專利名稱：一種雷公藤多苷提取物及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物提取物及其提取方法，具體的涉及一種雷公藤多苷提取物及其提取方法。
背景技術(shù)：
雷公藤屬在我國主要分布于長江流域以南山區(qū)和東北長白山區(qū)，民間廣泛流傳用作為治療關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、皮膚病等的草藥，也用于農(nóng)藥。在臨床上國內(nèi)對雷公藤的研究取得了顯著的成效和突破，從治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎已發(fā)展到治療紅斑狼瘡、銀屑病、腎炎和腫瘤研究等多種常見病和疑難雜癥，由于其應(yīng)用面廣、療效顯著，且對疑難頑癥具有獨(dú)特治療作用而逐漸成為國內(nèi)外、中醫(yī)、西醫(yī)、中西醫(yī)各專家矚目和研究的熱點(diǎn)。
中醫(yī)學(xué)中，雷公藤的傳統(tǒng)提取方法采用水煎濃縮。此方法投料量有限，溫度要求高，操作有較高要求，產(chǎn)量低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)?，F(xiàn)有的應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的雷公藤提取物的提取方法主要有下述幾種1.提取法將雷公藤藥材用水煎煮提取。該方法污染，水用量大，能耗大。
2.乙醇提取法將雷公藤用乙醇提取，之后用氯仿萃取并濃縮至干。生產(chǎn)效率極低，乙醇投料大且損耗大，不易于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
3.乙酸乙酯提取法將雷公藤用乙醇提取，之后用乙酸乙酯萃取，再用氯仿萃取并濃縮至干。
上述3種方法提取的產(chǎn)品質(zhì)量不好，其中藥效成分雷公藤甲素等萜類化合物的提取率低。
4.柱層析法該方法產(chǎn)品純度較高，但投料量小，大規(guī)模生產(chǎn)操作要求高，不易于大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。
自二十世紀(jì)80年代初期發(fā)現(xiàn)雷公藤療效后，許多藥廠紛紛生產(chǎn)雷公藤提取物產(chǎn)品。但是，由于目前對雷公藤制劑的藥理研究很少，缺乏正規(guī)的藥理資料，且對于藥效成分無統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，各廠家生產(chǎn)的雷公藤制劑所含組分和藥效成分含量不盡相同，因此，市面上的雷公藤制劑的藥理效果和毒副作用有很大的差異。其中，很多產(chǎn)品藥理效果不好，且毒副作用大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的提取方法提取的雷公藤多苷中藥效成分含量不高，產(chǎn)品質(zhì)量不好，或者工藝不易于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等問題，而提供一種產(chǎn)品藥效成份高，藥理效果好，且操作簡便，成本低，生產(chǎn)周期短，對環(huán)境污染少，易應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)的雷公藤多苷提取方法，以及其雷公藤多苷產(chǎn)品。
本發(fā)明的方法采用水提并醇提，吸附與柱層析并行的提純工藝，具體包括如下步驟(1)提取粗品將雷公藤粉末用水煮提取，再用醇或醇的水溶液提取，將提取液合并，濃縮至醇含量小于或等于體積百分比20％，之后用有機(jī)溶劑萃取，制得含粗品的萃取液，濃縮至干得粗品。本發(fā)明的方法在粗提部分選擇水煮和醇的水溶液分別提取，將有效成分更多的提取保存了出來，并減少了用水量。
其中，雷公藤可選用葉、花、根、莖各部，較佳的選用木質(zhì)部，經(jīng)精選研碎后制得粉末。
其中，所述的水煮提取的次數(shù)較佳的為1～3次；水的用量較佳的為雷公藤粉末重量的3～10倍；水煮的溫度較佳的為50～100℃；水煮的時間較佳的為30～60分。
其中，所述的醇或醇的水溶液提取的次數(shù)較佳的為1～3次；所述的醇可選自低級醇，較佳的為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇；醇的水溶液中醇的濃度較佳的為體積百分比40％以上；醇或醇的水溶液的用量較佳的為雷公藤粉末重量的6～10倍；醇的水溶液提取的溫度較佳的為20～50℃；醇的水溶液提取的時間較佳的為8～24小時。
其中，所述的萃取的次數(shù)為較佳的為1～3次；使用的有機(jī)溶劑較佳的選自石油醚、低級鹵代烷烴、環(huán)烷烴、烷烴、低級脂肪酮或酯；有機(jī)溶劑的用量為較佳的為提取液濃縮后體積的1～3倍；每次萃取的時間較佳的為30～60分鐘。
雷公藤多苷粗品為疏松紅棕色粉末，收率約為5～18wt‰。采用不同有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取所得的粗品的收率如表1所示。
表1采用不同有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取所得的粗品收率

