專利名稱：：硫辛酰胺在防治胰島素抵抗中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及硫辛酰胺在提高胰島素敏感性、防治胰島素抵抗中的用途。
背景技術(shù)：
：2型糖尿病是受多種因素影響的復(fù)雜代謝性病癥，源于環(huán)境因素和遺傳易感性之間的相互作用；其可誘發(fā)一系列并發(fā)癥，如心腦血管疾病、高血壓、高脂血癥、神經(jīng)系統(tǒng)病變(如腦中風(fēng))、腎衰竭和腫瘤等等，成為嚴(yán)重影響人類健康的疾病。糖尿病人以每年6%的速度遞增，預(yù)計(jì)在二十年內(nèi)將達(dá)到三億之眾，在我國目前糖尿病人數(shù)已接近3000萬，我國糖尿病和糖尿病前期患病率的迅速增長以及由于該病給人民健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展所帶來的沉重負(fù)擔(dān)，已經(jīng)使糖尿病成為中國嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。2型糖尿病的代表性病理特征是肌肉與脂肪等周邊組織產(chǎn)生胰島素抵抗及胰島P細(xì)胞功能損傷以至胰島素分泌衰減等。至今本領(lǐng)域?qū)Χ叩陌l(fā)生機(jī)制不詳。線粒體是機(jī)體消耗氧和產(chǎn)生ATP的主要場所，在能量代謝和自由基代謝中，均占據(jù)著十分重要的地位。線粒體的氧化磷酸化是依靠線粒體DNA(mtDNA)編碼并在線粒體內(nèi)表達(dá)，線粒體有一套獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄和翻譯體系是半自主性細(xì)胞器。因此，mtDNA及其編碼基因的狀況直接影響線粒體呼吸和ATP合成。線粒體基因突變和功能異常可引起胰島素對(duì)葡萄糖利用的調(diào)節(jié)障礙。再者，隨著膳食結(jié)構(gòu)的改變，大量攝入高脂、高蛋白食物會(huì)導(dǎo)致代謝異常，若游離脂肪酸(FFA)增加超過線粒體e氧化的負(fù)荷，可以產(chǎn)生一系列效應(yīng)(l)長鏈脂肪酰CoA(LCA-CoA)和二乙酰甘油(DAGS)升高在骨骼肌中可以引起胰島素抵抗，人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，F(xiàn)FA抑制基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激的組織對(duì)葡萄糖的利用，降低周圍組織和肝臟對(duì)胰島素的敏感性；(2)FFA可以上調(diào)線粒體內(nèi)膜上解耦聯(lián)蛋白2(UCP-2)的表達(dá)，隨著UCP2的表達(dá)可使線粒體氧化磷酸化解耦聯(lián)，導(dǎo)致線粒體合成ATP的效率降低，線粒體ROS釋放增加，引起ATP耗竭，抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS);(3)直接激活炎癥細(xì)胞釋放細(xì)胞因子(TNF-a，l印tin);TNF-a可抑制脂肪細(xì)胞的IRSP鏈和IRS-1的胰島素刺激的酪氨酸磷酸化，下調(diào)脂肪細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4-GLUT-4，也可使參與調(diào)節(jié)脂肪組織分化和能量儲(chǔ)存的PPARY活性降低。故TNF-a活性增高可導(dǎo)致胰島素抵抗與高胰島素血癥，后者進(jìn)一步促進(jìn)脂肪合成，加重肥胖；但TNF-a本身又可在多方面限制脂肪細(xì)胞進(jìn)一步成熟，形成脂肪堆積，使FFA水平增高。上述事件的發(fā)生將會(huì)導(dǎo)致促氧化和抗氧化機(jī)制的失衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激和活性氧釋放增加，又可引起脂質(zhì)過氧化增加，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物又損傷線粒體DNA，從而抑制呼吸鏈的電子傳遞，進(jìn)一步促進(jìn)活性氧的增多，形成惡性循環(huán)。同時(shí)脂代謝異常導(dǎo)致的"脂毒性"經(jīng)歷了起病初期對(duì)胰島素抵抗的代償，到失代償，直至最后出現(xiàn)3細(xì)胞的凋亡和胰島的結(jié)構(gòu)破壞，P細(xì)胞的功能衰退也由可逆轉(zhuǎn)為不可逆。研究資料表明，F(xiàn)FA可能影響前胰島素原啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄、活化，抑制它的合成速率和mRNA表達(dá)，使胰腺內(nèi)甘油三酯含量增加，持續(xù)的細(xì)胞內(nèi)甘油三酯堆積可以導(dǎo)致0細(xì)胞功能障礙，結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞數(shù)量減少，發(fā)生凋亡。而細(xì)胞內(nèi)甘油三酯堆積是引起P細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌功能障礙的重要原因。因此，線粒體損傷被認(rèn)為是產(chǎn)生糖脂代謝紊亂，導(dǎo)致胰島素抵抗和胰島e細(xì)胞分泌缺陷的重要機(jī)制。預(yù)防線粒體的氧化損傷并促進(jìn)線粒體修復(fù)和生成，改善糖脂代謝是防治胰島素抵抗和2型糖尿病的一種有效途徑。并且，脂肪組織不再單純地被認(rèn)為僅僅是儲(chǔ)存能量的組織，而是具有復(fù)雜代謝和內(nèi)分泌功能的器官，參與調(diào)控機(jī)體的能量代謝。脂肪細(xì)胞的糖脂代謝功能紊亂和分化異?？蓪?dǎo)致胰島素抵抗，誘發(fā)2型糖尿病和心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。正因?yàn)橹窘M織作為內(nèi)分泌器官對(duì)機(jī)體的能量代謝發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，使其成為治療肥胖，2型糖尿病和心血管疾病藥物的靶組織。綜上，盡管本領(lǐng)域?qū)τ谔悄虿〉陌l(fā)病機(jī)制有所了解，然而目前還缺乏防治糖尿病或胰島素抵抗的有效藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供硫辛酰胺在提高胰島素敏感性、防治胰島素抵抗方面的新用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種硫辛酰胺的用途，用于制備提高胰島素敏感性或防治胰島素抵抗的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于調(diào)節(jié)糖代謝或脂代謝。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于提高細(xì)胞內(nèi)過氧化物激活酶轉(zhuǎn)錄因子-Y激活因子-la(PGC-la)的表達(dá)；提高細(xì)胞內(nèi)線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mtTFA)和核呼吸因子1(NRF1)的表達(dá)；提高細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA生成；提高細(xì)胞線粒體傳遞鏈復(fù)合物蛋白(包括復(fù)合物I、復(fù)合物II和/或復(fù)合物III)的表達(dá)和活性；增加細(xì)胞線粒體的數(shù)目和截面積；或促進(jìn)細(xì)胞的耗氧。在另一優(yōu)選例中，所述的線粒體傳遞鏈復(fù)合物包括線粒體傳遞鏈復(fù)合物I、線粒體傳遞鏈復(fù)合物II和/或線粒體傳遞鏈復(fù)合物III。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于促進(jìn)脂肪酸廓清；或提高過氧化物酶增殖物激活受體-a(PPAR-a)和肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶l(L-CPT-l)的表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于促進(jìn)胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)；提高細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶的表達(dá)和活性；抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生；促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)生成；或抑制c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞是脂肪細(xì)胞。