專(zhuān)利名稱(chēng)：白介素-22在治療脂肪肝中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白介素-22(Interleukin-22)的醫(yī)藥用途。具體涉及白介素-22在制備治療脂肪肝(Fatty liver disease，F(xiàn)LD)的組合物中的用途。

背景技術(shù)：
脂肪肝(Fatty liver disease，F(xiàn)LD)是指肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過(guò)多引起的肝臟病變。正常肝內(nèi)脂肪占肝臟含量的3％—4％，當(dāng)脂肪含量超過(guò)5％時(shí)，即為脂肪肝，嚴(yán)重的脂肪肝其脂肪含量高達(dá)40％—50％。脂肪肝的形成主要是由于肝臟脂肪代謝紊亂所致。而脂肪肝主要的脂肪是甘油三酯，它的特點(diǎn)是泡性脂肪變性(macvovesicular steatosis)。脂肪肝可以進(jìn)一步引起肝纖維化(fibrosis)，和肝硬化(cirrhosis)和肝癌(hepatocellutar carcinoma)。在美國(guó)，大約31％的成年人用核磁共振方法(magnetic)診斷有脂肪肝，在中國(guó)大約有5.2％到11.4％患有脂肪肝。流行病學(xué)調(diào)查表明，越發(fā)達(dá)的地區(qū)，脂肪肝發(fā)病率越高。NAFLD在糖尿病人中發(fā)病率為50％，在肥胖病人中(體重指數(shù)BMI>30)高達(dá)三分之二。
脂肪肝可分為兩種一種是酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liverdisease，AFLD)，由于過(guò)量飲酒所引起(乙醇攝入量超過(guò)>20g/天)，長(zhǎng)期和過(guò)量的乙醇在肝細(xì)胞代謝，其毒性代謝產(chǎn)物導(dǎo)致肝臟脂肪代謝紊亂而導(dǎo)致脂肪肝。酒精可以改變NADH/NAD+的氧化還原電位，從而抑制脂肪酸的氧化和三羧酸循環(huán)反應(yīng)(tricarboxylicacid cycle)。其次，酒精可以在抑制肝脂肪氧化的同時(shí)還可以促進(jìn)脂肪的合成。酒精還可以抑制PPAR α(peroxisomeproliferators-activated receptor-α)轉(zhuǎn)錄因子活化(You et al.2004，Am.J.Gastrointest.Liver Physiol.287G1-G6)。第二種FLD是非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，NAFLD包括非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪變性肝炎(steatohepatitis)。而非酒精性脂肪肝又分為肥胖性脂肪肝、糖尿病性脂肪肝、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩和營(yíng)養(yǎng)不良性脂肪肝、妊娠性脂肪肝、藥物性脂肪肝、高脂血癥脂肪肝、中老年脂肪肝、以及其他類(lèi)型脂肪肝。在脂肪肝人中常見(jiàn)的脂肪肝合并癥有脂肪肝伴膽囊炎、脂肪肝伴膽石癥、脂肪肝伴肥胖癥、脂肪肝伴高血壓、脂肪肝伴糖尿病、脂肪肝伴冠心病等合并癥。
臨床主要診斷采用，超聲波，CT(Computerized tomography)和mRI掃描手段，肝組織活檢(liver biopsy)。脂肪肝最普通的血清學(xué)指標(biāo)是轉(zhuǎn)氨酶活性升高，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶Alanine transaminase(ALT)和草氨酸轉(zhuǎn)氨酶Aspartale transaminase(AST)的升高。同時(shí)，堿性磷酸酶alkalinephosphatase/γ-glutamyl transferas(GGT)也可能升高。轉(zhuǎn)氨酶升高指示肝臟代謝功能的降低，同時(shí)也可以作為脂肪肝的指針。
目前認(rèn)為NAFLD的病因主要是由直接和間接的因素引起直接的病因有代謝綜合癥包括，胰島素抵抗，脂肪代謝疾病等。間接的病因有藥物引起比如，糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物，激素，Tamoxifen，Methotrexate，zidouvdine，Aminodarone，ASA(水楊酸類(lèi))，四環(huán)素類(lèi)，Didanosine，嗎啡類(lèi)Cocaine，Perhexilene，Hypervitaminosis A，Diltizem；毒素蘑菇類(lèi)毒素(Amanitaphalloides Lepiota)；石油化工類(lèi)物質(zhì)(Petrochemicals)；磷酸基類(lèi)；Bacillus Cereus toxin；有機(jī)溶劑；間接性疾病引起Lipodystrophy(脂肪代謝紊亂)，Dysbetalipoproteinemia，Weber-Christian disease，Wolman’s disease，妊娠性急性脂肪肝，Reye’s syndrome，自發(fā)性免疫疾病引起如炎癥性腸病(inflammatory Bowel disease IBD)，關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡等.感染引起病毒引起HIV，HBV，細(xì)菌引起急劇體重減輕，如饑餓，gastric by pass，腸道手術(shù)。
目前臨床主要治療方法有抗氧化，如維生素C，維生素E；甲硫氨酸(Methione)的代謝中的化合物，如甜菜堿(Betaine)；甲福明二甲雙胍(Metformin)，它可增加對(duì)胰島素敏感性，同類(lèi)藥物還有噻唑烷二酮類(lèi)藥物(Thiazolidinediones TZD)，血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制劑(Angiotensin-converting Enzyme Inhibitors)，如血管緊張素II(AngiotensinII)受體的抑制劑；具有細(xì)胞保護(hù)，抗細(xì)胞凋亡，免疫調(diào)節(jié)功能的尿脫氧膽酸(Urodeoxycholic acid)；己酮可可堿(Pentoxifylline)可通過(guò)抑制炎癥因子，比如腫瘤壞死因子(TNF α)的產(chǎn)生取得療效；其他還有曲格列酮(Troglitazone)，咯格列酮(Rosiglitazone)，吡格列酮(Pioglitazone)。目前，所有的治療方法對(duì)脂肪肝的療效都不夠理想。
白介素-22(Interleukin-22，IL-22)是一種T細(xì)胞分泌的糖蛋白，又名白介素10誘導(dǎo)的T細(xì)胞因子(IL-10-related T cell-derived induciblefactor，IL-TIF)。白介素22mRNA的表達(dá)最初證明在小鼠的IL-9刺激后的T細(xì)胞株和IL-9刺激的肥大細(xì)胞株(mast cells)，以及concanavalinA激活后的脾細(xì)胞。人白介素22mRNA的表達(dá)主要在外周自分離的T細(xì)胞并通過(guò)抗CD-3的抗體或ConA刺激。白介素22mRNA在激活后的NK細(xì)胞也有表達(dá)?；罨腡細(xì)胞主要是CD4+，特別是由CD28通路的Th1細(xì)胞。