(2)粗品精制用有機(jī)溶劑溶解粗品，加入吸附劑進(jìn)行吸附，過濾，將濾餅用梯度有機(jī)溶劑的溶液進(jìn)行洗脫，收集有效部分的洗脫液，濃縮，再進(jìn)行柱層析，用梯度有機(jī)溶劑的溶液進(jìn)行洗脫，收集含有效成分的洗脫液，濃縮至干，即得精制雷公藤多苷。本發(fā)明方法中的吸附過程能夠有效提高產(chǎn)品純度，操作簡單，便于大規(guī)模工業(yè)化操作，能夠有效節(jié)省勞動力成本，縮短生產(chǎn)周期，節(jié)約時間成本；梯度洗脫提高了柱層析的分離效果，成品質(zhì)量有效提高。
其中，溶解雷公藤多苷粗品所用的用有機(jī)溶劑較佳的為石油醚、鹵代烷烴、環(huán)烷烴、烷烴、低級脂肪酮或酯。
其中，所述的吸附劑較佳的為硅膠、中性氧化鋁、纖維素或硅藻土；吸附劑的用量較佳的為粗品質(zhì)量的10～20倍。；吸附的時間為較佳的為30～60分。
吸附后過濾，將濾餅用梯度有機(jī)溶劑的溶液進(jìn)行洗脫，收集有效部分的洗脫液。其中，所述的有機(jī)溶劑較佳的選自石油醚、鹵代烷烴、環(huán)烷烴、烷烴、低級脂肪酮或酯，所述的梯度有機(jī)溶劑的溶液較佳的為梯度在體積百分比1～20％間的鹵代烷烴或烷烴的醇溶液，或梯度在體積百分比1～20％的環(huán)烷烴的丙酮溶液，或能夠達(dá)到同樣展開效果的其它梯度有機(jī)溶劑；所述的鹵代烷烴較佳的為二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿或四氯化碳；所述的環(huán)烷烴較佳的為環(huán)己烷或環(huán)戊烷；所述的烷烴較佳的為己烷或戊烷；所述的低級脂肪酮較佳的為丙酮或甲乙酮；所述的酯較佳的為乙酸乙酯。較佳的梯度洗脫的有機(jī)溶劑的溶液及其用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3～4毫升；3％的梯度，用量為1.5～2毫升；5％的梯度，用量為2～3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為3～5毫升；15％的梯度，用量為4～6毫升；百分比為體積百分比。
其中，所述的有效部分的洗脫液以采用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標(biāo)準(zhǔn)品對照進(jìn)行確認(rèn)。將洗脫液濃縮后，制得干浸膏，可再加入有機(jī)溶劑，按上述方法進(jìn)行二次吸附洗脫。吸附洗脫后進(jìn)行濃縮，最好濃縮至干，再加入有機(jī)溶劑溶解，進(jìn)行后續(xù)的柱層析。
柱層析的方法按常規(guī)操作進(jìn)行，使用梯度有機(jī)溶劑的溶液進(jìn)行洗脫，收集含有效成分的洗脫液。其中，每個梯度的有機(jī)溶劑的溶液的用量和時間，梯度有機(jī)溶劑的溶液的種類和配比，較佳的梯度洗脫的有機(jī)溶劑的溶液及其用量同前述。洗脫后的有效部分的洗脫液的確認(rèn)同前述。
將柱層析后的洗脫液濃縮至干，即制得精制雷公藤多苷產(chǎn)品。采用不同有機(jī)溶劑進(jìn)行梯度洗脫所得的精制雷公藤多苷產(chǎn)品的收率如表2所示。
表2采用不同有機(jī)溶劑進(jìn)行梯度洗脫所得的精制雷公藤多苷產(chǎn)品的收率

本發(fā)明的方法中，所用的醇和其他有機(jī)溶劑可全部回收循環(huán)使用，從而減少了成本，對環(huán)境友好。
本發(fā)明還涉及由上述方法制得的雷公藤多苷提取物，以及含有該雷公藤多苷提取物的藥物組合物。該藥物組合物包含治療有效量的本發(fā)明的雷公藤多苷和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明中，所述的藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，如稀釋劑，賦形劑(如水等)，粘合劑(如纖維素衍生物、明膠、聚乙烯吡咯烷酮等)，填充劑(如淀粉等)，崩裂劑(如碳酸鈣、碳酸氫鈉)。另外，還可以在組合物中加入其他輔助劑，如香味劑和甜味劑等。
本發(fā)明的藥物組合物，可以通過靜脈注射、皮下注射或口服的形式施加于需要治療的患者。用于口服時，可將其制備成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑或膠囊等；用于注射時，可將其制備成注射液。本發(fā)明的藥物組合物的各種劑型可以采用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行制備。其中雷公藤內(nèi)酯甲的含量可為不少于重量百分比0.01％。上述藥物組合物施加于需要治療的患者的一般劑量可為1～1.5mg雷公藤多苷成分/公斤體重/天，具體可根據(jù)患者的年齡和病情等變化。
本發(fā)明所用試劑及原料均市售可得。
本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明的方法采用水提并醇提，吸附與柱層析并行的提純工藝，制得的雷公藤多苷藥效成分含量高，且操作簡便，成本低，生產(chǎn)周期短，所用有機(jī)試劑可全部回收循環(huán)使用，對環(huán)境友好，易應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價值。由本發(fā)明的方法制得的雷公藤多苷藥效成分含量高，且含量比例適度，藥理效果好，毒副作用小。


圖1為效果實(shí)施例中雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2為效果實(shí)施例中雷公藤內(nèi)酯甲標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。