在本發(fā)明的第二方面，提供一種體外(優(yōu)選非治療性地)提高細(xì)胞對(duì)于胰島素的敏感性的方法，所述方法包括給予細(xì)胞有效量的硫辛酰胺。在另一優(yōu)選例中，所述的有效量是1-100yraol/L(uM/L)。在另一優(yōu)選例中，所述的有效量是1-10umol/L。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了硫辛酸或硫辛酰胺處理后脂肪細(xì)胞PGC1-a的表達(dá)。A.免疫蛋白印跡分析脂肪細(xì)胞PGC1-a的表達(dá)。B.根據(jù)圖象灰度半定量分析PGC1-a，結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組(不采用硫辛酸或硫辛酰胺處理的脂肪細(xì)胞)的百分?jǐn)?shù)表示，以均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n二5)。*p<0.05,**p<0,01與對(duì)照組相比有顯著性差異。圖2顯示了脂肪細(xì)胞經(jīng)硫辛酸或硫辛酰胺處理后服F1和mtTFA的表達(dá)。3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)硫辛酸或硫辛酰胺刺激24小時(shí)后，抽提總RNA，RT-定量PCR分析NRF1(A)和ratTFA(B)在raRNA水平上的表達(dá)。18SRNA作為內(nèi)參基因，以標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量，結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)表示，以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=5)。*p<0.05，**p<0.01與對(duì)照組相比有顯著性差異。圖3顯示了脂肪細(xì)胞經(jīng)硫辛酸或硫辛酰胺處理后線粒體DNA的表達(dá)。3T3-LI脂肪細(xì)胞經(jīng)硫辛酸或硫辛酰胺刺激24小時(shí)后，應(yīng)用定量PCR的方法分析脂肪細(xì)胞中DNA的含量，分別擴(kuò)增線粒體D-Loop區(qū)域與核18S核糖體基因的產(chǎn)物，以標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量，以線粒體D-Loop/18S脂A的比值進(jìn)行分析。結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)表示，以均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=5).*p<0.05，**p<0.01與對(duì)照組相比有顯著性差異。圖4顯示了脂肪細(xì)胞經(jīng)硫辛酸或硫辛酰胺處理后線粒體蛋白的表達(dá)。A.3T3-LI脂肪細(xì)胞經(jīng)硫辛酸(IOliM)或硫辛酰胺(10^M)刺激24小時(shí)后，抽提總蛋白，免疫蛋白印跡分析線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I，n和in的表達(dá)。B.根據(jù)A的結(jié)果進(jìn)行灰度半定量分析，結(jié)果以相對(duì)于未經(jīng)硫辛酸或硫辛酰胺處理的對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)表示，以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=5)。*p〈0.05，**p<0.01與對(duì)照組相比有顯著性差異。圖5顯示了電鏡分析硫辛酸或硫辛酰胺對(duì)于脂肪細(xì)胞線粒體的作用。A.脂肪細(xì)胞線粒體的形態(tài)(放大倍數(shù)10，000)，脂肪細(xì)胞分化第8天，應(yīng)用硫辛酸(10uM)或硫辛酰胺(10iiM)處理24小時(shí)，對(duì)照組未加硫辛酸和硫辛酰胺。B.線粒體截面積和線粒體密度，取4次試驗(yàn)的結(jié)果的均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤作圖，*p<0.05與對(duì)照組相比有顯著差異。圖6顯示了3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)硫辛酸或硫辛酰胺處理后耗氧的測定。細(xì)胞氧氣消耗的檢測應(yīng)用BD公司的OxygenBiosensorSystem。細(xì)胞用胰酶消化并重懸于培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移到96孔的耗氧測定板。在熒光酶標(biāo)儀(FlexStationII384，MolecularDevices)讀數(shù)1個(gè)小時(shí)，間隔一分鐘，激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長630nm。數(shù)據(jù)采用熒光變化的最大斜率表示。圖7顯示了線粒體復(fù)合物I，n和III活性的檢測。3T3-Ll脂肪細(xì)胞經(jīng)不同濃度的硫辛酸或硫辛酰胺刺激24小時(shí)后，抽提線粒體，分析線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物i，n和in的活性。A:線粒體復(fù)合物I的活性；B:線粒體復(fù)合物II的活性；C:線粒體復(fù)合物III的活性。結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)表示，以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤示值(n=5)。*p<0.05與對(duì)照組相比有顯著性差異，**P〈0.01與對(duì)照組相比有極顯著性差異。圖8顯示了硫辛酰胺對(duì)游離脂肪酸的利用。分化后的細(xì)胞應(yīng)用TNF-a刺激24小時(shí)后，再加入不同濃度的硫辛酰胺作用48小時(shí)，收集上清，測定游離脂肪酸含量。結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組(未加TNFa和硫辛酰胺)的百分?jǐn)?shù)表示，以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤示值(n=5)。輯p〈0.01與對(duì)照組相比有極顯著性差異；Wp〈0.05與TNF-a組相比有顯著性差異，抑p<0.01與TNF-a組相比有極顯著性差異。圖9顯示了PPAR-a和L-CPT-1的表達(dá)。分化后的細(xì)胞應(yīng)用TNF-a刺激24小時(shí)后，再加入硫辛酰胺10uM作用48小時(shí)，定量RT-PCR分析PPAR-a和L-CPT-lmRNA的含量。結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組(未加TNFa和硫辛酰胺)的百分?jǐn)?shù)表示，以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤示值(n=5)。*p〈0.05與對(duì)照組相比有顯著性差異，貼P<0.01與TNF-a組相比有極顯著性差異。圖IO顯示了硫辛酰胺改善胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。分化后的脂肪細(xì)胞應(yīng)用硫辛酰胺或N-乙酰半胱氨酸作用半小時(shí)，再應(yīng)用TNF-a刺激24小時(shí)后，測定胰島素刺激后對(duì)2-脫氧-3H葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率。結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組(未加TNFci、硫辛酰胺和N-乙酰半胱氨酸)的百分?jǐn)?shù)表示，以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤示值(n=5)。承p〈0.05與對(duì)照組相比有顯著性差異，#p〈0.05與TNF-a組相比有顯著性差異。