專利名稱：：木犀草素在制備抗補(bǔ)體藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及一種抗補(bǔ)體的藥物，具體涉及木犀草素在制備抗補(bǔ)體藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
：在正常的生理?xiàng)l件下，補(bǔ)體的功能主要是攻擊外來病原和清除免疫復(fù)合物，并維持機(jī)體的平衡。然而補(bǔ)體系統(tǒng)的非正常激活會(huì)引起人體免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)，導(dǎo)致人體自身正常組織的損傷和炎癥反應(yīng)。研究表明，與補(bǔ)體過度激活相關(guān)的疾病有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、老年性癡呆、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、器官移植后的排斥反應(yīng)、多器官功能衰竭綜合癥、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)等。據(jù)報(bào)道，重癥非典型性肺炎(SARS)和由H5N1型病毒感染引起的禽流感，臨床上可發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)癥狀，如ARDS，敗血癥休克及Reyes綜合征等，有研究認(rèn)為上述反應(yīng)癥狀與細(xì)胞免疫、體液免疫過度激活有關(guān)。己有的研究證實(shí)SARS和補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活有關(guān)，雖然目前尚未有證據(jù)證明高致病性的H5N1型禽流感病毒感染人后會(huì)引起補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活，然而已有的研究表明流感病毒感染激活補(bǔ)體旁路途徑，在病毒性呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生中起著重要作用。鑒于補(bǔ)體過度激活在引發(fā)人類許多危重疾病中的重要作用，因此急需尋找高效低毒的新型補(bǔ)體抑制劑。木犀草素(luteolin)是一種具有代表性的天然黃酮，屬弱酸性四羥基黃酮類化合物，化學(xué)名為3'，4'，5,7-四羥基黃酮(3',4'，5，7-Tetralydroxyflavone)，化學(xué)式為<:15111()06，分子量為286。因最初從木犀草科(Resedaceae)木犀草屬(ie"c/a)的草本植物木犀草(i.oAratoL.)的葉、莖、枝中所分離出而得名。木犀草素在植物界分布較廣，多分布于唇形科(Labiatae)和菊科(Compositae)植物中。在臨床上具有止咳、祛痰、消炎、抗菌、抗病毒及降低血脂和膽固醇等作用，還具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可用于抑制油脂食品的劣變。藥理實(shí)驗(yàn)表明，木犀草素在體外能抑制大鼠肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)增殖，并通過清除自由基從而抑制膠原基因表達(dá),在動(dòng)物體內(nèi)具有預(yù)防或治療肝纖維化的作用以及對(duì)抗四氯化碳所致的肝細(xì)胞損傷。木犀草素對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型具有較好的治療效果，與其抑制肺組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P(TGF-pi)mRNA表達(dá)有關(guān)。木犀草素還能擴(kuò)張冠脈血流量及降低冠脈血管阻力，而對(duì)心肌耗氧量無明顯影響。近年來的研究證實(shí)木犀草素對(duì)多種實(shí)體瘤、腹水癌和白血病細(xì)胞都有顯著抑制作用，具有多靶點(diǎn)抗腫瘤作用，既可直接作用于腫瘤細(xì)胞干擾細(xì)胞代謝，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)或增敏細(xì)胞凋亡；還可通過增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤作用，是一種非常有前途的潛在抗腫瘤藥物。值得重視的是木犀草素的抗炎活性十分顯著。一項(xiàng)數(shù)百名支氣管炎患者參加的臨床研究表明，木犀草素對(duì)慢性支氣管炎癥狀，如咳嗽、咳痰、哮喘等都能有效緩解，而且未見有肝臟、心臟或腎臟毒性報(bào)道。另有研究認(rèn)為木犀草素是中藥紫蘇抗炎抗過敏的主要成分，表現(xiàn)出體內(nèi)抑制TNFa產(chǎn)生，抑制耳腫脹和變態(tài)反應(yīng)性水腫，其作用機(jī)制是通過抑制5-脂氧酶(5-LO)和12-脂氧酶(12-LO),而抑制白三烯B4，C4，D4，E4的產(chǎn)生；能顯著減少干燥性皮炎引起的小鼠的自主瘙癢行為，降低病變皮膚中的PGE2含量，其作用機(jī)制可能是通過對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒及組胺釋放等抗過敏作用來實(shí)現(xiàn)的。