實(shí)施例1雷公藤木質(zhì)部經(jīng)揀選、處理為小塊，由粉碎機(jī)粉碎為粉末。稱取150Kg粉末，置于多用提取鍋中，用5倍重量的水?dāng)嚢杈鶆?，在提取鍋中直接通蒸汽加熱?0℃-100℃，蒸煮1h，待冷卻至常溫，收集濾液。再加6倍重量的乙醇，浸泡8h，溫度30℃，放出乙醇提取液，以同樣的方法再次加入乙醇，浸泡一次，合并提取液。
提取液抽至蒸餾鍋，首先打開冷凝器和冷卻器的進(jìn)水閥門，再慢慢將反應(yīng)鍋夾道的冷卻水放出，控制好蒸汽的流量和鍋內(nèi)溫度70-100℃左右，直至藥液中含乙醇濃度小于體積百分比20％為止。
加入與濃縮液等體積的氯仿回流提取三次，每次提取60min后，使氯仿萃取液和原乙醇提取液分出上下兩層，放出氯仿萃取液，將三次萃取液合并，脫水過濾，常壓蒸餾回收氯仿?？刂坪缅亙?nèi)溫度和壓力，減壓抽真空，真空度-0.07MPa以下，濃縮得疏松紅棕色粉末即為雷公藤多苷粗品提取物。
將上步的雷公藤多苷粗粉用氯仿，先溶解成溶液，然后緩緩加入混有氯仿的硅膠(100-200目)中，硅膠的用量為粗品質(zhì)量的15倍，攪拌進(jìn)行吸附1h，過濾抽干，濾液為無效成份。
濾餅以1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的氯仿乙醇溶液梯度洗脫，溶液用量以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3.5毫升；3％的梯度，用量為1.8毫升；5％的梯度，用量為2.5毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4毫升；15％的梯度，用量為5毫升。采用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標(biāo)準(zhǔn)品對照確認(rèn)有效洗脫梯度。過濾抽干，將有效濾液濃縮，回收氯仿，濃縮后得干浸膏。將干浸膏再加入氯仿稀釋成溶液，重復(fù)進(jìn)行二次吸附洗脫，減壓抽真空濃縮后得干浸膏，待柱層析備用。
在直徑9cm左右層析柱中，先裝入氯仿少許，然后推入藥棉(做成球狀)置于柱底部鋪平。濕法裝硅膠，排盡柱內(nèi)氣泡，靜置24h以上壓實(shí)，開活塞放出硅膠劑上面多余的氯仿，粒體開始收縮，自然壓緊柱體。
將柱中加入干浸膏的稀釋液，分別加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的氯仿乙醇液進(jìn)行梯度洗脫，溶液用量以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3.5毫升；3％的梯度，用量為1.8毫升；5％的梯度，用量為2.5毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4毫升；15％的梯度，用量為5毫升。用分瓶收集洗脫液。將收集的小瓶洗脫液分別點(diǎn)樣于硅膠G板上進(jìn)行薄層層析后，用紫外分析儀相應(yīng)波長下鑒別洗脫液是否含有效成分，收取有效瓶樣，將有效瓶樣的洗脫液濃縮抽干得有效成份。將分取的有效成份經(jīng)干燥、化驗(yàn)、配比，混合過100目篩，包裝，即為成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量為0.15wt％，雷公藤內(nèi)酯甲的含量為0.32wt％。將所用所有有機(jī)試劑回收循環(huán)使用。
雷公藤多苷粉的檢驗(yàn)方法，采用薄層層析法，與標(biāo)準(zhǔn)品對照一致，成份相同。多苷粉采用LD50急性毒性試驗(yàn)LD50＝155±15mg/Kg，理化性質(zhì)雷公藤多苷為黃色或棕黃色粉末，味苦，熔點(diǎn)100～120℃。雷公藤多苷按江蘇省衛(wèi)生廳蘇衛(wèi)藥萍字[84]第76號文執(zhí)行。
實(shí)施例2雷公藤木質(zhì)部經(jīng)揀選、處理為小塊，由粉碎機(jī)粉碎為粉末。稱取150Kg粉末，置于多用提取鍋中，用3倍重量的水?dāng)嚢杈鶆?，在提取鍋中直接通蒸汽加熱?0℃-60℃，蒸煮40分，待冷卻至常溫，收集濾液。重復(fù)用水提取2次。再加10倍重量的體積百分比90％甲醇水溶液(體積百分比)，浸泡24h，溫度20℃，放出甲醇提取液。合并提取液。
提取液抽至蒸餾鍋，首先打開冷凝器和冷卻器的進(jìn)水閥門，再慢慢將反應(yīng)鍋夾道的冷卻水放出，控制好蒸汽的流量和鍋內(nèi)溫度70-100℃左右，直至藥液中含甲醇濃度小于體積百分比10％為止。
加入3倍濃縮液體積的石油醚回流提取一次，提取40min后，使石油醚萃取液和原提取液分出上下兩層，放出石油醚萃取液，脫水過濾，常壓蒸餾回收石油醚?？刂坪缅亙?nèi)溫度和壓力，減壓抽真空，真空度-0.07MPa以下，濃縮得疏松紅棕色粉末即為雷公藤多苷粗品提取物。
將上步的雷公藤多苷粗粉用石油醚先溶解成溶液，然后緩緩加入混有石油醚的中性氧化鋁(100-200目)中，中性氧化鋁的用量為粗品質(zhì)量的10倍，攪拌進(jìn)行吸附1h，過濾抽干，濾液為無效成份。
濾餅用％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的石油醚乙醇溶液梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3毫升；3％的梯度，用量為1.5毫升；5％的梯度，用量為2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為3毫升；15％的梯度，用量為4毫升。采用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標(biāo)準(zhǔn)品對照確認(rèn)有效洗脫梯度。過濾抽干，將有效濾液濃縮，回收石油醚，濃縮后得干浸膏，待柱層析備用。