圖11顯示了過氧化氫酶的活性及表達(dá)。分化后的脂肪細(xì)胞應(yīng)用硫辛酰胺作用半小時(shí)，再應(yīng)用TNF-a刺激24小時(shí)后，抽提蛋白分析過氧化氫酶的活性(A),和免疫蛋白印跡分析過氧化氫酶的表達(dá)(B)。結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)表示，以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤示值(n二5)。*p<0.05與對(duì)照組相比有顯著性差異；**p<0.01與對(duì)照組相比有極顯著性差異；#p<0.05與TNF-ct組相比有顯著性差異。圖12顯示了硫辛酰胺抑制TNF-a所致的活性氧產(chǎn)生。分化后的脂肪細(xì)胞應(yīng)用硫辛酰胺或N-乙酰半胱氨酸作用半小時(shí)，再應(yīng)用TNF-a刺激2小時(shí)后，DCF染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定DCF的熒光。圖13顯示了脂肪細(xì)胞內(nèi)線粒體電子傳遞鏈的活性。分化后的脂肪細(xì)胞應(yīng)用硫辛酰胺作用半小時(shí)，再應(yīng)用TNF-ct刺激24小時(shí)后，分離線粒體測定線粒體復(fù)合物的活性。A:線粒體復(fù)合物I的活性；B:線粒體復(fù)合物II的活性；C:線粒體復(fù)合物III的活性。結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)表示，以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤示值(n=5)。*p<0.05與對(duì)照組相比有顯著性差異，**P<0.01與對(duì)照組相比有極顯著性差異；#p<0.05與TNF-a組相比有顯著性差異，#ttp<0.01與TNF-a組相比有極顯著性差異。圖14顯示了脂肪細(xì)胞胞漿內(nèi)ATP的水平。分化后的脂肪細(xì)胞應(yīng)用硫辛酰胺作用半小時(shí)，再應(yīng)用TNF-ci刺激24小時(shí)后，測定細(xì)胞胞漿內(nèi)ATP的含量。結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)表示，以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤示值(n=5)。**p<0.01與對(duì)照組相比有極顯著性差異；#p〈0.05與TNF-a組相比有顯著性差異，P<0.01與TNF-a組相比有極顯著性差異。圖15顯示了p-JNK的表達(dá)。分化后的脂肪細(xì)胞應(yīng)用硫辛酰胺作用半小時(shí)，再應(yīng)用TNF-a刺激24小時(shí)后，免疫蛋白印跡分析P-JNK的表達(dá)。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究，首次揭示硫辛酰胺對(duì)于促進(jìn)胰島素敏感性和防治胰島素抵抗具有極其優(yōu)異的效果。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。具體地說，本發(fā)明人以脂肪細(xì)胞作為研究模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫辛酰胺可顯著增加脂肪細(xì)胞線粒體的數(shù)量和體積，增加線粒體電子傳遞鏈中復(fù)合物i，n，in蛋白的表達(dá)和酶活性。這些變化伴隨著調(diào)控線粒體生成的轉(zhuǎn)錄因子過氧化物激活酶轉(zhuǎn)錄因子-Y激活因子-la(PGC-la)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mtTFA)和核呼吸因子l(NRF1)的表達(dá)，表明硫辛酰胺可以顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞中線粒體生成和功能。進(jìn)一步在腫瘤細(xì)胞壞死因子(TNF-a)誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞脂肪分解的模型中，應(yīng)用硫辛酰胺干預(yù)發(fā)現(xiàn)硫辛酰胺通過逆轉(zhuǎn)TNF-ci抑制與脂肪酸氧化相關(guān)的過氧化物激活酶轉(zhuǎn)錄因子-a(PPAR-a)和肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)的表達(dá)而改善脂質(zhì)代謝，促進(jìn)游離脂肪酸的利用；同時(shí)在TNF-a誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的模型中，應(yīng)用硫辛酰胺進(jìn)行早期干預(yù)，發(fā)現(xiàn)硫辛酰胺可通過上調(diào)過氧化氫酶的表達(dá)和增加其活性，直接或間接清除由TNF-a所致的活性氧過多產(chǎn)生，修復(fù)線粒體傳遞鏈復(fù)合體的酶活性，增加細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)的合成；同時(shí)抑制了TNF-a激活的c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)激酶的活化，改善了胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)了胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，增加了脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。硫辛酰胺硫辛酰胺(Lipoamide，LM)是一種至今被研究很少的化合物，一般被用作維生素類補(bǔ)充劑。并且，硫辛酰胺是硫辛酸的一種衍生物，其具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)式(I)本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，硫辛酰胺的體外清除氧自由基的能力顯著強(qiáng)于硫辛酸，并且其在糖尿病的研究中未見有報(bào)道。硫辛酰胺的異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前體也被包括在本發(fā)明中，只要它們具有與硫辛酰胺相同或接近的調(diào)節(jié)糖脂代謝、促進(jìn)胰島素敏感性或防治胰島素抵抗的功能。所述的"前體"指當(dāng)用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ煤?，該化合物的前體在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行代謝或化學(xué)反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)式(I)的一種化合物或其類似物。所述的硫辛酰胺或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前體可通過化學(xué)合成的方式獲得。用途本發(fā)明提供了硫辛酰胺或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物的用途，用于制備調(diào)節(jié)糖脂代謝、促進(jìn)胰島素敏感性、或防治胰島素抵抗的組合物。本發(fā)明人比較了硫辛酸與硫辛酰胺在作用于脂肪細(xì)胞后，脂肪細(xì)胞的線粒體生成情況。首先體外誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化成為成熟的脂肪細(xì)胞，應(yīng)用不同濃度的硫辛酸或硫辛酰胺處理，然后觀察兩者對(duì)線粒體生成的作用，包括觀察線粒體數(shù)目，體積，線粒體蛋白及線粒體DNA，線粒體耗氧及電子傳遞連的酶活性，涉及線粒體生成的轉(zhuǎn)錄因子的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫辛酰胺可極其顯著地提高細(xì)胞內(nèi)過氧化物激活酶轉(zhuǎn)錄因子-Y激活因子-la(PGC-la)的表達(dá)、提高細(xì)胞內(nèi)線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mtTFA)和核呼吸因子1(NRF1)的表達(dá)、提高細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA生成、提高細(xì)胞線粒體傳遞鏈復(fù)合物蛋白(包括復(fù)合物I、復(fù)合物n和/或復(fù)合物ni)的表達(dá)和活性、增加細(xì)胞線粒體的數(shù)目和截面積、促進(jìn)細(xì)胞的耗氧。