專(zhuān)利名稱：：聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素在制備抗乙肝病毒藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及鶴慶五味子中聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素的新的藥用用途。尤其涉及鶴慶五味子中聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素在制備抗乙肝病毒藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
：乙肝病毒(HBV)感染是全球性的影響人類(lèi)健康的主要疾病之一，全世界大約有3億多人為慢性HBV攜帶者，我國(guó)約占半數(shù)。由于HBV感染可以導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌，因此已成為影響人類(lèi)壽命的九大疾病之一。由于慢性HBV感染者較非攜帶者發(fā)生肝癌的相對(duì)危險(xiǎn)率為217，因此在全世界每年大約有200萬(wàn)人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我國(guó)又是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，每年約有25萬(wàn)人死于與乙肝相關(guān)的慢性肝病(肝硬化與肝癌)。這給人民健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大損失。因此，尋求高效低毒的抗HBV藥物已成為刻不容緩的問(wèn)題。盡管藥物化學(xué)工作者在篩選抗HBV藥物的過(guò)程中進(jìn)行了不懈的努力，但到目前為止人們還沒(méi)有找到特效藥來(lái)治愈HBV感染。臨床上已獲得FDA正式批準(zhǔn)使用的a-干擾素和核苷類(lèi)藥物拉米呋啶只能在某種程度上獲得治療效果，對(duì)大多數(shù)病人還達(dá)不到治愈的目的，停止治療后的"反跳"現(xiàn)象是醫(yī)藥工作者最感棘手的問(wèn)題，所以開(kāi)發(fā)研制高效、低毒、不"反跳"的抗HBV新藥向藥物化學(xué)工作者提出了挑戰(zhàn)。在篩選抗HBV新藥的過(guò)程中，越來(lái)越多的藥物化學(xué)工作者把注意力轉(zhuǎn)向了植物來(lái)源豐富，價(jià)廉易得，毒副作用小，分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的天然化合物。鶴慶五味子Schisandrawilsoniana為我國(guó)特有藥用植物，屬于五味子尋斗(Schisandrance)五味子屬(Schisandra)，分布于云南，其果實(shí)在民間一直作為五味子(FructusSchisandra)的代用品，具有收斂固澀，益氣養(yǎng)津，補(bǔ)腎寧心的功效，主治久咳虛喘，夢(mèng)遺滑精、遺尿、尿頻、自汗、盜汗、神經(jīng)衰弱、肝炎等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素的新的藥用用途，尤其涉及鶴慶五味子中聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素在制備抗乙肝病毒藥物中的新用途。本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代藥理篩選方法，對(duì)植物藥中抑制HBV的活性物質(zhì)進(jìn)行研究，從五味子科五味子屬(&/^am/ra)植物鶴慶五味子(51中提取聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素并證實(shí)其具有抗HBV病毒活性。-本發(fā)明涉及的聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素包括化合物五味子甲素(1)、戈米辛0(2)、五味子酯丙(2)和鶴慶五味子丁素(4)。本發(fā)明所述的活性聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)化合物具有如下式I的化學(xué)結(jié)構(gòu)其中各取代基及化合物1-4的情況如表1所示:表l化合物RiR2R3R4R5聯(lián)苯構(gòu)型八元環(huán)構(gòu)1MsMsHH(P)Me(a)TBC2R!十R2=CH2OH(p)H(P)Me(a)TC3R4+R2=CH2OTig(p)OH(a)Me(p)TBC4—OHMeOTig(p)o輔Me(a)TBC注TBC為船椅式構(gòu)象，TC為船式構(gòu)象。本發(fā)明涉及的鶴慶五味子為我國(guó)特有藥用植物S.vv&om'a""的干燥果實(shí)，分布于云南。