綜觀國(guó)內(nèi)外的報(bào)道，均未見木犀草素的抗補(bǔ)體藥效及用其制備的補(bǔ)體抑制藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供木犀草素新的藥用用途，具體涉及木犀草素在制備補(bǔ)體抑制藥物中的用途。本發(fā)明所述的木犀草素具有如下所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>本發(fā)明從用于防治重癥非典型性肺炎(SARS)的中藥復(fù)方(國(guó)家中醫(yī)藥管理局推薦)中分離提取得到木犀草素單體化合物。所述的中藥復(fù)方由魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭、草果組成，其比例為15:6:15:10:3。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)1.提取和分離純化木犀草素魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭、草果五味中藥按其組成比例為15:6:15:10:3配伍，共計(jì)19.8Kg。以95%乙醇冷浸提取，過濾，減壓回收乙醇至無醇味，得乙醇提取物。乙醇提取物加水混懸，分別以等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚一丙酮梯度洗脫。其中石油醚一丙酮(8:2)洗脫流份進(jìn)行反復(fù)硅膠柱層析(石油醚一丙酮7:3)，再經(jīng)SephadexLH-20(氯仿一甲醇l:l)純化，得木犀草素。2.木犀草素用于抗補(bǔ)體試驗(yàn)。經(jīng)體外試驗(yàn)證實(shí)木犀草素對(duì)經(jīng)典和旁路途徑激活所引發(fā)的細(xì)胞溶血均有抑制。1)抗補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑細(xì)胞溶血試驗(yàn)豚鼠血清l:80稀釋液作為補(bǔ)體，抗原激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑導(dǎo)致羊紅細(xì)胞溶血，參照文獻(xiàn)方法(Kabat，E.A.,Mayer，M.M..Complementandcomplementfixationinexperimentalimmunology.CharlesC.ThomasPublisher,Ilinois,U.S.A.1964.pp.133-240.)觀!j得木犀草素能抑制細(xì)胞溶血。CH5Q=54pg/mL，n=3。2)抗補(bǔ)體激活旁路途徑細(xì)胞溶血試驗(yàn)人血清1:IO稀釋液作為補(bǔ)體，激活補(bǔ)體旁路途徑導(dǎo)致兔紅細(xì)胞溶血，參照文獻(xiàn)方法(Klerx,J.P.，Beukelman,C丄,Van,D.H.,Willers,J.M..Microassayforcolorimetricestimationofcomplementactivityinguineapig，humanandmouseserum.JournalofImmunologicalMethods.1983.63,215-220)測(cè)得木犀草素能抑制細(xì)胞溶血。AP5()=48pg/mL，n=3。所述木犀草素經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)有較強(qiáng)抗補(bǔ)體活性?？捎糜谥苽溲a(bǔ)體抑制藥物。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備木犀草素魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭、草果五味中藥按其組成比例為15:6:15:10:3配伍，共計(jì)19.8Kg。以95%乙醇冷浸提取，過濾，減壓回收乙醇至無醇味，得乙醇提取物lKg。乙醇提取物加水混懸，分別以等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位(405g)、乙酸乙酯部位(200g)和正丁醇部位(100g)。乙酸乙酯部位(l卯g)經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚一丙酮梯度洗脫。其中石油醚一丙酮(8:2)洗脫流份進(jìn)行反復(fù)硅膠柱層析(石油醚一丙酮7:3)，再經(jīng)SephadexLH-20(氯仿-甲醇l:l)純化，得木犀草素。木犀草素(Luteolin):黃色針晶。ESI-MS(w/z):287[M+H]+.C15H10O6.!H-NMR(DMSO-d6，400MHz)S12.96(1H,brs,5-OH),10.80(1H，s,7國(guó)OH),9.63,9.62(each1H，s,3,,4，-OH),7.37(2H，m,H-2,,6，)，6.82(1H,d，^8.0Hz,H-5'),6.55(1H，s,H-3),6.33(1H,d,7=1.8Hz，H畫8)，6.08(1H,d，《/=1.8Hz,H-6).13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)S181.0(C-4),167.4(C-7),163.5(C-5)，161.3(C-9),157.4(C-3')，151.3(C-2),146.2(C-4')，120.2(C-l,),118.7(C-6'),115.8(C-2'),112.5(C-5'),102.3(C-3),101.9(C-10),99.5(C-6)，94.2(C-8).