在直徑10cm左右層析柱中，先裝入石油醚少許，然后推入藥棉(做成球狀)置于柱底部鋪平。濕法裝硅膠，排盡柱內(nèi)氣泡，靜置24h以上壓實(shí)，開活塞放出硅膠劑上面多余的石油醚，粒體開始收縮，自然壓緊柱體。
將柱中加入干浸膏的稀釋液，分別加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的石油醚乙醇液進(jìn)行梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3毫升；3％的梯度，用量為1.5毫升；5％的梯度，用量為2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為3毫升；15％的梯度，用量為4毫升。用分瓶收集洗脫液。將收集的小瓶洗脫液分別點(diǎn)樣于硅膠G板上進(jìn)行薄層層析后，用紫外分析儀相應(yīng)波長下鑒別洗脫液是否含有效成分，收取有效瓶樣，將有效瓶樣的洗脫液濃縮抽干得有效成份。將分取的有效成份經(jīng)干燥、化驗(yàn)、配比，混合過100目篩，包裝，即為成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量為0.12wt％，雷公藤內(nèi)酯甲的含量為0.30wt％。將所用所有有機(jī)試劑回收循環(huán)使用。
實(shí)施例3雷公藤木質(zhì)部經(jīng)揀選、處理為小塊，由粉碎機(jī)粉碎為粉末。稱取150Kg粉末，置于多用提取鍋中，用10倍重量的水?dāng)嚢杈鶆?，在提取鍋中直接通蒸汽加熱?5℃-100℃，蒸煮30分，待冷卻至常溫，收集濾液。重復(fù)用水提取1次。再加6倍重量的體積百分比40％異丙醇水溶液(體積百分比)，浸泡15h，溫度50℃，放出異丙醇提取液，重復(fù)再提取兩次，合并提取液。
提取液抽至蒸餾鍋，首先打開冷凝器和冷卻器的進(jìn)水閥門，再慢慢將反應(yīng)鍋夾道的冷卻水放出，控制好蒸汽的流量和鍋內(nèi)溫度70-100℃左右，直至藥液中含異丙醇濃度小于體積百分比5％為止。
加入2倍濃縮液體積的環(huán)己烷回流提取兩次，每次提取50min后，使環(huán)己烷萃取液和原提取液分出上下兩層，放出環(huán)己烷萃取液，將三次萃取液合并，脫水過濾，常壓蒸餾回收環(huán)己烷?？刂坪缅亙?nèi)溫度和壓力，減壓抽真空，真空度-0.07MPa以下，濃縮得疏松紅棕色粉末即為雷公藤多苷粗品提取物。
將上步的雷公藤多苷粗粉用環(huán)己烷，先溶解成溶液，然后緩緩加入混有環(huán)己烷的纖維素(100-200目)中，纖維素的用量為粗品質(zhì)量的18倍，攪拌進(jìn)行吸附50分，過濾抽干，濾液為無效成份。
濾餅1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的環(huán)己烷丙酮溶液梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為4毫升；3％的梯度，用量為2毫升；5％的梯度，用量為3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為5毫升；15％的梯度，用量為6毫升。采用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標(biāo)準(zhǔn)品對照確認(rèn)有效洗脫梯度。過濾抽干，將有效濾液濃縮，回收環(huán)己烷，濃縮后得干浸膏，再進(jìn)行二次吸附洗脫，濃縮后的干浸膏，待柱層析備用。
在直徑12cm左右層析柱中，先裝入環(huán)己烷少許，然后推入藥棉(做成球狀)置于柱底部鋪平。濕法裝硅膠，排盡柱內(nèi)氣泡，靜置24h以上壓實(shí)，開活塞放出硅膠劑上面多余的環(huán)己烷，粒體開始收縮，自然壓緊柱體。
將柱中加入干浸膏的稀釋液，分別加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的環(huán)己烷丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為4毫升；3％的梯度，用量為2毫升；5％的梯度，用量為3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為5毫升；15％的梯度，用量為6毫升。用分瓶收集洗脫液。將收集的小瓶洗脫液分別點(diǎn)樣于硅膠G板上進(jìn)行薄層層析后，用紫外分析儀相應(yīng)波長下鑒別洗脫液是否含有效成分，收取有效瓶樣，將有效瓶樣的洗脫液濃縮抽干得有效成份。將分取的有效成份經(jīng)干燥、化驗(yàn)、配比，混合過100目篩，包裝，即為成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量為0.10wt％，雷公藤內(nèi)酯甲的含量為0.25wt％。將所用所有有機(jī)試劑回收循環(huán)使用。
實(shí)施例4雷公藤木質(zhì)部經(jīng)揀選、處理為小塊，由粉碎機(jī)粉碎為粉末。稱取150Kg粉末，置于多用提取鍋中，用8倍重量的水?dāng)嚢杈鶆颍谔崛″佒兄苯油ㄕ羝訜嶂?0℃-80℃，蒸煮50分，待冷卻至常溫，收集濾液。再加8倍的體積百分比60％正丁醇水溶液，浸泡20h，溫度25℃，放出正丁醇提取液，以同樣的方法再次加入體積百分比60％正丁醇水溶液，浸泡一次，合并提取液。