白介素-22由179個(gè)氨基酸殘基組成，Dumoutier等最先報(bào)道了克隆小鼠和人的白介素-22基因(Dumoutier，et al，JI，1641814-1819，2000)。此外，Dumoutier還取得了IL-22的專(zhuān)利(US專(zhuān)利號(hào)6,359,117和6,274,710)。Gurney也取得了IL-22在治療人胰腺病變方面的應(yīng)用專(zhuān)利(US專(zhuān)利號(hào)6,551,799)。
白介素-22主要在胸腺、大腦、活化的T細(xì)胞和肥大細(xì)胞、lectin刺激后的脾細(xì)胞(Duroutier JI 2002)、白介素-2/白介素-12刺激后的NK細(xì)胞(Wolk，K JI 2002)，以及LPS刺激后的多個(gè)器官和組織中表達(dá)(Dumoutier PNAS paper)，包括腸道，肝，胃，腎，肺，心臟，胸腺，脾都可測(cè)到IL-22的表達(dá)升高。
IL-22通過(guò)結(jié)合IL-22RI受體和IL-10R2受體，發(fā)揮生物學(xué)功能。IL-22R1是IL-22特異的受體，它表達(dá)在皮膚，腎，消化系統(tǒng)(胰腺，小腸，肝，大腸，結(jié)腸)以及呼吸系統(tǒng)(肺，支氣管)。以公開(kāi)的研究表明，白介素22是一個(gè)免疫調(diào)節(jié)劑。
目前并未發(fā)現(xiàn)白介素-22可以在治療脂肪肝中發(fā)揮積極的作用。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供白介素-22在治療脂肪肝中的新用途。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供白介素-22在降低轉(zhuǎn)氨酶水平中的作用。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種白介素-22在制備用于治療脂肪肝的組合物中的用途。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于降低轉(zhuǎn)氨酶水平。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括藥物組合物或保健品組合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的白介素-22包括哺乳動(dòng)物白介素-22、和/或重組哺乳動(dòng)物白介素-22。
在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪肝包括酒精性脂肪肝、和/或非酒精性脂肪肝。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括選自下組的額外組分具有減肥功能、減低血脂或降血糖的提取物或化合物，炎癥性細(xì)胞因子(inflammatorycytokines)的抑制劑和抗體藥物，增加糖和脂肪代謝的激素，調(diào)節(jié)代謝的蛋白因子，或其混合。
在另一優(yōu)選例中，所述的具有減肥功能、減低血脂或降血糖的物質(zhì)(提取物或化合物)包括茶葉提取物、他汀類(lèi)化合物(如辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀)、抗氧化類(lèi)藥物、胰島素增敏類(lèi)藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制劑、和/或免疫調(diào)節(jié)功能類(lèi)藥物。
在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)代謝的蛋白因子包括胰島素，胰高糖素(glucagon)，瘦素(leptin)，和/或脂聯(lián)素(adiponectin)等。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物選自粉劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑、酊劑、口服液或片劑。
在本發(fā)明的第二部分，提供了一種白介素-22在制備降低轉(zhuǎn)氨酶水平的組合物中的用途。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還可用于治療脂肪肝。
據(jù)此，本發(fā)明提供了白介素-22在治療脂肪肝中的積極作用。



圖1顯示了人白介素-22的mRNA序列。
圖2顯示了小鼠白介素-22的mRNA序列. 圖3顯示了人白介素-22的蛋白質(zhì)序列。
圖4顯示了小鼠白介素-22的蛋白質(zhì)序列。
圖5顯示了白介素-22對(duì)肥胖小鼠ob/ob小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶水平的影響。
圖6顯示了白介素-22對(duì)治療非酒精性脂肪肝的作用； 其中A為注射載體溶液(對(duì)照組)的肥胖小鼠ob/ob組織切片用蘇木精-曙紅(hematoxylin-eosin)的染色結(jié)果，B為注射IL-22(IL-22治療組)的肥胖小鼠ob/ob組組織切片用蘇木精-曙紅的染色結(jié)果。
圖7顯示了白介素-22對(duì)治療酒精誘導(dǎo)的脂肪肝的作用； 其中A為注射載體溶液(對(duì)照組)的小鼠肝組織切片用“油紅0”方法染色的結(jié)果，A為注射IL-22(IL-22治療組)的小鼠肝組織切片用“油紅0”方法染色的結(jié)果。

具體實(shí)施例方式 發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，發(fā)現(xiàn)無(wú)論對(duì)于酒精性脂肪肝還是非酒精性脂肪肝，白介素-22都有積極的治療效果；發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)白介素-22能有效降低血清中轉(zhuǎn)氨酶的水平。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“組合物”包括(1)治療脂肪肝的組合物和/或(2)降低轉(zhuǎn)氨酶水平的組合物。
如本發(fā)明所用，“白介素-22”是指一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)(a)具有與Dumoutier等人在US Patent No.359,117中描述的人/鼠白介素-22基本相同的氨基酸序列和(b)具有與天然白介素-22相同的生物學(xué)活性。本發(fā)明的白介素-22包括，但不限于人白介素-22、重組人白介素、鼠白介素-22和/或重組鼠白介素-22。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列基本相同”是指序列相同或由一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變(缺失、增加、取代)引起的不同，但這種改變基本上不降低其生物學(xué)活性，即可以通過(guò)結(jié)合IL-22靶細(xì)胞受體而發(fā)生生物學(xué)功能。任何符合“基本相同”要求的白介素-22均包括在本發(fā)明內(nèi)，無(wú)論它是糖基化的(即來(lái)源于天然的或來(lái)源于真核生物表達(dá)系統(tǒng)的)或是非糖基化的(即來(lái)源于原核生物表達(dá)系統(tǒng)或化學(xué)合成的)。
