專利名稱：：土鱉干粉提取物的制備及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及中藥，具體涉及從土鱉蟲干粉中提取鎮(zhèn)痛有效部位的工藝，以及由該提取工藝所得到的一系列多肽組分，以及該多肽組分在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
背景技術：
：疼痛不僅是許多疾病的并合癥，而且已經被看作是一類疾病。從疾病層面上講，由各種各樣的疼痛造成的生活質量下降波及了最大量的人群。由于有效的鎮(zhèn)痛劑往往與依賴性相聯(lián)系，所以發(fā)明新的無依賴性的鎮(zhèn)痛劑具有重要價值。土鱉及土鱉干粉在我國傳統(tǒng)醫(yī)學中廣泛應用于治療帶狀皰疹。發(fā)明人根據帶狀皰疹伴隨激烈疼痛及土鱉干粉的治療效果，推斷土鱉干粉中存在鎮(zhèn)痛組分。土鱉及土鱉干粉在我國傳統(tǒng)醫(yī)學中應用時都是口服給藥，土鱉及土鱉干粉經口服給藥的一次劑量在10g左右。這樣大的劑量使病人感到不便。依據土鱉及土鱉干粉的蛋白質性質、蛋白質經口服進入胃可被胃蛋白酶降解為多肽的性質，以及多肽的良好水溶性，發(fā)明人推測土鱉及土鱉干粉的直接水提物和酶解物有可能在不減弱治療效果的前提下減少服藥量。
發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題在于依據土鱉及土鱉干粉的蛋白質性質、蛋白質經口服進入胃可被胃蛋白酶降解為多肽的性質，以及多肽的良好水溶性，研究設計土鱉干粉的提取物的制備和用途。本發(fā)明提供了一種土鱉干粉提取物的制備方法，該方法包括水提法或酶解法。1、水提法土鱉干粉提取物的制備方法，該方法包括下列步驟(1)土鱉水提多肽粗粉的制備將土鱉干粉與蒸餾水按3:100w/v的比例懸浮、50'C士3t:恒溫攪拌60分鐘、過濾、濾液冷凍干燥、得到的水提多肽粗粉Wo(C保存；(2)土鱉水提多肽粗粉的分離與純化將水提多肽粗粉Wo與蒸餾水按6:lw/v的比例溶解、10000轉離心10分鐘、上清液加載到SephadexG25層析柱上、以0.007mo1/L乙酸胺緩沖液洗脫，流速0.8mL/min，紫外檢測波長280nm、收集的餾份按峰合并、冷凍干燥、得到W^Wu、Wra和W^四種水提多肽組分。(3)得到W!、Wn、Wm和Ww四種水提多肽組分制成凍干粉。2、酶解法土鱉干粉提取物的制備方法，該方法包括下列步驟(1)土鱉酶解多肽粗粉的制備將土鱉干粉與蒸餾水按l:10w/v的比例懸浮、得到的懸浮液與模擬胃液2.0gNaCl,3.2g胃蛋白酶，7ml濃HCl，雙蒸水定容于1000ml，pH值為1.2按1:1的比例混合、46r土3t:恒溫振蕩4小時、減壓過濾、濾液用固體NaHC03調pH7.0、3000轉離心5分鐘、收集上清液、冷凍干燥，得到的酶解多肽粗品(Eo)4'C保存；(2)建立土鱉酶解多肽粗粉的分離與純化將酶解多肽粗粉與蒸餾水按5:lw/v的比例溶解、10000轉離心10分鐘、上清液加載到SephadexG25層析柱上、以0.007mo1/L乙酸胺緩沖液洗脫流速0.8mL/min，紫外檢測波長280nm、收集的餾份按峰合并、冷凍干燥、得到E!、En和Em三種多肽組分；(3)得到E^Eu和Em三種多肽組分制成凍干粉。通過測定分離得到的水解多肽組分WIV的HPLC指紋圖譜和HPLC-ESI-MS指紋圖譜，以及Eo、E!、En和Em四種酶解多肽組分的HPLC指紋圖譜和HPLC-ESI-MS指紋圖譜，確定水解多肽組分WTv和酶解多肽組分EhEn和Em多肽的氨基酸序列。鎮(zhèn)痛活性最強的Ww水提多肽組分測定HPLC-ESI-MS之后，選擇適宜的峰測定ESI-MS，根據互補原理分析圖譜(圖4)，得到一種序列H-Thr-Thr-Cys-Asn-Ser-Pro-Met-Leu(Ile)-Glu-Asp-Phe-Ala-Pro-OH.采用LC-MS技術確定ET、Eu和Em三種酶解多肽組分的特征多肽序列.