本發(fā)明首次從鶴慶五味子植物中分離到聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)鶴慶五味子植物中的聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素具有較好的抗HBV活性。本發(fā)明所述的的化合物通過(guò)下述方法制備-取上述鶴慶五味子果實(shí)汰g，95%乙醇冷浸，提取物濃縮后用乙醚萃取，共得400克，取200克干法上樣進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-丙酮梯度洗脫。油醚-丙酮(30:l)的流份中，得到粗晶，在油醚-丙酮(30:1)溶劑中重結(jié)晶后得五味子甲素(1);油醚-丙酮(20:l)的流份經(jīng)MCI柱(甲醇-水(4:l))除去色素，用石油醚-丙酮(20:l)反復(fù)硅膠柱層析，然后運(yùn)用制備TLC方法(石油醚-乙酸乙酯(10:1))進(jìn)行純化，得戈米辛0(2);油醚-丙酮(4:l)的流份經(jīng)MCI柱(甲醇-水(4:l))除去色素，再經(jīng)C18反相柱(甲醇:水(7:3))洗脫，最后經(jīng)制備TLC方法(石油醚:乙酸乙酯(3:1))進(jìn)行純化，得五味子酯丙(3);油醚-丙酮(3:l)的流份經(jīng)MCI柱除去色素，再經(jīng)C18反相柱(甲醇:水(6:4))洗脫，最后通過(guò)制備TLC方法(石油醚:乙酸乙酯(2:1》進(jìn)行純化，得鶴慶五味子丁素(4)，鶴慶五味子丁素為新化合物。其中，五味子甲素deoxyschisandrin(l),C24H3206(416),白色方晶(石油醚/丙酮)，熔點(diǎn)121-122°C;[a]g=+115°(c0.10，MeOH);UV(MeOH)wxnm(loge):220(4.85)，248(4.23)，280(3.52);IR(KBr)v麵(cm"-》1590,1489,1428,1328;"H隱NMR(CDC13，400MHz)5ppm:6.54(1H，s，H誦4)，2.60(2H，m，H-6),1.81(1H，m，H-7),1.91(1H,m,H-8),2.22(2H，m，H-9),6.53(1H,s，H-ll),0.73(3H,d,^7.2Hz,CH3(17》，1.00(3H,d，聲7.2Hz,CH3(18))，OCH3(3.59,3.59,3.93，3.94,3.95,3.96,各3H，s);EI掘m/z:416([M]+,100)，235(4)，181(3)。其中，戈米辛O(gomisin0)(2)，C23H2807(416)，白色粉末；[a]g=—36.4。(c0.05,MeOH);UV(MeOH)Wxtim(loge):214(4.74),282(sh，3.62);IR(KBr)vmax(cm-1):3500,1615,1595;!H-NMR(CDC13,400MHz)5ppm:6.42(1H,s,H-4)，6.56(1H,s，H-l1)，4.34(1H,d，風(fēng)2Hz,H-6),1.75(2H，m，H-7/8),2.17(2H,m,H-9)，0.90(6H,d,J=7.0Hz，CH3(17，r8))，5.96(2H，s,OCH20)，OCH3(3.52,3.90，3.90，3.91,各3H,s);EI-MSm/z:416([M]+,100),398(15),360(54)。其中，五味子酯丙(schisantherinC)(3),C28H3409(514),白色粉末，[a—〗g=—142.4°(c0.20，MeOH);UV(MeOH)Amax(lognm:220(4.66)，260(sh,3.97),295(sh，3.34);IR(KBr)vmax(cm-1):3524，1710，1692，1648，1622，1598;^-NMR(CDC13，400麗z)Jppm:6.76(1H,s,H-4)，5.67(1H,s,H-6),1.95(1H,m，H-8)，2.23(2H，m,H-9),6.50(1H,s，H畫(huà)ll)，1.13(3H，d，《/=7.4Hz，CH3(17))，1.29(3H,s，CH3(18》，6.00(1H,m,H畫(huà)3'),1.66(3H,d,/=7.1Hz,CH3(4'))，1.56(3H,s，CH3(5'))，5.85,5.92(各1H,d,/=1.2Hz,OCH20)，OCH3(3.54，3.68，3.85，3.88，各3H,力；EI陽(yáng)MSm/z:514(岡+,46),414(72)，371(20)，343(100),83(77)，55(89)。