。SLE患者約35X90%有腎臟累及的臨床表現(xiàn)，如蛋白尿、紅、白細胞尿，管型尿及腎小管和小球濾過功能的變化。腎臟病理檢查發(fā)現(xiàn)90%患者在光鏡下可出現(xiàn)異常；采用免疫熒光或電鏡等復雜技術，幾乎所有SLE患者均有不同程度的腎臟累及。腎臟損害的嚴重程度與SLE的預后密切相關。多數(shù)SLE患者最終出現(xiàn)腎功能不全,嚴重影響著患者的生命(畢志剛，劉曉華.紅斑狼瘡現(xiàn)代診療.第l版[M].江蘇江蘇科學技術出版社，2000.98-100)。SLE的治療主要以對癥的長期監(jiān)控治療為主,治療藥物主要為非甾體類抗炎藥、免疫抑制劑、靜脈注射免疫球蛋白、性激素等治療藥物。盡管糖皮質激素及免疫抑制劑能控制病情，但其長期應用產生的不良反應也是患者致死原因之一。研究表明，高水平抗自身抗體和補體系統(tǒng)的過度激活所引發(fā)的免疫性組織損傷是SLE患者發(fā)病的重要機制，而且與SLE的發(fā)生與預后有顯著聯(lián)系。通過特異性抑制補體組成成分激活，降低抗ds-DNA抗體水平，有望提高治療SLE的臨床療效，減少不良反應。臨床急需高效低毒的藥物來防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡。柴胡為常用中藥，為傘形科柴胡屬(Bupleurum)多種植物的根,具有疏散退熱、舒肝、升陽的功效，主治感冒發(fā)熱、寒熱往來、瘧疾、胸肋脹痛、月經不調及子宮脫垂等癥。柴胡的化學成分相當復雜，迄今為止，己報道含有皂甙、揮發(fā)油、黃酮、甾醇、香豆素、糖類、木質素、有機酸、多炔及生物堿等?，F(xiàn)代藥理研究證明柴胡具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫調節(jié)、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等作用。文獻(張興權，陳鴻珊.中國藥理學與毒理學雜志，1989，3(1):31.)報道柴胡(5"p7e"r鵬c/7//7e/weDC)多糖能顯著增加脾系數(shù)；提高巨噬細胞和天然殺傷細胞功能；能提高病毒特異抗體滴度；能明顯增加淋巴細胞轉化率和皮膚遲發(fā)超敏反應，顯示免疫促進作用。從狹葉柴胡(^//^e"r鵬sco/^/7eri/Wi湖Willd)中分離出的黃酮和皂苷顯示良好的免疫抑制活性(WenJC,LiWC，JennHL，etal.Phytochmistry,2003,64:1375.)。從其他柴胡(及/z^e〃r:朋/a化at鵬L)中分出的柴胡多糖IIb能抑制補體系統(tǒng)經典途徑激活所致的溶血反應，顯示免疫抑制作用(YamadaH,RaKS，KiyoharaH,etal.CarbohydrRes，1989,189:209.)。但未涉及對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的作用。綜觀國內外的研究，均未見報道柴胡總多糖的防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥效及其藥物。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供中藥柴胡總多糖新的藥用用途，具體涉及柴胡總多糖在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途。本發(fā)明從中藥柴胡中分離提取得到總多糖提取物。所述總多糖提取物經體外實驗證實有較強抗補體活性，整體動物模型試驗證實其具有很強的防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡作用。本發(fā)明所述的中藥柴胡包括柴胡(v9叩7e"r腿c力i/e/weDC)，狹葉柴胡(ie"7xwscor加"eri/b7i"j77Willd)禾口小葉黑柴胡(j9〃/x/e"ir//z75TW't力i/Wolff)。本發(fā)明的目的通過下述方法實現(xiàn)1、制備柴胡總多糖柴胡藥材以95%乙醇冷浸提取，濾過，藥渣于室溫下置通風處晾干，然后用熱水提取3次，濾過，合并提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液用水透析3天，透析液濃縮至小體積后加乙醇至含醇量80%，離心，沉淀冷凍干燥即得總多糖提取物，收率達3%以上，多糖含量超過65%。2、柴胡總多糖用于防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣綜合征試驗按常規(guī)方法，選用昆明種和BALB/c小鼠，以空腸彎曲菌滅活菌株免疫，建立系統(tǒng)性紅斑狼瘡綜合征模型。柴胡總多糖灌胃給藥。將試驗小鼠在實驗結束處理后，觀察動物的血清中抗體水平及尿蛋白水平。取腎，石蠟固定，切片，顯微鏡下觀察病理改變，取脾和胸腺測定器官指數(shù)。結果證實，柴胡總多糖對小鼠狼瘡樣綜合征引起的腎損傷有明顯的保護作用。整體試驗證實柴胡總多糖對小鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡有防治作用。圖1是SLE模型小鼠(昆明種)尿蛋白水平。