實(shí)施例2經(jīng)典途徑補(bǔ)體抑制試驗(yàn)取豚鼠血清，以VBSS+緩沖液(巴比妥緩沖液，p1^7.4，含0.5mMMg"+和0.15mMCa2+)稀釋為h80，作為經(jīng)典途徑的補(bǔ)體來源。將兔抗羊紅細(xì)胞的抗體以VBS^緩沖液稀釋為1:1000作為溶血素；保存于Alsever液中的羊紅細(xì)胞(SRBC)配置成2n/。SRBC。精密稱量木犀草素lmg，加入VBS^緩沖液溶解(加入P/。的DMSO助溶)，稀釋成8個(gè)濃度。不同濃度的木犀草素溶液200nL與l:80的補(bǔ)體200pL在37。C預(yù)孵育10min后，依次加入IOOiiL溶血素(1:1000)和100^2%SRBC，在37。C水浴30min后放入低溫高速離心機(jī)，在5000rpm、4。C條件下離心10min。分別取每管上清200pL于96孔板，在405nm測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置木犀草素對(duì)照組(200^L相應(yīng)濃度的木犀草素溶液加400pLVBS"緩沖液)、補(bǔ)體對(duì)照組(以200pLVBS"緩沖液代替木犀草素溶液)和全溶血組(100^iL2。/。SRBC溶于500nL三蒸水中)。將各濃度的木犀草素組吸光度值扣除相應(yīng)木犀草素對(duì)照組吸光度值后計(jì)算溶血抑制率。以木犀草素濃度的對(duì)數(shù)作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖，得到的擬合直線計(jì)算CH5o值。以肝素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照藥，結(jié)果顯示木犀草素可抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑激活所導(dǎo)致的細(xì)胞溶血(表l)。實(shí)施例3旁路途徑補(bǔ)體抑制試驗(yàn)取健康成年男性志愿者血清，以VBS-Mg-EGTA緩沖液(巴比妥緩沖液，pH=7.4，含5mMMg2+和8mMEGTA)稀釋為l:10，作為旁路途徑的補(bǔ)體來源。保存于3.8%枸櫞酸鈉溶液的兔紅細(xì)胞以VBS-Mg-EGTA緩沖液配置成2n/。兔紅細(xì)胞。精密稱量木犀草素lmg，加入VBS-Mg-EGTA緩沖液(加入in/。的DMSO助溶)，稀釋成8個(gè)濃度。不同濃度的木犀草素溶液150pL與l:10的補(bǔ)體150pL在37t:預(yù)孵育10min后，加入200)iL2。/。兔紅細(xì)胞，在37。C水浴30min后放入低溫高速離心機(jī)，在5000rpm、4。C條件下離心10min。分別取每管上清200nL于96孔板，在405nm測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置木犀草素對(duì)照組(150^L相應(yīng)濃度的木犀草素溶液加350pLVBS-Mg-EGTA緩沖液)、補(bǔ)體對(duì)照組(以150^iLVBS-Mg-EGTA緩沖液代替木犀草素溶液)和全溶血組(200pL2%兔紅細(xì)胞溶于300^iL三蒸水中)。將各濃度的木犀草素組吸光度值扣除相應(yīng)木犀草素對(duì)照組吸光度值后計(jì)算溶血抑制率。以木犀草素濃度的對(duì)數(shù)作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖，得到的擬合直線計(jì)算AP50值。以肝素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照藥，結(jié)果顯示木犀草素可抑制補(bǔ)體旁路途徑激活所導(dǎo)致的細(xì)胞溶血(表l)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1.木犀草素在制備抗補(bǔ)體藥物中的用途。2.按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的木犀草素具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及木犀草素在制備抗補(bǔ)體藥物中的新用途。本發(fā)明從用于防治重癥非典型性肺炎(SARS)的中藥復(fù)方中分離提取得到木犀草素，所述的中藥復(fù)方由魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭、草果組成，其比例為15∶6∶15∶10∶3，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其經(jīng)典途徑和旁路途徑的抗補(bǔ)體活性。本發(fā)明所述的化合物木犀草素，可進(jìn)一步作為活性成分，制備新型抗補(bǔ)體藥物。文檔編號(hào)A61P37/02GK101347424SQ200710044100公開日2009年1月21日申請(qǐng)日期2007年7月20日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者婷張,章蘊(yùn)毅,陳道峰申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)