其中，鶴慶五味子丁素(schisanwilsoninD)(4)，C28H3609(516),白色粉末，[a]g=-53.5(c0.02，MeOH);UV(MeOH)、axnm(logs):214(4.87)，290(sh,3.23);CD(c=0.02,MeOH):Ae204=+34.5，A￡233=-28,7,△￡248=-11.9，&252=-12.2;IR(KBr)Vmax(cm"):3440，2937，2849，1709，1595,1457，1404,1330，1260,1124,1090，735;'H-NMR(CDC13，400MHz)5ppm:6.71(1H，s，H-4),5.76(1H，s,H-6),2.07(1H，m，H-8)，2.26(2H,m，H-9),6.68(1H,s,H-l1),5.71(1H,brs，OH-12),3.57(3H,s，OCH3-l)，3.88(3H,s，OCHr2)，3.92(3H，s,OCH3-3),3.86(3H,s，OCH3-13)，3.31(3H，s,OCH3-14),1.14(3H,d,/=1.14Hz,CH3(17))，1.07(3H，d，J-1.14Hz,CH3(18))，5.97(1H,mH-3')，1.61(3H,d,J-7.0Hz,CH3(4'))，1.52(3H，s,CH3(5'));HR-ESI-MS:539.2262([M+Na]+，C28H3609Na+;calc.539.2257)。表2是化合物1-4的碳譜(13C-NMR)數(shù)據(jù)(Jinppm)。表212341234l151.4152.1152.6152.116122.2122.1121.9121.62140.0141.4142.1141.81712.617.519.419.23151.3151.9152.3151.81821.816.528.118.74107.1109.9110.4110.3OCH20-100.8101.0-5139.1135.5131.2131.4MeO-160.960.561.260.8633.781.484.685.9MeO-260.560.961.360.9739.137.972.675.8MeO-355.855.956.355.8840.737.042.842.7MeO-1255.9935.540.036.937.1MeO-1360.5--60.610T3—3.9136.9135.7137.1MeO-1460.959.559.559.2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>inCDC13，100MHz;本發(fā)明所述的聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素經(jīng)藥理試驗(yàn)，結(jié)果證明具有顯著的抗HBV作用，且有效濃度低，細(xì)胞毒性較小的特點(diǎn)(表3)。所測(cè)木脂素對(duì)HBsAg和HBeAg均顯示有抑制作用，且對(duì)HBsAg的作用高于HBeAg。其中五味子酯丙、戈米辛O在50^g/mL時(shí)對(duì)HBsAg的抑制率高于陽(yáng)性對(duì)照拉米呋啶(20(^g/mL時(shí)抑制率為28.6。/。)，其中五味子酯丙抑制作用較明顯，在50//g/mL時(shí)抑制率為59.0%。五味子甲素在20(Vg/mL時(shí)對(duì)HBsAg的抑制率為50.3%，明顯高于陽(yáng)性對(duì)照拉米呋啶(200//g/mL時(shí)抑制率為34.8M)。五味子酯丙和戈米辛0在5(Vg/mL對(duì)HBeAg的抑制率分別為34.7%和32.6%，和拉米呋啶相當(dāng)。鶴慶五味子丁素在濃度為50pg/mL時(shí)對(duì)HBeAg抑制率為28.8%，和拉米呋啶相當(dāng)，對(duì)HBeAg也表現(xiàn)出一定的抑制作用。本發(fā)明所述的聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素可作為活性成分制備用于治療乙型肝炎的藥物。圖1是鶴慶五味子中聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素成分提取分離工藝流程圖，注A:PE-AcetoneB:PE-EtOAcC:MeOH-H20。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備鶴慶五味子聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素取我國(guó)云南藥用鶴慶五味子植物(S.w&om'"m^的干燥果實(shí)8kg，95%乙醇浸泡，提取物濃縮后用乙醚萃取，共得400克(提取率5%)，取200克干法上樣進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-丙酮梯度洗脫，以石油醚-丙酮梯度洗脫。油醚-丙酮(30:l)的流份中，得到粗晶，在油醚-丙酮(30:1)溶劑中重結(jié)晶后得五味子甲素(1);油醚-丙酮(20:l)的流份經(jīng)MCI柱(甲醇-水(4:l))除去色素，用石油醚-丙酮(20:l-15:l)反復(fù)硅膠柱層析,然后運(yùn)用制備TLC方法(石油醚-乙酸乙酯(10:1))進(jìn)行純化，得戈米辛O(2);油醚-丙酮(4:l)的流份經(jīng)MCI柱(甲醇-水(4:l))除去色素，再經(jīng)C18反相柱(甲醇:水(7:3))洗脫，最后經(jīng)制備TLC方法(石油醚:乙酸乙酯(3:1))進(jìn)行純化，得五味子酯丙(3);石油醚-丙酮(3:l)的流份經(jīng)MCI柱除去色素，再經(jīng)C18反相柱(甲醇:水(6:4》洗脫，最后通過(guò)制備TLC方法(石油醚:乙酸乙酯(2:1))進(jìn)行純化，得鶴慶五味子丁素(4)。