圖2是SLE模型小鼠(昆明種)抗ds-DNA抗體水平。圖3是空白對照組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖4是模型對照組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖5是SLE模型組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖6是柴胡多糖給藥組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖7是陽性對照(潑尼松)組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖8是SLE模型小鼠(BALB/c)尿蛋白水平。圖9是SLE模型小鼠(BALB/c)抗ds-DNA抗體水平。圖10是SLE模型小鼠(BALB/c)抗組蛋白抗體水平。圖ll是空白對照組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖12是模型對照組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖13是SLE模型組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖14是柴胡多糖(30mg/kg)組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖15是柴胡多糖(15mg/kg)組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖16是陽性對照(潑尼松)組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。具體實施方式實施例1取柴胡藥材100g，以95%乙醇冷浸提取，藥渣于室溫下置通風處晾干，然后用熱水提取3次，濾過，合并提取液，濃縮，離心，上清液以S三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液用水透析3天，透析液濃縮至小體積加乙醇至含醇量80%，離心，沉淀冷凍干燥即得總多糖，產物收率達3%以上，多糖含量超過65%。所述的柴胡藥材可選自柴胡(5"/7eyr咖c/yy7朋seDC)，狹葉柴胡(5"/7e"r鵬sco/^o/ejy'/b7i鵬Willd)或小葉黑柴胡(5";7e〃r柳57wY/j7Wolff)。表1是柴胡總多糖收率及含量。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2昆明種小鼠30只(16—20g)，隨機分為5組(A、B、C、D、E組)。A組為正常對照組，B組為模型對照組，C組為SLE模型組，D組為柴胡多糖組，E組為醋酸潑尼松組。初次免疫，A組為正常對照組，尾根部皮下注射生理鹽水，B組為模型對照組，尾根部皮下注射弗氏完全佐劑，其余各組以空腸彎曲菌配合弗氏完全佐劑尾根部皮下注射，免疫誘導SLE樣綜合征，每只小鼠注射量為50Ul。初次免疫后第14天加強免疫l次A組和B組皮下注射生理鹽水，其余各組皮下注射空腸彎曲菌菌懸液，每只小鼠注射量為0.2ml。小鼠在免疫當天開始灌胃給藥，每天一次至第32天。D組柴胡多糖給藥劑量為30mg/kg，E組醋酸潑尼松組給藥劑量為5mg/kg，B組和C組均給予配藥用空白賦形劑(5%羧甲基纖維素鈉，CMC),A組不灌胃。小鼠于免疫后d32，摘眼球放血處死，取血測定血清抗自身抗體水平，檢測免疫功能。取腎，石蠟固定，切片，顯微鏡下觀察病理改變。病理損傷評級，按損傷的嚴重程度分為輕、中、重度，分別給l、2、3分，無病理損傷給O分。結果顯示，與正常對照組和模型對照組相比，SLE模型鼠的尿蛋白明顯升高，柴胡多糖對SLE樣綜合征小鼠尿蛋白有明顯的降低作用(附圖1)。與正常對照組和模型對照組相比，SLE模型鼠的抗ds-DNA抗體水平明顯升高，柴胡多糖對SLE樣綜合征小鼠抗ds-DNA抗體水平有明顯的降低作用(附圖2)。腎病理檢測顯示，正常組小鼠腎臟正常，模型對照小鼠基本正常。模型組小鼠腎臟均有炎性細胞侵潤、腎小球增大和腎小球囊腔縮小。柴胡多糖給藥組僅有一只小鼠腎臟有腎小球部分增大，腎小球囊腔縮小，無炎性細胞侵潤。陽性對照藥強地松僅有一只小鼠的腎小球部分增大、囊腔縮小，伴炎性細胞侵潤。結果表明，柴胡總多糖在體內抑制ds-DNA抗體水平，降低尿蛋白水平，明顯改善腎小球的增大，抑制炎性細胞侵潤，有緩解SLE樣小鼠腎損傷作用。表2是昆明種小鼠腎病理損傷評級(X土SD)(n=25)。表2組別數(shù)量腎小球炎性細胞浸潤腎小球囊腔縮小正常60±0氺氺0±0**模型對照60.2±0.4林0.2±0.4林SLE模型60.8±0.41±0柴胡多糖(30mg/kg)60±0**0.2±0.4**潑尼松(5mg/kg)_^_Q.2士0.4林_0.2±0.4**其中，求與SLE模型組比較P〈0.05;林與SLE模型組比較P〈0.01。實施例3BALB/c小鼠48只(16—20g)，隨機分為5組(A、B、C、D、E、F組)。