提取液抽至蒸餾鍋，首先打開冷凝器和冷卻器的進(jìn)水閥門，再慢慢將反應(yīng)鍋夾道的冷卻水放出，控制好蒸汽的流量和鍋內(nèi)溫度70-100℃左右，直至藥液中含正丁醇濃度小于體積百分比10％為止。
加入同濃縮液等體積的己烷回流提取三次，每次提取30min后，使己烷萃取液和原提取液分出上下兩層，放出己烷萃取液，將三次萃取液合并，脫水過濾，常壓蒸餾回收己烷?？刂坪缅亙?nèi)溫度和壓力，減壓抽真空，真空度-0.07MPa以下，濃縮得疏松紅棕色粉末即為雷公藤多苷粗品提取物。
將上步的雷公藤多苷粗粉用己烷，先溶解成溶液，然后緩緩加入混有己烷的硅藻土(100-200目)中，硅藻土的用量為粗品質(zhì)量的18倍，攪拌進(jìn)行吸附30分，過濾抽干，濾液為無效成份。
濾餅1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的己烷的甲醇溶液梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3.5毫升；3％的梯度，用量為1.6毫升；5％的梯度，用量為2.8毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4.5毫升；15％的梯度，用量為5.5毫升。采用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標(biāo)準(zhǔn)品對照確認(rèn)有效洗脫梯度。過濾抽干，將有效濾液濃縮，回收己烷，濃縮后得干浸膏，再進(jìn)行二次吸附洗脫，濃縮至干，待柱層析備用。
在直徑8cm左右層析柱中，先裝入己烷少許，然后推入藥棉(做成球狀)置于柱底部鋪平。濕法裝硅膠，排盡柱內(nèi)氣泡，靜置24h以上壓實(shí)，開活塞放出硅膠劑上面多余的己烷，粒體開始收縮，自然壓緊柱體。
用少量己烷溶解洗脫后濃縮的干粉，加入柱中，分別加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的己烷的甲醇溶液液進(jìn)行梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3.5毫升；3％的梯度，用量為1.6毫升；5％的梯度，用量為2.8毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4.5毫升；15％的梯度，用量為5.5毫升。用分瓶收集洗脫液。將收集的小瓶洗脫液分別點(diǎn)樣于硅膠G板上進(jìn)行薄層層析后，用紫外分析儀相應(yīng)波長下鑒別洗脫液是否含有效成分，收取有效瓶樣，將有效瓶樣的洗脫液濃縮抽干得有效成份。將分取的有效成份經(jīng)干燥、化驗(yàn)、配比，混合過100目篩，包裝，即為成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量為0.11wt％，雷公藤內(nèi)酯甲的含量為0.25wt％。將所用所有有機(jī)試劑回收循環(huán)使用。
實(shí)施例5雷公藤木質(zhì)部經(jīng)揀選、處理為小塊，由粉碎機(jī)粉碎為粉末。稱取150Kg粉末，置于多用提取鍋中，用8倍重量的水?dāng)嚢杈鶆?，在提取鍋中直接通蒸汽加熱?0℃-70℃，蒸煮40分，待冷卻至常溫，收集濾液。再加8倍的體積百分比80％乙醇水溶液，浸泡10h，溫度20℃，放出正丁醇提取液，以同樣的方法再次加入體積百分比80％乙醇水溶液，浸泡一次，合并提取液。
提取液抽至蒸餾鍋，首先打開冷凝器和冷卻器的進(jìn)水閥門，再慢慢將反應(yīng)鍋夾道的冷卻水放出，控制好蒸汽的流量和鍋內(nèi)溫度70-100℃左右，直至藥液中含乙醇濃度小于體積百分比10％為止。
加入同濃縮液等體積的乙酸乙酯回流提取三次，每次提取60min后，使乙酸乙酯萃取液和原提取液分出上下兩層，放出乙酸乙酯萃取液，將三次萃取液合并，脫水過濾，常壓蒸餾回收乙酸乙酯?？刂坪缅亙?nèi)溫度和壓力，減壓抽真空，真空度-0.07MPa以下，濃縮得疏松紅棕色粉末即為雷公藤多苷粗品提取物。
將上步的雷公藤多苷粗粉用丙酮，先溶解成溶液，然后緩緩加入混有丙酮的硅藻土(100-200目)中，硅藻土的用量為粗品質(zhì)量的20倍，攪拌進(jìn)行吸附30分，過濾抽干，濾液為無效成份。
濾餅1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的四氯化碳的乙醇溶液梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3毫升；3％的梯度，用量為1.7毫升；5％的梯度，用量為2.2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4.2毫升；15％的梯度，用量為4.5毫升。采用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標(biāo)準(zhǔn)品對照確認(rèn)有效洗脫梯度。過濾抽干，將有效濾液濃縮，回收四氯化碳，濃縮后得干浸膏，再進(jìn)行二次吸附洗脫，濃縮至干，待柱層析備用。
在直徑8cm左右層析柱中，先裝入己烷少許，然后推入藥棉(做成球狀)置于柱底部鋪平。濕法裝硅膠，排盡柱內(nèi)氣泡，靜置24h以上壓實(shí)，開活塞放出硅膠劑上面多余的己烷，粒體開始收縮，自然壓緊柱體。