并且，硫辛酰胺在非常低的濃度(如約l-10uM)下即可產(chǎn)生顯著的效應(yīng)；而硫辛酸只能在較高的濃度(如約100uM)下上調(diào)PGC-la、mtTFA、NRF1表達(dá)，但對(duì)于線粒體面積和數(shù)目無顯著效應(yīng)、對(duì)于線粒體傳遞鏈復(fù)合物的表達(dá)無顯著影響，對(duì)于線粒體耗氧影響也不明顯。因此可見，硫辛酰胺對(duì)于促進(jìn)線粒體生成和功能具有顯著意義。本發(fā)明人還建立了脂肪分解的體外模型，分化后的細(xì)胞用含有TNF-a的培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)并建立了脂肪細(xì)胞脂肪分解模型。應(yīng)用硫辛酰胺或N-乙酰半胱氨酸干預(yù)實(shí)驗(yàn)，先應(yīng)用TNF-a刺激，再加入不同濃度的硫辛酰胺作用，然后觀察游離脂肪酸的變化，及涉及與脂肪酸氧化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫辛酰胺可極其顯著地促進(jìn)脂肪酸廓清效應(yīng)，以及提高過氧化物酶增殖物激活受體-a(PPAR-a)和L-CPT-1的表達(dá)。因此可見，硫辛酰胺對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞的脂代謝是有用的。本發(fā)明人還建立了脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型，分化后的脂肪細(xì)胞用含有TNF-a培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)并建立胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞模型。應(yīng)用硫辛酰胺或N-乙酰半胱氨酸干預(yù)實(shí)驗(yàn)，先將藥物與脂肪細(xì)胞孵育，再應(yīng)用TNF-a處理24小時(shí)，然后觀察藥物干預(yù)前后，脂肪細(xì)胞對(duì)2-脫氧-D-[1」H]葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體的活性，活性氧，過氧化氫酶的表達(dá)及活性，以及胞漿內(nèi)ATP的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫辛酰胺可極其顯著地促進(jìn)胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，提高細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶的表達(dá)和活性，抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ATP生成，抑制c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的表達(dá)。因此可見，硫辛酰胺對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖代謝是有用的，并且，硫辛酰胺可促進(jìn)胰島素敏感性，防止胰島素抵抗。組合物如本文所用，術(shù)語"本發(fā)明的組合物"包括藥物組合物和飲食補(bǔ)充劑(如保健品組合物)，只要它們含有硫辛酰胺作為促進(jìn)胰島素敏感性、防治胰島素抵抗或調(diào)節(jié)糖脂代謝的活性成分。通常，所述的飲食補(bǔ)充劑含有0.000001-20wt。/。(優(yōu)選的為0.00005-10wt%;更優(yōu)選0.00001-5wt。/。)的硫辛酰胺或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物；(b)食品上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，含有(a)有效量(如0.000001-20wt。/。；優(yōu)選的為0.00005-10wt%;更優(yōu)選0.00001-5wt%)的硫辛酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的"成分是適用于人和/或動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的載體"是用于將本發(fā)明的硫辛酰胺或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物傳送給動(dòng)物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。本發(fā)明所述的組合物的劑型可以是多種多樣的，只要是能夠使活性成分有效地到達(dá)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的劑型都是可以的。比如可選自片劑、膠囊、粉末、顆粒、糖漿、溶液、懸浮液、或氣霧劑。其中硫辛酰胺可以存在于適宜的固體或液體的載體或稀釋液中。從易于制備和給藥的立場看，優(yōu)選的組合物是固態(tài)組合物，尤其是片劑和固體填充或液體填充的膠囊。組合物的口服給藥是優(yōu)選的。所用的活性成分的有效劑量可隨所用的化合物、給藥的模式或待治療的疾病的嚴(yán)重程度而變化。然而，通常當(dāng)本發(fā)明的硫辛酰胺或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物每天以約O.卜100mg/kg動(dòng)物體重的劑量給予時(shí)，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以1-3次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥。對(duì)大部分大型哺乳動(dòng)物而言，每天的總劑量約為0.卜1000mg，較佳地約為l-500rag。適用于內(nèi)服的劑量形式，包含與固態(tài)或液態(tài)藥學(xué)上可接受的載體密切混合的約1-200rag的活性化合物。可調(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少或增加。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)首次揭示硫辛酰胺對(duì)于調(diào)節(jié)糖脂代謝、促進(jìn)胰島素敏感性或防治胰島素抵抗具有極其優(yōu)異的效果，并且其效果明顯優(yōu)于硫辛酸等其它化合物。(2)僅需要較低劑量的硫辛酰胺就可發(fā)揮良好的效應(yīng)，成本低廉，從而為糖脂代謝紊亂相關(guān)藥物、糖尿病藥物的開發(fā)提供了新的途徑。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法1.試劑地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤；抗PGC-lci抗體購于美國SantaCruz公司；抗微管蛋白(tubulin)抗體購于美國Sigma公司；TRIzol購于美國Invitrogen公司；抗復(fù)合物I,II，III的抗體購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購于美國Proraega公司；游離脂肪酸測定試劑盒購自南京建成生物試劑公司；熱啟動(dòng)Taq酶購于日本TaKaRa公司；D-loop,PPAR-a,L-CPT1，NRF1;mtTFA和18SRNA引物由上海博亞公司合成；硫辛酰胺購自于Fluka公司，N-乙酰半胱氨酸購自德國Calbiochem公司；實(shí)時(shí)定量PCR測定試劑盒購自大連寶生物(TakaraBio)公司;p-JNK抗體購自美國CellSignalingTechnology公司；小鼠月中瘤壞死因子a(Tumornecrosisfactor—a，TNF—a)購自美國R&D公司；2-脫氧-D-[1-3H]葡萄糖(2-D0G)購自英國Amersham公司；BCA蛋白測定試盒和WestPicochemilurainescent發(fā)光底物來自美國PIERCE公司；R-硫辛酸(簡稱硫辛酸)由德國K.Wessel博士贈(zèng)送(或也可商購，如可購自上海新嵩巍有限公司)；其余的細(xì)胞培養(yǎng)的試劑均購自于美國Invitrogen公司。2.