術(shù)語(yǔ)“治療”是指基于治愈、緩解、改善、減輕、影響治療對(duì)象疾病、癥狀、疾病體質(zhì)(predisposition)的目的而給予需要治療的對(duì)象本發(fā)明的白介素-22。
術(shù)語(yǔ)“治療對(duì)象”是指鼠、人及其他哺乳動(dòng)物。
術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指能夠在治療對(duì)象體內(nèi)達(dá)到治療目的的白介素-22的量。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解，所述“治療有效量”可隨白介素-22的給藥途徑、所用藥物輔料以及與其他藥物聯(lián)合用藥情況的不同而有所不同。
本發(fā)明的白介素-22是用基因重組技術(shù)克隆表達(dá)的。表達(dá)的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或者高等真核生物細(xì)胞。適用的原核宿主細(xì)胞包括，但不限于G+或G-菌，如大腸桿菌E.coli.，能夠通過(guò)公共途徑得到的E.coli.菌株包括K12 MM294(ATCC 31，446)、X1776(ATCC 31，537)、W3110(ATCC27，325)和K5 772(ATCC 53，635)等。其他可用的原核細(xì)胞包括但不限于歐式桿菌(Erwinia)、克雷伯桿菌(Klebsiella)、變形桿菌(Proteus)、沙門(mén)桿菌(Salmonella)如鼠傷寒桿菌(Salmonella typhimurium)、沙雷菌屬(Serratia)如粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans)、志賀菌屬(Shigella)、枯草桿菌.(B.subtilis)、地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)、假單胞菌屬(Pseudomonas)如綠膿桿菌(P.aeruginosa)、鏈球菌(Streptomyces)。E.coli.W3110因其常被用作重組DNA產(chǎn)品的發(fā)酵宿主而被推薦為優(yōu)選。
除了原核細(xì)胞，真核細(xì)胞如絲狀真菌(filamentous fungi)或酵母菌(yeast)等同樣適用于表達(dá)或者克隆本發(fā)明的白介素-22。釀酒酵母菌(Saccharomyces)就是一種常用的低等真核宿主微生物，其他宿主如非洲粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse，Nature，290140[1981]；EP 139，383)；克魯維酵母菌(Kluyveromyces hosts)(U.S.Pat.No.4，943，529；Flee et al.，Bio/Technology，9968-975(1991))如K.lactis(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt et al.，J.Bacteriol.，154(2)737-742[1983])，K.fragilis(ATCC12，424)，K.waltii(ATCC56，500)，K.drosophilarum(ATCC 36，906；Van den Berg et al.，Bio/Technolog，8135(1990))，K.thermotolerans，K.marxianus；yarrowia(EP 402，226)；巴氏畢赤酵母菌(Pichia Pastoris)(EP 183.070；Sreekrishnaet al.，J.Basic Microbiol.，28265-278[1988])；念珠菌(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；脈胞菌(Neurospora crassa)(Case etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，765259-5263[1979])；施萬(wàn)異樣霉菌(schwanni omyces)如Schwanniomyces occidentalis(EP 394,538)；絲狀真菌(filamentous fungi)如Neurospora，青霉菌(Penicillium)，Tolypocladium(WO 91/00357)，曲霉菌(Aspergjllus)如A.nidulans(Balanceet al.，Biochem.Biophys.Res.Commum.，112284-289[1983]；Tilburm etal.，Gene，26205-221[1983]；Yelton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811470-1474[1984])和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes，EMBO J.，4475-479[1985])。甲基營(yíng)養(yǎng)酵母菌(Methylotropic yeasts)同樣可用于表達(dá)本發(fā)明的白介素-22，包括但不限于各種能夠在甲醇中生長(zhǎng)的酵母菌如漢遜酵母菌(Hansenula)，念珠菌(Candida)，克勒克酵母菌(kloeckera)，畢赤酵母菌(Pichia)，釀酒酵母菌(Saccharomyces)，球擬酵母菌(Torulopsis)，紅酵母菌(Rhodotorula)。屬于甲基營(yíng)養(yǎng)酵母菌類(lèi)的典型菌種參見(jiàn)C.Anthony，The Biochemistry of Methylotrophs，269(1982)。
用于表達(dá)糖基化的本發(fā)明的白介素-22的宿主細(xì)胞來(lái)源于多細(xì)胞有機(jī)體。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括昆蟲(chóng)細(xì)胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9，植物細(xì)胞。適用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的例子包括中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，COS細(xì)胞。特別是，經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎細(xì)胞株293(Graham et al.，J.Gen Virol.，3659(1977))；CHO/-DHFR(Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；小鼠睪丸滋養(yǎng)細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；人肺細(xì)胞(WI38，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺癌細(xì)胞(MMT 060562，ATCC CCL5 1)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)知如何選擇合適的宿主細(xì)胞。