用少量四氯化碳溶解洗脫后濃縮的干粉，加入柱中，分別加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的四氯化碳的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3毫升；3％的梯度，用量為1.7毫升；5％的梯度，用量為2.2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4.2毫升；15％的梯度，用量為4.5毫升。用分瓶收集洗脫液。將收集的小瓶洗脫液分別點(diǎn)樣于硅膠G板上進(jìn)行薄層層析后，用紫外分析儀相應(yīng)波長下鑒別洗脫液是否含有效成分，收取有效瓶樣，將有效瓶樣的洗脫液濃縮抽干得有效成份。將分取的有效成份經(jīng)干燥、化驗(yàn)、配比，混合過100目篩，包裝，即為成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量為0.10wt％，雷公藤內(nèi)酯甲的含量為0.25wt％。將所用所有有機(jī)試劑回收循環(huán)使用。
效果實(shí)施例高效液相色譜測定雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲含量(儀器Agilent.1100Series高效液相色譜儀)(一)雷公藤甲素測定1、對照品溶液的制備取雷公藤甲素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成每毫升約含50ug的溶液。
2、供試品溶液的制備取各廠家雷公藤多苷片各50片，取約1.5克，精密稱定，加入乙酸乙酯10mL溶解，稱重，超聲提取，再稱重加乙酸乙酯補(bǔ)足損失量，搖勻，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL，加至用乙酸乙酯濕法裝好的中性氧化鋁(3g內(nèi)徑1cm，70-350目)柱上(室溫條件下)，用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除乙酸乙酯，殘?jiān)约状嫁D(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
3、測定精密吸取供試品溶液10μL，照HPLC法(中國藥典2005年版一部)操作。色譜條件柱溫30℃，流動相甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀(3565)，流速1.00mL/min。在225nm波長處測定供試品和對照品的峰面積，計(jì)算即得。
(二)雷公藤內(nèi)酯甲測定1、對照品溶液的制備取雷公藤內(nèi)酯甲對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成每毫升中約含0.1mg的溶液。
2、試品溶液的制備取各廠家雷公藤多苷片各50片，取約1.5克，精密稱定，加入乙酸乙酯10mL溶解，稱重，超聲提取，稱重并加入乙酸乙酯補(bǔ)足損失量，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL至已用乙酸乙酯濕法裝好的中性氧化鋁(3g，內(nèi)徑1cm，70-350目)柱上(室溫條件下)，用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，殘?jiān)约状嫁D(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
3、測定精密吸取供試品溶液20μL，照HPLC法(中國藥典2005年版一部附錄)操作。色譜條件柱溫30℃，流動相甲醇-乙晴-水(60∶25∶15)，流速1.0mL/min。在210nm波長處測定供試品和對照品的峰面積，計(jì)算即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密稱取雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲對照品8.15mg、6.04mg，用甲醇溶解并定容至25mL作為儲備液。分別精密吸取儲備液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL和0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0置5mL量瓶中，按色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。分別繪制曲線，并計(jì)算得回歸方程Y1＝1714.2X+0.7818，Y2＝507.02X-0.0258；R1＝1.0000，R2＝0.9998。表明在0.163～1.630μg、0.484～4.840μg之間兩者有較好的線性關(guān)系(見圖1和圖2)。
表1 雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

表2 雷公藤酯甲標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

表3給出了由實(shí)施例1的方法5個批次制得的雷公藤多苷原粉制得的雷公藤多苷片和其他生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的雷公藤多苷片中雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲的含量對比。
表3 不同生產(chǎn)企業(yè)雷公藤多甙片甲素、內(nèi)酯甲含量對比表