其中^為1)H-Asn-Ser-Tyr-Cys-Met-Asn國Met-Met-Cys-OH和2)H-Gln-Cys-Ala-Pro-Gly-Asp-Arg-Met-Asn-Thr-OH;Eu為3)H-Ala-Gln(Lys)-Phe-Pro國Ala-Pro-Gly-Phe-Gln(Lys)-Thr-Ser-His-Met-Thr-Thr國OH和4)H-Phe-Thr-Ser-Asp陽His陽Ser-Tyr-Asn-Phe陽Leu(Ile)-Val-Gln(Lys)曙Gln(Lys)-OH;Em為5)H-Pro-Gly-Ala-Gln(Lys)-Met-Gly-Pro-Thr墨Ser-Ala-Val-Gly-Gln(Lys)-Ala-Pro-OH和6)H-His-Gly-Val-Met-Arg-His-Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met國OH,Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH。本發(fā)明另一目的是提供了土鱉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。本發(fā)明用小鼠耳腫脹模型評價本發(fā)明分離得到的水解多肽組分WQ、W卜W、Wffl、Ww和酶解多肽組分Eo、E!、En和Em對疼痛的抑制作用。本發(fā)明用小鼠1個月喂養(yǎng)實驗評價本發(fā)明分離得到的水解多肽組分W。、W,、Wu、Wm、Wiv和酶解多肽組分Eo、Et、En和Em的毒性和依賴性。結果表明本發(fā)明的土鱉提取物具有鎮(zhèn)痛活性，未出現(xiàn)任何毒性反應癥狀和耐受性癥狀及成斷反應癥狀。本發(fā)明提供的土鱉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用，所述藥物為土鱉提取物與藥用輔料組成的制劑。為了進一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應當理解為對本發(fā)明的限制。圖l.具體實施過程描述。圖2.W^的HPLC指紋圖譜。圖3.W^的HPLC-ESI-MS指紋圖譜。圖4.WIV的組分之一的HPLC-ESI-MS圖譜。圖5.&的HPLC指紋圖譜。圖6.Eu的HPLC指紋圖譜。圖7.Em的HPLC指紋圖譜。圖8.^的HPLC-ESI-MS指紋圖譜。圖9.En的HPLC-ESI-MS指紋圖譜。圖10.Em的HPLC-ESI-MS指紋圖譜。圖ll.E!的組分之一的HPLC-ESI-MS圖譜。圖12.Ez的組分之二的HPLC-ESI-MS圖譜。圖13.Eu的組分之一的HPLC-ESI-MS圖譜。圖14.En的組分之二的HPLC-ESI-MS圖譜。圖15.Em的組分之一的HPLC-ESI-MS圖譜。具體實施例方式實施例l土鱉水提多肽粗粉的制備將15g土鱉干粉(由干土鱉研磨而得)懸浮于500ml蒸餾水中。得到的懸浮液于50。C恒溫攪拌60分鐘。懸浮液常壓自然過濾,濾液冷凍干燥,得到3.0g(20。/。)土鱉水提多肽粗粉，4'C保存待用。實施例2土鱉水提多肽粗粉的分離與純化SephadexG25經處理后裝柱(2.6X60cm),將0.007mo1/L乙酸胺經0.45nm微孔濾膜過濾后作為緩沖液平衡。3.0g土鱉水提多肽粗粉用0.5ml蒸餾水溶解，10000轉離心10分鐘。上清液上SephadexG25層析柱,以0.007mo1/L乙酸胺緩沖液洗脫，流速0.8mL/min,8min收一管,每管均選用紫外分光光度計光度測量，波長280nm，記錄數據，用MicrosoftExcel做出曲線，按峰形合并餾份，冷凍干燥。得到0.20g(6.7%)Wh0.50g(17%)Wn、0.99g(33%)Wm和0.30g(10.0%)Ww四種水提多肽組分。實施例3Wz、Wu、Wm和W^的鎮(zhèn)痛活性測定將雄性ICR小鼠(22士2g)分為對照組(Wo)，以及W!、Wu、Wm和Ww治療組，每組10只小鼠。Wn、Wm和Ww分別用0.3ml生理鹽水溶解。\^、Wn、Wn#BWIV的灌胃劑量按照劑量(mg/kg"9.01X38mg/只X收率計算，艮卩0.4mg/0.3ml/只Wj、9.1mg/0.3ml/只Wn、12.5mg/0.3ml/只Wm禾口3.2mg/0.3ml/只Ww。