方法細(xì)胞培養(yǎng)和脂肪細(xì)胞分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞(購自ATCC，Cat.No.CL-173)用完全培養(yǎng)液(DMEM+10%胎牛血清+青、鏈霉素各100u/ml)，在37。C孵箱(5。/。二氧化碳，95%空氣)中培養(yǎng)，每2天換液1次。待細(xì)胞生長至完全融合后2天(第0天)，開始誘導(dǎo)分化，具體步驟為將培養(yǎng)液換成含0.5raMIBMX、0.25pM地塞米松和1yM胰島素的完全培養(yǎng)液；48h后，撤去IBMX和地塞米松，使完全培養(yǎng)液中只含有l(wèi)UM胰島素；2天后換液，撤去胰島素，使用不含有任何誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基；以后每2天換液1次，直至第8天95%以上細(xì)胞已分化為成熟的脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞分化第8天應(yīng)用硫辛酰胺(IO幽)或/硫辛酸(10幽)作用24小時(shí)后，2.5%戊二醛過夜固定，細(xì)胞經(jīng)10g/L鋨酸后固定、丙酮脫水、浸透、樹脂包埋、超薄切片、鈾-鉛復(fù)染、透射電鏡下觀察，計(jì)數(shù)并觀察10個(gè)脂肪細(xì)胞，定量分析線粒體數(shù)目和線粒體的截面積。線粒體DNA含量的測定總DMA使用DNA提取試劑盒提取(U-geneBiotechCo.LTD,China)。實(shí)時(shí)定量PCR使用MasterPremix(T0Y0B0CO.，LTDOsaka,日本)。引物序列如表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>PCR條件95°C，lOmin，然后進(jìn)行40循環(huán)為95°C，lmin，55°C，lmin，72°C，1min。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線分別進(jìn)行相對(duì)定量，以線粒體D-loop/18SRNA的比值進(jìn)行比較。總RNA抽提和RT-PCR按試劑盒說明，用TRIzol試劑提取細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度儀測定RNA的純度和含量。常規(guī)方法設(shè)計(jì)引物序列，由上海賽百盛公司合成。引物序列如表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>RT-PCR反應(yīng)1ug總RNA合成cDNA。總體積20w1，42。C反應(yīng)60min，95°C反應(yīng)5rain。合成的cDNA，使用Takara公司的DDR305AExTaq(Hotstartversion)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件95°C，10min，然后進(jìn)行40循環(huán)95°C，lmin，55°C，1min,72°C，1min。數(shù)據(jù)表示為2—Aet，ACt=Ct-Ct18S。免疫蛋白印跡各種處理因素作用后，棄去培養(yǎng)液，用PBS充分清洗，加入細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮匙刮下細(xì)胞，冰上孵育30分鐘，1,3000r/min4°C離心10分鐘，收集上清即為細(xì)胞蛋白提取液。應(yīng)用Bradford法進(jìn)行總蛋白定量，-8(TC保存。蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，轉(zhuǎn)移至固相支持體硝酸纖維素膜上，室溫下封閉1小時(shí)，加入一抗PGC-la(1:1000)，微管蛋白(tubulin,1:5000)，復(fù)合物I(1:1000)，復(fù)合物II(1:1000)，復(fù)合物III(1:1000)，4i:孵育過夜，洗膜，加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體)，室溫孵育i小時(shí)，ECL發(fā)光，X線膠片感光。應(yīng)用NIHImage圖像分析軟件對(duì)蛋白條帶的密度進(jìn)行半定量分析。細(xì)胞耗氧的檢測應(yīng)用BD公司的OxygenBiosensorSystem(BDBiosciences)的耗氧板檢測細(xì)胞耗氧。細(xì)胞用胰酶消化并重懸于培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移到96孔的耗氧測定板。在熒光酶標(biāo)儀(FlexStationII384，MolecularDevices)讀數(shù)1小時(shí)，每間隔l分鐘收集熒光，激發(fā)波長485nra，發(fā)射波長630nm(參見Schieke，S.M.等，(2006)，Themammaliantargetofrapamycin(mTOR)pathwayregulatesmitochondrialoxygenconsumptionandoxidativecapacity.J"BiolChem281，27643-27652)。數(shù)據(jù)采用熒光變化的最大斜率表示。線粒體復(fù)合物i，n和ni活性的檢測細(xì)胞培養(yǎng)在lOOram細(xì)胞培養(yǎng)板中，經(jīng)上述處理后，用PBS洗一次，刮下細(xì)胞，在低滲溶液中用玻璃勻衆(zhòng)器手動(dòng)研磨20次，800grcf，4。C離心5分鐘，收取上清，1，1000g、4。C離心30分鐘，所得沉淀為線粒體，用于復(fù)合物的活性測定。復(fù)合物I的測定方法為在反應(yīng)液(50mMTrispH8.1，0.1%BSA，lyMAntimycinA，0.2raM線，0.05mMCoQl，O.4mMDCPIP)中加入終濃度為50ng/ml的線粒體，用終濃度為0.2mM的NADH啟動(dòng)反應(yīng)，于600nm測定吸光度的降低速度，以此作為活性的反映。復(fù)合物II的測定方法為在反應(yīng)液(50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.8，2mMEDTA，0.1%BSA，3uM魚藤酮，luMAntimycinA，0.2mMNaN3，0.05mMCoQl，0.2mMATP，0.4mMDCPIP)中加入終濃度為lOOyg/ral的線粒體，于600nm測定吸光度的降低速度，以此作為活性的反映。復(fù)合物III的測定方法為在反應(yīng)液(50mMTris-HC1,pH7.8，0.2mMNaN3，0.08%tween-20，0.1%BSA，0.2mM還原性泛醌(decylubiquinol)中加入終濃度為15^g/ral的線粒體，用終濃度為40uM的細(xì)胞色素c啟動(dòng)反應(yīng)，于550nm測定吸光度的降低速度，以此作為活性的反映。建立脂肪分解的體外模型分化后的細(xì)胞用含有TNF-a(20ng/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)，誘導(dǎo)并建立脂肪細(xì)胞脂肪分解的模型。游離脂肪酸測定參照南京建成公司說明書操作，誘導(dǎo)8-10天后的3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞，0.2%BSA-DMEM孵育過夜，PBS洗兩遍，加入含有TNF-a(20ng/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)；或應(yīng)用TNF-a處理24小時(shí)后，加入不同濃度的硫辛酰胺再共同孵育48小時(shí)，收集上清。用改良比色法測定游離脂肪酸，經(jīng)抽提和銅皂化，顯色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定550nm光密度進(jìn)行比色定量。建立3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型分化后的細(xì)胞用含有TNF-a(20ng/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)并建立胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞模型。