由表3數(shù)據(jù)看出，本發(fā)明的雷公藤多苷提取物制得的雷公藤多苷片與其他生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的雷公藤多苷片相比，其中所含雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲的含量及比例有較大不同，處于適中的范圍。由以上兩種可檢測成分為代表表明，本發(fā)明的雷公藤多苷提取物制得的雷公藤多苷片中藥效成分含量及比例適中。
由下述雙倍劑量雷公藤多苷治療原發(fā)性腎病綜合癥的實(shí)驗(yàn)表明由本發(fā)明的方法制得的雷公藤多苷藥理效果好，毒副作用小。
1 對象和方法1.1病例選擇18例患者均符合以下條件①臨床表現(xiàn)為單純NS，無或僅有很少量鏡下血尿，腎功能正常，無感染及血栓等并發(fā)癥。其中一部分患者曾用激素治療；②組織學(xué)改變?yōu)橄的ぴ錾圆∽?；③無肝功能異常，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常；④排除繼發(fā)性腎小球腎炎。其中男性13例，女性5例，平均年齡24.4±8.6歲，病程半個月～12年。治療前的臨床情況見表1。
18例患者的腎活檢組織學(xué)診斷①IgA腎病(IgAN)8例，有5例以往曾接受激素治療，2例敏感，3例無效；②IgM腎病(IgMN)4例，2例用過激素敏感；③系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)6例，以往3例用過激素，1例敏感，2例無效。
1.2 治療方法1.2.1 T II 泰州制藥廠生產(chǎn)雷公藤多甙片(本發(fā)明的雷公藤多苷片)1.2.2 給藥方案起始劑量2mg/(kg.d)分三次餐后口服(一般為10mg/片，4片，每日三次)，持續(xù)4周后改為1.5mg/(kg.d)×4周后減至1mg/(kg.d)維持。
1.3觀察項(xiàng)目①臨床觀察浮腫、尿量變化，消化道反應(yīng)，有無皮疹等；②實(shí)驗(yàn)室檢查尿量，尿蛋白定量；外周血象；肝腎功能及血漿蛋白等每周檢查一次，部分患者治療前進(jìn)行尿蛋白SDS-PAGE平板電泳，分析尿蛋白組成。
1.4療效判斷①緩解尿蛋白消失或降至微量，定量在0.4g/24h以下；②改善尿蛋白比治療前減少50％以上；③無效未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)。
2 結(jié)果2.1雙倍劑量T II對NS的療效本組18例原發(fā)性腎小球腎炎，治療后的臨床情況見表4。共有15例得到完全緩解，占83.3％(見表5)。8例IgAN中7例緩解(占87.5％)，1例改善。6例MsPGN中5例緩解(83.3％)，4例IgMN 3例緩解(75.0％)。18例中有5例以往曾用足量激素治療無效但經(jīng)大劑量T II治療后獲得緩解。本組中有1例IgMN和1例MsPGN對T II無效。在緩解的15例中，治療1周即緩解者有4例，治療2周緩解者有8例，因此共有12例(占緩解組的80％)在治療2周內(nèi)尿蛋白消失(見表6)。原有浮腫、尿少的患者在服用T II后，可見明顯的利尿反應(yīng)，浮腫很快消失。在1例T II治療無效的IgMN，盡管蛋白尿沒有明顯減少，但尿量明顯增加，浮腫也迅速消退。
表4 一般臨床情況及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

表5 T II對不同病理類型NS的療效

表6 患者癥狀緩解出現(xiàn)時間

2.2 T II療效與尿蛋白成份的關(guān)系11 例患者治療前進(jìn)行了尿液SDS2PAGE平板電泳檢查，發(fā)現(xiàn)緩解組患者的尿蛋白主要為白蛋白，無高分子及小分子蛋白質(zhì)，而非緩解組尿蛋白組成中含有較多分子量＜2萬的蛋白質(zhì)(占8.5±4.6％)，同時存在較多大分子尿蛋白(占21.0±14.7％)。
2.3 雙倍劑量T II治療的副反應(yīng)治療中僅有個別病例有惡心、嘔吐或有食欲下降等胃腸不適，本組18例患者均能很好地耐受雙倍劑量T II治療?？陀^檢查少數(shù)病例在治療初期SGPT短暫輕度升高(僅1例＞100U/L)，繼續(xù)治療后又恢復(fù)正常，無血清膽紅素升高。無一例出現(xiàn)白細(xì)胞減少至215×109/L以下，僅1例WBC降至3.1×109/L，但未影響治療。在觀察期內(nèi)，所有病例腎功能保持正常(見表7)。
表7 治療的副反應(yīng)(n＝18)

2.4 雙倍劑量治療后的復(fù)發(fā)情況2例患者在使用T II 2mg/(kg.d)4周，臨床癥狀緩解后將T II劑量迅速減至1mg/(kg.d)，給藥2周后NS均復(fù)發(fā)。另2例患者在尿蛋白緩解后隨訪過程中因上感蛋白尿加重，繼續(xù)應(yīng)用雙倍劑量治療后尿蛋白消失。其余病例正在隨訪中，尚未見復(fù)發(fā)者。
權(quán)利要求