Wo組0.3ml/只生理鹽水。將小鼠置于特制塑料圓筒內，尾部暴露在筒外，室內溫度保持在(2o土rc),待動物穩(wěn)定30min后,以輻射熱甩尾法測痛，采用一特制燈罩使其發(fā)出直徑為2mm的光束照在距尾端部約2-3cm處,調節(jié)光源電壓使甩尾潛伏期在6.5-8.5s,兩次測甩尾潛伏期的間隔為5min，共測4次,取平均值作為基礎閾值。給藥后30min、60min、90min、120min、150min禾tH80min各測一次閾值。測得值與基礎值比較,以變化率表示痛閾變化,g卩(給藥后的痛閾-基礎痛閾)/基礎痛閾X100n/c,痛閾超過15s者按15s計算。測定的數據列入表l。表l.服W(Hv后小鼠痛閾的變化(M±SD%)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>0=生理鹽水,11=10,3)與Wo組比較P0.05，b)與Wo組比較PO.01.實施例4W^的量效關系測定按照實施例3的方法，將雄性ICR小鼠(22土2g)分為對照組(Wo)，以及Wjv高劑量組、W^中劑量組和Ww低劑量組，每組10只小鼠。灌胃劑量為3.2mg/0.3m1/只W^(高劑量組)、32嗎/0.3ml/只W^(中劑量組)、3.2|xg/0.3mlARWIV(低劑量組)、0.3ml/只生理鹽水(Wo組)。測定的數據列入表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>Wo二生理鹽水，n-10,a)與Wo組比較P0.05,b)與W。組比較PO.01.實施例5Ww的HPLC指紋圖譜將lmg具有明顯鎮(zhèn)痛活性的Wv用lml三蒸水溶解，得到的樣品溶液過0.2)nm微孔濾膜。然后進行HPLC分析。色譜柱為KromasilC18柱，粒徑5nm，4.6mmX250mm。流動相為甲醇-水(5:95)。檢測波長為280nm。柱溫為室溫。進樣量為10pl。流速為lml/min。得到的HPLC指紋圖譜見圖2。實施例6Ww的HPLC-ESI-MS將lmg具有明顯鎮(zhèn)痛活性的Wv用lml三蒸水溶解，得到的樣品溶液過0.2pm微孔濾膜。然后進行HPLC分析。色譜柱為KromasilC18柱，粒徑5pm,4.6mmX250mm。流動相為甲醇-水(5:95)。檢測波長為280nm。柱溫為室溫。進樣量為10pl。流速為lml/min。得到的HPLC-ESI-MS指紋圖譜見圖3。實施例7Ww中多肽的序列按照實施例5的方法測定WIV的HPLC-ESI-MS之后，選擇適宜的峰測定ESI-MS，根據互補原理分析圖譜(圖4),得到一種序列H-Thr-Thr-Cys-Asn-Ser-Pro-Met-Leu(Ile)-Glu-Asp-Phe-Ala-Pro-OH.實施例8土鱉酶解多肽粗粉的制備根據1995年美國藥典提供的模擬胃液配方(2.0gNaCl,3.2g胃蛋白酶，7ml濃HC1,雙蒸水定容于1000ml，pH值約為1.2)酉己制200ml模擬胃液。將10g土鱉干粉懸浮于100ml蒸餾水中。將得到的懸浮液與100ml模擬胃液混合、46°C土3'C恒溫振蕩器中振蕩4小時、用布氏漏斗抽濾。濾液用固體NaHC03調pH值7.0(有不溶物出現(xiàn))、3000轉離心5分鐘、收集上清液、冷凍干燥。得到酶解多肽粗品(5.5g,收率55%)、命名為Pr-E、4'C保存。實施例9土鱉酶解多肽粗粉的分離與純化按照實施例8的方法，從2g酶解多肽粗品分離到180mg(9X)E!、1440mg(72%)En和380mg(19%)Em三種多肽組分。實施例IOEt、Eu和Em的HPLC指紋圖譜按照實施例5的方法，得到E!、Eu和Em的HPLC指紋圖譜(圖5-7)實施例llEhEn和Em的HPLC-ESI-MS按照實施例6的方法，得到E!、En和Em的HPLC-ESI-MS指紋圖譜(圖8-10)實施例12Ei、En和Em中多肽的序列按照實施例6的方法測定W!v的HPLC-ESI-MS之后，選擇適宜的峰測定ESI-MS，根據互補原理分析圖譜(圖11-15)，En和Em得到六種序列。