上述宿主細(xì)胞經(jīng)白介素-22表達(dá)載體或克隆載體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化后可在傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)基(nutrient media)中培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)基經(jīng)修飾后適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子(promoter)、選擇性轉(zhuǎn)化體(selecting transformant)或者擴(kuò)增白介素-22編碼基因序列。培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基、溫度、pH等的選擇對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)則是應(yīng)知的。如何使細(xì)胞培養(yǎng)繁殖力最大化的一般原則、方案以及操作技術(shù)可參見(jiàn)Mammalian Cell Biotechnologya Practical Approach，M.Butler，cd.(IRL Press，1991)and Sambrook et al.，supra.。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)熟知真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，例如CaCl2法、磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體媒介法或電穿孔法。根據(jù)使用的宿主細(xì)胞的不同，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可選擇相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化技術(shù)，例如CaCl2法(Sambrooket al.，supra.)或電穿孔法通常用于原核細(xì)胞；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)感染主要用于某些植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(Shaw et al.，Gene，23315(1983)and WO 89/05859)；對(duì)于沒(méi)有細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，則可以使用磷酸鈣沉淀法(Graham and van der Eb，Virology，52456-457(1978))；有關(guān)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染的全面描述可參見(jiàn)U.S.Pat.N..4,399,216。有關(guān)如何轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞可參見(jiàn)Van Solingen et al.，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，763829(1979).。其他將DNA引入細(xì)胞的方法，如核酸微量注射、電穿孔、完整細(xì)菌細(xì)胞原生質(zhì)體融合(bacterial protoplast fusion with intact cells)、或者聚陽(yáng)離子法(polycations)如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)、聚鳥(niǎo)氨酸(polyornithine)等皆可用于本發(fā)明中。有關(guān)各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)的描述可參見(jiàn)Keown et al.，Methods in Enzymology，185527-537(1990)和Mansour et al.，Nature，336348-352(1988)。
編碼本發(fā)明的白介素-22的核苷酸序列(即cDNA或基因組DNA)可被插入一可復(fù)制載體(replicable vector)進(jìn)行基因克隆(DNA擴(kuò)增)或者表達(dá)。各種載體如質(zhì)粒、粘粒(cosmid，裝配型質(zhì)粒)、病毒顆?；蚴删w等均可通過(guò)公共途徑獲得。運(yùn)用本領(lǐng)域的公知技術(shù)，可將本發(fā)明的白介素-22的編碼核苷酸序列按常規(guī)步驟插入可復(fù)制載體上適宜的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。一個(gè)可復(fù)制載體通常包括但不限于以下部件一條或多條信號(hào)序列(signal sequence)，一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)(origin of replication)，一條或多條標(biāo)記基因(marker gene)，一個(gè)增強(qiáng)子元件(enhancer element)，一個(gè)啟動(dòng)子(promoter)，以及一段轉(zhuǎn)錄中止序列(transcription termination sequence)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可運(yùn)用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)(ligation techniques)構(gòu)建含有一個(gè)或多個(gè)上述部件的合適的可復(fù)制載體。
本發(fā)明的白介素-22不但可以通過(guò)基因重組直接表達(dá)，也可以通過(guò)與異種多肽形成融和多肽的方式生產(chǎn)，后者可以是一段位于成熟蛋白質(zhì)或多肽N端的信號(hào)序列，也可以是位于成熟蛋白質(zhì)或多肽N端的具有特異性切割位點(diǎn)的其他多肽片段。通常情況下，這段信號(hào)序列是上述可復(fù)制載體的一部分，或者它也可以是插入可復(fù)制載體的本發(fā)明的白介素-22編碼核苷酸序列的一部分。所述信號(hào)序列可以是原核信號(hào)序列，例如堿性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或者熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列。在酵母分泌系統(tǒng)(yeast secretion)中，該信號(hào)序列可以是酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列(yeast invertase leader)，α因子前導(dǎo)序列(包括釀酒酵母菌和克魯維酵母菌α因子前導(dǎo)序列，參見(jiàn)U.S.Pat.No.5,010,182)，或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列，C.albicans葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列(EP 362,179)。在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中，哺乳動(dòng)物信號(hào)序列可直接用于分泌目標(biāo)蛋白質(zhì)，此類(lèi)序列包括來(lái)源于相同或相近物種哺乳動(dòng)物分泌蛋白的信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列。