胰島素抵抗的特征胰島素刺激的葡萄糖攝取下降，抑制胰島素受體及受體底物(IKS)-1/(IRS)-2酪氨酸磷酸化，而促進(jìn)絲氨酸、蘇氨酸磷酸化，從而干擾胰島素受體及其下游IRS-磷酯酰肌醇3激酶(PI-3K)通路的信號(hào)傳導(dǎo)、下調(diào)脂肪細(xì)胞細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT)-4的基因表達(dá)及(GLUT)-4由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)測定在24孔板中，誘導(dǎo)后8天的細(xì)胞經(jīng)過24小時(shí)0.2%BSA-DMEM孵育過夜后，PBS洗兩遍，用含有TNF-a(20ng/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)；或應(yīng)用硫辛酰胺，N-乙酰半胱氨酸預(yù)先處理半小時(shí)后，再加入TNF-a共同培養(yǎng)24小時(shí)后，用預(yù)熱37。C的PBS洗三遍，加入不含有或含有100nM胰島素的Krebs-Ringer磷酸緩沖液(KRP，1.32mM氯化鈉，4.71mM氯化鉀，47mM氯化鈣，1.24mM硫酸鎂，2.48mM磷酸三鈉，10mMHEPES，pH7.4)0.5ml，孵育30min后，加入終濃度為O.5nCi/ml的用KRP配制的2-DOG50"1，孵育10min，吸出上清，用含有IOmM葡萄糖的冰冷PBS洗三遍。細(xì)胞用O.1N氫氧化鈉溶液裂解，吸取0.5ml加入預(yù)先配制的3.5ral閃爍液(以1份曲吹通X-IOO與2.5份甲苯，混合搖勻，1000ml中加入2.5-二苯基噁唑(PP0)6.0g;1.4-雙-2-(5-苯基噁唑)苯(P0P0P)0.30g，搖勻后避光保存)中，振蕩混勻，靜置隔夜，用液閃計(jì)數(shù)儀(BeckmanInstruments)測定d.p.m值，并用裂解液的蛋白含量校正d.p.m值。過氧化氫酶活性的測定在24孔板中，誘導(dǎo)后8天的細(xì)胞經(jīng)過24小時(shí)0.2%BSA-麗EM孵育過夜后，PBS洗兩遍，用含有TNF-a(20ng/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)；或應(yīng)用不同濃度的硫辛酰胺預(yù)先處理半小時(shí)后，再加入TNF-a共同培養(yǎng)24小時(shí)后，過氧化氫酶可以催化過氧化氫產(chǎn)生水和氧氣。殘余的過氧化氫在過氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化產(chǎn)生紅色的產(chǎn)物(N-(4-antipyry1)-3-chloro-5-sUIfonate-p-benzoquinonemonoimine)，最大吸收波長為520nm。用過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中過氧化氫酶的酶活力。過氧化氫酶表達(dá)的測定采用常規(guī)的免疫蛋白印跡法?？惯^氧化氫酶的抗體購自德國calbiochem公司。細(xì)胞胞漿內(nèi)ATP的含量胞漿內(nèi)ATP的測定應(yīng)用ATP熒光酶的分析測定試劑盒測定。細(xì)胞生長于96孔板中，誘導(dǎo)后8天的細(xì)胞經(jīng)過24小時(shí)0.2%BSA-DMEM孵育過夜后，PBS洗兩遍，用含有TNF-a(20ng/ral)培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)；或應(yīng)用不同濃度的硫辛酰胺預(yù)先處理半小時(shí)后，再加入TNF-a共同培養(yǎng)24小時(shí)后。吸棄上清，裂解細(xì)胞，取80u1裂解上清液與100u1的含有熒光酶的反應(yīng)液(IOmg/ml)作用，應(yīng)用酶標(biāo)儀讀取數(shù)值?；钚匝醯臏y定應(yīng)用分子探針2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽OW)CF-DA)標(biāo)記脂肪細(xì)胞，H2DCFDA能自由透過細(xì)胞膜，在胞漿內(nèi)被酯酶分解成二氫-二氯熒光黃，后者被過氧化氫轉(zhuǎn)化為發(fā)熒光的2'，7'-二氯熒光黃(DCF)，通過流式細(xì)胞儀測定熒光產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行相對(duì)定量分析。脂肪細(xì)胞用含有TNF-a(20ng/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)；或應(yīng)用不同濃度的硫辛酰胺預(yù)先處理半小時(shí)，再加入TNF-a共同培養(yǎng)24小時(shí)后，與H2DCFDA(10pM)孵育30分鐘后，胰酶消化，收集后，計(jì)數(shù)IO，OOO個(gè)活細(xì)胞，再加入TNF-a共同培養(yǎng)24小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測和分析(FACSCaliburBectonDickinson)。統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)值以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)或者方差分析(ANOVA)，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為處理組和對(duì)照組之間有顯著性差異，p<0.01被認(rèn)為具有極顯著性差異。II.具體實(shí)施例實(shí)施例1硫辛酸或硫辛酰胺誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞線粒體生成基因的表達(dá)過氧化物激活酶轉(zhuǎn)錄因子-Y激活因子-la(PGC-la)是能夠促進(jìn)線粒體生成和線粒體脂肪酸氧化的輔助增強(qiáng)子，脂肪細(xì)胞與硫辛酸(LA)或/硫辛酰胺作用24小時(shí)后，應(yīng)用免疫蛋白印跡的方法觀察PGC-la的表達(dá)。圖1顯示，硫辛酸能夠上調(diào)PGC-1a，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，100ixM硫辛酸產(chǎn)生最大效應(yīng)，與對(duì)照組相比有顯著性差異。然而，硫辛酰胺能夠從0.1-100uM上調(diào)PGC-la的表達(dá)，顯示出鐘形曲線，l.O-lOiiM與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，最大效應(yīng)發(fā)生在10yM。由圖1還可知，硫辛酰胺在較低劑量即可顯著上調(diào)PGC-la，而達(dá)到相同效應(yīng)需要硫辛酸的劑量大大提高。轉(zhuǎn)錄因子NRF1和mtTFA都涉及到調(diào)控核基因編碼線粒體蛋白表達(dá)和線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。應(yīng)用RT-定量PCR來檢測NRF1和ratTFA在mRNA水平上的表達(dá)，脂肪細(xì)胞分別與濃度為0.1-100wM的硫辛酸或硫辛酰胺作用24小時(shí)，結(jié)果觀察到硫辛酸能夠上調(diào)NRFl和mtTFA的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，硫辛酸在100uM時(shí)能夠顯著增加NRFl的表達(dá)(是對(duì)照組的151±15.8%，p<0.05)(見圖2A);同時(shí)能夠顯著增加mtTFA的表達(dá)(是對(duì)照組的123±9.2%，p<0.05)(見圖2B)。硫辛酰胺能夠從0.1-100nM上調(diào)NRF1和mtTFA的表達(dá)，顯示出鐘形曲線的效應(yīng)，1.0-10ixM顯著上調(diào)NRF1的表達(dá)(是對(duì)照組的150土11.2%，p<0.01;是對(duì)照組的152±21.3%，p<0.05);10uM硫辛酰胺顯著上調(diào)mtTFA的表達(dá)(是對(duì)照組的128±4.9%，p<0.01)。實(shí)施例2硫辛酸或硫辛酰胺誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞線粒體DNA的生成線粒體D-loop是調(diào)控線粒體DNA重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄起始部位，應(yīng)用定量PCR的方法檢測硫辛酸或硫辛酰胺對(duì)脂肪細(xì)胞線粒體DNA的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫辛酰胺在1.0-10uM時(shí)顯著增加了mtD-lo叩/18SRNA的比值(分別是對(duì)照組的164±23.7%，p<0.05和191±0.5%，p〈0.01);硫辛酸在100"M時(shí)顯著增加了mtD-loop/18SRNA的比值(是對(duì)照組的153±9.6%，p<0.01)，見圖3。