實(shí)施例2體外抗HBV實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HepG2的2.2.15細(xì)胞株(教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海)，以每孔10xl()S個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)基為DMEM，生長(zhǎng)液含10%胎牛血清，380|ug/mlG418，0.03°/。谷胺酰胺，青霉素、鏈霉素各100|ng/ml，在5%<:02孵箱中37。C培養(yǎng)，48小時(shí)后，換成二甲基亞砜助溶的含藥物的培養(yǎng)液，每種藥物設(shè)35個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)9天(每3天換液一次)，收集上清液用ELISA檢測(cè)HBsAg及HBeAg含量。同樣條件下以不含藥物的培養(yǎng)液上清液作為對(duì)照組。同時(shí)用上述細(xì)胞株，用MTT法測(cè)定藥物的細(xì)胞毒性。陽(yáng)性對(duì)照為拉米呋啶(3TC)。結(jié)果證實(shí)本發(fā)明化合物具有顯著的抗HBV作用，且有效濃度低，細(xì)胞毒性較小。表3是聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞的毒性情況及對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制效果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>"未見(jiàn)明顯毒性"系指用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率275。/。；+:"顯示毒性"指細(xì)胞存活率<75%;/:沒(méi)有進(jìn)行抑制率測(cè)試。權(quán)利要求1、聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素在制備抗乙肝病毒藥物中的用途，所述的聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素具有式I的化學(xué)結(jié)構(gòu)其中各取代基及化合物如下表，其中TBC為船椅式構(gòu)象，TC為船式構(gòu)象。2、按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素是鶴慶五味子S.w&omVOT"中聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素。3、按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素是化合物五味子甲素。4、按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素是化合物M米辛o。5、按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素是化合物五味子酯丙。6、按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素是化合物鶴慶五味子丁素。全文摘要本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素在制備抗乙肝病毒藥物中的新用途。本發(fā)明從五味子屬Schisandra植物鶴慶五味子S.wilsoniana中提取聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其抗具有HBV病毒活性。所述的聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)木脂素經(jīng)與陽(yáng)性對(duì)照拉米呋啶藥理試驗(yàn)比較，結(jié)果證實(shí)具有顯著的抗HBV作用，且有效濃度低，細(xì)胞毒性較小，本發(fā)明所述的化合物聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素可作為活性成分制備用于治療乙型肝炎的藥物。文檔編號(hào)A61K31/21GK101375842SQ20071004530公開(kāi)日2009年3月4日申請(qǐng)日期2007年8月27日優(yōu)先權(quán)日2007年8月27日發(fā)明者佩周,陳道峰,馬文輝,海黃申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)