表達(dá)載體和克隆載體均含有一段核苷酸序列，該序列使載體能夠在一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。與各種細(xì)菌、酵母或病毒宿主細(xì)胞對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。例如，質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適用于大多數(shù)G細(xì)菌，2.mu.質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)適用于酵母細(xì)胞，而各種病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40，多形瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)則適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的克隆載體。
表達(dá)載體和克隆載體通常含有一段選擇基因，又名“選擇標(biāo)記”。典型的選擇基因編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(a)對(duì)某些抗生素或毒素如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤，四環(huán)素等具有抗性；(b)能彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺乏(auxotrophicdeficiencies)(c)補(bǔ)充復(fù)合型培養(yǎng)基不能提供的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如桿菌宿主細(xì)胞需要的D-丙氨酸消旋酶的編碼基因。
適用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的選擇基因應(yīng)該可以將有能力吸納本發(fā)明的白介素-22編碼基因的宿主細(xì)胞區(qū)分出來(lái)，如DHFR或胸(腺嘧啶核)苷激酶。適用的以野生型DHFR為選擇基因的宿主細(xì)胞是無(wú)DHFR活性的CHO細(xì)胞株，該細(xì)胞株的制備及繁殖方法可參見(jiàn)Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980)。適用于酵母細(xì)胞的選擇基因是在酵母質(zhì)粒Yrp7中表達(dá)的trpl基因(Stinchcomb et al.，Nature，28239(1979)；Kingsman et al.，Gene，7141(1979)；Tschemperet al.，Gene，10157(1980))。trpl基因可用于篩選不能在色氨酸中生長(zhǎng)的酵母菌突變株如ATCC No.44047或PEP4-1(Jones，Genetics，8512(1977))。
表達(dá)載體和克隆載體通常含有一個(gè)可人工操縱地連接到本發(fā)明的白介素-22編碼核苷酸序列上的啟動(dòng)子，以指導(dǎo)mRNA的合成。與各種宿主細(xì)胞對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。適用于原核宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang et al.，Nature，275615(1978)；Goeddelet al.，Nature，281544(1979))，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel，Nucleic Acids Res.，84057(1980)；EP 36,776)，雜合啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子(deBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983))。細(xì)菌宿主細(xì)胞啟動(dòng)子同樣包含一段可人工操縱地連接到本發(fā)明的白介素-22編碼基因序列的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
適用于酵母宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子序列包括3-磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.，2552073(1980))或其他糖酵解酶的啟動(dòng)子(Hess et al.，J.Adv.Enzvme Reg.，7149(1968)；Holland，Biochemistry，174900(1978))，如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，果糖磷酸激酶，葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸異構(gòu)酶，葡糖磷酸異構(gòu)酶，和葡糖激酶。
還有一些可誘導(dǎo)的酵母啟動(dòng)子，它們能更好地根據(jù)生長(zhǎng)情況來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，包括醇脫氫酶2，異細(xì)胞色素C，酸性磷酸酶，氮素代謝相關(guān)降解酶，金屬硫蛋白，甘油醛-3-磷酸，麥芽糖和半乳糖代謝酶等的啟動(dòng)子。有關(guān)適用于酵母表達(dá)系統(tǒng)的載體和啟動(dòng)子的進(jìn)一步描述參見(jiàn)EP 73,657。
啟動(dòng)子可以控制哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)可復(fù)制載體上本發(fā)明的白介素-22編碼基因序列的轉(zhuǎn)錄。所述啟動(dòng)子包括來(lái)自于多形瘤病毒，禽痘病毒(UK2,211,504)，腺病毒，牛乳頭(狀)瘤病毒，禽類(lèi)肉瘤病毒，巨細(xì)胞病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，乙肝病毒，或猿猴空泡病毒(SV40)等病毒基因組的啟動(dòng)子，來(lái)自于異種哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子，以及來(lái)自于熱休克蛋白的啟動(dòng)子，前提是這些啟動(dòng)子同宿主細(xì)胞表達(dá)體系相容。