實(shí)施例3硫辛酸或硫辛酰胺誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞線粒體傳遞鏈復(fù)合物蛋白表達(dá)免疫蛋白印跡分析脂肪細(xì)胞經(jīng)應(yīng)用10yM硫辛酸或硫辛酰胺作用后線粒體傳遞鏈復(fù)合物蛋白的表達(dá)，10ixM的硫辛酰胺可顯著增加線粒體傳遞鏈復(fù)合物蛋白I的表達(dá)(是對(duì)照組的202±26.3%，p〈0.05);顯著增加線粒體傳遞鏈復(fù)合物蛋白II的表達(dá)(是對(duì)照組的176±6.3%，p〈0.01);顯著增加線粒體傳遞鏈復(fù)合物蛋白III的表達(dá)(是對(duì)照組的167±6.3%，p<0.01);然而，10uM的硫辛酸未顯示出任何效應(yīng)，見圖4A和圖4B。實(shí)施例4電鏡觀察脂肪細(xì)胞的線粒體本發(fā)明人應(yīng)用電鏡觀察硫辛酸(10^M)或硫辛酰胺(10pM)對(duì)脂肪細(xì)胞線粒體的數(shù)目及結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果見圖5A和圖5B，定量分析顯示，lOyM的硫辛酸未能增加線粒體的面積和數(shù)目；10uM的硫辛酰胺顯著增加了脂肪細(xì)胞線粒體的截面積(是對(duì)照組的178±22%，P<0.05)，亦同時(shí)增加了線粒體的數(shù)目(是對(duì)照組的165±18%，p<0.05)。實(shí)施例5硫辛酸或硫辛酰胺促進(jìn)細(xì)胞的耗氧本發(fā)明人進(jìn)一步觀察脂肪細(xì)胞的線粒體生成是否伴隨耗氧的變化。脂肪細(xì)胞分別與10uM的硫辛酸或10uM的硫辛酰胺作用24小時(shí)后，測定細(xì)胞的耗氧情況。結(jié)果見圖6，10uM的硫辛酰胺顯著增加了脂肪細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧，10yM的硫辛酸沒有產(chǎn)生效應(yīng)。實(shí)施例6硫辛酸或硫辛酰胺促進(jìn)脂昉細(xì)胞線粒體傳遞鏈復(fù)合物的活性本發(fā)明人還測定了硫辛酸或硫辛酰胺對(duì)于脂肪細(xì)胞線粒體傳遞鏈復(fù)合物活性的影響。硫辛酰胺在1.0-IOWM時(shí)顯著增加了線粒體傳遞鏈復(fù)合物I的活性(分別是對(duì)照組的117±6.2%，p<0.05;120±7.4%，p<0.05);而硫辛酸(O.1-100uM)沒有產(chǎn)生顯著影響，見圖7A。硫辛酰胺在1.0-10pM時(shí)顯著增了線粒體傳遞鏈復(fù)合物II的活性(分別是對(duì)照組的114±3.9%，p<0.05和125±2.9%，p<0.01);而硫辛酸在100(iM顯著增加了線粒體傳遞鏈復(fù)合物II的活性(是對(duì)照組116±3.4%，p〈0.05)，見圖7B。10uM的硫辛酰胺顯著增加了線粒體傳遞鏈復(fù)合物in的活性(是對(duì)照組的120±6.4%,p<0.05)，見圖7C;而硫辛酸(0.1-100uM)對(duì)于線粒體電子傳遞鏈III的活性沒有顯著影響。實(shí)施例7硫辛酰胺促進(jìn)脂肪酸廓清效應(yīng)將脂肪細(xì)胞經(jīng)TNF-a作用24小時(shí)后，加入不同濃度的硫辛酰胺再作用48小時(shí)，檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清中脂肪酸的含量。結(jié)果見圖8，由圖可見，TNF-a可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞分解，上清中游離脂肪酸含量明顯增加，是對(duì)照組的238%(p〈0.01);加入硫辛酰胺后可顯著降低上清中游離脂肪酸的含量，lOixM硫辛酰胺處理后，脂肪酸是對(duì)照組的128%(與TNF-a組相比，p<0.05)，lOOyM硫辛酰胺處理后，脂肪酸顯著下降，是對(duì)照組的116%(與TNF-a組相比，p<0.01)。實(shí)施例8硫辛酰胺上調(diào)TNF-a抑制的PPAR-a和L-CPT-1mRNA的表達(dá)將脂肪細(xì)胞經(jīng)TNF-a作用24小時(shí)后，加入100PM的硫辛酰胺再作用48小時(shí)，抽提RNA,進(jìn)行定量RT-PCR分析。結(jié)果顯示，TNF-a可以顯著抑制脂肪細(xì)胞中PPAR-a和L-CPT-1mRNA(p<0.05)的表達(dá)，IOOuM的硫辛酰胺干預(yù)后可以明顯上調(diào)PPAR-a和L-CPT-lmRNA(p<0.01)的表達(dá)，見圖9。實(shí)施例9硫辛酰胺改善TNF-a抑制的胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)將脂肪細(xì)胞用10yM硫辛酰胺預(yù)處理半小時(shí)后，再加入TNF-a20ng/ml孵育24小時(shí)，觀察對(duì)于胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的效應(yīng)。同時(shí)還設(shè)立加入N-乙酰半胱氨酸(NAC)的實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)比。結(jié)果表明TNF-a顯著抑制了胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，與對(duì)照組相比，僅是對(duì)照組的40.5±5.9%(p<0.05);應(yīng)用硫辛酰胺10"M預(yù)處理后，可以顯著逆轉(zhuǎn)TNF-a的抑制效應(yīng)，胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)增加為對(duì)照組的63.6±3.7%(與TNF-a組相比p〈0.05);而應(yīng)用50uMN-乙酰半胱氨酸預(yù)處理后，并沒有顯著改善TNF-a的效應(yīng)，見圖10。實(shí)施例10硫辛酰胺修復(fù)TNF-ct抑制的過氧化氫酶的表達(dá)和活性測定過氧化氫酶是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以催化過氧化氫產(chǎn)生水和氧氣，從而清除體內(nèi)過多的過氧化氫。本發(fā)明人測定了經(jīng)硫辛酰胺處理后細(xì)胞的過氧化氫酶的活性以及表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞應(yīng)用TNF-a作用24小時(shí)后，過氧化氫酶的活性及表達(dá)都同時(shí)下降，與對(duì)照組相比有顯著性差異，見圖11A;應(yīng)用不同濃度的硫辛酰胺預(yù)處理半小時(shí)后，再加入TNF-a作用24小時(shí)，結(jié)果顯示硫辛酰胺可以上調(diào)過氧化氫酶的活性和表達(dá)，上調(diào)的最大效應(yīng)發(fā)生在100uM時(shí)(與TNF-a組相比，P〈0.05)，見圖IIB。實(shí)施例11硫辛酰胺抑制TNF-ci誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生應(yīng)用TNF-a刺激脂肪細(xì)胞后，脂肪細(xì)胞經(jīng)DCF染色，流式細(xì)胞儀測定DCF的熒光。結(jié)果見圖12。結(jié)果表明，TNF-ci可以顯著刺激脂肪細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，是對(duì)照組的152%(p〈0.05)，脂肪細(xì)胞經(jīng)應(yīng)用硫辛酰胺10iiM預(yù)處理后，可以顯著抑制TNF-a刺激的活性氧產(chǎn)生，僅為對(duì)照組的97%。實(shí)施例12硫辛酰胺修復(fù)TNF-a抑制的線粒體傳遞鏈復(fù)合物的活性脂肪細(xì)胞應(yīng)用硫辛酰胺IOUM預(yù)處理半小時(shí)后，再加入TNF-a20ng/ml孵育24小時(shí)后，測定線粒體傳遞鏈復(fù)合物的活性。TNF-a處理后細(xì)胞的復(fù)合物1的活性顯著下降，是對(duì)照組的84%(p<0.05)，10uM的硫辛酰胺處理后可以顯著提高復(fù)合物I的活性，是對(duì)照組的105%(與TNF-a組相比，p<0.05)，見圖13A;TNF-a可以顯著降低復(fù)合物II的活性，是對(duì)照組的74%(p<0.05)，10yM的硫辛酰胺可以顯著提高復(fù)合物II的活性，是對(duì)照組的103%(與TNF-Cl組相比，p<0.05)，見圖13B;TNF-a可以顯著降低復(fù)合物III的活性，是對(duì)照組的83%(p<0.01)，10wM的硫辛酰胺可以顯著提高復(fù)合物II的活性，是對(duì)照組的110%(與TNF-a組相比，p<0.05)，見圖13C。