其中&為1)H-Asn-Ser-Tyr-Cys-Met-Asn-Met-Met-Cys-OH禾口2)H-Gln-Cys-Ala-Pro-Gly-Asp-Arg-Met-Asn-Thr-OH;En為3)H-Ala-Gln(Lys)陽Phe-Pro-Ala-Pro-Gly-Phe-Gln(Lys)-Thr-Ser-His-Met-Thr陽Thr-OH禾口4)H-Phe-Thr-Ser-Asp-His-Ser-Tyr-Asn-Phe-Leu(Ile)-Val-Gln(Lys)-Gln(Lys)-OH;Em為5)H-Pro-Gly-Ala誦Gln(Lys)-Met-Gly-Pro-Thr-Ser-Ala-Val-Gly-Gln(Lys)國Ala-Pro-OH禾口6)H隱His-Gly-Val-Met-Arg-His-Met-Asp隱Phe-Ala-Ala陽Tyr-Met-OH.-Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH。實施例13EH和Em的鎮(zhèn)痛活性測定按照實施例3的方法，將雄性ICR小鼠(22±2g)分為對照組(W0)，以及Et組、En組和Em組，每組10只小鼠。灌胃劑量為0.14mg/0.3ml/只E!、5mg/0.3m1/只Eu、0.31mg/0.3ml/只Em、0.3ml/只生理鹽水(Wo組)。測定的數據列入表3。表3.服W。、E!-m后小鼠痛閾的變化(M±SD%)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>\^=生理鹽水，11=10,3)與Wo組比較P0.05,b)與Wq組比狡PO.01.實施例14Em的量效關系測定按照實施例3的方法，將雄性ICR小鼠(22±2g)分為對照組(Wo)，以及Em高劑量組、Em中劑量組和Em低劑量組，每組10只小鼠。灌胃劑量為0.31mg/0.3ml/只Era(高劑量組)、3.1ng/0.3ml/只Em(中劑量組)、0.3.1pg/0.3ml/只Em(低劑量組)、0.3ml/只生理鹽水(Wo組)。測定的數據列入表4。表4J艮不同劑量WIV后小鼠痛閾的變化(M±SD%)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>Wo:生理鹽水，n-10,a)與Wo組比較P0.05，b)與Wo組比較PO.01.實施例15WIV和Em的急性毒性評價20只雄性ICR小鼠(23±lg)分為2組，每組10只，用WIV和Eml次性灌胃，W^的灌胃劑量為47mg/0.3ml/只，相當于最高有效劑量的15倍。Em的灌胃劑量為34mg/0.3ml/只，大約相當于最高有效劑量的100倍。小鼠按正常條件飼養(yǎng)7天，期間未觀察到任何行為異常。第7天小鼠處死，解剖之后未觀察到任何臟器異常。實施例16EI、EII、EIII和WIV的耐受性評價50只雄性ICR小鼠(31土lg)分為5組，每組10只，用EI、EII、EIII和WIV灌胃，EI灌胃單劑量為0.02184mg/0.3ml/只、EII灌胃單劑量為0.19121mg/0.3m1/只、EIII灌胃單劑量為0.04645mg/0.3ml/只、WIV灌胃單劑量為0.00648mg/0.3m1/只。均相當于中等有效劑量。連續(xù)灌胃30天，未見小鼠出現(xiàn)任何毒性反應癥狀、耐受性癥狀。小鼠停止給藥7天，未見小鼠出現(xiàn)任何戒斷反應癥狀。權利要求1、土鱉提取物的制備方法，其特征在于該方法為水提法，包括下列步驟(1)土鱉水提多肽粗粉的制備將土鱉干粉與蒸餾水按3:100w/v的比例懸浮、50℃±3℃恒溫攪拌60分鐘、過濾、濾液冷凍干燥、得到的水提多肽粗粉4℃保存；(2)土鱉水提多肽粗粉的分離與純化將水提多肽粗粉與蒸餾水按6:1w/v的比例溶解、10000轉離心10分鐘、上清液加載到SephadexG25層析柱上、以0.007mol/L乙酸胺緩沖液洗脫，流速0.8mL/min，紫外檢測波長280nm、收集的餾份按峰合并、冷凍干燥、得到WI、WII、WIII和WIV四種水提多肽組分；(3)得到的WI、WII、WIII和WIV四種水提多肽組分制成凍干粉。