通過(guò)在可復(fù)制載體中插入增強(qiáng)子可增強(qiáng)本發(fā)明的白介素-22的編碼核苷酸序列在高等真核生物表達(dá)體系中的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是一種DNA分子的順式作用元件，通常為10到300個(gè)bp，通過(guò)作用于啟動(dòng)子而增強(qiáng)DNA分子的轉(zhuǎn)錄。目前已知很多增強(qiáng)子序列來(lái)自于哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白，彈性蛋白酶，白蛋白，α-胎蛋白，胰島素)。而使用較多的是來(lái)自于真核病毒細(xì)胞的增強(qiáng)子，如位于復(fù)制起點(diǎn)下游(late side)的SV40增強(qiáng)子(100-270bp)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，位于復(fù)制起點(diǎn)下游的多形瘤病毒增強(qiáng)子，腺病毒增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可被剪切插入位于可復(fù)制載體上的本發(fā)明的白介素-22的編碼核苷酸序列的5’端或3’端，優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5’端。
真核宿主細(xì)胞(酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、人類(lèi)細(xì)胞，或者來(lái)源于其他多細(xì)胞有機(jī)體的有核細(xì)胞)中的表達(dá)載體同樣含有中止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所需的核苷酸序列。此類(lèi)序列通常取自真核或者病毒DNA或cDNA非翻譯區(qū)的5’端，有時(shí)也可取自3’端。所述“非翻譯區(qū)”包含的核苷酸片段可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生位于本發(fā)明的白介素-22 mRNA非翻譯區(qū)的聚腺苷?；?。
其他可在重組脊椎動(dòng)物培養(yǎng)體系中用于合成本發(fā)明的白介素-22的方法、載體和宿主細(xì)胞可參見(jiàn)Gething et al.，Nature，293620-625(1981)；Manteiet al.，Nature，28140-46(1979)；EP 117,060；以及EP 117,058。
用途 白介素-22可用作治療脂肪肝的組合物中的活性成分。所述的白介素-22可包括哺乳動(dòng)物白介素-22、和/或重組哺乳動(dòng)物白介素-22，或其混合。優(yōu)選地，包括人白介素-22、重組人白介素、鼠白介素-22和/或重組鼠白介素-22。
組合物中的活性成分除了上述的白介素-22，還可以含有有助于治療脂肪肝的額外組分，例如炎癥性細(xì)胞因子(inflammatory cytokines)的抑制劑和抗體藥物，增加糖和脂肪代謝的激素，和/或調(diào)節(jié)代謝的蛋白因子如:胰島素，胰高糖索(glucagon)，瘦素(leptin)，脂聯(lián)素(adiponectin)等。
在本發(fā)明的組合物中，還可以包括其它具有減肥功能、減低血脂或降血糖的物質(zhì)(提取物或化合物)，例如茶葉提取物、他汀類(lèi)化合物(如辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀)、抗氧化類(lèi)藥物、胰島素增敏類(lèi)藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制劑、和/或免疫調(diào)節(jié)功能類(lèi)藥物。
本發(fā)明白介素-22還可用作降低轉(zhuǎn)氨酶水平的組合物中的活性成分。所述的白介素-22可包括哺乳動(dòng)物白介素-22、和/或重組哺乳動(dòng)物白介素-22，或其混合。優(yōu)選地，包括人白介素-22、重組人白介素、鼠白介素-22和/或重組鼠白介素-22。
本發(fā)明的降低轉(zhuǎn)氨酶水平的組合物中還可以包括其它具有降低轉(zhuǎn)氨酶水平作用的物質(zhì)。
本發(fā)明的白介素-22的編碼核苷酸序列可被應(yīng)用于基因治療中。在基因治療過(guò)程中，基因被導(dǎo)入細(xì)胞中以期在體內(nèi)合成具有治療效果的基因表達(dá)產(chǎn)物，比如替代原有的缺陷基因。“基因治療”包括傳統(tǒng)的基因療法，即通過(guò)一次治療而長(zhǎng)期有效；也包括給予基因治療藥物，后者包括一次或者多次地給予有效的DNA或者mRNA。反義RNA和DNA亦可被用作基因治療藥物以阻斷體內(nèi)某些基因的表達(dá)。業(yè)已證實(shí)，盡管反義寡核苷酸短片段被細(xì)胞膜吸收有限，導(dǎo)致其胞內(nèi)濃度降低，它仍然可以在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑制劑的作用(Zamecnjk et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834143-4146[1986]))所述寡核苷酸片段經(jīng)修飾例如用不帶電荷的基團(tuán)取代其帶負(fù)電荷的磷酸二酯基團(tuán)后，可提高其細(xì)胞膜吸收度。
本發(fā)明的白介素-22可被用作治療藥物。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可按本領(lǐng)域的常規(guī)方法將其制備成各種藥學(xué)上有效的制劑(formulation)，其中包含有效量的白介素-22和藥學(xué)上可接受的載體。
當(dāng)制成凍干制劑或溶液劑時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物中還需要加入其他一些生理上可接受的載體、賦形劑、穩(wěn)定劑等以便于儲(chǔ)存(Remington’sPharmaceutical Sciences16th edition，Osol，A.Ed.(1980))。所述“生理上可接受”的載體、賦形劑、穩(wěn)定劑等其藥用劑量和濃度應(yīng)對(duì)給藥對(duì)象(人、鼠及其他哺乳動(dòng)物)無(wú)毒，包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機(jī)酸；抗氧化劑如抗壞血酸(Vit C)；低分子量(少于10個(gè)氨基酸殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，氨基酸如氨基乙酸、谷氨酸鹽、天冬酰胺酸、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖或糊精；鰲合劑如EDTA；糖醇(sugaralcohols)如甘露醇、山梨醇；成鹽抗衡離子(counterions)如鈉離子；和/或非離子型表面活性劑如TWEEN.TM.，PLURONICS.TM.或PEG.等。
含有本發(fā)明的白介素-22的制劑在體內(nèi)給藥前必須經(jīng)過(guò)滅菌。該步驟可在凍干和再組成(reconstitution)之前或之后借助滅菌過(guò)濾膜(sterilefiltration membranes)過(guò)濾完成。
本發(fā)明的藥物組合物通常被置于一配備有“滅菌入口”(sterile accessport)的容器中，例如，一個(gè)有瓶塞的靜脈溶液瓶，所述塞子可被皮下注射針穿透。
本發(fā)明的藥物組合物可按本領(lǐng)域的常規(guī)途徑給藥，包括但不限于靜脈注射或輸注、腹腔注射、腦內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、眼內(nèi)注射、動(dòng)脈注射或輸注、局部給藥或者通過(guò)緩釋系統(tǒng)(sustained release systems)給藥。