實(shí)施例13硫辛酰胺逆轉(zhuǎn)TNF-a抑制的ATP生成脂肪細(xì)胞應(yīng)用硫辛酰胺IOixM預(yù)處理半小時(shí)后，再加入TNF-a20ng/ml孵育24小時(shí)后，測定細(xì)胞胞漿內(nèi)ATP的含量，TNF-a可顯著降低ATP的含量(與對(duì)照組相比P〈0.01);硫辛酰胺可以增加細(xì)胞胞漿內(nèi)ATP的含量，呈劑量依賴效應(yīng)，10-100ixM硫辛酰胺可顯著逆轉(zhuǎn)TNF-a抑制的ATP生成，結(jié)果如圖14所示。實(shí)施例14硫辛酰胺抑制TNF-a誘導(dǎo)p-JNK的活化TNF-a可以激活c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的表達(dá)，應(yīng)用硫辛酰胺10yM預(yù)處理半小時(shí)后，可以顯著抑制p-JNK的活化；而應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸未顯示出抑制效應(yīng)，結(jié)果見圖15。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110〉中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>硫辛酰胺在防治胰島素抵抗中的用途<130〉074893〈160〉14<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉18<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400>1aatctaccatcctccgtg18<210〉2<211〉20<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400>2gactaatgattcttcaccgt20<210〉3<211>21<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉3cattcgaacgtctgccctatc21<210〉4<211〉18<212>DNA〈213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400〉4cctgctgccttccttgga<210>5<211〉19<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400〉5gcaaacgcaaacacaggcc<210>6<211>19<212〉腿<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400〉6ctgcatctccctgagaagc<210〉7<211〉18<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400>7aa犯siggaEiagctatgac〈210>8<211>18<212>DNA<213〉人工序列<221〉misc一feature<223〉引物<400〉8agcaccatattttcgttg<210〉9<211〉20<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature'<223〉引物<400〉9tcacacaatgcaatccgttt<210〉10<211>20<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400>10ggccttgaccttgttcatgt<210>11<211〉21<212>腿〈213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>11tgtccaagtatctggcagtcg<210>12<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉12catagccgtcatcagcaacc<210〉13<211〉21〈212〉腿<213>人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400>13cattcgaacgtctgccctatc<210>14<211〉18<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc_feature<223〉引物<400>14cctgctgccttccttgga說明書第25/25頁202權(quán)利要求1.一種硫辛酰胺的用途，其特征在于，用于制備提高胰島素敏感性或防治胰島素抵抗的組合物。2.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于調(diào)節(jié)糖代謝或脂代謝。3.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于-提高細(xì)胞內(nèi)過氧化物激活酶轉(zhuǎn)錄因子-Y激活因子-la的表達(dá)；提高細(xì)胞內(nèi)線粒體轉(zhuǎn)錄因子A和核呼吸因子1的表達(dá)；提高細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA生成；提高細(xì)胞線粒體傳遞鏈復(fù)合物蛋白的表達(dá)和活性；增加細(xì)胞線粒體的數(shù)目和截面積；或促進(jìn)細(xì)胞的耗氧。4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的線粒體傳遞鏈復(fù)合物包括線粒體傳遞鏈復(fù)合物I、線粒體傳遞鏈復(fù)合物II和/或線粒體傳遞鏈復(fù)合物III。5.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于促進(jìn)脂肪酸廓清；或提高過氧化物酶增殖物激活受體-a和肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1的表達(dá)。6.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于促進(jìn)胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)；提高細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶的表達(dá)和活性；抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生；促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷生成；或抑制c-Jun氨基末端激酶的表達(dá)。7.如權(quán)利要求3-6任一所述的用途，其特征在于，所述的細(xì)胞是脂肪細(xì)胞。8.—種體外提高細(xì)胞對(duì)于胰島素的敏感性的方法，其特征在于，所述方法包括給予細(xì)胞有效量的硫辛酰胺。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的有效量是1-100umol/L。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的有效量是l-10umol/L。全文摘要本發(fā)明屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了硫辛酰胺的新用途，用于制備提高胰島素敏感性或防治胰島素抵抗的組合物。本發(fā)明首次揭示硫辛酰胺對(duì)于促進(jìn)線粒體生成和功能、調(diào)節(jié)糖脂代謝、促進(jìn)胰島素敏感性、防治胰島素抵抗具有極其優(yōu)異的效果，并且僅需較低的劑量即可發(fā)揮極其顯著的作用。文檔編號(hào)A61K31/385GK101396357SQ20071004661公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2007年9月29日優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日發(fā)明者劉健康,沈偉利,川田申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院