A組為正常對照組(n=8)，B組為模型對照組(n=8)，C組為SLE模型組(n=10)，D組為柴胡多糖30mg/kg組(n=8)，E組為柴胡多糖15mg/kg組(n=8)，F(xiàn)組為醋酸潑尼松組(n=8)。初次免疫，A組為正常對照組，足跖部皮下注射生理鹽水，B組為模型對照組，足跖部皮下注射弗氏完全佐劑，其余各組以空腸彎曲菌配合弗氏完全佐劑足跖部皮下注射，免疫誘導SLE樣綜合征，每只小鼠注射量為50"1。初次免疫后第14天加強免疫1次A組和B組尾靜脈注射生理鹽水，其余各組注射空腸彎曲菌菌懸液，每只小鼠注射量為0.2ml。在免疫當天開始給小鼠灌胃給藥，每天一次至第34天。D組柴胡多糖給藥劑量為30mg/kg，E組柴胡多糖給藥劑量為15mg/kg，F(xiàn)組醋酸潑尼松組給藥劑量為5mg/kg，B組和C組均給予配藥用空白賦形劑(5%羧甲基纖維素鈉，CMC)，A組不灌胃。免疫后第35天，取BALB/c小鼠血測定血清抗自身抗體水平。取小鼠胸腺、脾稱重，求器官指數(shù)。器官指數(shù)=臟器重(mg)/10g體重。取雙側腎，石蠟固定，切片，顯微鏡下觀察病理改變。病理損傷評級，按損傷的嚴重程度分為輕、中、重度，分別給l、2、3分，無病理損傷給O分。結果顯示，與正常對照組和模型對照組相比，SLE模型鼠的尿蛋白明顯升高，柴胡多糖30mg/kg對SLE樣綜合征小鼠的尿蛋白有明顯的降低作用，柴胡多糖15tng/kg對SLE樣綜合征小鼠的尿蛋白也有一定的降低作用(附圖8)。與正常對照組和模型對照組相比，SLE模型鼠的抗ds-DNA抗體和抗組蛋白抗體水平明顯升高，柴胡總多糖30mg/kg對SLE樣綜合征小鼠升高的抗ds-DNA抗體和抗組蛋白抗體水平有明顯的降低作用；柴胡總多糖15rag/kg對SLE樣綜合征小鼠的高抗ds-DNA抗體水平有一定的降低作用，但是與模型組相比沒有顯著性差異，但柴胡總多糖15rag/kg對SLE樣綜合征小鼠的高抗組蛋白抗體水平有明顯的降低作用(附圖9，10)。與正常小鼠和模型對照組相比，免疫使模型組小鼠的脾指數(shù)升高。與模型組相比，柴胡總多糖30mg/kg和陽性對照藥潑尼松均顯著性抑制小鼠免疫后脾指數(shù)升高，但潑尼松對脾指數(shù)有過度抑制作用，脾指數(shù)低于正常小鼠(p<0.001)，柴胡總多糖15mg/kg對小鼠脾指數(shù)無影響。與正常小鼠和模型對照組相比，免疫使模型組小鼠的胸腺指數(shù)升高。與模型組相比，陽性對照藥潑尼松能顯著性降低胸腺指數(shù)，柴胡總多糖30mg/kg和柴胡總多糖15mg/kg對胸腺指數(shù)無影響。表3是BALB/c小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)(X土SD)(n=49)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其中，承與SLE模型組比較P〈0.05;種與SLE模型組比較P〈0.01，林承與SLE模型組比較P〈0.001。腎病理檢測顯示，正常組小鼠腎臟正常，模型對照小鼠基本正常。模型組小鼠腎臟腎小球腫脹、腎小球囊腔縮小、腎小球細胞數(shù)的增多；與模型組小鼠相比，正常組小鼠腎小管正常，模型對照小鼠腎小管基本正常，模型組小鼠腎小管腫脹。柴胡總多糖30mg/kg對SLE樣模型小鼠的腎臟病變有明顯的改善作用，柴胡總多糖15mg/kg對SLE樣模型小鼠的腎臟病變有一定的改善作用(附圖ll,12，13，14,15)。表4是BALB/c小鼠腎病理損傷評級(X土SD)(n=49)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，*與SLE模型組比較P〈0.05;林與SLE模型組比較P〈0.01。結果證實，柴胡總多糖在體內能抑制SLE樣綜合征小鼠的抗自身抗體水平的升高(抗ds-DNA抗體和抗組蛋白抗體)，改善小鼠的體液免疫應答亢進,抑制脾腫大；柴胡總多糖在體內能降低SLE樣綜合征小鼠的尿蛋白水平，明顯改善腎小球和腎小管的病變，有緩解SLE樣小鼠的腎損傷作用，可制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物和防治自身免疫性疾病等藥物。權利要求1、柴胡總多糖在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明屬中藥領域，具體涉及柴胡總多糖在制備防治系統(tǒng)性藥物中的用途。本發(fā)明從中藥柴胡中分離提取得到總多糖提取物，平均產物收率3.32％，多糖含量超過65％。所述總多糖經整體動物模型試驗，結果顯示，對系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣綜合征小鼠的自身免疫反應亢進和腎損傷有明顯的保護作用，證實對系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣綜合征有防治作用。可制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物和防治自身免疫性疾病等藥物。文檔編號A61P37/08GK101095708SQ20071004345公開日2008年1月2日申請日期2007年7月5日優(yōu)先權日2007年7月5日發(fā)明者弘力,晗徐,錚王,章蘊毅,陳道峰申請人:復旦大學