本發(fā)明的藥物組合物的劑量和濃度范圍可因?qū)嶋H使用情況的不同而變化。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)知如何根據(jù)實(shí)際需求去選擇合適的劑量和給藥途徑。本發(fā)明人所做的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已為白介素-22在人體的用量范圍提供了一個(gè)可信的指導(dǎo)，例如，重組鼠白介素-22在劑量大于30ug/kg/d時(shí)可見(jiàn)顯著的降血脂效果，并呈量效關(guān)系(實(shí)施例3)。對(duì)于不同種系，例如人和鼠之間藥物劑量范圍的調(diào)整原則，可參見(jiàn)Mordenti，J.and Chappell，W.“The use ofinterspecies scaling in toxicokinetics”In Toxicokinetics and New DrugDevelopment，Yacobi et al.；Pergamon Press，New York 1989，pp.42-96.。
當(dāng)本發(fā)明的白介素-22體內(nèi)給藥時(shí)，其通常劑量范圍為每天1ng/kg—100mg/kg哺乳動(dòng)物體重，優(yōu)選范圍10ug/kg/d—100ug/kg/d，根據(jù)給藥途徑的不同而有所不同。對(duì)于某些特定劑量和給藥方法的指導(dǎo)參見(jiàn)U.S.Pat.Nos.4657760；5206344；或5225212?？梢灶A(yù)見(jiàn)的是，不同的白介素-22制劑將對(duì)不同的病種有效；當(dāng)藥物作用靶點(diǎn)(器官或組織)發(fā)生變化時(shí)，給藥方式也需要做相應(yīng)的調(diào)整。
含有本發(fā)明的白介素-22的微膠囊可用于本發(fā)明的白介素-22的緩釋給藥。重組蛋白的微囊緩釋給藥技術(shù)已成功應(yīng)用于重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)、重組人干擾素(rhIFN)、白介素-2和MNrgp120(Johnson et al.，Nat.Med.，2795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther 271221-1223(1993)；WO 97/03692，WO96/40072，WO 96/07399；U.S.Pat.No.5654010。
本發(fā)明的白介素-22的緩釋制劑可用具有良好生物兼容性和寬泛生物可降解性的乳酸羥基乙酸高聚物(PLGA)制備。PLGA的降解產(chǎn)物，乳酸和羥基乙酸可被人體很快清除。而且，該高聚物的降解能力可隨其分子量和組成的不同，從幾個(gè)月延長(zhǎng)到幾年(Lewis，“Controlled release of bioactive agents formlactide/glycolide polymer，”inM.Chasin and R.Langer(Eds.)，Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel DekkerNew York，1990)，pp.1-41))。
本發(fā)明的白介素-22還可用各種活化的分子量為5,000—100,000的聚乙二醇(PEG)修飾以使之高分子化，延長(zhǎng)其半衰期。具體操作可參見(jiàn)Greenwald etal.，Bioorg.Med.Chem.Lett.1994，4，2465；Caliceti et al.，IL Farmaco，1993，48，919；Zalipsky and Lee，《聚乙二醇化學(xué)生物技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用》，J.M.Harris編，Plenum Press，N.Y.，1992。優(yōu)選使用多臂樹(shù)權(quán)型活性PEG(CN ZL02101672.0，WO9932139，PCT/US95/0755，PCT/US94/13013，US Pat4,640,835，4,496,689，4,301,144，4,670,417，4,791,192，4,179,337)。
本發(fā)明的IL-22還可以做成嵌合分子(Chimeric Molecule)或融合蛋白(Fusion Protein)從而增強(qiáng)其生物學(xué)活性或延長(zhǎng)其體內(nèi)的生物半衰期。比如與人的整個(gè)和部分免疫球蛋白基因(Fc)相連進(jìn)行表達(dá)。IL-22的部分可以用整個(gè)或部分IL-22cDNA序列。生產(chǎn)表達(dá)Fc融合蛋白可見(jiàn)US Pat5,428,130。IL-22基因可以放在Fc的N-末端，也可以放在Fc的C-末端進(jìn)行表達(dá)。
共價(jià)修飾的IL-22蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明內(nèi)?；瘜W(xué)共價(jià)修飾包括改變N-末端或C-末端或其他氨基酸加上一個(gè)化學(xué)分子。這種修飾也包括改變IL-22的氨基酸序列。改變IL-22本身的糖基化狀態(tài)(Glycosalytion)，包括增加糖基化或減少糖基化，或者直接通過(guò)化學(xué)反應(yīng)改變糖基化狀態(tài)，比如專(zhuān)利WO87/05330。
其他制劑技術(shù)如納米制劑(US60/544,693)、噴霧劑(CN00114318.2，PCT/CN02/00342)、吸入劑等同樣包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書(shū)所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于 1、白介素-22具有明顯的治療脂肪肝的作用。
2、白介素-22具有明顯的降低轉(zhuǎn)氨酶水平的作用。
下面將結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。
除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1 人和小鼠白介素-22基因克隆 人白介素-22基因的克隆取正常人的外周血單核細(xì)胞，用anti-CD3mAb刺激并培養(yǎng)過(guò)夜。提取tRNA的方法采用超速離心法。cDNA通過(guò)用dT為引物合成。人白介素-22基因用引物包括有意義鏈(5’-GCAGAATCTGAACAGGTTC-3’)和反意義鏈(5’-GGCATCTAATTGTTATTTCTAG-3’)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的人白介素-22的DNA再克隆到大腸桿菌表達(dá)載體。
小鼠白介素-22基因的克隆C57BL/6雌性小鼠，注射LPS(5mg/kg，sc)，20小時(shí)后取脾，抽取RNA。CDNA通過(guò)用dT引物合成。小鼠白介素-22用引物包括有意義鏈(5’-CTCTCACTTATCAACTGTTGAC-3’)和反意義鏈引物(5’-GATGATGGACGTTAGCTTCTCAC-3’)，進(jìn)行PCT擴(kuò)增后再克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET21(+)。