2、根據權利要求1所述土鱉提取物的制備方法，其特征在于其中水提多肽組分WIV的多肽序列采用LC-MS技術確定為H-Thr-Thr-Cys-Asn-Ser-Pro-Met-Leu(Ile)-Glu-Asp-Phe-Ala-Pro-OH。3、土鱉提取物的制備方法，其特征在于該方法為酶解法，包括下列步驟(1)土鱉酶解多肽粗粉的制備將土鱉干粉與蒸鎦水按l:10w/v的比例懸浮、得到的懸浮液與模擬胃液2.0gNaCl,3.2g胃蛋白酶，7ml濃HCl,雙蒸水定容于1000ml，pH值為1.2按1:1的比例混合、46'C士3'C恒溫振蕩4小時、減壓過濾、濾液用固體NaHC03調pH7.0、3000轉離心5分鐘、收集上清液、冷凍干燥，得到的酶解多肽粗品4'C保存；(2)土鱉酶解多肽粗粉的分離與純化將上述酶解多肽粗粉與蒸餾水按5:lw/v的比例溶解、10000轉離心10分鐘、上清液加載到SephadexG25層析柱上、以0.007mol/L乙酸胺緩沖液洗脫流速0.8mL/min，紫外檢測波長280nm、收集的餾份按峰合并、冷凍干燥、得到&、En和Em多肽組分；(3)得到的E!、En和Em三種多肽組分制成凍干粉。4、根據權利要求3所述土鱉提取物的制備方法，其特征在于其中酶解多肽組分&、En和Em采用LC-MS技術確定的多肽序列為EI:1)H-Asn-Ser-Tyr-Cys-Met-Asn-Met-Met-Cys-OH禾口2)H-Gln-Cys-Ala-Pro-Gly-Asp-Arg-Met-Asn-Thr-OH;EII:3)H-Ala-Gln(Lys)-Phe-Pro-Ala國Pro-Gly-Phe-Gln(Lys)-Thr-Ser-His-Met國Thr-Thr國OH禾口4)H-Phe-Thr-Ser-Asp隱His-Ser-Tyr國Asn-Phe-Leu(Ile)-Val-Gln(Lys)-Gln(Lys)-OH;5)H-Pro-Gly-Ala曙Gln(Lys)-Met-Gly-Pro-Thr-Ser-Ala-Val-Gly-Gln(Lys)-Ala-Pro-OH禾口6)H-His-Gly-Val-Met-Arg-His-Met-Asp隱Phe-Ala-Ala-Tyr陽Met-OH,Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH。5、一種如權利要求1所述的土鱉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用，其特征在于所述的土鱉提取物含有W卜W、Wm和Ww水提多肽組分。6、一種如權利要求3所述的土鱉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用，其特征在于所述的土鱉提取物含有E!、En和Em酶解多肽組分。7、根據權利要求5或6所述的土鱉提取物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用，其特征在于所述藥物為土鱉提取物與藥用輔料組成的制劑。全文摘要本發(fā)明公開了土鱉干粉提取物的制備方法。本發(fā)明方法包括水提法或酶解法，土鱉干粉先水提或酶解，將水提液或酶解液通過SephadexG25柱層析分離，得到系列多肽組分，再將所分離的多肽組分經冷凍干燥制備成凍干粉。經小鼠耳腫脹模型評價表明，本發(fā)明的土鱉干粉提取物系列多肽組分對于疼痛均有顯著的抑制作用。小鼠1個月喂養(yǎng)實驗表明，本發(fā)明的多肽組分既無毒性也無依賴性。本發(fā)明提供了土鱉干粉提取物系列多肽組分在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。文檔編號A61K9/19GK101390881SQ20071004624公開日2009年3月25日申請日期2007年9月21日優(yōu)先權日2007年9月21日發(fā)明者葉偉東,彭師奇,李春波,偉毛,明趙,蕾魏申請人:浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