1.一種雷公藤多苷的提取方法，其特征在于包括如下步驟(1)提取粗品將雷公藤粉末用水煮提取，再用醇或醇的水溶液提取，將提取液合并，濃縮至醇含量小于或等于體積百分比20％，之后用有機(jī)溶劑萃取，制得含粗品的萃取液，濃縮至干得粗品；(2)粗品精制用有機(jī)溶劑溶解粗品，加入吸附劑進(jìn)行吸附，過濾，將濾餅用梯度有機(jī)溶劑的溶液進(jìn)行洗脫，收集有效部分的洗脫液，濃縮，再進(jìn)行柱層析，用梯度有機(jī)溶劑的溶液進(jìn)行洗脫，收集含有效成分的洗脫液，濃縮至干，即得精制雷公藤多苷。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的水煮提取的次數(shù)為1～3次；所述的醇或醇的水溶液提取的次數(shù)為1～3次；所述的萃取的次數(shù)為1～3次；步驟(2)中，所述的向含粗品的萃取液中加入吸附劑進(jìn)行吸附，過濾，將濾餅用梯度有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，收集有效部分的洗脫液的步驟的次數(shù)為1～2次。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的水煮的溫度為50～100℃ 水煮的時間為30～60分。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的醇或醇的水溶液提取的溫度為20～50℃；醇或醇的水溶液提取的時間為8～24小時。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的水的用量為雷公藤粉末重量的3～10倍；所述的醇或醇的水溶液的用量為雷公藤粉末重量的6～10倍；所述的萃取用的有機(jī)溶劑的用量為提取液濃縮后體積的1～3倍。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的醇的水溶液中醇的濃度為體積百分比40％以上。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的萃取每次的時間為30～60分鐘。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的吸附劑為硅膠、中性氧化鋁、纖維素或硅藻土。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的吸附劑的用量為粗品質(zhì)量的10～20倍。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的吸附的時間為30～60分。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為石油醚、鹵代烷烴、環(huán)烷烴、烷烴、低級脂肪酮或酯。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的梯度有機(jī)溶劑的溶液為梯度在體積百分比1～20％間的鹵代烷烴或烷烴的醇溶液，或梯度在體積百分比1～20％的環(huán)烷烴的丙酮溶液，或能夠達(dá)到同樣展開效果的其它梯度有機(jī)溶液。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于所述的鹵代烷烴為二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿或四氯化碳；所述的環(huán)烷烴為環(huán)己烷或環(huán)戊烷；所述的烷烴為己烷或戊烷；所述的低級脂肪酮為丙酮或甲乙酮；所述的酯為乙酸乙酯。
14.如權(quán)利要求1或12所述的方法，其特征在于權(quán)利要求1的步驟(1)中或權(quán)利要求12中，所述的醇為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的梯度有機(jī)溶劑的溶液及每個梯度的溶液的用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3～4毫升；3％的梯度，用量為1.5～2毫升；5％的梯度，用量為2～3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為3～5毫升；15％的梯度，用量為4～6毫升；百分比為體積百分比。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的有效部分的洗脫液以采用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標(biāo)準(zhǔn)品對照進(jìn)行確認(rèn)。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將所述的醇和/或有機(jī)溶劑回收，循環(huán)使用。
18.如權(quán)利要求1所述的方法制得的雷公藤多苷。
19.含有如權(quán)利要求18所述的雷公藤多苷的藥物組合物。
全文摘要
一種雷公藤多苷的提取方法，包括(1)提取粗品將雷公藤粉末用水煮提取，再用醇或醇的水溶液提取，合并提取液，濃縮至醇含量≤體積百分比20％，再用有機(jī)溶劑萃取，濃縮至干得粗品；(2)粗品精制用有機(jī)溶劑溶解粗品，加入吸附劑進(jìn)行吸附，過濾，將濾餅用梯度有機(jī)溶劑的溶液進(jìn)行洗脫，收集有效部分的洗脫液，濃縮，再進(jìn)行柱層析，用梯度有機(jī)溶劑的溶液進(jìn)行洗脫，收集含有效成分的洗脫液，濃縮至干即可。本方法操作簡便，成本低，生產(chǎn)周期短，所用試劑可循環(huán)使用，對環(huán)境污染少，易應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明還公開了由上述方法制得的雷公藤多苷及其藥物組合物。該產(chǎn)品藥效成分含量高，含量比例適度，藥理效果好。
文檔編號A61P13/00GK101088519SQ20071004385
公開日2007年12月19日 申請日期2007年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月17日
發(fā)明者林健 申請人:上海美通生物科技有限公司, 江蘇美通制藥有限公司