人和小鼠白介素-22基因通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)無(wú)誤，見(jiàn)圖1和2。
實(shí)施例2 人和鼠白介素-22蛋白的表達(dá) 大腸桿菌BL21(E.Coli)用來(lái)表達(dá)重組蛋白。大腸桿菌在高壓下用勻漿破壞。含白介素-22的包含體以離心方法獲得。包含體在緩沖液體(含50mMTris-HCl pH 8.0，NaCl 100mM，EDTA 1mM，DTT 1mM，Sodium Deoxycholate 0.5％)中充分洗滌。包含體進(jìn)一步在8M尿素，50mM Mes，10mM EDTA和0.1mM DTT，PH 6.5中溶解。溶解后的包含體在100mM Tris HCL，2mM EDTA，0.5m L-arginine，1mM還原型谷胱甘肽，0.1mM氧化型谷胱甘肽，PH8.0還原復(fù)位20小時(shí)4次。然后經(jīng)過(guò)濃縮，并進(jìn)一步在Superdex75(Amersham)柱層析純化。重組后的蛋白質(zhì)用Tris-HCl 20mM、NaCl 50mM PH 7.0洗脫。白介素-22的純度用SD3-PAGE膠染色(純度>95％)，見(jiàn)圖3和4。并定量分裝在-80℃保存。
實(shí)施例3 重組白介素-22降低肥胖小鼠ob/ob小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶的水平 取8—12周的肥胖小鼠ob/ob，體重范圍35—50g，連續(xù)注射實(shí)施例2制得的重組白介素-22，300ug/kg/d，14天，對(duì)照組小鼠注射相同體積的載體溶液(0.1％BSA，PBS)。在第15天時(shí)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，取血清，測(cè)定血中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和草氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性。結(jié)果見(jiàn)圖5所示。
結(jié)果表明，注射IL-22可明顯降低血清中甘油三酯濃度的同時(shí)，顯著降低血清中AST，ALT酶的活性。
實(shí)施例4 重組白介素-22對(duì)治療肥胖小鼠ob/ob(非酒精性的)脂肪肝的作用 取8—12周的肥胖小鼠ob/ob，體重范圍35—50g，IL-22治療組小鼠連續(xù)注射實(shí)施例2制得的重組白介素-22，300ug/kg/d，14天；對(duì)照組小鼠注射相同體積的載體溶液(0.1％BSA，PBS)。在第15天時(shí)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，取肝臟在10％甲醛中固定，進(jìn)行病理分析。組織切片用蘇木精-曙紅(hematoxylin-eosin)染色。結(jié)果見(jiàn)圖6所示。
結(jié)果表明，注射載體溶液的肥胖小鼠ob/ob組可見(jiàn)明顯的脂肪變性和脂肪肝變。而注射IL-22的肥胖小鼠ob/ob組可顯著地降低肝臟的脂肪變性的程度。顯示出白介素-22對(duì)非酒精性脂肪肝明顯的治療作用。
實(shí)施例5 重組白介素-22對(duì)治療酒精誘導(dǎo)的脂肪肝的作用 取C57BC/6小鼠，周齡8-12周。用液體飼料喂養(yǎng)(Lieber.et al.1989，Hepatology 10501-510)，液體飼料含蛋白質(zhì)20％，10％脂肪，碳水化合物45％。乙醇25％飼養(yǎng)(百分比以總熱量計(jì)算)。小鼠喂養(yǎng)2-3周后動(dòng)物隨機(jī)分為兩組一組是對(duì)照組，注射相同體積的載體溶液(0.1％BSA，PBS)；一組為IL-22治療組，注射實(shí)施例2制得的重組小鼠IL-22蛋白300ug/kg/d。2周后處死動(dòng)物。取小鼠肝臟進(jìn)行病理分析，肝組織切片用“油紅O”方法染色，結(jié)果見(jiàn)圖6所示。
結(jié)果表明，重組白介素-22對(duì)治療小鼠酒精誘導(dǎo)的脂肪肝有顯著的作用。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種白介素-22在制備用于治療脂肪肝的組合物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于降低轉(zhuǎn)氨酶水平。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物包括藥物組合物或保健品組合物。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的白介素-22包括哺乳動(dòng)物白介素-22、和/或重組哺乳動(dòng)物白介素-22。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪肝包括酒精性脂肪肝、和/或非酒精性脂肪肝。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物包括選自下組的額外組分具有減肥功能、減低血脂或降血糖的提取物或化合物，炎癥性細(xì)胞因子的抑制劑和抗體藥物，增加糖和脂肪代謝的激素，調(diào)節(jié)代謝的蛋白因子，或其混合。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的具有減肥功能、減低血脂或降血糖的提取物或化合物包括茶葉提取物、他汀類(lèi)化合物、抗氧化類(lèi)藥物、胰島素增敏類(lèi)藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制劑、和/或免疫調(diào)節(jié)功能類(lèi)藥物；所述的調(diào)節(jié)代謝的蛋白因子包括胰島素，胰高糖素，瘦素，和/或脂聯(lián)素。
8.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物選自粉劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑、酊劑、口服液或片劑。
9.一種白介素-22在制備降低轉(zhuǎn)氨酶水平的組合物中的用途。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述的組合物還可用于治療脂肪肝。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了白介素-22在治療脂肪肝中的應(yīng)用，所述的用途可通過(guò)降低轉(zhuǎn)氨酶水平實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還公開(kāi)了白介素-22在降低轉(zhuǎn)氨酶水平中的應(yīng)用，通過(guò)這種應(yīng)用可產(chǎn)生治療脂肪肝的功效。
文檔編號(hào)A61K38/20GK101361968SQ20071004459
公開(kāi)日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2007年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月6日
發(fā)明者黃予良, 黃智華 申請(qǐng)人:健能隆醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限公司